CN103130896B - 抗细胞表面异位表达的单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药领域，提供了一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体，其抗体分子Fab段抗原结合部位的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备治疗、预防消化道肿瘤或者消化道肿瘤转移的药物中的用途。本发明还提供了含有上述单克隆抗体的检测试剂盒和药物组合物。本发明还提供了上述的单克隆抗体的制备方法。通过一系列体内和体外试验证明，纯化和除菌后的上述单克隆抗体具有对肿瘤细胞胞外异位表达的PALP和/或IALP抗原高亲和性，并可抑制肿瘤细胞生长和迁移的生物学活性功能。

Description

抗细胞表面异位表达的单克隆抗体及其制备方法和用途
技术领域：
本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种单克隆抗体，具体来说是一种抗胃癌等消化道肿瘤细胞表面异位表达的碱性磷酸酶的单克隆抗体及其制备方法和用途。
背景技术：
胃癌（Gastric Cancer，GC）是最常见的消化***恶性肿瘤，在世界范围内是肿瘤相关死亡的第二大原因。中国是世界上胃癌发病率最高的国家之一，每年新发病例近40万，约占全世界的42%，并且很多患者在就诊时已属晚期。目前，胃癌的早期筛查和确诊主要依靠胃镜结合组织病理学活检，虽然近年来这种早期筛查诊断手段的特异性、敏感性、准确性和安全性均有了一定程度的提高，但是由于普及困难以及诸多干扰因素的存在，临床应用效果并不十分令人满意。因此，多数胃癌患者初诊时往往已发展至晚期，主要依靠手术治疗、放疗、全身化疗，但是这些传统治疗措施不仅费用昂贵，增加了个人、社会经济负担，而且治疗的针对性不强，疗效常常差强人意，患者的五年生存率通常不超过10%，所以胃癌的临床治疗仍不容乐观。近年来，虽然一些新的治疗药物以及联合治疗方案的实施使患者的治疗反应率有所提高，但是在已经开展的随机临床研究中，均未达到中位生存期1年以上的治疗目标。由于胃癌细胞普遍对化疗及放疗不敏感，而且目前尚缺乏有效的胃癌二线治疗方案，因此近年来新的胃癌治疗策略以及治疗药物的研发成为基础及临床研究的热点。2002年NCI-PRG建议对肿瘤进行分子层面的定义，从而有效实现肿瘤患者的个体化治疗、复发检测以及预后评估。在这些新理念的指导下，胃癌的分子靶向治疗应运而生，成为新的生物学治疗方法。
分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达或者特异性表达的某些标志性分子作为靶点。上世纪90年代至今，多种分子靶向治疗药物相继进入临床试验用于多种肿瘤的治疗，部分药物显示出较好的疗效。这些药物主要包括两大类，即大分子单克隆抗体以及小分子酪氨酸激酶抑制剂。由于抗体高度特异性识别并结合抗原，因此肿瘤的抗体靶向治疗（Antibody-Targeted Therapy,ATT）在肿瘤治疗领域彰显出独特魅力。以与肿瘤发生发展密切相关的分子作为靶点，通过单克隆抗体的激动剂（Agonist）或者竞争性拮抗作用（Competitive Antagonism），以及将抗体作为传递药物的载体，或是借助某些免疫学机制（如ADCC），实现对肿瘤细胞的特异性抑制、杀伤或对肿瘤生长微环境的针对性干扰，因此与传统治疗措施相比，效果更为明显而毒副作用大大降低。肿瘤的抗体药物靶向治疗将会成为传统治疗方式的重要补充甚至有可能取代现有的治疗方法。
胃癌的抗体药物靶向治疗近年来发展迅速。临床前研究以及临床研究显示，以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的单抗药物Cetuximab，以表皮生长因子受体2（EGFR2，HER2）为靶点的单抗药物Trastuzumab以及以血管内皮生长因子（VEGF）为靶点的单抗药物Bevacizumab（Avastin）均具有一定程度的抗胃癌活性，但是均存在着特异性不高，靶向性不强的问题，实际临床治疗效果并不十分理想。胃癌靶向治疗单抗药物研究的核心是寻找鉴定胃癌特异性抗原以及制备抗特异性抗原天然表位的抗体。Brichory等首先将蛋白质组学方法引入到鉴定筛选肿瘤相关抗原及抗肿瘤自身抗体领域。