CN118184785A - Cea抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CEA抗体及其应用。具体地,本发明还描述了编码所述抗体的核酸、包含所述抗体的组合物、制备所述抗体的方法以及使用所述抗体治疗或预防疾病,例如癌症和/或炎性疾病的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地涉及CEA抗体及其应用。
背景技术
胃肠道肿瘤对于人类生命是一个很大的威胁,虽然手术治疗、放化疗、介入治疗等治疗手段对于该类肿瘤有一定疗效,但患者生存率仍无显著改善。目前,备受关注的治疗性抗体以及CAR-T细胞治疗技术有望成为治疗的突破口。
癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一种酸性糖蛋白,最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中,后被证实广泛存在于内胚叶起源的消化***肿瘤,比如胃癌、肝癌、胰腺癌(超75%)、结直肠癌(60%),同时可在多种肿瘤患者血清中出现,属于临床上很常用的一项肿瘤标志物,在临床上主要用于辅助恶性肿瘤的诊断、判断预后、监测疗效和肿瘤复发等。
值得注意的是,除低表达于肠上皮细胞外,CEA几乎不在其他正常细胞中表达。因此,它被认为是实体肿瘤极具治疗潜力的一个靶点。
因此,本领域亟需开发具有更大抗癌潜力、更低毒性、更低用药剂量的针对CEA的治疗性抗体,从而有效地治疗多种实体肿瘤。
发明内容
本发明提供了一类CEA抗体及其应用
在本发明的第一方面,提供了一种CEA抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下组的重链可变区的三个互补决定区CDR(HCDR)和轻链可变区的三个互补决定区CDR(LCDR):
(1)SEQ ID NO:2所示的HCDR1,
SEQ ID NO:3所示的HCDR2,
SEQ ID NO:4所示的HCDR3,
SEQ ID NO:6所示的LCDR1,
SEQ ID NO:7所示的LCDR2,
SEQ ID NO:8所示的LCDR3;
(2)SEQ ID NO:12所示的HCDR1,
SEQ ID NO:3所示的HCDR2,
SEQ ID NO:13所示的HCDR3,
SEQ ID NO:15所示的LCDR1,
SEQ ID NO:16所示的LCDR2,
SEQ ID NO:8所示的LCDR3;
(3)SEQ ID NO:20所示的HCDR1,
SEQ ID NO:21所示的HCDR2,
SEQ ID NO:22所示的HCDR3,
SEQ ID NO:24所示的LCDR1,
SEQ ID NO:25所示的LCDR2,
SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在另一优选例中,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下组的序列:
(1)重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(2)重链可变区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;
(3)重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列,并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列;。
在另一优选例中,所述抗体或其抗原结合片段的重链还包括重链恒定区;所述抗体或其抗原结合片段的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中,所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中,所述的重链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中,所述的轻链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中,所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中,所述抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述抗体还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。
在本发明的第二方面,提供了一种重组蛋白,所述重组蛋白具有:
(i)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段;以及
(ii)任选地协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中,所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中,所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中,所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在本发明的第三方面,提供了一种多核苷酸分子,所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中,所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:9、10、17、18、27、或28所示的序列。
在本发明的第四方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在另一优选例中,所述的载体为真核表达载体。
在本发明的第五方面,提供了一种工程化的细胞,含有如本发明第四方面述的载体或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子、或表达如本发明第一方面所述的CEA抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中,所述细胞为真核细胞或原核细胞。
在另一优选例中,所述细胞为免疫细胞,且其表面同时表达有一嵌合抗原受体。
在另一优选例中,所述的免疫细胞为T细胞、NK细胞或其组合。
在另一优选例中,所述免疫细胞为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。
在另一优选例中,所述嵌合抗原受体选自下组:CEA、Mesothelin、GPC3、NKG2D、MUC1或其组合。
在本发明的第六方面,提供了一种免疫偶联物,所述免疫偶联物含有:
