CN103145865A

CN103145865A - 粗毛韧革菌菌丝体多糖的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103145865A
Application number: CN2013100602020A
Authority: CN
Inventors: 张志才; 王永生
Original assignee: BEIJING LYUKE TIANCHENG BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Anhui Bio Technology Co ltd
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: CN103145865B

Abstract

本发明公开了粗毛韧革菌菌丝体多糖的制备方法及其应用，涉及生物发酵及医药领域，具体的说本发明涉及通过粗毛韧革菌液体培养获取菌丝体、提取菌丝体多糖生产工艺流程，以及该多糖的降血糖降血脂功效。本发明申请人经反复试验研究发现应用该生产工艺生产的菌丝体多糖，经腹腔注射途径或口服途径给药，可显著降低高血糖小鼠的血糖和血脂水平，因此证实粗毛韧革菌菌丝体多糖具有作为制备降低血糖和血脂药物的用途。本发明不仅为深度开发利用粗毛韧革菌打开了一条崭新的途径，而且可以为降低血糖和降低血脂提供新的理想中药。

Description

粗毛韧革菌菌丝体多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵及医药领域，具体的说本发明涉及通过粗毛韧革菌培养生产粗毛韧革菌菌丝体多糖的方法，由该方法获得的粗毛韧革菌菌丝体多糖，以及含有该多糖的药物组合物和/或保健品。所述的粗毛韧革菌菌丝体多糖具有预防和/或治疗糖尿病的药物，特别是其具有降低血糖和血脂功效，使其为降低血糖和血脂提供理想药物。

背景技术

糖尿病是目前中老年人的常见病和多发病，由糖尿病引起的并发症严重危及人类的生命健康。现有西药类降糖药物难免有副作用，而天然中药类降糖药物大多数降糖不明显，同时受物种资源的限制。而以药用真菌液体培养生产降糖药物则没有上述缺点。

粗毛韧革菌，是金耳的寄生菌，与金耳菌种共同形成金耳子实体，生长于海拔1900-3300米的栎树和桦树树干上。民间对金耳的认识和药用有着非常悠久的历史，早在明朝时期，著名的药物学家李时珍在他的《本草纲目》中详细记载金耳。如“其金色者(当指金耳)治癖饮积聚，服痛金苍”。另外，《中国药用真菌》、《中国中药大典宗旨》、《云南食用菌》对金耳的药用价值均有详细介绍。金耳性温寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，调气，平阴阳；临床上治神经衰弱，肺热，哮喘，慢性支气管炎，高血压，肝炎等疾病。

近代科学研究证明金耳子实体用水煮成粘稠状后加白糖，制成的制剂可以治疗“肺热”、感冒、咳嗽、哮喘和高血压。近年来对金耳的研究表明其能产生多种生物活性物质。Kiho等发现腹腔注射金耳子实体水溶性多糖和醇溶多糖对正常小鼠，链脲霉素诱导的糖尿病小鼠以及基因缺陷型糖尿病小鼠均具降血糖作用。毛述永等发现口服云南金耳子实体水溶性多糖对四氧嘧啶糖尿病模型大鼠具有显著降血糖作用。目前由于对金耳野生资源的过度利用已经对该资源形成了很大的威胁。而传统人工栽培方式周期长，需要数月才能形成一代子实体。长期的栽培过程造成了子实体成分特别是那些生物活性物质不稳定，使得从子实体中提取活性成分缺少商业可行性。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种以粗毛韧革菌为出发菌株，经过液体深层培养、提取等步骤，制备粗毛韧革菌菌丝体多糖。

本发明所使用的粗毛韧革菌为市售的任意一种粗毛韧革菌菌种。该菌属于真菌门，伞菌纲，非褶菌目(也叫多孔菌目)，革菌科，学名Stereum hirsutum(Willd)Pers，又叫粗皮硬革菌、粗毛硬革菌。不形成或很难形成子实体，菌丝体遇氢氧化钾溶液变暗或变黑。生殖菌丝疏松地交织在一起，分枝，有锁状联合，近无色。

本发明所述的粗毛韧革菌菌丝体多糖的制备方法，包括以粗毛韧革菌为黑发菌株，进行液体摇瓶培养、一级或多级种子培养和发酵培养，离心、水洗和烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体，菌丝体通过水解、中和、超滤、浓缩和结晶步骤获得菌丝体多糖；

具体的，在本发明所述的摇瓶培养中，其摇瓶培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，培养条件是：装液量为60～150mL/250mL，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；