在目前的后基因组时代，这一策略在多种肿瘤研究中被广泛应用，包括胃癌，并且揭示出众多可能的新的胃癌分子标志物，如葡萄糖调节蛋白（GlucoseRegulated Protein，GRP78），热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP27、70、60）以及纤维蛋白肽A（Fibrin Peptide A）。但是由于肿瘤单抗靶向治疗的理想候选靶点是细胞表面特异性抗原，而且蛋白质组学研究中所采用的某些技术很难保证抗原的天然构象，限制了鉴定筛选得到的胃癌分子标志物以及相应抗体的进一步研究应用。毋庸置疑，在天然状态下鉴定胃癌或其它肿瘤细胞表面特异性抗原，并且实现高通量制备抗胃癌或其它肿瘤表面分子标志物的特异性抗体将会为胃癌分子标志物鉴定以及胃癌靶向治疗单抗药物的研发提供有力工具。
碱性磷酸酶（ALP）属于同源二聚体蛋白，分子量为56kDa。每个单体由449个氨基酸组成，完整的ALP分子呈现典型的α/β的拓扑结构。ALP是一种含锌的糖蛋白酶。人的ALP在pH8.0的碱性环境呈现最高的活力并能够水解磷酸单酯化合物底物。正常ALP是由pho-A基因编码的。它是一种分泌蛋白，在胞浆内合成氨基末端分泌信号肽的单体前体，分泌信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，形成的同源二聚体被分泌至胞外。
ALP有多个亚型并是一类能够将对应底物去磷酸化的酶或同工酶。正常人血清中的ALP主要来自肝脏，来自骨组织的ALP一般少于总活性的一半。目前已知ALP的亚型有胎盘型（PALP）、肠型（IALP）、生殖细胞型（GALP）以及非特异组织型（TNSALP）。而TNSALP为基因表达后加上多个修饰所形成的肝、肾、骨等次级同工酶；
在人体生理性异常或病理性的情况下，ALP主要经肝脏排出到外周血，从而血清ALP增高。ALP主要存在机体的骨骼、肝脏、肾脏等组织。肝胆***疾病包括肝胆恶性肿瘤、骨骼发育异常、孕妇等ALP会增高，但是目前还没有报道在胃癌等消化道肿瘤中升高的报道，也没有任何文献、专利或会议交流中报道ALP的亚型可以异位性表达在肿瘤细胞表面。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体及其制备方法和用途，所述的这种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体能有效的抑制消化道肿瘤细胞的生长和转移。
本发明提供了一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体，其抗体分子Fab段抗原结合部位的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其抗体分子Fab段抗原结合部位的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步的，其轻链可变区的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步的，上述的抗细胞表面异位表达的单克隆抗体是一种鼠源IgG亚型的免疫球蛋白。
本发明还提供了上述的单克隆抗体在制备治疗、预防消化道肿瘤或者转移的药物中的用途。
进一步的，所述的消化道肿瘤包括但并不局限于胃鳞状细胞癌、胃腺癌、小细胞癌、腺鳞癌、类癌、食管癌、胃癌、十二指肠癌、胰腺癌、胆管癌、胆囊癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌。
本发明还提供了一种检测试剂盒，含有上述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体。
进一步的，上述的检测试剂盒还含有与上述的抗细胞表面异位表达的单克隆抗体结合的标记物，所述的标记物为荧光标记物、或者放射性标记物、或者酶标标记物。
本发明还提供了一种药物组合物，含有上述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体。
进一步的，上述的药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或混合剂。
本发明还提供了上述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体在消化道肿瘤的血清学、病理学诊断、X线断层显像、或者正电子发射断层扫描-X线断层显像中的应用。