(a)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中,所述偶联物选自:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物含有:
(i)如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第六方面所述的免疫偶联物;以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中,所述的药物组合物用于制备***的药物,所述的肿瘤选自下组:胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、结肠癌、***癌、口腔癌、喉癌、扁桃体癌、或其组合。
在本发明第八方面,提供了如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第六方面所述的免疫偶联物的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;
所述试剂、检测板或试剂盒用于:检测样品中CEA蛋白;
所述药剂用于治疗或预防表达CEA蛋白的肿瘤。
在另一优选例中,所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
在另一优选例中,所述的药物组合物用于制备***的药物,所述的肿瘤选自下组:胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、结肠癌、***癌、口腔癌、喉癌、扁桃体癌、或其组合。
在本发明的第九方面,提供了一种检测样品中CEA蛋白的方法,所述方法包括步骤:
(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在CEA蛋白。
在另一优选例中,所述样品包括:人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。
在另一优选例中,所述方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中,所述方法为体外方法。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤,(3)分析抗体和抗原的亲和力。
在本发明的第十方面,提供了一种检测板,所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条,所述的测试条含有如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或如本发明第六方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中,所述的测试条还含有抗原点样区。
在另一优选例中,所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。
在本发明的第十一方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒中包括:
(1)第一容器,所述第一容器中含有如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段;和/或
(2)第二容器,所述第二容器中含有抗如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的二抗;和/或
(3)第三容器,所述第三容器中含有细胞裂解试剂;
或者,
所述试剂盒含有如本发明第十方面所述所述的检测板。
在另一优选例中,所述第一容器中的抗体带有可检测标记。
在另一优选例中,所述第二容器中的抗体带有可检测标记。
在本发明的第十二方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的PD-1抗体或其抗原结合片段的方法,包括在适合产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下,培养包含编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞,并从细胞或培养物中回收抗体或抗原结合片段。
在本发明的第十三方面,提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化的细胞的方法,包括以下步骤:将本发明第三方面所述的多核苷酸分子或本发明第四方面所述的载体转导入细胞内,从而获得所述工程化的细胞。
在另一优选例中,所述的细胞为免疫细胞。
在另一优选例中,所述的免疫细胞为T细胞、NK细胞或其组合。
在另一优选例中,所述免疫细胞为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞在本发明的第十四方面,提供了一种重组多肽的制备方法,所述方法包含:
(a)在适合表达的条件下,培养如本发明第五方面所述的细胞;
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十五方面,提供了一种预防和/或治疗疾病的方法,包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明第一方面所述的CEA抗体或其抗原结合片段、本发明第五方面所述的工程化的细胞、或本发明第七方面所述的药物组合物。
在另一优选例中,所述疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中,所述癌症或肿瘤选自下组:血液肿瘤、淋巴瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中,所述血液肿瘤选自下组:急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中,所述淋巴瘤选自下组:霍奇金淋巴瘤(HL),弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白细胞(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)以及其他复杂B细胞非霍奇金淋巴瘤。
在另一优选例中,所述实体瘤选自下组:胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、***、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、***、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。
在本发明的第十六方面,提供了一种免疫检测点抑制剂,所述抑制剂含有本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了通过FACS检测的三免后小鼠血清与CHO-CEA细胞的结合情况。
图2显示了通过FACS检测的四免后小鼠血清与CHO-CEA细胞的结合情况。
