CN103119152B

CN103119152B - Spnk菌株

Info

Publication number: CN103119152B
Application number: CN201180034360.8A
Authority: CN
Inventors: 韩蕾
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2031-05-11
Also published as: IL222821A0; KR20130080007A; US20110281359A1; RU2012153212A; WO2011143291A1; JP2013531976A; TW201201700A; MX2012013099A; EP2569414A1; BR112012028860A2; RU2580015C2; AU2011250904A1; CA2798886A1; CN103119152A; MX342130B

Abstract

本发明包括多杀菌素生物合成基因、用生物合成基因转化的产生多杀菌素的微生物、使用生物合成基因提高多杀菌素杀昆虫大环内酯的产生的方法，和使用基因或基因片段改变由产生多杀菌素的微生物产生的产物的方法。另外，本发明包括将产生多杀菌素A和D的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体多杀菌素J和L的菌株的方法和组合物。

Description

SPNK菌株

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2010年5月11日提交的美国临时专利申请61/333,540的权益，将其全部内容并入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及破坏基因表达的分子遗传学的技术领域。更具体地，已经发现，在spnK基因中的突变将产生多杀菌素(Spinosad)的菌株转化成产生乙基多杀菌素(spinetoram)前体的菌株。

背景技术

如美国专利5,362,634中所披露，发酵产物A83543是由刺糖多孢菌(SaccharopolySpora spinosa)产生的相关化合物的家族。已将该家族的已知成员称为因子或组分，并且各自给予标识字母代号。将这些化合物在下文中称为多杀菌素A、B等。多杀菌素化合物可用于控制蜘蛛、线虫和昆虫，具体地，鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)物种，它们在环境上相当友好并且具有吸引人的毒理学特征。

天然产生的多杀菌素化合物由以下物质组成：与12元大环内酯稠合的5,6,5-三环环系、中性糖(鼠李糖)和氨基糖(forosamine)(见Kirst等人(1991))。如果氨基糖不存在，则将所述化合物称为A、D等的拟甙元，以及如果中性糖不存在，则将所述化合物称为A、D等的反拟甙元。更优选的命名是将拟甙元称为多杀菌素A17-Psa、多杀菌素D17-Psa等，以及将反拟甙元称为多杀菌素A9-Psa、多杀菌素D9-Psa等。

天然产生的多杀菌素化合物可由培养物NRRL18395、18537、18538、18539、18719、18720、18743和18823经发酵产生。这些培养物已经进行保藏，并成为美国北方农业研究所保藏中心(the Midwest Area NorthernRegional Research Center,Agricultural Research Service,United StatesDepartment of Agriculture,1815North University Street,Peoria,Ill.,61604)的储备培养物收集的一部分。

美国专利5,362,634和相应的欧洲专利申请375316A1涉及多杀菌素A、B、C、D、E、F、G、H和J。这些化合物据说通过培养选自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539的新型微生物刺糖多孢菌的菌株产生。

WO93/09126涉及多杀菌素L、M、N、Q、R、S和T。其中还讨论了两种产生多杀菌素J的菌株：NRRL18719和NRRL18720，和产生多杀菌素Q、R、S和T的菌株：NRRL18823。

WO94/20518和美国专利5,6704,486涉及多杀菌素K、O、P、U、V、W和Y，及其衍生物。还讨论了产生多杀菌素K的菌株NRRL18743。

产生多杀菌素化合物的挑战来自以下事实：需要非常大的发酵体积产生非常少量的多杀菌素。高度希望提高多杀菌素产生效率并由此提高多杀菌素实用性，同时降低成本。

还有利的是提供克隆的生物合成基因，所述克隆的生物合成基因提供产生新的可具有不同杀昆虫活性范围的多杀菌素衍生物的方法。新衍生物是需要的，因为尽管已知多杀菌素抑制广谱的昆虫，但是它们不控制全部害虫。不同的控制模式(patterns of control)可通过多杀菌素的生物合成中间体，或者通过它们在体内产生的衍生物，或者通过它们的体外化学修饰得到的衍生物提供。

还有利的是提供通过刺糖多孢菌的突变菌株合成的新型中间体，其中编码多杀菌素生物合成酶的某些基因的一些部分被已经进行体外特异性突变的相同基因的一些部分代替，或者被来自其它有机体的基因的相应部分代替。

发明内容

本发明提供将产生多杀菌素的菌株如多杀菌素A和D转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株如多杀菌素J和L的方法。这种方法可包括在spnK基因中进行修饰，以消除3′-O-甲基转移酶活性。所述修饰可通过符合读框的缺失、突变、取代、删除、***等进行。所述符合读框的缺失可在整个基因内进行，包括删除5′端、3′端或编码spnK的区域。一个这种符合读框的缺失可包括SEQ.ID.NO.9。点突变可包括但不限于在以下位置的突变：碱基对528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131。这些突变可在spnK基因的翻译中导致变化。这种变化可为氨基酸变化、取代或产生终止密码子。与多杀菌素A和D相比，这种修饰导致多杀菌素J和L的多杀菌素化合物产生。

本发明的具体方法包括通过使spnK基因失效(disabling)同时维持多杀菌素J和L产生而将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株。正常spnK蛋白活性的失效或破坏可通过符合读框的缺失、突变、取代、删除、***等进行。它也可通过操作启动子或核糖体结合位点序列实现。

本发明还提供产生乙基多杀菌素前体的遗传修饰的宿主细胞。这种遗传修饰的宿主可通过以下方法产生：修饰spnK基因以消除3′-O-甲基转移酶活性。所述修饰可通过符合读框的缺失、突变、取代、删除、***等进行。符合读框的缺失可包括删除5′端、3′端或删除编码spnK的区域。

通过修饰spnK基因以消除3′-O-甲基转移酶活性，本发明还提供将产生多杀菌素的菌株转化成产生多杀菌素前体的菌株的方法。这种方法可包括符合读框的缺失、点突变、删除和***。这种符合读框的缺失可包括符合读框的缺失5′端，符合读框的缺失3′端和符合读框的缺失编码spnK的区域。删除可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除。***可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。点突变可发生在碱基对位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131处。这些点突变可在spnK基因的活性位点或底物结合位点处导致氨基酸取代。

本发明还包括通过在spnK基因中产生修饰以消除3′-O-甲基转移酶活性而产生乙基多杀菌素前体的遗传修饰的宿主细胞，其中所述遗传修饰的宿主细胞为通常不产生大量乙基多杀菌素前体的原核宿主细胞。其它实施方案包括通过使spnK基因失效同时维持多杀菌素J和L产生而将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株的方法。这种方法可包括符合读框的缺失、点突变、删除和***。所述符合读框的缺失可包括符合读框的缺失5′端，符合读框的缺失3′端和符合读框的缺失编码spnK的区域。所述删除可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除。***可包括破坏spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。点突变可发生在碱基对位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131处。这些点突变可在spnK基因的活性位点或底物结合位点处导致氨基酸取代。使spnK失效的其它方法可通过操作核糖体结合位点或者通过操作spnK基因的启动子实施。

附图说明

图1示出spnK点突变的位置。突变在spnK的野生型序列(SEQ ID NO:17)中突出显示。

图2示出spnJ、spnK、spnL和spnM的物理图谱。产生的PCR产物通过线在染色体图下面指出。

图3示出根据本发明实施方案作为单交换同源重组将spnK符合读框的缺失构建体整合在spnLM区域中。(星号指出spnJ和spnM的不完全编码序列)。

图4示出根据本发明实施方案的双交换突变物，其导致spnK基因的删除。PCR片段的大小和DNA序列表明了spnK基因的符合读框的缺失。

图5为根据本发明实施方案在spnK中含有框内阿泊拉霉素(apramycin)抗性基因盒(aac(3)IV)的***盒的图解。

图6示出核糖体结合位点(标为Shine-Dalgarno)，其位于根据本发明实施方案的编码spnK的序列(SEQ ID NO:16)的上游。该序列在图中突出显示。

具体实施方式

克隆的刺糖多孢菌DNA有许多用途。克隆的基因可用于改善多杀菌素收率和产生新的多杀菌素。改善的收率可通过以下方法得到：向特定菌株的基因组中整合在该菌株中限速的任何酶的基因的复制拷贝。在生物合成途径在特定突变菌株中由于缺乏需要的酶而阻断的情况中，需要的多杀菌素的产生可通过以下方法恢复：整合需要的基因的拷贝。在生物合成途径被破坏的情况中，可生成不同的前体菌株。更具体地，与多杀菌素A和D产生相比，spnK基因的破坏可导致多杀菌素J和L产生。

可使用克隆的DNA的片段破坏多杀菌素的生物合成中的步骤来产生新型多杀菌素。这种破坏可导致前体或“支路”(shunt)产物(前体的天然处理的衍生物)的积聚。在实施破坏中可用的片段是从基因的5′和3′端以及在整个基因中省略碱基的基因的内部片段。使用该片段的同源重组事件导致基因的两个部分拷贝：一个缺少省略的5′端碱基以及另一个缺少省略的3′端碱基。在片段的每个末端省略的碱基数目必须足够大，使得基因的任一部分拷贝均不保留活性。

本申请使用以下定义并应参考这些定义来解释权利要求和说明书。除非另有说明，将本申请引用的全部美国专利和美国专利申请的全部内容并入本文作为参考。

本申请在本发明的要素或组分前所用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”意在关于该要素或组分的发生(即，出现)次数而言是非限制性的。因此，“一个”或“一种”应理解为包括一或者至少一个(种)，并且所述要素或者组分的单数形式也包括复数，除非数字明显是指单数的。

本申请所用的术语“包含”和“包括”是指存在如权利要求中所述的特性、整数、步骤或者组分，但是它并不排除存在或者加入一种或多种其它特性、整数、步骤、组分或它们的组。这意味着“包含”或“包括”一列要素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或者装置不仅仅限于这些要素，而是可包括未清楚列出的或者其固有的其它要素。本申请所用的“或”是指兼取的和择一的“或者”。例如，下面任一种满足A或B：A为是(或存在)而B为否(或不存在)，A为否(或不存在)而B为是(或存在)，以及A和B均为是(或存在)。

本申请所用术语“约”修饰本发明的或者所使用的成分或反应物的数量，其是指，例如通过在现实世界中用于配制浓缩物或者使用溶液的典型的测量和液体处理步骤；通过这些操作中非故意的失误；通过在用于制备组合物或实施方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等可出现的数量差异。术语“约”还涵盖因由具体初始混合物得到的组合物的不同平衡条件引起的不同的量。不论被术语“约”修饰与否，权利要求都包括这些数量的等价物。

本申请所用术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，其意在涵盖所有如说明书所描述和权利要求所述的可能的变体。

本申请所用的术语“多肽”和“肽”可互换使用，指两个或更多个氨基酸通过肽键连接在一起的聚合物。一方面，该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化，等等。包括在该定义内的是例如，包含一个或多个氨基酸类似物或者标记氨基酸的肽以及肽模拟物。肽可包含L-氨基酸。