本发明还提供了上述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：采用四种等同比例组合（混合）的胃癌细胞株SGC7901、BGC823、MKN28、MKN45活细胞多点免疫小鼠，三次正常免疫和一次加强免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG化学融合，筛选出能够分泌出能够结合上述四种胃癌活细胞表面抗原而不与人正常外周血单个核细胞相反应的杂交瘤细胞株，将此杂交瘤细胞株亚克隆后，获得所培养的杂交瘤细胞上清液，经亲和纯化即得到本发明的单克隆抗体。
进一步的，通过免疫亲和层析方法纯化杂交瘤细胞培养上清液。
本发明建立一个有效的肿瘤活细胞高通量筛选的方法，通过混合的人胃癌细胞系活细胞免疫小鼠并选择高免疫反应的小鼠脾脏与小鼠的SP2/0细胞系融合而产生的抗体杂交瘤，在通过对杂交瘤抗体抗胃癌细胞系的高通量筛选和对正常人的外周血单核白细胞（PBMC）对照筛选从而得到了此株MS17-57对GI肿瘤细胞高特异性反应的单克隆抗体。
本发明采用了以制备的抗胃癌单抗反向筛选鉴定抗原的方法，旨在实现“一步法”同时制备特异性抗胃癌细胞表面天然构象抗原的MS17-57单抗以及鉴定其特异性胃癌分子标志物ALP细胞膜表达蛋白。
由于传统抗体筛选制备方法很难获得识别活细胞表面天然构象抗原的抗体，所以本发明采用了“鸟枪法”活细胞免疫，杂交瘤技术结合流式细胞术高通量检测的方法，在活细胞水平直接筛选抗细胞表面天然构象抗原的MS17-57特异性抗体，在进行MS17-57抗体的鉴定及MS17-57抗体与胃癌临床病理学参数的相关性分析后，采用蛋白印迹法、免疫沉淀法和蛋白质谱法完成对所制备的MS17-57抗体特异性结合靶抗原蛋白的快捷鉴定，从而筛选和发现了这个ALP新的胃癌细胞表面分子标志物。
本发明的MS17-57单抗能高度特异性地对分子量约56kDa的肿瘤细胞表面自然表达的IALP和/或PALP分子反应。在本发明自有特殊的单抗杂交瘤筛选设计中，所表达的单克隆抗体是由命名为MS17-57的单抗杂交瘤细胞株分泌产生的，小鼠单抗的亚型是属于IgG1重链和κ轻链。
本发明通过以抗体反向鉴定抗原的策略，旨在实现在制备抗胃癌细胞表面分子标志物特异性抗体的同时筛选鉴定新的胃癌分子标志物。单克隆抗体是一种良好的蛋白质组学研究工具，传统的单抗制备途径是杂交瘤方法，通常采用非分子标志物免疫，也较少采用融合后大量铺板的高通量筛选方法，因此获得抗细胞抗原天然表位抗体的机率较低。本发明采用类似“鸟枪法”（“shot gun”manner）通过活细胞免疫小鼠，采用独特的杂交瘤高融合率方法进行融合、大批量铺板（每次多于50-60块板）结合FACS-HTS高通量检测筛选的方法，在活细胞水平上直接筛选抗细胞表面带有构象性表位（Conformational Epitopes）分子标志物的抗体，并通过复查鉴定最终选定特异性高亲和力的单克隆抗体。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明在进行对所制备的抗胃癌混合细胞株特异性单克隆抗体与胃癌等消化道肿瘤的临床病理学参数相关性分析后，对MS17-57单抗相作用于在肿瘤细胞表面的IALP和/或PALP分子作用功能分析，发现MS17-57单抗是针对一组人胃癌细胞的表面PALP/IALP抗原而产生的，并可诱导特异性、功效性生物反应，能够特异性识别胃癌等消化道肿瘤并进行靶向治疗，同时可以应用在消化道肿瘤的诊断和影像中。本发明建立了一套高通量制备抗胃癌及消化道实体瘤细胞表面天然构象抗原特异性抗体的全新方法，并以获得的MS17-57单抗作为蛋白质组学研究工具，反向筛选鉴定胃癌等消化道实体肿瘤细胞表面分子靶向标志物。若将所述单克隆抗体人/鼠嵌合化或人源化后可开发用于人胃肠道肿瘤治疗的生物药剂。
附图说明：
图1显示了FACS对四种混合胃癌细胞株免疫后的小鼠血清与正常人PBMC、胃癌的SGC7901和BGC823细胞株滴度反应的检测。
图2显示了FACS对MS17-57单抗分别与4种免疫用的胃癌细胞株不同程度的结合反应。
图3是MS17-57单抗分别与正常人PBMC、胎儿胃粘膜上皮转化细胞株GES-1和胃癌细胞株AGS结合反应的FACS检测。
图4是MS17-57单抗分别与正常人PBMC、胃癌细胞MKN74、TMK-1、KKLS、ST-8和ST-9细胞系结合反应的FACS检测。
图5是MS17-57单抗与胃癌BGC823细胞膜抽提蛋白结合的ELISA检测反应。
图6是MS17-57单抗与胃癌MKN45细胞膜抽提蛋白结合的ELISA检测反应。
图7是MS17-57单抗与GES-1细胞膜抽提蛋白结合反应的ELISA检测。