在本发明所述的一级或多级种子培养中，其种子罐培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，消泡剂0.1～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；培养条件是：按种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时；

在本发明所述的发酵培养中，所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖20～80，玉米粉10～40，麸皮5～30，蛋白胨3～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，CaCO₃0～10，消泡剂0.2～5，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。

按照该发酵工艺，其中在进行摇瓶发酵培养之前，首先将粗毛韧革菌的斜面菌种接入新配制的土豆培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时；其中所述的土豆培养基的组成可参见诸葛健和王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367。

由本发明的方法获得的粗毛韧革菌菌丝体得率为2～30g/L发酵液。

所述的菌丝体通过水解、中和、超滤、浓缩和结晶步骤制备菌丝体多糖的方法包括以下步骤：

A.水解-在菌丝体中加入5～50倍1～4％NaOH溶液，80℃水解1～6小时，2500～4000rpm离心5～20分钟，菌丝体用水洗涤2～3次，洗涤液并入水解液中；

B.中和-合并后的水解液用盐酸中和至pH6.0～8.5，2500～4000rpm离心，取滤液；

C超滤-用0.1微米的膜微滤，再用分子量5000～30000的膜超滤；

D.浓缩-用酒精浓缩超滤液，使之沉淀；

E.结晶-滤出浓缩沉淀物，用浓酒精洗涤后烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体多糖。

按此工艺菌丝体多糖的得率为5～15g/100g菌丝体。

本发明的又一目的是提供了所述粗皮韧革菌菌丝体多糖在药物和保健品制备中的应用。其中所述的药品和保健品具有降低血糖血脂的功能。

本发明的又一目的是提供了用本发明的方法制备得到的粗皮韧革菌菌丝体多糖在制备预防和/或治疗糖尿病的药物和/或保健品中的应用。

本发明的方法所制备的粗皮韧革菌菌丝体多糖的降血糖降脂功能，可通过下面的药剂实验证明：

选取空腹小鼠，以无菌的pH4.6柠檬酸缓冲液配制4％的四氧嘧啶(alloxan)注射液，按体重160mg/kg剂量一次性腹腔注射造型，120小时后，选择空腹血糖值大于13mmol/L的小鼠随机分为5组，每组12只，组间差异小于0.5mmol/L，设阳性对照(I，生理盐水)；阳性药物组(II，二甲双胍，剂量120mg/kg体重)；给药组(III，粗毛韧革菌菌丝体多糖，剂量100mg/kg体重)均采用口服给药，每隔10天测定空腹血糖一次，实验时间30天，最后一天分析血浆总胆固醇机三磷酸甘油酯含量。

上述试验给药10d后，粗皮韧革菌菌丝体多糖组与对照组相比，血糖指标均显著降低(pH＜0.05)，给药30天后，粗皮韧革菌菌丝体多糖组与对照组相比，血清总胆固醇、三磷酸甘油酯指标均显著降低(pH＜0.05)可见粗皮韧革菌菌丝体多糖10d即能显著降低高血糖小鼠血糖和30天即能降低血脂指标。因此证实了粗皮韧革菌菌丝体多糖具有制备降血糖和血脂功能的保健品和/或药品的用途。应用本发明的粗毛韧革菌培养方法，可以大规模或工业化生产粗皮韧革菌菌丝体多糖和含有该混合物的药物组合物。由于该药物组合物中所含有的粗皮韧革菌菌丝体多糖来源于天然菌种的培养，因此没有任何毒副作用，从而为糖尿病患者提供了理想的药物，并为粗毛韧革菌的应用开创了广阔的前景，

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了下述的实施例。但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：粗毛韧革菌发酵液和菌丝体多糖的制备

1、用新配置的土豆培养基(葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)斜面转接粗毛韧革菌菌种，27℃培养，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有60mL摇瓶培养基的250mL三角瓶(共84瓶)，于22℃、90转/分钟摇床培养24小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH₂PO₄1，MgSO₄1，起始pH值为5.0。

2、将上述培养的菌种5000mL接入装有45L种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体积为50L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速度90转/分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间90小时。其中种子罐中的种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH₂PO₄1，MgSO₄1，消泡剂0.5，起始pH值为5.0。

3、将50L种子罐菌种接入装有600L发酵液培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为650L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速度90转/分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间150小时，其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉10，麸皮5，蛋白胨3，KH₂PO₄1，MgSO₄1，CaCO₃0，消泡剂0.5，起始pH值为5.0。