本申请所用的术语“感兴趣的肽”、“POI”、“基因产物”、“目标基因产物”和“目标编码区基因产物”是指通过重组表达的外源基因编码的所期望的异源肽/蛋白质产物。感兴趣的肽可包括任何肽/蛋白质产物，包括但不限于蛋白质、融合蛋白、酶、肽、多肽和寡肽。感兴趣的肽的大小为2~398个氨基酸。

本申请所用术语“遗传构建体”是指可用于调节生物体的基因型或表型的一系列连续的核酸。遗传构建体的非限制性实例包括但不限于核酸分子，以及开放阅读框架、基因、表达盒、载体、质粒等。

本申请所用术语“内源基因”是指在生物体的基因组中处于其天然位置的天然基因。

本申请所用“外源基因”是指通常不见于宿主生物体中的基因，但是其通过基因转移引入宿主生物体中。外源基因可包括***非天然生物体中的天然基因，或者嵌合基因。

本申请在具体的生物体/基因组中针对序列的术语“异源”表示该序列源于外源物种，或者若源于相同的物种则通过故意的人工干预从其天然形式进行了组成和/或基因组基因座的实质性修饰。因此，例如，异源基因表达是指来自一种生物体/基因组的基因通过将其置于不同的生物体/基因组的基因组中进行表达的过程。

本申请所用术语“重组体”是指人工组合两种本来是分开的(otherwiseseparated)序列片段，例如，通过化学合成或者通过用遗传工程技术对分离的核酸片段进行操作。“重组体”还涉及通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者如此修饰的细胞衍生得到的细胞，但是不涵盖因自然发生事件(例如，自发突变、天然转化、天然转导、天然转座)而改变的细胞或载体，诸如那些未经故意的人为干预而发生改变的细胞或载体。

术语“遗传工程(化)的”或者“遗传改变的”是指在活的生物体中的遗传物质结构的科学改变。它涉及产生和使用重组体DNA。更具体而言，它用于描述从天然存在的生物体区分的遗传工程化或修饰的生物体。遗传工程化可通过本领域已知的多种技术诸如例如基因置换，基因扩增，基因破坏，转染，转化使用质粒、病毒或其它载体实现。遗传修饰的生物体例如遗传修饰的微生物也常常称之为重组生物，例如重组微生物。

本申请所用术语“破坏的”或“破坏”在涉及基因时是指经遗传工程化或者经改变基因活性的天然原因而经过操作或改变。所述基因活性可提高或降低。此外，所述破坏可消除蛋白质的功能。为了促进这样的下降，可减少基因拷贝数，例如通过基因的表达不足或破坏。如果所述基因的转录水平与野生型基因相比下降，那么该基因被认为是“表达不足的”。这可通过例如Northern印迹分析(其对作为基因表达指标的mRNA进行定量)测量。如本申请中所使用的，若与野生型基因产生的mRNA的量相比产生的mRNA的量下降了至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%，则基因是表达不足的。或者，弱的启动子可用于引导多核苷酸的表达。在另一实施方案中，该基因上游的核糖体结合位点、调节区和/或启动子可发生改变以实现降低的表达。所述表达也可通过缩短信使RNA的相对半寿期而降低。在另一实施方案中，多肽本身的活性可通过利用多肽氨基酸序列中的一个或多个降低活性的突变得到降低。例如，改变多肽对其相应底物的亲和力可导致降低的活性。同样地，可缩短多肽的相对半寿期。无论是基因表达降低还是活性降低的任一情形中，所述降低可通过改变细胞培养基的组成和/或培养所用方法来实现。本申请所用的“降低的表达”或“降低的活性”是指与野生型蛋白质、多核苷酸、基因；或者在多核苷酸或多肽减少之前存在的蛋白质的活性和/或浓度相比，减少至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%。SpnK蛋白的活性也可通过使该蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂接触来降低。术语“降低的活性”、“减少或消除的活性”在本申请中可互换使用。

表述“调控序列”通指启动子序列、核糖体结合位点、转录终止序列、上游调节域、增强子，等等，它们共同提供编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。并不需要所有的这些调控序列总是存在于重组体载体中，只要所期望的基因能转录和翻译即可。

“重组”是指在两个DNA或RNA分子之间DNA或RNA序列片段的再分配(reassortment)。“同源重组”发生在依靠各自DNA分子中存在的同源或互补核苷酸序列杂交的两个DNA分子之间。

术语“严格条件”或者“在严格条件下杂交”是指在该条件下探针会优先与其靶亚序列杂交，而较少程度或者根本不与其它序列杂交。在核酸杂交实验例如Southern杂交和Northern杂交的上下文中，“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。核酸杂交的广泛指导参见Tssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter2Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays,Elsevier,NewYork。一般而言，高严格杂交和洗涤条件选择为比特异性序列在指定的离子强度和pH下的热解链点(T_m)低约5℃。T_m是在指定的离子强度和pH下50%的靶序列杂交至完美匹配的探针的温度。非常严格条件选择为等于针对具体探针的T_m。

在Southern或Northern印迹中在滤纸上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的一个实例是50%甲酰胺与1mg肝素在42℃，其中杂交进行过夜。高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃达约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃用0.2xSSC洗涤持续15分钟(参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning--A LaboratoryManual(2nd ed.)Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborPress,NY，就SSC缓冲液描述而言)。常常，在高严格洗涤之前进行低严格洗涤以除去背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的一个实例是在45℃用1xSSC持续15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的一个实例是在40℃用4-6xSSC持续15分钟。一般而言，在具体的杂交测定中观察到相对于不相关探针的2x(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。如果核酸编码的多肽是基本上相同的，那么在严格条件下未彼此杂交的核酸仍然是基本上相同的。这发生在例如，核酸的拷贝是使用遗传编码所允许的最大密码子简并产生之时。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其可在严格条件下，优选在高严格条件下，与本发明的多核苷酸杂交。

本申请所用术语“杂交”意在描述用于杂交和洗涤的条件，在该条件下彼此至少约50%、至少约60%、至少约70%、更优选至少约80%、甚至更优选至少约85%~90%、最优选至少95%同源的核苷酸序列通常保持彼此杂交。

在一个实施方案中，本发明核酸是与本申请所示的核酸序列或其互补物至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源的。

严格杂交条件的另一个非限制性实例是在约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在1xSSC,0.1%SDS中在50℃、优选在55℃、更优选在60℃且甚至更优选在65℃进行一次或多次洗涤。

高严格条件可包括使用标记的DNA探针诸如地高辛(DIG)标记的DNA探针，在42℃温育几天诸如2~4天的时间，然后进行一次或多次在2xSSC,0.1%SDS中在室温的洗涤以及一次或多次在0.5xSSC,0.1%SDS或者0.1xSSC,0.1%SDS中在65-68℃的洗涤。具体地，高严格条件包括例如2小时至4天的在42℃的温育，其中使用DIG标记的DNA探针(例如通过使用DIG标记***制备；Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,Germany)，在溶液诸如包含或者不含100μg/ml鲑精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnostics GmbH)，或者包含50%甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02%十二烷基硫酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭剂的溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，然后在2xSSC和0.1%SDS中在室温洗涤滤纸两次持续5~15分钟，接着在0.5xSSC和0.1%SDS或者0.1xSSC和0.1%SDS中在65-68℃洗涤两次持续15~30分钟。

在一些实施方案中，在高严格条件下与本发明核苷酸序列杂交的本发明的分离的核酸分子可对应于天然存在的核酸分子。本申请所用的“天然存在的”核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列(例如，编码天然蛋白质)的RNA或DNA分子。

技术人员会知道就严格和高严格杂交条件而言适用什么条件。关于所述条件的另外指导在本领域中是易于得到的，例如在Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人(eds.),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley& Sons,N.Y.)中。

包含用于多杀菌素生物合成酶的基因的DNA的克隆片段使编码在产生多杀菌素中的限速酶的基因得以复制。这可在编码活性中的一种限制期望的多杀菌素合成的任一情形中用于提高产量。这种类型的产量提高在新霉素链霉菌(Streptomyces fradiae)发酵中通过复制编码将大菌素(macrocin)转化成泰乐菌素(tylosin)的限速甲基转移酶的基因得以实现(Baltz等人，1997)。

特异性中间体(或其天然衍生物)可通过其中编码用于多杀菌素生物合成的酶的某些基因已经被破坏的刺糖多孢菌突变菌株合成。所述菌株可通过经同源重组整合包含目标基因的内在片段的诱变质粒产生。在质粒整合后，形成生物合成基因的两个不完全拷贝，由此消除其编码的酶功能。该酶的底物或其一些天然衍生物应在突变菌株发酵时积聚。这样的策略有效地用于生成产生新型6-去氧红霉素衍生物的红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)菌株(Weber & McAlpine,1992)。

所述菌株可通过下面方法生成：经双交换同源重组将目标区与包含在目标区两侧的未突变序列之间的新片段的诱变质粒进行对换。该杂交基因可产生具有改变功能(缺乏活性或者从事新的酶转化)的蛋白质。新的衍生物可在突变菌株的发酵时积聚。这样的策略已用于生成产生新型脱水红霉素衍生物的红色糖多孢菌菌株(Donadio等人，1993)。

克隆多杀菌素生物合成基因及相关的ORF，并确定各自的DNA序列。克隆的基因和ORF在下文中指定为spnA、spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnI、spnJ、spnK、spnL、spnM、spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、ORFL15、ORFL16、ORFR1、ORFR2、刺糖多孢菌gtt、刺糖多孢菌gdh、刺糖多孢菌epi和刺糖多孢菌kre。

刺糖多孢菌产生9种紧密相关的化合物的混合物，通称为“多杀菌素”。在该混合物中，多杀菌素A和D(称为多杀霉素(spinsoad))是主要组分并且对关键昆虫目标具有最高活性。多杀菌素J和L(多杀菌素混合物中的两种次要组分)是乙基多杀菌素(第二代多杀菌素杀虫剂)的前体。本发明实施方案涉及经编码3′-O-甲基转移酶的spnK的操作将产生多杀菌素的菌株直接转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株。

多杀菌素是Dow AgroSciences(Indianapolis,Ind.)生产的杀虫剂，其主要包含约85%多杀菌素A和约15%多杀菌素D。多杀菌素A和D是刺糖多孢菌发酵产生的天然产物，如美国专利5,362,634中所披露。多杀菌素是几种可从Dow AgroSciences商购的杀虫制剂的活性成分，所述杀虫制剂包括TRACER^TM、SUCCESS^TM、SPINTOR^TM和CONSERVE^TM昆虫控制产品。例如，TRACER产品由约44%~约48%的多杀菌素(w/v)或者约4磅多杀菌素/加仑构成。呈颗粒和液体制剂形式的多杀菌素化合物对于控制蜘蛛、线虫和昆虫(具体为鳞翅目、缨翅目(Thysanopetera)和双翅目物种)具有确定的效用。多杀菌素A和D在本申请中也称为多杀菌素A/D。