图8是MS17-57单抗在胃粘膜转化细胞GES-1和胃癌细胞BGC823、MKN45的免疫组织化学反应检测。
图9是MS17-57单抗对胃癌BGC823和MKN45细胞膜抽提靶蛋白进行直接法和间接法的免疫沉淀反应。
图10是各种胃癌细胞株的PALP和IALP在mRNA水平上的qRT-PCR反应。
图11是MS17-57单抗分别对胃癌BGC823和MKN45细胞生长增值抑制反应。
图12是MS17-57单抗对胃癌细胞MKN45迁移运动的抑制作用；A.细胞培养液对照；B.5μg/mL MS17-57单抗；C.10μg/mL MS17-57单抗；D.20μg/mL MS17-57单抗；E.5μg/mL同型对照单抗；F.20μg/mL同型对照单抗。
图13是MS17-57单抗对胃癌细胞BGC823迁移运动的抑制作用；A.细胞培养液对照；B.5μg/mL MS17-57单抗；C.10μg/mL MS17-57单抗；D.20μg/mL MS17-57单抗；E.5μg/mL同型对照单抗；F.20μg/mL同型对照单抗。
图14是MS17-57单抗对胃癌细胞BGC823迁移运动的抑制作用的定量计算和比对。
图15是MS17-57单抗能够抑制胃癌细胞MKN45在小鼠体内肿瘤的生长；A.MS17-57单抗抑制MKN45细胞株肿瘤生长的实验组，4个小鼠平均每个小鼠有1.5个肿瘤并直径在0.30cm大小左右；B.同型对照单抗对MKN45细胞株肿瘤生长的对照组，4个小鼠平均每个小鼠有8.5个肿瘤并直径在0.31cm大小左右；C.空白对照PBS缓冲液对MKN45细胞株肿瘤生长的对照组，空白对照组4个小鼠，平均每个小鼠有9.0个肿瘤并直径在0.28cm大小左右。
图16是MS17-57单抗能够抑制胃癌细胞BGC823在小鼠体内肿瘤的生长；A.MS17-57单抗抑制BGC823细胞株肿瘤生长的实验组，4个小鼠平均每个小鼠有1个肿瘤并直径在0.27cm大小左右；B.同型对照单抗对BGC823细胞株肿瘤生长的对照组，4个小鼠平均每个小鼠有7个肿瘤并直径在0.31cm大小左右；C.空白对照PBS缓冲液对BGC823细胞株肿瘤生长的对照组，空白对照组4个小鼠，平均每个小鼠有6.5个肿瘤并直径在0.3cm大小左右。
具体实施方式：
下面实施例采用的试剂和实验器具均为本领域的常用物品，可以在市场上购买或者通过正规途径可以获得。
实施例1
采用四种等比例混合的4株胃癌细胞（BGC823、MKN28、MKN45和SGC7901，均来源于中国科学院上海细胞生物学研究所）经在含10%FBS的RPMI1640培养基中，5%CO2、37℃环境下培养后，收集的混合活细胞在PBS缓冲液中作为免疫原，在A/J-JAX小鼠（购置于南京大学实验动物模式中心，小鼠来源于The Jackson Laboratory,美国）背部皮下及腹腔内注射进行免疫，每次每只小鼠1×107个细胞，隔周免疫一次；在第3次免疫1周后，取小鼠血清，流式细胞术高通量***（FACS-HTS）检测血清与4株胃癌细胞的反应情况，健康志愿者PBMC作为对照细胞【健康志愿者外周血经Ficoll液分离外周单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）并作为在荧光流式细胞仪高通量筛选（FACS-HTS）的正常人细胞抗原对照筛选】。选择血清效价较高以及与对照细胞PBMC交叉反应程度较低的小鼠（同一稀释比例下，血清与胃癌细胞及对照细胞的平均荧光强度值的差值＞500）进行融合前加强免疫。
取已经加强免疫过的小鼠脾脏，用无血清的DMEM培养液将免疫反应性比较高的1号小鼠的脾脏细胞制备成单细胞悬液；在50%PEG（pH7.4）条件下，将脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，融合后大批量铺板（50块板）并用HAT选择性培养基培养10天至抗体杂交瘤细胞克隆的形成。收集及混合大批量培养的上述四种胃癌细胞株作为筛选对象，分离正常人外周血PBMC细胞作为筛选对照细胞，二种细胞都分别在预冷的1.5%BSA/PBS封闭液中重悬并平均分配（约每孔1～2x105细胞）各加入51块96孔U型板中【总共102块板，二个第51块板分别为阳性（免疫后的小鼠血清并梯度稀释）和阴性（正常小鼠血清并梯度稀释和HAT选择性培养液）对照板】。