图3显示了通过ELISA检测四免后小鼠血清的TMB显色情况。
图4显示了通过FACS检测的筛选阳性结果较好的孔。
图5显示了通过FACS检测的CEA-10-1E6阳性亚克隆检测结果。
图6显示了通过FACS检测的CEA-10-2D10阳性亚克隆检测结果。
图7显示了通过FACS检测的CEA-10-2E7阳性亚克隆检测结果。
图8显示了通过FACS检测的CEA-10-4G4阳性亚克隆检测结果。
图9显示了通过FACS检测的CEA-10-5C7阳性亚克隆检测结果。
图10显示了通过FACS检测的CEA-10-5H2阳性亚克隆检测结果。
图11显示通过流式分析的CEA-10-1E6、CEA-10-2D10和CEA-10-5H2重组抗体的表达鉴定结果。
图12显示了通过流式分析的CEA-10-2E7和CEA-10-5H2重组抗体的表达鉴定结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量筛选,意外地发现一类抗CEA单克隆抗体,具体包括CEA-10-1E6、CEA-10-2D10和CEA-10-2E7。实验结果表明,本发明的单克隆抗体特异性高、亲和力强,能够特异性结合CEA。在此基础上完成了本发明。
CEA
癌胚抗原(CEA)是一种非特异性血清生物标志物,最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中,后被证实广泛存在于内胚叶起源的消化***肿瘤,比如胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、以及甲状腺髓样癌、乳腺癌、黏液性卵巢癌、肺癌等。
CEA是一种分子量为200kDa的糖蛋白,通常来源于胎儿的胚胎内胚层上皮,受胎儿癌基因控制。它通常在出生后从血清中消失;然而,少量CEA可能残留在结肠组织中。CEA和相关基因构成了人类CEA家族,并聚集在染色体19q13.2上。
目前,CEA是临床常见的广谱肿瘤标志物,广泛用于结肠癌、直肠癌、胃癌、肺癌等多个肿瘤的鉴别诊断、病情监测及预后评估,由于它与各种类型的恶性和非恶性疾病有关,升高的血清CEA不是癌症起源的特定部位的确定标志物。因此,其常与其他指标联合筛查,例如CEA联合CA199,指标均升高则提示患胰腺癌、胆囊癌等的风险较高。
CEA是癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAMs)家族成员之一,CEACAMs是一类细胞表面糖蛋白家族,共包含12个家族成员,该家族成员在正常组织和肿瘤组织中表达不同。其中CEA糖蛋白与肿瘤发展关系最为密切,其在肿瘤进展、转移、血管生成和炎症过程发挥重要作用。
CEA分子属于免疫球蛋白超家族黏附分子,蛋白质分子N端有108个氨基酸组成的免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域和0-6个免疫球蛋白恒定区(IgC)2型样结构域。CEA通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接在细胞膜上。CEACAMs参与许多病理生理过程,如吞噬作用、增殖、信号转导、细胞黏附和肿瘤抑制等。CEA目前正在被作为各种癌症导向治疗的靶点进行研究。
术语
在本发明中,术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用,都指特异性结合CEA蛋白的抗体,例如具有重链可变区(如SEQ ID NO:1、11或19的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO:5、14、或23的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
优选地,本发明的抗体编号以及对应的序列编号如下表1所示。
表1
抗体编号 | VH | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | VL | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 |
CEA-10-1E6-1C1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
CEA-10-2D10-1E7 | 11 | 12 | 3 | 13 | 14 | 15 | 16 | 8 |
CEA-10-2E7-1B6 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 |
注:表中各个数值表示序列编号,即“1”表示“SEQ ID NO:1”,表中显示的VH、HCDR1、HCDR2、HCDR3、VL、LCDR1、LCDR2、LCDR3的序列编号为其氨基酸序列的编号。
优选地,本发明的CEA-10-1E6-1C1抗体具有如SEQ ID NO:1所示的重链序列和SEQID NO:5所示的轻链序列;CEA-10-2D10-1E7抗体具有如SEQ ID NO:11所示的重链序列和SEQ ID NO:14所示的轻链序列;CEA-10-2E7-1B6抗体具有如SEQ ID NO:19所示的重链序列和SEQ ID NO:23所示的轻链序列。
在另一优选例中,所述的抗体为抗CEA蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体,它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地,所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地,本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣,因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此,本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子,只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有CEA蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽,如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了本发明抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中,“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表2进行氨基酸替换而产生。
表2