乙基多杀菌素是5,6-二氢-3'-乙氧基多杀菌素J(主要组分)和3'-乙氧基多杀菌素L的混合物，其由Dow AgroSciences生产。该混合物可通过下面方法制备：乙氧基化多杀菌素J和多杀菌素L的混合物，然后氢化。多杀菌素J及其3'-乙氧基衍生物的5,6双键的氢化比多杀菌素L及其3'-乙氧基衍生物的5,6双键的氢化容易得多，这是由于在多杀菌素L及其3'-乙氧基衍生物中C-5的甲基的空间位阻。参见美国专利6,001,981。多杀菌素J和L在本申请中也称为多杀菌素J/L。

近来已经证实，spnK编码3′-O-甲基转移酶。参见Kim等人，JACS,132(9):2901-3(2010)。申请人已经发现，可将spnK经框内双交换同源重组从多杀菌素生物合成基因簇除去，而对下游基因spnL和spnM的转录不具有极化效应。这使得可将产生多杀菌素的菌株工程化，以生成产生乙基多杀菌素前体的菌株。这也表明，spnK敲除菌株已经失去3′-O-甲基转移酶活性。

本发明实施方案可包括在spnK基因中的操作，其通过在产生多杀菌素的菌株中除去一个或多个密码子而导致spnK基因的符合读框的缺失。spnK基因的符合读框的缺失可包括spnK基因的任何部分的任何截断。本发明的符合读框的缺失包括这样的删除，即，其除去编码蛋白质的序列的片段，而在删除后仍保留适当的阅读框。本发明一些实施方案的删除可包括“干净删除”，即，它们不含***到基因中的外源性DNA序列。spnK基因的符合读框的缺失可包括从1–397氨基酸除去任何位置。它可包括除去起始密码子。它还可包括除去任何保守结构域或任何转录起始区。

在本申请中使用常规命名描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。5'到3'添加核苷酸至新生RNA转录物的方向称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链称为“编码链”；在DNA链上具有与由该DNA转录的mRNA相同的序列的并且位于RNA转录物的5'端的5'的序列称为“上游序列”；在DNA链上具有与RNA相同的序列的并且位于编码RNA转录物的3'端的3'的序列称为“下游序列”。

本发明实施方案可包括在spnK基因中的操作，其通过在产生多杀菌素的菌株中除去一个或多个密码子而导致spnK基因的5′端的符合读框的缺失。这些密码子可包括ATG密码子的第一、第二或第三情况(first,second or thirdinstance of an ATG codon)。

本发明的另外的实施方案可包括在spnK基因中的操作，其通过在产生多杀菌素的菌株中除去一个或多个密码子而导致spnK基因的3′端的符合读框的缺失。

本发明的其它实施方案可包括在符合读框的缺失编码spnK的区域(单一密码子或多个密码子)中的在spnK基因中的操作，同时保持基因的5′端和3′端完整。

本发明的另外的实施方案可包括在spnK基因中的操作，其包括单一或多个点突变，所述突变在多个位点(包括但不限于活性位点)和/或在底物结合位点导致过早转录终止或者一个或多个氨基酸取代。这种单一或多个点突变可发生在SAM结合性基序中，在活性位点或底物结合位点导致提前终止。这种单一或多个点突变也可位于影响整体spnK结构或影响适当折叠(其可消除spnK功能)的位置处。这种单一或多个点突变可通过检测功能性多态性或通过诱变生成。

在本申请中使用的“功能多态性”是指基因的碱基对序列的变化，该变化导致由该基因编码的蛋白质的活性的定性或定量变化(例如，活性特异性的变化；活性水平的变化)。术语"功能多态性"包括突变、删除和***。

一般而言，检测感兴趣的多态性的步骤可通过以下方法进行：从来源收集包含DNA的生物样品，然后确定在该生物样品中包含所感兴趣的多态性的DNA的存在或删除。

确定编码具体突变的DNA的存在或删除可借助用合适的可检测基团标记的寡核苷酸探针和/或通过扩增反应诸如聚合酶链式反应或连接酶链式反应(该扩增反应的产物然后可用标记的寡核苷酸探针或者多种其它技术检测)进行。此外，检测步骤可包括以下步骤：检测是否所述受试者对于具体突变而言是杂合的或纯合的。多种不同的寡核苷酸探针测定形式是已知的，其可用于实施本发明。参见例如，Wahl等人的美国专利4,302,204；Falkow等人的美国专利4,358,535；Ranki等人的美国专利4,563,419；以及Stavrianopoulos等人的美国专利4,994,373。

扩增选定或目标核酸序列可通过任何适宜方式进行。总体参见Kwoh等人，Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990)。适宜的扩增技术的实例包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增(总体参见G.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,392-396(1992)；G.Walker等人，Nucleic Acids Res.20,1691-1696(1992))、基于转录的扩增(参见D.Kwoh等人，Proc.Natl.AcadSci.USA86,1173-1177(1989))、自动维持序列复制(或“3SR”)(参见J.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1874-1878(1990))、Qβ复制酶***(参见P.Lizardi等人，BioTechnology6,1197-1202(1988))、基于核酸序列的扩增(或“NASBA”)(参见R.Lewis,Genetic Engineering News12(9),1(1992))、修复链反应(或“RCR”)(参见R.Lewis,见前述)以及自返式DNA扩增(或“BDA”)(参见R.Lewis,见前述)。聚合酶链式反应通常是优选的。

聚合酶链式反应(PCR)可根据已知的技术进行。例如参见美国专利4,683,195；4,683,202；4,800,159和4,965,188。一般而言，PCR涉及，首先针对待检测特异性序列的每条链用一种寡核苷酸引物在杂交条件下处理核酸样品(例如，在热稳定的DNA聚合酶存在下)，从而合成与各核酸链互补的各引物的延伸产物，其中各引物和与其杂交的特异性序列的各链是充分互补的，从而由各引物合成的延伸产物当与其互补物分离时可用作其它引物的延伸产物的合成用模板，然后如果存在待检测的序列，则在变性条件下处理样品以将引物延伸产物与其模板分离。这些步骤循环重复直至达到所期望的扩增度。扩增序列的检测可通过如下方法进行：向反应产物中加入能与该反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，该探针携带可检测的标记，然后根据已知技术或者通过直接在凝胶上显影检测该标签。所述探针可以是5~500个核苷酸长，优选5~250个，更优选5~100个或5~50个核酸。当PCR条件允许所有的等位基因类型的扩增时，所述类型可通过用等位基因特异性探针进行杂交、通过限制内切核酸酶消化、通过在变性梯度凝胶上电泳或者其它技术来区分。

连接酶链式反应(LCR)也可根据已知技术进行。例如，参见R.Weiss,Science254,1292(1991)。一般而言，该反应用两对寡核苷酸探针进行：一对与待检测序列的一条链结合；另一对与待检测序列的另一条链结合。每对一起与其对应的链完全重叠。该反应如下进行：首先，变性(例如，分开)待检测序列的各链，然后使各链与两对寡核苷酸探针在热稳定的连接酶存在下反应从而使各对寡核苷酸探针连接在一起，而后分离反应产物，接着循环重复该过程直至序列扩增至所期望的程度。然后检测可与上面针对PCR描述类似的方式进行。

DNA扩增技术诸如前述技术可涉及使用一个探针、一对探针或者两对探针，所述探针与包含功能多态性的DNA特异性结合，但是不与不含功能多态性的DNA特异性结合。或者，所述探针或者探针对既可与包含又可与不包含功能多态性的DNA结合，但是产生或者扩增其中可检测差异可得到确定的产物(例如，延伸产物)(例如，较短产物，其中功能多态性是删除突变)。所述探针可根据标准技术由与spnK连锁的基因中的或与所述基因相关的已知DNA序列或者由可根据标准技术由所述基因产生的序列得到。

会理解的是本申请所描述的检测步骤可以直接或间接地进行。间接测定等位基因类型的其它方式包括测量与具体的功能多态性相关联的多态标志，如VNTR(数目可变的串联重复)所示例说明的。

分子生物学包括分析核酸和蛋白质序列的广泛多样的技术。这些技术和方法中的许多种构成临床诊断测定和试验的基础。这些技术包括核酸杂交分析、限制酶分析、遗传序列分析以及核酸和蛋白质的分离和纯化(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2Ed.,Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。

这些技术中的大多数涉及对大量样品进行多个操作(例如，移液、离心和电泳)。它们常常是复杂和耗时的，并且通常要求高度的准确性。多种技术因缺乏灵敏度、特异性或重现性而限制了其应用。

核酸杂交分析通常涉及用过量探针DNA在相对大量的复杂非靶核酸中检测非常少量的特异性靶核酸(DNA或RNA)。样品中核酸复杂性的降低有助于检测低拷贝数(即10,000～100,000)的核酸靶标。DNA复杂性的降低通过扩增靶核酸序列在某种程度上得以实现。(参见M.A.Innis等人，PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,1990,Spargo等人，1996,Molecular & Cellular Probes，关于SDA扩增)。这是因为靶核酸的扩增导致靶核酸序列相对于非靶序列的巨大数量，从而改善后续的靶杂交步骤。

杂交步骤涉及将制备的DNA样品与特异性报道探针在设定的对于靶DNA序列和探针之间发生杂交最优的条件下接触。杂交可以以多种形式中的任一种进行。例如，多样品核酸杂交分析已经以多种滤纸和固体支持物形式进行(参见Beltz等人，Methods in Enzymology,Vol.100,Part等人，Eds.,Academic Press,New York,Chapter19,pp.266-308,1985)。一种形式(所谓的“点印迹”杂交)涉及将靶DNA非共价连接至滤纸，然后后续杂交至放射性同位素标记的探针。在过去二十年，“点印迹”杂交得到广泛应用，在这段时间开发了多种版本(参见Anderson and Young,in Nucleic AcidHybridization-A Practical Approach,Hames and Higgins,Eds.,IRL Press,Washington,D.C.Chapter4,pp.73-111,1985)。例如，点印迹方法得到发展用于基因组突变的多重分析(Nanibhushan等人的EPA0228075)以及用于检测重叠克隆和构建基因组图谱(Evans的美国专利5,219,726)。

进行多样品核酸杂交分析的另外技术包括微形式化多路或者矩阵装置(例如，DNA芯片)(参见M.Barinaga,253Science,pp.1489,1991；W.Bains,10Bio/Technology,pp.757-758,1992)。这些方法通常将特异性DNA序列连接到固体支持物的非常小的特异性区，诸如DNA芯片的微孔。这些杂交形式是常规的“点印迹”和“夹心”杂交***的微量版。

微形式化杂交可用于进行“通过杂交测序”(SBH)(参见M.Barinaga,253Science,pp.1489,1991；W.Bains,10Bio/Technology,pp.757-758,1992)。SBH使用所有可能的n-核苷酸寡聚物(n-聚体)来鉴定未知DNA样品中的n-聚体，随后通过算法分析进行比对排列来产生DNA序列(参见Drmanac美国专利5,202,231)。