经上述步骤后得到粗毛韧革菌发酵液，经过离心、水洗和80℃烘干，得到1.2Kg粗毛韧革菌菌丝体。

4、粗毛韧革菌菌丝体加入5倍重量的4％NaOH溶液，80℃水解1.5小时，2500rpm离心20分钟，菌丝体用水洗涤2～3次，洗涤液并入水解液中并用盐酸中和至pH8.0，2500rpm离心，取滤液；滤液用0.1微米的膜微滤，再用分子量30000的膜超滤；超滤液浓缩，浓缩液用酒精沉淀，次日滤出浓缩沉淀物，用浓酒精洗涤后烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体多糖。菌丝体多糖的得率为5g/100g菌丝体。

实验例2：粗毛韧革菌培养液和菌丝体多糖的制备

1、用新配置的土豆培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)斜面转接粗毛韧革菌菌种，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有90mL摇瓶培养基的250mL三角瓶(共40瓶)，25℃、120转/分钟摇床培养36小时。

2、将上述培养的菌种4000mL接入装有50L种子培养基的100L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为54L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速度120转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，培养时间90小时。

3、将30L种子罐菌种接入装有300L发酵液培养基的500L发酵罐中，发酵罐中，发酵液的总体为350L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速度120转/分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间120小时，得到粗毛韧革菌培养液。

上述步骤使用的各种培养基的配方如下：

摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，起始pH值为6.5。

种子罐培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄2，消泡剂0.1，起始pH值为6.5。

发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉25，麸皮20，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，CaCO₃1，消泡剂0.1，起始pH值为6.5。

经上述步骤后得到粗毛韧革菌发酵液，经过离心、水洗和80℃烘干，得到12Kg粗毛韧革菌菌丝体。

4、粗毛韧革菌菌丝体加入25倍2.5％NaOH溶液，80℃水解4小时，3000rpm离心10分钟，菌丝体用水洗涤3次，洗涤液并入水解液中并用盐酸中和至pH7.0，3000rpm离心，取滤液；滤液用0.1微米的膜微滤，再用分子量15000的膜超滤；超滤液浓缩，浓缩液用酒精沉淀，次日滤出浓缩沉淀物，用浓酒精洗涤后烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体多糖。菌丝体多糖的得率为15g/100g菌丝体。

实施例3：粗毛韧革菌发酵液和菌丝体多糖的制备

1、用新配置的PDA培养基斜面(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)转接粗毛韧革菌菌种，培养温度30℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有150mL摇瓶培养基的250mL三角瓶(共10瓶)，30℃、150转每分钟摇床培养46小时。

2、将此液体摇瓶培养的菌种3000mL接入装有50L一级种子培养基的30L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为31.5L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速度150转/分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。

3、将15L一级种子菌种接入装有320L发酵液培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为335L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速度150转每分钟，通风量1∶01v/v/m，发酵时间180小时，得到粗毛韧革菌发酵液。

上述步骤使用的各种培养基的配方如下：

摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，起始pH值为8.0。

种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH₂PO₄ 6，MgSO₄4，消泡剂0.8，起始pH值为8.0。

发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖80，玉米粉40，麸皮30，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，CaCO₃10，消泡剂0.8，起始pH值为8.0。

经上述步骤后得到粗毛韧革菌发酵液，经过离心、水洗和80℃烘干，得到24Kg粗毛韧革菌菌丝体。

4、粗毛韧革菌菌丝体加入50倍1％NaOH溶液，80℃水解6小时，3000rpm离心10分钟，菌丝体用水洗涤2次，洗涤液并入水解液中并用盐酸中和至pH8.5，3000rpm离心，取滤液；滤液用0.1微米的膜微滤，再用分子量5000的膜超滤；超滤液浓缩，浓缩液用酒精沉淀，次H滤出浓缩沉淀物，用浓酒精洗涤后烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体多糖。菌丝体多糖的得率为10g/100g菌丝体。

实施例4：多糖含量的测定

本发明所述的粗皮韧革菌菌丝体多糖测定方法硫酸蒽酮法，具体操作参见李合生主编的《植物生理生化实验原理和技术》195～197页。

本发明所述的粗皮韧革菌菌丝体多糖组分分析方法为：称取20mg多糖，加入4mol/L的硫酸于100℃水解8小时，加碳酸钡中和水解物，离心取上清液，采用薄层层析技术，以葡萄糖、半乳糖，甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、鼠李唐和岩藻糖作为对照，展开剂为正丁醇∶丙酮∶水＝4∶3∶1，硫酸蒽酮喷雾110℃烘烤显色，结果证明粗皮韧革菌菌丝体多糖的单糖组成为葡萄糖、半乳糖，甘露糖、鼠李唐和岩藻糖。