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:SEQ ID NO.:9、10、17、18、27和/或28所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列,但与SEQ ID NO:SEQ ID NO.:9、10、17、18、27和/或28所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1% Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:1-16、19-26所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用,也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素(Koppe等,2005,癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24,539);2.生物毒(Chaudhary等,1989,自然(Nature)339,394;Epel等,2002,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51,565);3.细胞因子如IL-2等(Gillies等,1992,美国国家科学院院刊(PNAS)89,1428;Card等,2004,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53,345;Halin等,2003,癌症研究(Cancer Research)63,3202);4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等,2005,癌症通信(Cancer letters)239,36;Huang等,2006,美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128,2115);5.病毒颗粒(Peng等,2004,基因治疗(Gene therapy)11,1234);6.脂质体(Mamot等,2005,癌症研究(Cancerresearch)65,11631);7.纳米磁粒;8.前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL));10.化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
抗体
如本文所用,术语“抗体”指免疫球蛋白,是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同,故其抗原性也不同。据此,可将免疫球蛋白分为五类,或称为免疫球蛋白的不同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类,由于化学结构和生物功能差异,它又可以分为4个子类:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大,为可变区(V区);靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性,又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成,从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区,即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3;重链的3个CDR区,即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则,或者符合Chothia和IMGT的编号规则。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用,术语“抗原结合片段”,指具有抗原结合活性的Fab片段,Fab'片段,F(ab')2片段,或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区,但没有恒定区,并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的,Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头,且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合片段的非限制性例子包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab')2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)scFv分子;(vi)dAb片段;和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如,独立的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。如本文所用,表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子,如结构域特异性抗体,单结构域抗体,结构域缺失抗体,嵌合抗体,CDR移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米体(例如单价纳米体、双价纳米体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR域。
如本文所用,术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的,除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的,不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗CEA蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗CEA蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体,以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地,本发明包括具有含超变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
如本领域技术人员所知,免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗CEA蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗CEA蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab或(Fab’)2片段;抗体重链;抗体轻链。