存在两种进行SBH的形式。第一形式涉及在支持物上生成所有可能的n-聚体的阵列，其随后用所有靶序列进行杂交。第二种形式涉及将靶序列连接至支持物上，其随后用可能的n-聚体探查。Southern(英国专利申请GB8810400,1988；E.M.Southern等人，13Genomics1008,1992)提议使用第一形式来分析或者测序DNA。Southern使用PCR扩增的基因组DNA鉴定出已知的单点突变。Southern还描述在用于SBH的固体支持物上合成寡核苷酸阵列的方法。Drmanac等人(260Science1649-1652,1993)使用第二形式来对几种短的(116bp)DNA序列测序。将靶DNA与膜支持物连接(“点印迹”形式)。各滤纸用272标记的10聚体和1聚体寡核苷酸顺序地杂交。范围广泛的严格条件用于实现针对各种n-聚体探针的特异性杂交。使用0℃~16℃的温度，洗涤时间从5分钟至过夜不等。大多数探针需要在16℃的3小时的洗涤。滤纸必须暴露2~18小时以检测杂交信号。

一般而言，多种方法可用于检测和分析杂交事件。取决于用于标记DNA探针的报道基团(荧光团、酶、放射性同位素等)，检测和分析以荧光、量热、或放射自显影方式进行。通过观察和测量发出的辐射诸如荧光辐射或颗粒发射，可得到关于杂交事件的信息。即使当检测方法具有非常高的固有灵敏度时，杂交事件的检测由于非特异性结合物质的背景存在而是困难的。因此，杂交事件的检测依赖于如何能够进行特异性和灵敏性杂交。关于遗传分析，已经开发了几种试图提高特异性和灵敏度的方法。

遗传分析的一种形式是以说明单核酸多态性或(“SNPs”)为中心的分析。偏好使用SNP的因素是它们在人基因组中的高丰度(尤其与短串联重复(STR)相比)，它们常常位于基因的编码区或调节区内(其可影响蛋白质结构或者表达水平)，以及它们在从一代传至下一代时的稳定性(Landegren等人，GenomeResearch,Vol.8,pp.769-776,1998)。

SNP定义为存在于两个变体中并且最常见变体出现的机会小于99%的基因组中的任意位置。为了将SNP用作广泛的遗传标志，能容易、快速、

准确、划算地对它们进行基因分型是关键。目前有多种技术可用于分型SNP(对于综述，参见Landegren等人，Genome Research,Vol.8,pp.769-776,(1998)，所有这些都需要靶扩增。它们包括直接测序(Carothers等人，BioTechniques,Vol.7,pp.494-499,1989)、单链构象多态性(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,pp.2766-2770,1989)、等位基因特异性扩增(Newton等人，Nucleic Acid Research,Vol.17,pp.2503-2516,1989)、限制消化(Day and Humphries,Analytical Biochemistry,Vol.222,pp.389-395,1994)、以及杂交测定。在其最基础的形式中，杂交测定通过相对于匹配和错配的靶甄别短的寡核苷酸报道子而发挥作用。已经开发了多种针对基础方案的改编。这些包括连接酶链式反应(Wu and Wallace,Gene,Vol.76,pp.245-254,1989)和迷你测序(Syvanen等人，Genomics,Vol.8,pp.684-692,1990)。其它提高包括使用Taq DNA聚合酶的5'-核酸酶活性(Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88,pp.7276-7280,1991)、分子信标(Tyagi and Kramer,Nature Biotechnology,Vol.14,pp.303-308,1996)、热变性曲线(Howell等人，Nature Biotechnology,Vol.17,pp.87-88,1999)和DNA“芯片”(Wang等人，Science,Vol.280,pp.1077-1082,1998)。

可用于区别SNP的另一现象是源自多靶特异性探针与单一靶的杂交的核酸相互作用能或者碱基堆积能(参见R.Ornstein等人，“An OptimizedPotential Function for the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies”,Biopolymers,Vol.17,2341-2360(1978)；J.Norberg and L.Nilsson,BiophysicalJournal,Vol.74,pp.394-402,(1998)；以及J.Pieters等人，Nucleic Acid Research,Vol.17,no.12,pp.4551-4565(1989))。在本发明中以独特形式使用该碱基堆积现象来提供高度敏感的Tm差异，从而允许直接检测核酸样品中的SNP。

其它方法也已经用于区分相关生物体中的核酸序列或者用于测序DNA。例如，Hogan等人的美国专利5,030,557披露单链靶核酸的二级和三级结构除了受到“探针”寡核苷酸的影响之外还可受到结合“辅助”寡核苷酸的影响，导致探针与靶核酸之间显示较高的Tm。然而，该应用在其方法上限制于将杂交能仅用于改变自退火RNA链的二级和三级结构，其若未改变则往往阻碍探针杂交至靶。

关于DNA测序，例如K.Khrapko等人，Federation of EuropeanBiochemical Societies Letters,Vol.256,no.1,2,pp.118-122(1989)披露了连续堆积杂交导致双链体稳定化。此外，J.Kieleczawa等人，Science,Vol.258,pp.1787-1791(1992)披露了使用六聚体的连续串来引发DNA合成，其中该连续串表现出使引发稳定。类似地，L.Kotler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.90,pp.4241-4245,(1993)披露了在通过使用六聚体和五聚体寡核苷酸模块的DNA测序反应引发中的序列特异性。此外，S.Parinov等人，Nucleic AcidResearch,Vol.24,no.15,pp.2998-3004,(1996)披露了将碱基堆积寡聚物用于与被动DNA测序微芯片相关的DNA测序。此外，G.Yershov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93,pp.4913-4918(1996)披露了SBH中的碱基堆积能在被动微芯片上的应用。在Yershov的示例中，10-聚体DNA探针锚定在微芯片的表面上，并杂交至与另外的短探针结合的靶序列，其组合似乎稳定了探针的结合。在该形式中，核酸序列的短片段可针对DNA测序得到阐明。Yershov还注意到在它们的***中错配的去稳定化作用因使用较短的探针(例如，5-聚体)而提高。在DNA测序中使用上述短探针提供了沿着探查中的序列辨别错配存在的能力，而不是仅仅辨别在探针/靶杂交复合体的一个具***置处的单一错配的能力。使用较长探针(例如，8-聚体、10-聚体和13-聚体寡聚物)就上述目的而言是较不实用的。

在核酸分析中使用碱基堆积的方法学的其它实例包括Lane等人的美国专利5,770,365，其中披露了一种捕获核酸的方法，该方法使用具有单链环和双链区的单分子捕获探针，所述探针与结合靶一起发挥作用从而通过堆积能稳定化双链体形成。

核苷酸序列可便利地通过根据常规方法的位点定向诱变进行修饰。或者，核苷酸序列可通过化学合成制备，包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪，其中寡核苷酸是基于期望的多肽的氨基酸序列设计的，并且优选地选择那些在将生成该重组多肽的宿主细胞中偏好的密码子。

新型多杀菌素也可在产生多杀菌素的生物体中通过克隆基因的诱变以及突变基因取代其未突变的对应物来产生。诱变可包括，例如：1)KR、DH或ER域的删除或失活，从而将这些功能中的一种或多种阻断并且该菌株产生具有带双键、羟基或酮基的内酯核的多杀菌素(双键、羟基或酮基不存在于多杀菌素A的核中)(参见Donadio等人，1993)；2)置换AT域从而将不同的羧酸引入内酯核中(参见Ruan等人，1997)；3)将KR、DH或ER域加入现有的PKS模块中，从而该菌株产生带饱和键、羟基或双键的内酯核的多杀菌素(所述饱和键、羟基或双键不存在于多杀菌素A的核中)；或者4)增加或减去完整的PKS模块，从而该环状内酯核具有较多或较少的碳原子数。杂交PKS可通过用异源PKS装载代替多杀菌素PKS装载来生成。例如，参见美国专利7,626,010。进一步注意到多杀菌素经由修饰与多杀菌素内酯主链相连的糖类，可包括鼠李糖和/或福乐糖胺部分的修饰或不同脱氧糖类的连接。西班牙的Salas小组证实了新型聚酮化合物可通过用不同糖分子取代现有的糖分子来产生。Rodriguez等人，J.Mol.Microbiol Biotechnol.2000Jul;2(3):271-6。本申请下文中的实施例有助于示例说明诱变用于产生具有修饰官能度的多杀菌素的用途。

来自多杀菌素基因簇区的DNA可用作鉴定同源序列的杂交探针。因此，此处克隆的DNA可用于从刺糖多孢菌基因文库中定位其它质粒，其与此处描述的区重叠并且还包括来自刺糖多孢菌的基因组中相邻区的先前未克隆DNA。此外，来自在此克隆的区的DNA可用于在其它生物体中鉴定不同但类似的序列。杂交探针通常是至少约20个碱基长并且是经标记的以允许检测。

出于多种目的，可在本发明中使用多种诱变。它们包括但不限于定位诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或者其它递归突变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用带缺口的双链体DNA的诱变，等等，或者它们的任意组合。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复删除型宿主菌株的诱变、限制-选择和限制-纯化、删除诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复，等等。包括但不限于涉及嵌合构建的诱变也包括在本发明中。在一个实施方案中，诱变可通过天然存在的分子或者改变或突变的天然存在分子的已知信息指导，包括但不限于测序、序列比较、物理性质、晶体结构，等等。

本申请中存在的文本和实例描述了这些方法。补充信息可参见下面的出版物以及其中引用的参考文献：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis:an overview，Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996)；Smith,In vitro mutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle,Strategies and applications ofin vitro mutagenesis,Science229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,The efficiency ofoligonucleotide directed mutagenesis,in Nucleic Acids和MolecularBiology(Eckstein,F.and Lilley,D.M.J.eds.,Springer Verlag,Berlin)(1987)；Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection,Proc.Natl.AcadSci.USA82:488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid andefficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods inEnzymol.154,367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with newDNA-binding specificities,Science242:240-245(1988)；Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors:an efficientand general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template,Methods inEnzymol.154:329-350(1987)；Taylor等人，The use ofphosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA,Nucl.Acids Res.13:8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13:8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein,Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage byphosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directedmutagenesis,Nucl.AcidsRes.14:9679-9698(1986)；Sayers等人，Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.16:791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases inthe presence of ethidium bromide,(1988)Nucl.AcidsRes.16:803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction,Nucl.AcidsRes.12:9441-9456(1984)；Kramer和FritzOligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic invitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations,Nucl.Acids Res.16:7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell38:879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985)；Carter，Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff,Use of oligonucleotides togenerate large deletions,Nucl.Acids Res.14:5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state ofsubtilisin,Phil.Trans.R.Soc.LondA317:415-423(1986)；Nambiar等人，Totalsynthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein,Science223:1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana,Total synthesis and expression of agene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-bindingprotein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988)；Wells等人，Cassettemutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at definedsites,Gene34:315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directedmutagenesis by microscale`shot-gun`gene synthesis,Nucl.AcidsRes.13:3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand breakrepair in plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986)；Arnold,Protein engineering forunusual environments,Current Opinion in Biotechnology4:450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology,19:456-460(2001).W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994)；以及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。多种以上方法的其他具体细节可参见Methods in EnzymologyVolume154，其还描述了用于各种诱变方法的故障诊断问题的有用对照。