将50块抗体杂交瘤细胞融合板（96孔板）的上清液（相当于第一抗体即原始的单抗）每次70微升/孔分别移入相应的筛选板和对照板中并震荡混合，在冰浴中反应和用封闭液洗涤后，再加入100微升/孔的FITC荧光标记的羊抗鼠而进行的细胞荧光染色实验反应，由此的荧光流式细胞标记高通量筛选（FACS-HTS），先以空白对照孔以及同型对照孔的细胞调节FACS参数并作为本底，对两组96孔U型板每一孔的细胞样本逐一进行FACS检测。同时满足以下两个条件的定为阳性细胞孔：（1）与4株胃癌细胞表面抗原有结合反应（即与同型对照信号峰相比，样品信号峰偏移幅度大于一个对数值的）；（2）与PBMC细胞无结合反应（即与同型对照信号峰相比，样品信号峰偏移幅度小于5-10%的）。所选择和挑取结合独特的杂交瘤高通量筛选细胞，经选择性培养基和普通培养基的过渡、杂交瘤细胞的亚克隆及多次对抗体杂交瘤细胞培养上清的检测，MS17-57单抗所选定的杂交瘤细胞上清的抗体亲和纯化并经0.2微米膜过滤后4℃无菌保存和加入50%甘油在-20℃中长期保存。
实施例2
用Qiagen（Valencia，美国加州）的RNeasy试剂盒从MS17-57单抗杂交瘤细胞株中抽提总RNA，用Invitrogen（Grand Island，美国纽约州）的SuperScript IIIFirst-Strand试剂盒将mRNA反转录成MS17-57单抗的cDNA文库。利用德国的ProgenBiotechnik公司”Mouse IgG Library Primer Set”（F2010）试剂盒的23个引物进行21个PCR反应（不包含λ轻链的反应），所产生的特异轻、重链产物进行DNA测序、氨基酸多肽序列的翻译和CDRs（抗原决定族区域）和FW（骨架区域）的辨认。
表-1（a），MS17-57单抗轻链的可变区cDNA序列（SEQ ID NO：1）：
5’-atgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagggccagctcaagtat
aatttccagttacttgcactggttccagcagaagtcaggtgccccccccaaactct
ggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagt
gggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtggaggctgaagatgctgc
cacttattactgccagcagttcagtggttcccctatcacgttcggtgctggaccaa
gctggaactga-3’
表-1（b），MS17-57单抗轻链的可变区氨基酸序列（SEQ ID NO：2）：
MSASPGEKVTMTCRASSSIISSYLHWFQQKSGAPPKLWIYSTSNLASG
VPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQFSGSPITFGAGPSWNX
表-2（a），MS17-57单抗重链的可变区cDNA序列（SEQ ID NO：3）：
5’-gaggtccaagctgcagcagtctggaactgaactggtaaagcctggggcttcagtga
agttgtcctgcaaggcttttgactacaccttcacaaactacgatattaactgggtg
aagcagaggcctggacagggacttgagtggattggatggatttatcctggaagtgg
tagtactgaatacggtgagaagttcaaggggaaggccacactgactgcagacaaat
cctccagcacagtctacatgctcctcagcagcctgacagctgaggattctgcggtc
tatttctgtgcaagatcgagtaactggtacttcgatgtctggggtatagggaccac
ggtcaccgtctcctcagccaaaacgacacccccatctgactat-3’
表-2（b），MS17-57单抗重链的可变区氨基酸序列（SEQ ID NO：4）：
RSKLQQSGTELVKPGASVKLSCKAFDYTFTNYDINWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGSTE
YGEKFKGKATLTADKSSSTVYMLLSSLTAEDSAVYFCARSSNWYFDVWGIGTTVTVSSA
KTTPPSDY
表-1和表-2的（a）、（b）DNA与氨基酸序列是对等的。在氨基酸序列中的黑斜体和下划线是表明CDR区域的位置，是按CDR1、CDR2和CDR3顺序排列并在它们之间的区域序列是骨架蛋白序列（FW）。
实施例3