如本文所用,术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因,然后***载体,转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力,又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。
如本文所用,术语“人源化抗体”,是本发明鼠抗的一种可变区改造形式,具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区,和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区;即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用,所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。
在本发明中,抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗,比如,所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合CEA蛋白分子,因而可用于预防和治疗CEA相关疾病。此外,还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
缩略词
CDR:互补决定区
FR:抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH:抗体重链可变区
VL:抗体轻链可变区
IgG:免疫球蛋白G
Kabat:由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号***
Chothia:由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号***
IMGT:基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息***的编号***
ELISA:酶联免疫吸附
FACS:流式细胞技术
PCR:聚合酶链式反应
LS174t细胞:是一种人结肠腺癌细胞,是LS180结肠腺癌细胞株的胰蛋白酶化变种。它相较于亲本细胞更易传代,并能生成大量的癌胚抗原(CEA)。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明针对CEA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株;优选的,本发明提供了高效价的针对CEA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在获得生产本发明的CEA蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后,本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外,本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区),然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,本发明抗原,可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体,可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞,包括骨髓瘤细胞株,例如鼠类的骨髓瘤细胞株,包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection,洛克维尔,马里兰,美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications),51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生,如,通过体外结合分析例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后,可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned),并通过标准方法生长(Goding,单克隆抗体(MonoclonalAntibodies):原则和实践(Principles and Practice),Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括,例如,DMEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离,这些纯化工艺为例如,蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种针对CEA蛋白的单克隆抗体,特别是针对CEA蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液,经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(ProteinG-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内,10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水,经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
标记的免疫球蛋白
在本发明的一个优选例中,所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地,所述的标记物选自下组:胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中,CEA蛋白的单克隆抗体用胶体金标记,得到胶体金标记的单克隆抗体。
本发明的CEA蛋白单克隆抗体具有很好的特异性,很高的效价。
方法和样本
本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测肿瘤的方法。该方法步骤大致如下:获得细胞和/或组织样本;将样本溶解在介质中;检测在所述溶解的样本中CEA蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本,正如在液基细胞检测法中所使用的。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明进一步设计用于检测CEA水平的检测试剂盒,该试剂盒包括识别CEA蛋白的抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明的抗体特异性高,亲和力强,并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。