术语“同源性”或“百分比同一性”在本申请中可互换使用。就本发明目的而言，在此定义：为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸序列的百分比同一性，将序列就最佳比较目的进行比对(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口用于与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由与第二序列中对应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则各分子在该位置上的是相同的。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享相同位置的数目的函数(即，%同一性=相同位置数/总位置数(即，重叠位置x100)。优选地，两个序列具有相同的长度。

本领域技术人员会注意到下面的事实，几种不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性。例如，在两个序列之间比较序列和确定百分比同一性可使用数学算法完成。在一种优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定，其已经纳入GCG软件包中的GAP程序(可在互联网上在accelrys网站获得，更具体为http://www.accelrys.com)，其中使用Blossom62矩阵或者PAM250矩阵，以及缺口权重16、14、12、10、8、6或4，和长度权重1、2、3、4、5或6。本领域技术人员会理解当使用不同算法时所有这些不同参数会导致略为不同的结果，但是两个序列的总体百分比同一性不显著变化。

在又一实施方案中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性使用在GCG软件包中的GAP程序来确定(可在互联网上在accelrys网站获得，更具体为http://www.accelrys.com)，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、3、4、5或6。在另一实施方案中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性使用E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989)确定，该算法被纳入ALIGN程序(2.0版)中(可在互联网上在vega网站获得，更具体为ALIGN-IGH Montpellier，或者更具体在http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)，其中使用PAM120权重剩余表(weight residue table)，缺口长度罚分12和缺口罚分4。

本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”来进行对公共数据库的检索，例如，以鉴定出其他家族成员或相关序列。所述检索可使用Altschul,等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可使用BLASTN程序进行(得分=100，字长=12)以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可使用BLASTX程序(得分=50，字长=3)进行以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口比对，可使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可采用各程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省参数(可在互联网上在ncbi网站获得，更具体为http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本发明其它实施方案可包括在spnK基因中的操作，其可包括单一或多个核苷酸碱基删除，所述删除可破坏spnK的正常阅读框。这种删除可包括从1至1194核苷酸的任何位置。这种删除影响spnK的正常阅读框，从而导致生成产生乙基多杀菌素前体的菌株。

本发明的另一实施方案可包括在spnK基因中的操作，其可包括破坏spnK的正常阅读框的在编码spnK的区域中的单一或多个核苷酸***。这种***影响spnK的正常阅读框，从而导致生成产生乙基多杀菌素前体的菌株。

本发明的另外的实施方案可包括在spnK基因中的操作，其包括使用反义或正义技术消除或显著干扰spnK蛋白的产生。本领域技术人员知道如何实现反义和共抑制效果。例如，共抑制的抑制方法已经描述于Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990),340-344)、Niebel等人(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),91-103)、Flavell等人(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),43-46)、Palaqui和Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995),149-159)、Vaucheret等人(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317)、de Borne等人(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)。

因此，通过在有机体如刺糖多孢菌中将具有反向重复序列5′或3′的核酸表达成正义或反义定向序列，本发明还提供了基因沉默的方法，其中所述正义或反义定向序列与待抑制的目标基因具有实质的序列一致性，但是反向重复序列的序列与目标基因不相关。在另一实施方案中，异源反向重复序列两侧为5′和3′定向序列。

基因沉默构建体可在所选的有机体中表达，例如，细菌细胞、真菌细胞、真核细胞如植物细胞或哺乳动物细胞。

适用于本发明的表达载体包括原核生物载体和真核生物载体(例如，质粒、噬菌粒、或噬菌体)，包括哺乳动物载体和植物载体。适宜的原核生物载体包括质粒，诸如，但不限于那些常用于放线菌属中DNA操作的质粒(例如pSET152、pOJ260、pIJ101、pJV1、pSG5、pHJL302、pSAM2、pKC1250)。所述质粒在Kieser等人，(“Practical Streptomyces Geneics”,2000)中有披露。其他适宜的载体可包括质粒，诸如那些能在大肠杆菌中复制的质粒(例如pBR322、ColE1、pSC101、PACYC184、itVX、pRSET、pBAD(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)等)。所述质粒被Sambrook披露(参见“Molecular Cloning:ALaboratory Manual,”第二版,编者Sambrook,Fritsch,& Maniatis,Cold SpringHarbor Laboratory,(1989))，并且许多这样的载体是可商购的。芽孢杆菌属(Bacillus)质粒包括pC194、pC221、pT127等，并被Grczan披露(参见:TheMolecular Biology of the Bacilli,Academic Press,NY(1982),pp.307-329)。适宜的链霉菌属(Streptomyces)质粒包括pli101(Kendall等人，J.Bacteriol.169:4177-4183,1987)，并且链霉菌噬菌体包括但不限于诸如ψC31(Chater等人，参见Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology,AkademiaiKaido,Budapest,Hungary(1986),pp.45-54)。假单胞菌属(Pseudomonas)质粒由John等人综述(Re v.Infect.Dis.8:693-704,1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33:729-742,1978)。

特定基因表达的抑制对于研究以及对于开发更适于具体目的的遗传工程化生物体是一种重要的手段。基因沉默可如下实现：引入对应于感兴趣基因的转基因，以相对于其启动子的反义方向(参见，例如，Sheehy等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA85:88058808(1988)；Smith等人，Nature334:724726(1988))，或者以相对于其启动子的正义方向(Napoli等人，Plant Cell2:279289(1990)；van der Krol等人，Plant Cell2:291299(1990)；美国专利5,034,323；美国专利5,231,020以及美国专利5,283,184)，这二者都导致转基因以及内源基因的表达降低。

转录后基因沉默已经被报道伴随着反义RNA的小(20~25个核苷酸)片段的积聚，其可由RNA模板合成并代表该过程的特异性和移动性决定子(Hamilton & Baulcombe,Science286:950952(1999))。已经变得清楚的是，在一定范围的生物体中引入dsRNA(双链RNA)是导致基因沉默的重要组分(Fire等人，Nature391:806811(1998)；Timmons & Fire,Nature395:854(1998)；WO99/32619；Kennerdell & Carthew，Cell95:10171026(1998)；Ngo等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA95:1468714692(1998)；Waterhouse等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA95:1395913964(1998)；WO99/53050；Cogoni & Macino,Nature399:166169(1999)；Lohmann等人，Dev.Biol.214:211214(1999)；Sanchez-Alvarado & Newmark,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA96:50495054(1999))。在细菌中，受抑制的基因无需是内源细菌基因，因为报道转基因和病毒基因二者均受到引入的转基因造成的转录后基因沉默(English等人，Plant Cell8:179188(1996)；Waterhouse等人，同上)。然而，在所有的上述情形中，在引入的转基因与受到抑制的基因之间一定的序列相似性可能是优选的。

在先前的实例中，在CaMV35S启动子的控制下引入由ACC氧化酶基因的5′-UTR(“非翻译区”)、编码区和3′-UTR组成的正义转基因在15%的番茄植株种群中导致降低的ACC氧化酶酶活性(Hamilton等人,Plant J.15:737746(1998);WO98/53083)。然而，如果在构建体中包含这种ACC氧化酶的5′-UTR部分的反向和正义重复序列，在96%的植株中观察到抑制(Hamilton等人,见前述)。另外，实现了在序列上与转基因的编码区相关，但是与转基因的5′-UTR不相关的另一ACC氧化酶基因的抑制，从而显示，转录本的任何部分的双链RNA靶向整个RNA转录本降解。另外，通过引入含有病毒编码区的反向重复序列的构建体或报道基因，或者通过将表达目标基因的编码区的有义和反义转录本的植株杂交在一起，已经发现高频率和高水平的转录后基因沉默(Waterhouse等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:1395913964(1998))。通过在相同植株中在不同启动子的控制下表达正义和反义转基因，得到相似的结果(Chuang & Meyerowitz,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA97:49854990(2000))。

本发明的其它实施方案可包括在spnK基因中的操作，其包括基因沉默。短语“基因沉默”是指将特异性基因产物的表达减少或弱化的方法。基因沉默可通过多种途径进行。除非另有说明，本申请使用的基因沉默是指基因产物表达降低，其产生于RNA干扰(RNAi)，一种确定的，不过是部分表征的途径，通过这种途径，小抑制RNA(siRNA)与宿主蛋白(例如，RNA诱导的沉默复合体，RISC)一起作用，以序列依赖性方式降解信使RNA(mRNA)。基因沉默的水平可通过多种方法测量，包括但不限于，通过Northern印迹分析、B-DNA技术、转录敏感报道子构建、表达纹印测试(expression profiling)(例如，DNA芯片)和相关技术测量转录本水平。或者，可通过评价特异性基因编码的蛋白质水平测量沉默水平。这可通过实施一些研究(包括Western分析)，测量具有例如荧光性质(例如，GFP)或酶活性(例如，碱性磷酸酶)的报道蛋白的表达水平或数种其它操作来完成。

另外的实施方案包括在spnK基因的活性位点或底物结合位点处的单一或多个氨基酸取代，其使spnK基因失效并导致多杀菌素J/L产生。通常，本领域技术人员将认识到，可对本发明的肽的氨基酸序列进行少量删除或取代，而不会过度不利地影响其活性。因此，含有这种删除或取代的蛋白质和肽是本发明的另一方面。在含有氨基酸的取代或替换的肽中，肽序列的一个或多个氨基酸可被一个或多个其它氨基酸替换，其中这种替换不影响该序列的功能。这种变化可通过氨基酸之间在物理性质如电荷密度、疏水性/亲水性、大小和构型方面的已知相似性指导，使得氨基酸被具有基本相同功能性质的其它氨基酸取代。例如：Ala可被Val或Ser替换；Val可被Ala、Leu、Met或Ile，优选被Ala或Leu替换；Leu可被Ala、Val或Ile，优选被Val或lie替换；Gly可被Pro或Cys，优选被Pro替换；Pro可被Gly、Cys、Ser或Met，优选被Gly、Cys或Ser替换；Cys可被Gly、Pro、Ser或Met，优选被Pro或Met替换；Met可被Pro或Cys，优选被Cys替换；His可被Phe或Gin，优选被Phe替换；Phe可被His、Tyr或Trp，优选被His或Tyr替换；Tyr可被His、Phe或Trp，优选被Phe或Trp替换；Trp可被Phe或Tyr，优选被Tyr替换；Asn可被Gin或Ser，优选被Gln替换；KGln可被His、Lys、Glu、Asn或Ser，优选被Asn或Ser替换；Ser可被GIn、Thr、Pro、Cys或Ala替换；Thr可被Gin或Ser，优选被Ser替换；Lys可被Gin或Arg替换；Arg可被Lys、Asp或Glu，优选被Lys或Asp替换；Asp可被Lys、Arg或Glu，优选被Arg或Glu替换；以及Glu可被Arg或Asp，优选被Asp替换。一旦实施，可常规地筛查变化以确定它们在功能上的影响。