在96孔“U”型板上，用1%BSA/PBS调配平均每孔约20万个不同胃癌细胞/100微升而加入U型板中，分别将胃癌活细胞免疫后的血清成5倍滴度连续稀释，然后每孔分别加入100微升，混匀后冰上或4°C反应20分钟，经2次洗涤后再加入1:333稀释的羊抗鼠IgGFc-FITC100μL/孔，4°C反应和洗涤后，在BD公司的LSR-II荧光流式细胞仪-HTS机上读取各孔的MFI值。
结果表明：免疫反应性比较高的1号小鼠血清与胃癌细胞结合的滴度反应明显高于与正常人PBMC结合的滴度，此小鼠脾细胞用于MS17-57单抗杂交瘤产生的融合实验。（如图1所示）。
实施例4
亲和纯化后的MS17-57单抗经与实施例3说明所述的U孔板细胞染色方法，对四种免疫用的胃癌细胞株进行结合染色反应，并在LSR-II FACS仪上读取MRI值。其它实验步骤与实施例3相同。
结果显示了FACS对MS17-57单抗分别与4种免疫用的胃癌细胞株不同程度的结合反应，其中MS17-57单抗对MKN-45胃癌细胞株反应最高，而对SGC7901细胞反应相对较低，与其它二个细胞株反应性介于中间（如图2所示）。
实施例5
亲和纯化后的MS17-57单抗经与实施例3说明所述的U孔板细胞染色方法，对正常人PBMC、胃癌细胞株GES-1、AGS进行结合染色反应，并在LSR-II FACS仪上读取MRI值。
结果说明MS17-57单抗对GES-1和AGS细胞株都具有较高的结合反应性，而与正常人PBMC无结合反应，同时同型对照的无关单抗都是无结合反应的阴性对照（如图3所示）。
实施例6
亲和纯化后的MS17-57单抗经与图-1说明所述的U孔板细胞染色方法，对正常人PBMC和各个胃癌细胞株进行结合染色反应，并在LSR-II FACS仪上读取MFI值。
结果显示了MS17-57单抗分别与正常人PBMC、胃癌细胞MKN74、TMK-1、KKLS、ST-8和ST-9细胞系的结合反应，而结果全部呈现阴性即无结合反应（如图4所示）。
实施例7
亲和纯化后的MS17-57单抗与胃癌细胞株BGC823细胞膜抽提蛋白（事先已包被于美国Fisher Scientific公司的Immunlon-II ELISA反应板中）进行系列酶联结合反应，并在ELISA读板仪上读取OD值和作图。
ELISA结果显示了MS17-57单抗与胃癌BGC823细胞膜抽提蛋白有一定程度的结合反应，说明MS17-57单抗能与降解后的结合靶蛋白反应，这为后面的抗体免疫共沉淀工作做了准备实验（如图5所示）。
实施例8
亲和纯化后的MS17-57单抗与胃癌细胞株MKN45细胞膜抽提蛋白（事先已包被于美国Fisher Scientific公司的Immunlon-II ELISA反应板中）进行系列酶联结合反应，并在ELISA读板仪上读取OD值和作图。
ELISA结果显示了MS17-57单抗与胃癌MKN45细胞膜抽提蛋白有一定程度的结合反应。与图5的实验一样，MS17-57单抗能与降解后的结合靶蛋白反应，这为后面的抗体免疫共沉淀工作做了准备实验（如图6所示）。
实施例9
亲和纯化后的MS17-57单抗与胎儿胃粘膜上皮转化细胞株GES-1膜蛋白膜抽提蛋白（事先已包被于美国Fisher Scientific公司的Immunlon-II ELISA反应板中）进行系列酶联结合反应，并在ELISA读板仪上读取OD值和作图。
ELISA结果显示了对MS17-57单抗与GES-1细胞膜抽提蛋白有较低的结合反应（如图7所示）。
实施例10
胃粘膜转化细胞GES-1和胃癌细胞BGC823、MKN45经细胞玻片上离心（Cytospin）后在与MS17-57单抗结合的过氧化氢酶染色反应并显示靶点蛋白均分布与细胞膜表面结果（放大倍数分别为40x和100x）的免疫组织化学法反应。
免疫组织化学法检测结果显示了MS17-57单抗能够结合于胃粘膜转化细胞GES-1和胃癌细胞BGC823、MKN45的细胞膜表面上，这也是对MS17-57单抗靶蛋白定位的一个佐证（如图8所示）。
实施例11
间接免疫沉淀法是MS17-57单抗与胃癌细胞膜抽提蛋白反应，抗体的Fc端与Protein-A磁珠特异性结合并洗去非特异性吸附蛋白，然后通过与SDS-PAGE上样缓冲液一起加热解离；直接免疫沉淀法是用MS17-57单抗直接偶联于美国Invitrogen公司（Grand Island，美国纽约州）活化的Dynabeads磁珠上，然后的几步反应与间接免疫沉淀法相同。实践证明对于MS17-57单抗的免疫沉淀法必须要用直接法才能得到特异而清晰的靶点条带。后续的多次高敏质谱分析确定了MS17-57单抗相应的靶点为PALP和/或IALP蛋白。