(2)本发明的抗体可以用于特异性靶向CEA阳性肿瘤细胞的靶向性药物,抗体药物偶联物或多功能抗体。
(3)本发明的抗体可以用于制备诊断肿瘤的试剂或用于制备嵌合抗原受体免疫细胞。
(4)本发明的抗体可以作为嵌合抗原受体免疫细胞共同表达的分泌型抗体,作用于局部肿瘤。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
抗CEA抗体制备
本实施例的主要技术方案如下:
1.对小鼠实施四次DNA免疫+1次细胞冲击免疫,间隔两周。其中,DNA是指人CEADNA,所用细胞为CHO-CEA(即表达CEA的CHO细胞)。
2.使用CHO-CEA(表达CEA的CHO细胞)细胞进行FACS筛选。
按照以下实验步骤进行:
1.免疫小鼠
按照表3的方案对实验小鼠进行免疫:
表3免疫小鼠的时间方案
小鼠ID | 一免 | 二免 | 三免 | 四免 | 冲击免疫 |
CEA-A-01 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | 2020/12/04 |
CEA-A-02 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | |
CEA-A-03 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | 2020/12/04 |
CEA-A-04 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | |
CEA-A-05 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | |
CEA-A-06 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | |
CEA-A-07 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | |
CEA-A-08 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | 2020/12/04 |
CEA-A-09 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | |
CEA-A-10 | 2020/09/08 | 2020/09/22 | 2020/10/10 | 2020/10/23 | 2020/12/04 |
其中,一免:CEA-A-01-10每只小鼠均进行DNA免疫(60μg DNA,肌肉注射);二免:CEA-A-01-10每只小鼠均进行DNA免疫;三免:CEA-A-01-10每只小鼠均进行DNA免疫;四免:CEA-A-01-10每只小鼠均进行DNA免疫;冲击免疫:CEA-A-01、03小鼠冲击免疫蛋白抗原。
2.血清检测
(1)流式检测:
1)分装适量的CHO-CEA(或LS174t)细胞于1.5mL Ep管中,4000rpm,5min,吸弃上清。
2)50μL由PBS1:100稀释的血清重悬上述细胞,4℃静置15min。
3)4000rpm,5min,吸弃上清。
4)50μL由PBS1:500稀释的Goat anti-mouseIgGFc-FITC重悬上述细胞,4℃静置15min。
5)同步骤3。
6)200μL PBS重悬细胞,FACS分析。
三免后的小鼠血清通过FACS检测其与CHO-CEA的结合情况如图1所示。结果显示,10只小鼠三免后均检测不到明显的免疫反应,四免后再进行检测,同时使用ELISA进行检测。
四免后的小鼠血清通过FACS检测其与CHO-CEA的结合情况如图2所示。结果显示,使用CHO-CEA细胞检测四免后血清均检测不到明显的免疫反应,使用LS174t细胞均可以检测出较好的免疫反应。
(2)ELISA检测
四免后的小鼠血清通过ELISA检测,实验材料和条件如表3所示。
表3
TMB显色结果如图3所示,OD450读书如表4所示。
表4
由结果可知,使用蛋白抗原进行检测结果良好,选择CEA-A-01,03小鼠进行冲击免疫融合。
3.融合
在冲击免疫两周后,将小鼠的B淋巴细胞分别与骨髓瘤细胞进行融合,得到对应的杂交瘤细胞。
4.融合后筛选
(1)FACS检测筛选:每只小鼠各铺种5块96孔板(12*8个孔,1-8对应行号,A-H对应列号,如表1),分别编号为1、2、3、4、5,进行FACS检测。
表5初筛结果
检测结果如图4和表5所示,根据检测结果,选择CEA-10-1E6、CEA-10-2D10、CEA-10-2E7、CEA-10-4G4、CEA-10-5C7、CEA-10-5H2进行亚克隆。
(2)亚克隆筛选
经FACS检测,结果如图5-10所示。结果显示,CEA-10-1E6、CEA-10-2D10、CEA-10-2E7、CEA-10-4G4、CEA-10-5C7、CEA-10-5H2均亚克隆成功。
5.亚克隆建株
经上述FACS检测,优选的阳性亚克隆汇总于表6。
表6优选阳性亚克隆汇总结果
克隆号 | 亚克隆号 | 亚型 |
CEA-10-1E6 | 1C1 | IgG1 |
CEA-10-2D10 | 1E7、1A2、1E1、1G11 | IgG1 |
CEA-10-2E7 | 1D9、1B6、1G10 | IgG2b |
CEA-10-4G4 | 1A2、1C1、1C7 | IgG1 |
CEA-10-5C7 | 1C10、1A5、1A11、1C3 | IgG1 |
CEA-10-5H2 | 1A12、1A2、1A1、1C11 | IgG1 |
实施例2
2.1重组CEA抗体的构建
对从实施例1中的选定的优选阳性亚克隆抗体为:CEA-10-1E6-1C1、CEA-10-2D10-1E7、CEA-10-5H2-1A12、CEA-10-2E7-1B6,这些克隆根据融合后杂交瘤细胞上清在LS174t细胞上的流式阳性结果进行了亚克隆。
并对其进行抗体序列和亚型分析。
首先,对确定的以上亚克隆(CEA-10-2E7-1B6等)进行抗体序列和亚型分析。
具体实验步骤如下:
(1)分装LS174t细胞于1.5mL EP管中。
(2)4000rpm离心5min,弃上清。
(3)取50μL杂交瘤上清重悬细胞,4℃静置15min。
(4)4000rpm离心5min,弃上清。
(5)取50μL 1:200稀释的Goat anti-mouse IgG1-FITC,Goat anti-mouse IgG2a-FITC和Goat anti-mouse IgG2b-FITC重悬上述细胞,4℃静置15min。
(6)4000rpm离心5min,弃上清。
(7)300μL PBS重悬细胞,流式分析。
流式分析结果如表7所示。结果显示:CEA-10-2E7-1B6抗体亚型为IgG2b。
使用毛细管电泳的Sanger法进行抗体基因测序。