本发明其它实施方案可包括在spnK基因中的操作，其包括操作核糖体结合位点(RBS)。可操作位于编码spnK的序列的上游的核糖体结合位点(标为Shine-Dalgarno)，使得破坏spnK基因，从而导致产生乙基多杀菌素前体的菌株的产生。

本发明的另外的实施方案可包括影响spnK基因的多个信号途径的酶抑制，其可导致产生乙基多杀菌素的菌株的产生。检测与目标相关的酶活性的方法可包括使用酶联测定。

本发明的另一实施方案包括阻滞编码spnK基因的启动子序列。这种阻滞可通过任何类型的操作，包括但不限于截断、删除、点突变和***。这种操作可为框内的或框外的。这种操作导致产生乙基多杀菌素的菌株的产生。

在以下非限制性实施例中更详细地解释本发明。

实施例1：在spnK中产生点突变

在spnK基因中的点突变经产生刺糖多孢菌A和D的菌株的随机诱变产生(Kieser等人,2000)。产生多杀菌素J和L而非多杀菌素A和D的突变菌株经以下方法进一步表征：PCR扩增spnK基因，然后DNA测序。将spnK基因用spnKF(SEQ ID NO:1；GGGAATTCCATATGTCCACAACGCACGAGATCGA)和spnKR(SEQ ID NO:2；GCCGCTCGAGCTCGTCCTCCGCGCTGTTCACGTC S)，使用FailSafe PCR***(Epicentre Biotechnologies；Madison,WI)PCR扩增。将所得PCR产物使用MoBio Ultraclean PCR Clean-up DNA纯化试剂盒(MoBio Laboratories；Solana Beach,CA)纯化并使用T4DNA连接酶(Invitrogen Life Technologies；Carlsbad,CA)克隆至TA克隆载体中。将推定含有PCR产物的细菌克隆分离并经限制酶消化证实。阳性质粒克隆的DNA测序如制造商规程所述使用CEQ ^TM DTC S-Quick Start Kit(Beckman-Coulter；Palo Alto,CA)实施。反应混合物如制造商规程所述使用Performa DTR Gel Filtration Cartridges(EdgeBioSystems；Gaithersburg,MD)纯化。在Beckman-Coulter CEQ^TM2000XLDNA分析***上分析序列反应混合物，并使用SEQUENCHER^TM(Gene CodesCorporation；Ann Arbor,MI)实施核苷酸表征。测序结果证实在spnK基因序列中点突变的位置。所得点突变在表1中列出并在图1中加阴影。

刺糖多孢菌的spnK突变菌株的发酵可在Burns等人(WO2003070908)所述的条件下实施。发酵液的多杀菌素因子的存在的分析可在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述的条件下实施。为证实在上清液中多杀菌素因子的存在，将发酵液提取物在SpeedVac中干燥过夜，然后在水和***(ether)之间分配残余物。醚层通过在N₂气流下蒸发干燥。然后将样品溶解在丙酮-d₆中并转移至NMR管，用于1D质子NMR采集。将NMR谱图与多杀菌素标准品的谱图进行比较。NMR结果表明存在比A/D多的J/L。与产生含有多杀菌素A和D的多杀菌素混合物的对照刺糖多孢菌相比，含有点突变的菌株的发酵产生含有多杀菌素J和L的多杀菌素混合物。

表1：点突变、它们在spnK中的位置和由这些菌株在发酵过程中产生的多杀菌素化合物的列表。

实施例2：产生spnK删除突变

构建spnK符合读框的缺失载体

将1,595bp DNA片段使用产生多杀菌素A和D的菌株的基因组DNAPCR扩增(Hopwood等人,1985)。该片段跨越spnK的起始密码子并含有无spnJ的5′端的spnJ编码区(图2)。使用FailSafe PCR试剂盒(EpicentreBiotechnologies；Madison,WI)以及正向引物#1(SEQ ID NO:3；CGGTGCCCGAATTCCATGACCCG)和反向引物#1(SEQ ID NO:4；GTGCGTTCTAGACATATGAGCTCCTCATGGCTG)完成PCR反应。

完成第二PCR反应，其产生1,951bp DNA片段；该片段含有spnK的3′端、完整spnL和spnM的5′端(图2)。使用FailSafe PCR试剂盒以及正向引物#2(SEQ ID NO:5；GTGCCATCTAGACTGGACGACATATTGCACCTG)和反向引物#2(SEQ ID NO:6；GAATGCGAAGCT TACGATCTCGTCGTCCGTG)完成PCR反应。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen；Valencia,CA)根据制造商的指示纯化PCR产物。

用EcoRI和XbaI消化1,595bp PCR片段。用XbaI和HindIII消化1,951bp PCR片段。在限制酶消化完成后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化片段。将消化的片段使用FastLink DNA连接试剂盒(Epicentre；Madison,WI)连接至质粒pOJ260的对应的EcoRI和HindIII限制位点，并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen；Carlsbad,CA)中。选择集落并经限制酶消化和DNA序列分析筛选希望的连接产物。鉴别阳性克隆并将选择的克隆用于随后符合读框的缺失刺糖多孢菌中的spnK。所得的在质粒pOJ260中的删除的spnK基因片段的序列在表2中给出。

表2：删除的spnK基因的核苷酸序列排列。

因此，一种spnK删除包括序列：

ATGTCTAGACTGGACGACATATTGCACCTGGCCGACGTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA(SEQ ID NO:9)。

将spnK删除载体接合至刺糖多孢菌中

将spnK符合读框的缺失构建体转化至大肠杆菌接合供体菌株ET12567/pUZ8002中。将阳性转化菌株鉴别并用于接种Luria Broth培养基(含有适合的抗生素)的烧瓶，以225rpm摇晃，在37℃生长过夜。质粒一致性的证实通过以下方法进行：从大肠杆菌供体菌株分离质粒DNA并完成限制酶消化。在证实该克隆的保真性正确后，将剩余培养物在20%甘油中于-80℃贮存，用于进一步使用。

携带spnK符合读框的缺失构建体的大肠杆菌细胞与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施。选择由于在spnK符合读框的缺失构建体的载体骨架上存在阿泊拉霉素抗性的基因标记而抗阿泊拉霉素的推定转接合子。

证实转接合子和扩增spnK区以测定整合位点

将在R6培养基上生长的单初级转接合子转移至补充有50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酸的脑心浸液(BHI)琼脂平板上，以证实抗性表型。将转接合子的菌丝体从BHI板接种至补充有50μg/mL阿泊拉霉素的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中。将培养物在以250rpm摇晃下在29℃孵育72小时。在72小时孵育后收集菌丝体，并使用Edge BioSystem的基因组DNA分离试剂盒，根据制造商的指示(Edge Biosystems；Gaithersburgh,MD)分离基因组DNA。使用从转接合子分离的基因组DNA作为模板，用spnK删除确认1号正向引物(SEQ ID NO:7；GTTCACGGTGATTCCGGTGACTCG)和spnK删除确认1号反向引物(SEQ ID NO:8；ACCTGCACTGCTTCCTGGAGCTTC)实施PCR。另外，使用从刺糖多孢菌母体对照菌株分离的基因组DNA和spnK符合读框的缺失构建体的质粒DNA作为对照PCR反应的模板。将PCR扩增结果测序。测序数据表明，spnK符合读框的缺失构建体经单交换同源重组整合至spnLM区中(图3)。在spnLM区的整合在染色体中产生spnJ、spnK、spnL的完整拷贝，和在载体骨架pOJ260上游的截断的spnM，和截断的spnJ，和在所述载体骨架下游的完整的spnL和spnM。

分离双交换spnK符合读框的缺失突变体

将抗阿泊拉霉素的单交换突变体在不存在阿泊拉霉素的情况下接种在BHI琼脂平板上，并在29℃孵育14天。将孢子根据Hopwood等人(1985)从板收集并在20%甘油中于-80℃贮存。将孢子接种至不含阿泊拉霉素的10个新的BHI琼脂平板上，并将板在29℃孵育14天。将该步骤重复三次。将孢子制品使用20%甘油稀释至10^-6，并将稀释的孢子在10个BHI琼脂平板上涂板。将板在29℃孵育10天，用于单集落发展。将单个集落在含有和不含阿泊拉霉素的新的BHI琼脂平板上处理(patched)。将全部板在29℃孵育10天，用于菌丝体发展。将在含有50μg/mL阿泊拉霉素的BHI琼脂平板上不生长的集落确定为双交换突变物候补者，并选择用于PCR确认。

双交换突变物的鉴别和确认

经PCR证实双交换突变物。将spnK删除(Del)确认1号正向引物(SEQ IDNO:7)和spnK删除确认1号反向引物(SEQ ID NO:8)设计成结合在spnL中，并将spnJ基因用于使用FailSafe PCR***的PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物的大小。鉴别导致spnK基因删除的双交换突变物(图4)，并基于PCR产物的大小进行选择。PCR片段的大小和DNA序列表明spnK基因的符合读框的缺失。

双交换突变物经摇瓶发酵的多杀菌素产生

双交换突变物的发酵可在Burns等人(WO2003070908)所述的条件下实施。发酵液的多杀菌素因子的存在的分析可在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述的条件下实施。为证实在上清液中多杀菌素因子的存在，将发酵液提取物在SpeedVac中干燥过夜，然后在水和***之间分配残余物。通过在N2气流下蒸发干燥醚层。然后将样品溶解在丙酮-d₆中并转移至NMR管，用于1D质子NMR采集。将NMR谱图与多杀菌素标准品的谱图进行比较。双交换突变物的发酵产生多杀菌素J和L。NMR结果表明存在比A/D多的J/L。

实施例3：产生spnK***突变

刺糖多孢菌突变物经spnK基因中的***突变产生。构建含有在spnK基因中的框内抗阿泊拉霉素基因盒(aac(3)IV)和未破坏的上游和下游spnJ和spnL基因侧翼序列的DNA片段(图5)。将aac(3)IV基因片段克隆至质粒中，并转化至大肠杆菌接合供体菌株ET12567/pUZ8002中。将阳性转化菌株鉴别并用于接种Luria Broth培养基(含有适当的抗生素)烧瓶，以225rpm摇晃，在37C生长过夜。质粒一致性的证实通过以下方法进行：分离质粒DNA并完成限制酶消化。在证实含有阿泊拉霉素***盒的质粒正确后，将剩余培养物在20%甘油中于-80C贮存。