直接免疫沉淀法的SDS-PAGE变性胶银染色条带显示，MS17-57单抗在BGC823细胞株抽提膜蛋白上只有一条带即IALP蛋白，而在MKN45细胞株抽提膜蛋白上有二条带（即有IALP条带又有PALP蛋白条带），其它残留重、轻链抗体分解条带都在正常的位置上。间接免疫共沉淀法由于方法的放大步骤和过高的敏感性带来了很强的背景和非特异性。（如图9所示，A为非直接免疫沉淀，B为直接免疫沉淀。）
实施例12
qRT-PCR方法:总RNA是用Qiagen（Valencia，美国加州）的RNeasy试剂盒从细胞中提取的。用Invitrogen（Grand Island，美国纽约州）的SuperScript-IIIFirst-Strand试剂盒将mRNA反转录成cDNA。使用Applied BioSystems（Foster City，美国加州）的引物，探针以及TaqMan（Invitrogen）基因表达Master Mix（Invitrogen）扩增,用StepOnePlus仪器（Invitrogen）检测相关的基因。GAPDH作为内参基因同时被检测。
Relative expression=2ΔCt sample (gene of interest-GAPDH)/2ΔCt reference (gene of interest-GAPDH)
通过IALP和PALP分别的qRT-PCR对各种胃癌细胞株的RNA水平表达的分析，IALP在MKN45、SGC7901、AGS和GES-1细胞有不同程度的表达，但是PALP仅在BGC823细胞株表达较高。这些数据与IP和MASS的结果有些吻合，但也存在差异，毕竟是在二个不同RNA和蛋白水平上的观察结果（如图10所示）。
实施例13
采用Dojindo公司（Santa Clara，美国加州）的CCK-8细胞染色计数试剂盒（CellCounting Kit-8）通过每个条件5复孔CCK-8染色的细胞增殖实验，不同的MS17-57单抗剂量控制而加入每个细胞孔中（每孔细胞控制在500个细胞左右），每块板含有各种不同剂量、条件和各5复孔，铺8块板。每天取出一块板进行CCK-8染料对孔内存在的活细胞进行染色反应，在37°C细胞培养箱内孵育4小时后用酶标仪在OD450nm下测定OD值并计算，从而间接证明细胞的增殖情况。
CCK8染料检测结果显示了MS17-57单抗在二个不同剂量下分别对胃癌BGC823（如图11A）和MKN45（如图11B）细胞生长的增值抑制反应。MS17-57单抗对胃癌细胞增殖抑制作用还是非常敏感的，2～3μg/mL的MS17-57单抗浓度即可有显著抑制反应。
实施例14
将胃癌细胞株MKN45铺入不含基质胶的小室内，每个小室铺入50,000个细胞，然后分别以20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和培养基对照液的浓度梯度分别加入MS17-57单抗和同型对照抗体，37°C静置48小时后观察MS17-57单抗抑制胃癌细胞株迁移的作用。实验组与对照组的实验结果显示MS17-57单抗具有抑制胃癌细胞的迁移功能。
结果显示了MS17-57单抗在的Transwell小室中对胃癌细胞MKN45迁移运动有不同浓度梯度而不同程度的抑制作用，同型抗体显示了很好的阴性对照（如图12所示）。
实施例15
如实施例14的实验步骤，将胃癌细胞株BGC823铺入不含基质胶的小室内，每个小室铺入50,000个细胞，然后分别以20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和培养基对照液的浓度梯度分别加入MS17-57单抗和同型对照抗体，37°C静置48小时后观察MS17-57单抗抑制胃癌细胞株迁移的作用。实验组与对照组的实验结果显示MS17-57单抗具有抑制胃癌细胞的迁移功能。
结果显示了MS17-57单抗在的Transwell小室中对胃癌细胞BGC823迁移运动有不同浓度梯度而不同程度的抑制作用，同型抗体显示了很好的阴性对照（如图13所示）。
实施例16
如实施例14的实验步骤，将不同浓度MS17-57单抗作用后的Transwell小室穿膜过的胃癌细胞株BGC823细胞和膜收集和染色，然后在OD450nm下读取光密度值，计算结果和批内误差值后作出此直方图。
结果显示了MS17-57单抗在Transwell小室中对胃癌细胞BGC823迁移运动的抑制作用功能反应并进行了多复孔实验的相对抑制定量计算。结果表明MS17-57单抗可以抑制胃癌细胞BGC823的迁移运动可达到20-30%(如图14所示)。