关于CEA-10-1E6-1C1、CEA-10-2D10-1E7、CEA-10-5H2-1A12、CEA-10-2E7-1B6抗体的详细情况汇总于表7中。
表7抗体的亚型及基因序列
克隆号 | 亚型 | 重链 | 轻链 |
CEA-10-1E6-1C1 | IgG1 | IGHV14-4 | IGKV4-57 |
CEA-10-2D10-1E7 | IgG1 | IGHV14-4 | IGKV4-57 |
CEA-10-5H2-1A12 | IgG1 | IGHV3-6 | IGKV3-2 |
CEA-10-2E7-1B6 | IgG2b | IGHV2-9 | IGKV10-96 |
CEA-10-1E6-1C1的重链IGHV14-4序列如SEQ ID NO:9(DNA)以及SEQ ID NO:1(氨基酸)所示。
CEA-10-1E6-1C1的轻链IGKV4-57序列如SEQ ID NO:10(DNA)以及SEQ ID NO:5(氨基酸)所示。
CEA-10-2D10-1E7的重链IGHV14-4序列如SEQ ID NO:17(DNA)以及SEQ ID NO:11(氨基酸)所示。
CEA-10-2D10-1E7的轻链IGKV4-57序列如SEQ ID NO:18(DNA)以及SEQ ID NO:14(氨基酸)所示。
CEA-10-2E7-1B6的重链IGHV2-9序列如SEQ ID NO:27(DNA)以及SEQ ID NO:19(氨基酸)所示。
CEA-10-2E7-1B6的轻链IGKV10-96序列如SEQ ID NO:28(DNA)以及SEQ ID NO:23(氨基酸)所示。
2.2重组抗体的表达验证
具体步骤如下:将编码CEA-10-1E6-1C1、CEA-10-2D10-1E7、CEA-10-2E7-1B6抗体的重链可变区和轻链可变区核苷酸序列分别克隆到pCAG真核表达载体中,得到分别表达抗体重链可变区和轻链可变区的重组表达载体。
将10μg轻重链表达载体使用磷酸钙方法共转进入10cm培养皿中的293T细胞,三天后收集上清,在LS174t细胞中进行FACS验证。
FACS验证实验包括以下步骤:
(1)分装LS174t细胞于1.5mL EP管中。
(2)4000rpm离心5min,弃上清。
(3)取50μL293T细胞转染上清重悬细胞,4℃静置15min。
(4)4000rpm离心5min,弃上清。
(5)取50μL 1:200稀释的Goat anti-mouse IgG Fc-FITC重悬上述细胞,4℃静置15min。
(6)4000rpm离心5min,弃上清。
(7)300μL PBS重悬细胞,流式分析。
FACS验证结果如图11-12所示。结果显示,CEA-10-1E6-1C1、CEA-10-2D10-1E7、CEA-10-2E7-1B6转染上清结果信号较好,序列正确。而CEA-10-5H2-1A12信号稍差,后在此进行转染验证后,信号仍然较差。
本发明的序列信息如表8所示。
表8
/>
/>
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种CEA抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下组的重链可变区的三个互补决定区CDR(HCDR)和轻链可变区的三个互补决定区CDR(LCDR):
(1)SEQ ID NO:2所示的HCDR1,
SEQ ID NO:3所示的HCDR2,
SEQ ID NO:4所示的HCDR3,
SEQ ID NO:6所示的LCDR1,
SEQ ID NO:7所示的LCDR2,
SEQ ID NO:8所示的LCDR3;
(2)SEQ ID NO:12所示的HCDR1,
SEQ ID NO:3所示的HCDR2,
SEQ ID NO:13所示的HCDR3,
SEQ ID NO:15所示的LCDR1,
SEQ ID NO:16所示的LCDR2,
SEQ ID NO:8所示的LCDR3;
(3)SEQ ID NO:20所示的HCDR1,
SEQ ID NO:21所示的HCDR2,
SEQ ID NO:22所示的HCDR3,
SEQ ID NO:24所示的LCDR1,
SEQ ID NO:25所示的LCDR2,
SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段具有选自下组的序列:
(1)重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(2)重链可变区具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;
(3)重链可变区具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列,并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列;。
3.一种重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白具有:
(i)如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段;以及
(ii)任选地协助表达和/或纯化的标签序列。
4.一种多核苷酸分子,其特征在于,所述多核苷酸编码如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。
5.一种载体,其特征在于,所述载体含有如权利要求4所述的多核苷酸分子。
6.一种工程化的细胞,其特征在于,含有如权利要求5述的载体或基因组中整合有如权利要求4所述的多核苷酸分子、或表达如权利要求1所述的CEA抗体或其抗原结合片段。
7.一种免疫偶联物,其特征在于,所述免疫偶联物含有:
(a)如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
8.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物含有:
(i)如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求3所述的重组蛋白、或如权利要求7所述的免疫偶联物;以及
(ii)药学上可接受的载体。
9.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段、如权利要求3所述的重组蛋白、或如权利要求7所述的免疫偶联物的用途,其特征在于,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;
所述试剂、检测板或试剂盒用于:检测样品中CEA蛋白;
所述药剂用于治疗或预防表达CEA蛋白的肿瘤。
10.一种检测样品中CEA蛋白的方法,所述方法包括步骤:
(1)将样品与如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在CEA蛋白。
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