大肠杆菌供体细胞与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施。使用对阿泊拉霉素的抗性选择阿泊拉霉素基因盒从大肠杆菌的转移和随后该质粒向刺糖多孢菌的基因组中的整合。

将在R6培养基上生长的单初级转接合子转移至补充有50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酸的脑心浸液(BHI)琼脂平板上，以证实抗性表型。将转接合子的菌丝体从BHI板接种至补充有50μg/mL阿泊拉霉素的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中。将培养物在以250rpm摇晃下在29℃孵育72小时。在72小时孵育后收集菌丝体，并使用Edge BioSystem的基因组DNA分离试剂盒，根据制造商的指示(Edge Biosystems；Gaithersburgh,MD)分离基因组DNA。使用从转接合子分离的基因组DNA作为模板实施PCR。将希望的PCR产物使用克隆技术(Invitrogen；Carlsbad CA)克隆至质粒中。将在载体中克隆的推定含有PCR产物的细菌克隆分离，并经限制酶消化证实。实施阳性质粒克隆的DNA测序。测序结果表明，阿泊拉霉素***盒经双交换同源重组整合在刺糖多孢菌的spnK基因中。所得的经同源重组的***破坏spnK转录，由此消除spnK基因功能。

刺糖多孢菌的spnK突变菌株的发酵可在Burns等人(WO2003070908)所述的条件下实施。发酵液的多杀菌素因子的存在的分析可在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述的条件下实施。为证实在上清液中多杀菌素因子的存在，将发酵液提取物在SpeedVac中干燥过夜，然后在水和***之间分配残余物。将醚层通过在N₂气流下蒸发干燥。然后将样品溶解在丙酮-d₆中并转移至NMR管，用于1D质子NMR收集。将NMR谱图与多杀菌素标准品的谱图进行对比。NMR结果表明存在比A/D多的J/L。与产生含有多杀菌素A和D的多杀菌素混合物的对照刺糖多孢菌相比，含有***突变的菌株的发酵产生含有多杀菌素J和L的多杀菌素混合物。

实施例4：破坏spnK Shine-Dalgarno序列

破坏位于spnK上游的Shine-Dalgarno序列(图6)，由此导致减少的spnKmRNA翻译。含有删除的spnK Shine-Dalgarno序列的刺糖多孢菌的突变菌株使用相似的规程如实施例2中所述产生。将位于spnK Shine-Dalgarno序列上游和下游的至少1,500bp的两个片段PCR扩增。这些片段不含以下序列5′-AGGAGCTC-3′。将两个片段在可用于与刺糖多孢菌接合的质粒如pOJ260中连接在一起。

将希望的质粒转化至大肠杆菌接合供体菌株ET12567/pUZ8002中。阳性转化菌株经限制酶消化证实。在证实含有质粒的大肠杆菌菌株正确后，大肠杆菌细胞与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施。选择质粒从大肠杆菌供体细胞的转移和随后质粒向刺糖多孢菌基因组中的整合，以使用对抗生素的抗性。

质粒在刺糖多孢菌染色体中的整合经特异性基因组DNA区的PCR扩增分子表征。简而言之，分离基因组DNA，并将含有spnK Shine-Dalgarno序列的***PCR扩增，克隆和测序。测序数据表明，spnK Shine-Dalgarno删除构建体经单交换同源重组整合至spnJK区中。

使用实施例2中所述的规程，得到含有破坏的spnK Shine-Dalgarno序列的双交换突变物。将在含有抗生素(其通过载体骨架上存在的标记来选择)的BHI琼脂平板上不能生长的集落鉴定为双交换突变物的候选者，并选择用于使用PCR证实。使用设计成结合在spnK和spnJ基因中的引物。将所得PCR产物使用克隆技术(Invitrogen；Carlsbad CA)亚克隆至质粒中。将含有克隆在载体中的PCR产物的细菌克隆分离并经限制酶消化证实。实施阳性质粒克隆的DNA测序。测序结果表明，将spnK Shine-Dalgarno核苷酸序列从刺糖多孢菌基因组破坏。刺糖多孢菌的spnK Shine-Dalgarno突变菌株的发酵可在Burns等人(WO2003070908)所述的条件下实施。发酵液的多杀菌素因子的存在的分析可在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述的条件下实施。为证实在上清液中多杀菌素因子的存在，将发酵液的提取物在SpeedVac中干燥过夜，然后在水和***之间分配残余物。醚层通过在N₂气流下蒸发干燥。然后将样品溶解在丙酮-d₆中并转移至NMR管，用于1D质子NMR采集。NMR结果表明存在比A/D多的J/L。将NMR谱图与多杀菌素标准品的谱图进行比较。与产生含有多杀菌素A和D的多杀菌素混合物的对照刺糖多孢菌相比，含有删除的spnK Shine-Dalgarno序列突变的菌株的发酵产生含有多杀菌素J和L的多杀菌素混合物。

实施例5：经spnK的反义RNA下调来降低3′-O-甲基转移酶表达

设计质粒，以产生与编码spnK的序列互补的asRNA(反义RNA)。所得的spnK基因表达的下调导致spnK活性的降低。

将编码spnK的序列PCR扩增，并克隆至质粒如pOJ260中，以整合至刺糖多孢菌染色体中。或者，可将编码spnK的序列克隆至在刺糖多孢菌的胞质溶胶中稳定维持并复制的质粒中。构建所得质粒，以通过使用强组成型细菌启动子表达spnK的反义链来产生spnK asRNA。将这种spnK asRNA质粒转化至大肠杆菌接合供体菌株ET12567/pUZ8002中。阳性转化菌株经限制酶消化证实。在证实含有质粒的大肠杆菌菌株正确后，来自大肠杆菌供体细胞的质粒与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施。选择将来自大肠杆菌的spnK asRNA质粒转移至刺糖多孢菌中，以使用对抗生素的抗性；将其抗性在spnK asRNA质粒上编码。将基因组DNA从转接合子分离并用作PCR扩增的模板，以证实质粒的存在。

含有spnK asRNA质粒的刺糖多孢菌菌株的发酵可在Burns等人(WO2003070908)所述的条件下实施。发酵液的多杀菌素因子的存在的分析可在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述的条件下实施。为证实在上清液中多杀菌素因子的存在，将发酵液的提取物在SpeedVac中干燥过夜，然后在水和***之间分配残余物。将醚层通过在N₂气流下蒸发干燥。然后将样品溶解在丙酮-d₆中并转移至NMR管，用于1D质子NMR采集。NMR结果表明存在比A/D多的J/L。将NMR谱图与多杀菌素标准品的谱图进行对比。与产生含有多杀菌素A和D的多杀菌素混合物的对照刺糖多孢菌相比，含有spnKasRNA质粒的菌株的发酵产生含有多杀菌素J和L的多杀菌素混合物。

实施例6：产生另外的spnK删除突变

实施例6.1构建spnK5′端删除载体

将产生多杀菌素A和D的菌株的基因组DNA(Hopwood等人,1985)PCR扩增，以产生两个DNA片段。第一扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于ATG起始密码子的上游。第二扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于spnK碱基对61的下游。PCR扩增使用本领域技术人员已知的方法完成。合成寡核苷酸引物，以引入限制酶结合序列。将所得PCR产物用断裂通过引物引入的结合序列的限制酶消化。将片段连接在一起，然后连接至质粒pOJ260的相应的限制位点中。将所得连接产物克隆至大肠杆菌感受态细胞中。选择集落并经限制酶消化和DNA序列分析筛选希望的连接产物。鉴别阳性克隆，并将选择的克隆用于随后的在刺糖多孢菌中的spnK的5′端删除。在表3中提供所得的在质粒pOJ260中的删除的spnK基因片段的序列。因此，spnK起始密码子删除包括序列：(SEQ ID NO:10)。

表3：spnK的删除的5′端的核苷酸序列排列

将spnK删除载体接合至刺糖多孢菌中

携带spnK5′端删除构建体的大肠杆菌细胞与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施并在实施例2中例示。选择由于在spnK5′端删除构建体的载体骨架上存在阿泊拉霉素抗性的基因标记而抗阿泊拉霉素的推定转接合子。

证实转接合子并扩增spnK区以测定整合位点

将在R6培养基上生长的单初级转接合子转移至补充有50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酸的脑心浸液(BHI)琼脂平板上，以证实抗性表型。将转接合子的菌丝体从BHI板接种至补充有50μg/mL阿泊拉霉素的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中。将培养物在以250rpm摇晃下在29℃孵育72小时。在72小时孵育后收集菌丝体并分离基因组DNA。使用从转接合子分离的基因组DNA作为模板，用设计成检测单交换突变物的引物实施PCR。将PCR扩增产物结果测序。测序数据表明，spnK5′端删除构建体经单交换同源重组整合至spnJK区中。

分离双交换spnK5′端删除突变物

在不存在阿泊拉霉素的情况下将抗阿泊拉霉素的单交换突变体接种在BHI琼脂平板上并在29℃孵育14天。将孢子根据Hopwood等人(1985)从板收集并在20%甘油中于-80℃贮存。将孢子接种至不含阿泊拉霉素的新的BHI琼脂平板上，并将板在29℃孵育14天。将该步骤重复多次。使用20%甘油稀释孢子制品并将稀释的孢子在BHI琼脂平板上涂板。将板在29℃孵育10天，用于单集落发展。将单个集落处理在含有和不含阿泊拉霉素的新的BHI琼脂平板上。将全部板在29℃孵育10天，用于菌丝体发展。将在含有50μg/mL阿泊拉霉素的BHI琼脂平板上不生长的集落鉴别为双交换突变物的候选者并选择用于PCR证实。

双交换突变物的鉴别和证实

双交换突变物经PCR证实。将引物设计成结合在spnJ中并将spnK基因用于PCR扩增。PCR产物的大小经琼脂糖凝胶电泳测定。将导致spnK基因的5′端删除的双交换突变物鉴别并给予PCR产物的大小选择。PCR片段的大小和DNA序列表明spnK基因的ATG起始密码子和5′端的删除。

经摇瓶发酵的多杀菌素产生

双交换突变物的发酵可在Burns等人(WO2003070908)所述的条件下实施。发酵液的多杀菌素因子的存在的分析可在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述的条件下实施。双交换突变物的发酵产生多杀菌素J和L。

实施例6.2构建spnK符合读框的缺失载体

将两个DNA片段使用产生多杀菌素A和D的菌株的基因组DNA PCR扩增(Hopwood等人,1985)。第一扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于第一推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的上游。第二扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于第一推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的下游。PCR扩增使用本领域技术人员已知的方法完成。合成寡核苷酸引物以引入限制酶结合序列。将所得PCR产物用断裂通过引物引入的结合序列的限制酶消化。将片段连接在一起，然后连接至质粒pOJ260的相应的限制位点。所得连接产物克隆至大肠杆菌感受态细胞中。选择集落并经限制酶消化和DNA序列分析筛选希望的连接产物。鉴别阳性克隆，并将选择的克隆用于随后的在刺糖多孢菌中的spnK的第一推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的符合读框的缺失。在表4中提供所得的在质粒pOJ260中的删除的spnK基因片段的序列。因此，spnK删除包括序列：SEQID NO:11。