实施例5

将实施例1、2和3所得的粗皮韧革菌菌丝体多糖，按公知的制片技术和装备制成片剂。

实施例6粗毛韧革菌菌丝体多糖降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖试验

粗毛韧革菌菌丝体多糖按实施例1，2和3方法制取。

实验动物：昆明小白鼠，雄性，体重为21～26g，由中科院上海实验动物中心提供糖尿病小鼠模型制备；雄性小鼠禁食24小时后，腹腔注射160ug/kg四氧嘧啶造模型，5天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值＞13mmol/L为实验性糖尿病型鼠。

实验模型鼠按血糖水平随机分组，分为一个模型对照组和3个试验组和一个二甲双胍组(作为对照)，每组12只小鼠，试验组分别给予按实施例2、3和4制得的菌丝体多糖(给药剂量100mg/kg)和二甲双胍组(给药剂量100mg/kg)，各组按照要求剂量分别灌胃，对照组灌以自来水。连续给予受试物30天，每隔10天测空腹血糖，第30天测定血糖值的同时测定血脂值(测定均采用南京建成生物科技有限公司生产的血糖和血脂试剂盒)。

结果显示：采用三种实施例制得菌丝体多糖和二甲双胍给药后，三次测定血糖、磷酸甘油酯总胆固醇值的显著低于对照组对应的值(P＜0.05)(表1和2)，这显示粗毛韧革菌菌丝体多糖具有降低血糖和血脂的作用。试验结果表明三种实施例制得多糖均具有显著的降低血糖和血脂作用，可以用于制备降血糖和降血脂的药物

与现有降血糖降血脂药物的药效比较实验可以表明，粗毛韧革菌菌丝体多糖药效快，降血糖降血脂效果明显。由于本身是一种纯中药制剂，并且原有“调气、平时阳”等作用，因此粗毛韧革菌菌丝体多糖服用后有益无害。本发明不仅为深度开发利用粗毛韧革菌打开了一条崭新的途径，而且为降低血糖降血脂提供了新的理想中药，将带来良好的经济效益和社会效益。

表1.粗毛韧革菌菌丝体多糖对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖水平的影响(mmol/L)

注：时间的单位为天；血糖值的单位mmol/L；*：表示与阳性对照组(I)比较，血糖值存在显著差异(p＜0.05)

表2.粗毛韧革菌菌丝体多糖对四氧嘧啶致高血糖小鼠脂代谢的影响，

*：表示与阳性对照组(I)比较，血浆胆固醇/血浆甘油三酯存在显著差异(p＜0.05)

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种粗毛韧革菌菌丝体多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以粗毛韧革菌为出发菌株，进行液体摇瓶培养、一级或多级种子培养和发酵培养，离心、水洗和烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体，菌丝体通过水解、中和、超滤、浓缩和洁晶步骤获得菌丝体多糖；

所述的摇瓶培养中，其摇瓶培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，培养条件是：装液量为60～150mL/250mL，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；

所述的一级或多级种子培养中，其种子罐培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，消治率0.2～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养期间80～90小时；

所述的发酵培养中，所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖20～80，玉米粉10～40，麸皮5～30，蛋白胨3～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，CaCO₃0～10，消泡剂0.2～5，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；培养条件是：接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m培养时间120～180小时。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中在进行液体摇瓶培养之前，首先将粗毛韧革菌的斜面菌种接入新配制的土豆培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的菌丝体通过水解、中和、超滤、浓缩和结晶步骤制备菌丝体多糖的方法包括以下步骤：

A.水解：在菌丝体中加入5～50倍1～4％NaOH溶液，80℃水解1～6小时，2500～4000rpm离心5～20分钟，菌丝体用水洗涤2～3次，洗涤液并入水解液中；

B.中和：合并后的水解液用盐酸中和至pH6.0～8.5，2500～4000rpm离心，取滤液；

C超滤：用0.1微米的膜微滤，再用分子量5000～30000的膜超滤；

D.浓缩：用酒精浓缩超滤液，使之沉淀；

E.结晶：滤出浓缩沉淀物，用浓酒精洗涤后烘干，得到粗毛韧革菌菌丝体多糖。

4.权利要求1-3任一所述的方法制备的粗皮韧革菌菌丝体多糖在药物和保健品制备中的应用，所述的药物和保健品具有降低血糖血脂、预防和/或治疗糖尿病的功能。