实施例17
图15A的实验组，对小鼠（裸鼠）注射2.0毫升MS17-57单抗和MKN45细胞混合的PBS液，其包含了50μg/mL的MS17-57单抗（100微克抗体蛋白）和1x106的MKN45细胞，每二周注射一次（腹腔和尾静脉）共3次，初次注射后的第6周将小鼠腹腔打开并观察胃癌细胞MKN45所长出的肿瘤。图-15B的同型单抗对照组，对小鼠（裸鼠）注射2.0毫升同型对照单抗和MKN45细胞混合的PBS液，其包含了50μg/mL的同型对照单抗（100微克抗体蛋白）和1x106的MKN45细胞。每二周注射一次（腹腔和尾静脉）共3次，初次注射后的第6周将小鼠腹腔打开并观察胃癌细胞MKN45所长出的肿瘤；图-15C的空白PBS缓冲液的对照组，对小鼠（裸鼠）注射2.0毫升空白对照PBS缓冲液和MKN45细胞混合液，其也包含了1x106的MKN45细胞，每二周注射一次（腹腔和尾静脉）共3次，初次注射后的第6周将小鼠腹腔打开并观察胃癌细胞MKN45所长出的肿瘤。
结果显示了MS17-57单抗能够抑制胃癌细胞MKN45在小鼠体内肿瘤生长的功能。
实施例18
图16A的实验组，对小鼠（裸鼠）注射2.0毫升MS17-57单抗和BGC823细胞混合的PBS液，其包含了50μg/mL的MS17-57单抗（100微克抗体蛋白）和1x106的BGC823细胞，每二周注射一次（腹腔和尾静脉）共3次，初次注射后的第6周将小鼠腹腔打开并观察胃癌细胞BGC823所长出的肿瘤。图16B的同型单抗对照组，对小鼠（裸鼠）注射2.0毫升同型对照单抗和BGC823细胞混合的PBS液，其包含了50μg/mL的同型对照单抗（100微克抗体蛋白）和1x106的BGC823细胞。每二周注射一次（腹腔和尾静脉）共3次，初次注射后的第6周将小鼠腹腔打开并观察胃癌细胞BGC823所长出的肿瘤；图16C的空白PBS缓冲液的对照组，对小鼠（裸鼠）注射2.0毫升空白对照PBS缓冲液和BGC823细胞混合液，其也包含了1x106的BGC823细胞，每二周注射一次（腹腔和尾静脉）共3次，初次注射后的第6周将小鼠腹腔打开并观察胃癌细胞BGC823所长出的肿瘤。
结果显示了MS17-57单抗能够抑制胃癌细胞BGC823在小鼠体内肿瘤生长的功能。
Figure IDA00002941780800021

Claims (10)

1.一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体，其特征在于：其抗体分子Fab段抗原结合部位的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其抗体分子Fab段抗原结合部位的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的抗细胞表面异位表达的单克隆抗体，其特征在于：其轻链可变区的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示。
3.如权利要求1所述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体，其特征在于：是一种鼠源IgG亚型的免疫球蛋白。
4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗、预防消化道肿瘤的药物中的用途。
5.权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗、预防消化道肿瘤转移药物中的用途。
6.如权利要求4或5所述的用途，所述的消化道肿瘤为小细胞癌、或者腺鳞癌、或者类癌、或者食管癌、或者胃癌、或者十二指肠癌、或者胰腺癌、或者胆管癌、或者胆囊癌、或者肝癌、或者结肠癌、或者结直肠癌。
7.一种检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的一种检测试剂盒，其特征在于：还含有与所述的抗细胞表面异位表达的单克隆抗体结合的标记物，所述的标记物为荧光标记物、或者放射性标记物、或者酶标标记物。
9. 一种药物组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的一种抗细胞表面异位表达的单克隆抗体。
10.如权利要求9所述的一种药物组合物，其特征在于：还包含药学上可接受的载体、赋形剂或混合剂。
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