表4：spnK的删除的第一推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的核苷酸序列排列(将推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域加下划线)。

将spnK删除载体接合至刺糖多孢菌中

携带spnK符合读框的缺失构建体的大肠杆菌细胞与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施并在实施例2中例示。选择由于在spnK符合读框的缺失构建体的载体骨架上存在抗阿泊拉霉素的基因标记而抗阿泊拉霉素的推定转接合子。

证实转接合子并扩增spnK区以测定整合位点

将在R6培养基上生长的单初级转接合子转移至补充有50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酸的脑心浸液(BHI)琼脂平板上，以证实抗性表型。将转接合子的菌丝体从BHI板接种至补充有50μg/mL阿泊拉霉素的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中。将培养物在以250rpm摇晃下在29℃孵育72小时。在72小时孵育后收集菌丝体并分离基因组DNA。使用从转接合子分离的基因组DNA作为模板，用设计成检测单交换突变物的引物实施PCR。将PCR扩增结果测序。测序数据表明，spnK符合读框的缺失构建体经单交换同源重组整合至spnK区中。

分离双交换spnK符合读框的缺失突变体

将抗阿泊拉霉素的单交换突变体在不存在阿泊拉霉素下接种在BHI琼脂平板上，并在29℃孵育14天。将孢子根据Hopwood等人(1985)从板收集，并在20%甘油中于-80℃贮存。将孢子接种至不含阿泊拉霉素的新的BHI琼脂平板上，并将板在29℃孵育14天。将该步骤重复多次。使用20%甘油稀释孢子制品并将稀释的孢子在BHI琼脂平板上涂板。将板在29℃孵育10天，用于单集落发展。将单个集落处理在含有和不含阿泊拉霉素的新的BHI琼脂平板上。将全部板在29℃孵育10天，用于菌丝体发展。将在含有50μg/mL阿泊拉霉素的BHI琼脂平板上不生长的集落鉴别为双交换突变物的候选者并选择用于PCR证实。

双交换突变物的鉴别和证实

双交换突变物经PCR证实。将引物设计成结合在spnK基因中，并用于PCR扩增。PCR产物的大小经琼脂糖凝胶电泳测定。将导致在spnK基因中的第一推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域删除的双交换突变物鉴别并基于PCR产物的大小选择。PCR片段的大小和DNA序列表明在spnK基因中的第一推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的删除。

经摇瓶发酵的多杀菌素产生

实施例6.3构建spnK符合读框的缺失载体

将两个DNA片段使用产生多杀菌素A和D的菌株的基因组DNA PCR扩增(Hopwood等人,1985)。第一扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于第二推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的上游。第二扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于第二推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的下游。PCR扩增使用本领域技术人员已知的方法完成。合成寡核苷酸引物以引入限制酶结合序列。将所得PCR产物用断裂通过引物引入的结合序列的限制酶消化。将片段连接在一起，然后连接至质粒pOJ260的相应的限制位点。所得连接产物克隆至大肠杆菌感受态细胞中。选择集落并经限制酶消化和DNA序列分析筛选希望的连接产物。鉴别阳性克隆，并将选择的克隆用于随后在刺糖多孢菌中的spnK的第二推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的符合读框的缺失。在表5中提供所得的在质粒pOJ260中的删除的spnK基因片段的序列。因此，spnK删除包括序列：SEQID NO:12。

表5：spnK的删除的第二推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的核苷酸序列排列(将推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域加下划线)。

将spnK删除载体接合至刺糖多孢菌中

证实转接合子并扩增spnK区以测定整合位点

分离双交换spnK符合读框的缺失突变体

双交换突变物的鉴别和证实

双交换突变物经PCR证实。将引物设计成结合在spnK基因中，并用于PCR扩增。PCR产物的大小经琼脂糖凝胶电泳测定。将导致在spnK基因中的第二推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域删除的双交换突变物鉴别并基于PCR产物的大小选择。PCR片段的大小和DNA序列表明在spnK基因中的第二推定S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的删除。

经摇瓶发酵的多杀菌素产生

实施例6.4构建spnK3′端删除载体

将两个DNA片段使用产生多杀菌素A和D的菌株的基因组DNA PCR扩增(Hopwood等人,1985)。第一扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于spnK碱基对1141的上游。第二扩增片段的长度约为1,500bp，并且直接位于spnK终止密码子的下游并包含部分的spn。PCR扩增使用本领域技术人员已知的方法完成。合成寡核苷酸引物以引入限制酶结合序列。将所得PCR产物用断裂通过引物引入的结合序列的限制酶消化。将片段连接在一起，然后连接至质粒pOJ260的相应的限制位点。所得连接产物克隆至大肠杆菌感受态细胞中。选择集落并经限制酶消化和DNA序列分析筛选希望的连接产物。鉴别阳性克隆，并将选择的克隆用于随后的在刺糖多孢菌中的spnK的3′端的删除。在表6中提供所得的在质粒pOJ260中的删除的spnK基因片段的序列。因此，spnK删除包括序列：SEQ ID NO:13。

表6：spnK基因的删除的3′端的核苷酸序列排列

将spnK删除载体接合至刺糖多孢菌中

携带spnK3′端删除构建体的大肠杆菌细胞与刺糖多孢菌的接合根据Matsushima等人(1994)所述的方法实施并在实施例2中例示。选择由于在spnK3′端删除构建体的载体骨架上存在抗阿泊拉霉素的基因标记而抗阿泊拉霉素的推定转接合子。

证实转接合子并扩增spnK区以测定整合位点

将在R6培养基上生长的单初级转接合子转移至补充有50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酸的脑心浸液(BHI)琼脂平板上，以证实抗性表型。将转接合子的菌丝体从BHI板接种至补充有50μg/mL阿泊拉霉素的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中。将培养物在以250rpm摇晃下在29℃孵育72小时。在72小时孵育后收集菌丝体并分离基因组DNA。使用从转接合子分离的基因组DNA作为模板，用设计成检测单交换突变物的引物实施PCR。将PCR扩增结果测序。测序数据表明，spnK3′端删除构建体经单交换同源重组整合至spnKL区中。

分离双交换spnK3′端删除突变物

在不存在阿泊拉霉素的情况下将抗阿泊拉霉素的单交换突变体接种在BHI琼脂平板上并在29℃孵育14天。将孢子根据Hopwood等人(1985)从板收集并在20%甘油中于-80℃贮存。将孢子接种至不含阿泊拉霉素的新的BHI琼脂平板上，并将板在29℃孵育14天。将该步骤重复多次。使用20%甘油稀释孢子制品并将稀释的孢子在BHI琼脂平板上涂板。将板在29℃孵育10天，用于单集落发展。将单个集落处理在含有和不含阿泊拉霉素(apramycin)的新的BHI琼脂平板上。将全部板在29℃孵育10天，用于菌丝体发展。将在含有50μg/mL阿泊拉霉素的BHI琼脂平板上不生长的集落鉴别为双交换突变物的候选者并选择用于PCR证实。

双交换突变物的鉴别和证实

双交换突变物经PCR证实。将引物设计成结合在spnK中并将spnL基因用于PCR扩增。PCR产物的大小经琼脂糖凝胶电泳测定。将导致spnK基因的3′端删除的双交换突变物鉴别并基于PCR产物的大小选择。PCR片段的大小和DNA序列表明spnK基因的3′端的删除。

经摇瓶发酵的多杀菌素产生

将参考的全部专利和公开的全部内容并入本文作为参考。前述内容用于说明本发明，不应视为对本发明的限制。本发明由所附权利要求限定，并包括权利要求的等同物。

Claims

1.将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株的方法，其包括在spnK基因中产生修饰以消除3′-O-甲基转移酶活性，其中所述修饰选自符合读框的缺失、点突变、删除和***，其中所述点突变在选自下组的碱基对位置中发生：位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131，其中所述spnK基因由SEQ ID NO:17的核苷酸序列组成；其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失；其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除；其中所述***为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。

2.权利要求1的方法，其中通过使用反义技术使所述spnK基因失效。

3.权利要求1的方法，其中所述修饰在所述编码spnK的区域中发生。

4.产生乙基多杀菌素前体的遗传修饰的宿主细胞，其中所述遗传修饰的宿主细胞为通常不产生大量乙基多杀菌素前体的原核宿主细胞，包括在spnK基因中产生修饰而消除3′-O-甲基转移酶活性，其中所述修饰选自符合读框的缺失、点突变、删除和***，其中所述点突变在选自下组的碱基对位置中发生：位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131，其中所述spnK基因由SEQ ID NO:17的核苷酸序列组成；其中其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失；其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除；其中所述***为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。

5.将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株的方法，其包括使spnK基因失效，同时维持多杀菌素J和L产生，其中所述使spnK基因失效选自下组：符合读框的缺失、点突变、删除和***，其中所述点突变在选自下组的碱基对位置中发生：位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131，其中所述spnK基因由SEQ ID NO:17的核苷酸序列组成；其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失；其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除；其中所述***为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。

6.权利要求5的方法，其中所述使spnK基因失效通过操作核糖体结合位点引起。

7.权利要求6的方法，其中所述核糖体结合位点为spnK Shine-Dalgarno序列。

8.权利要求5的方法，其中所述使spnK基因失效通过操作spnK基因的启动子引起。

9.权利要求8的方法，将所述启动子与spnJ的启动子共转录。

10.权利要求5的方法，其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失。

11.权利要求5的方法，其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除。

12.spnK基因中的修饰在将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株的中的用途，其中所述修饰选自符合读框的缺失、点突变、删除和***，其中所述点突变在选自下组的碱基对位置中发生：位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131，其中所述spnK基因由SEQ ID NO:17的核苷酸序列组成；其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失；其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除；其中所述***为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。

13.spnK基因中的修饰在使产生乙基多杀菌素前体的宿主细胞产生中的用途，其中所述修饰选自符合读框的缺失、点突变、删除和***，其中所述点突变在选自下组的碱基对位置中发生：位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131，其中所述spnK基因由SEQ ID NO:17的核苷酸序列组成；其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失；其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除；其中所述***为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。

14.spnK基因中的修饰在将产生多杀菌素的菌株转化成产生乙基多杀菌素前体的菌株的方法中的用途，所述方法包括使spnK基因失效，同时维持多杀菌素J和L产生，其中所述使spnK基因失效选自下组：符合读框的缺失、点突变、删除和***，其中所述点突变在选自下组的碱基对位置中发生：位置528、589、602、668、721、794、862、895、908、937和1131，其中所述spnK基因由SEQ ID NO:17的核苷酸序列组成；其中所述符合读框的缺失选自下组：5′端的符合读框的缺失、3′端的符合读框的缺失和编码spnK的区域的符合读框的缺失；其中所述删除为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基删除；其中所述***为破坏所述spnK基因的正常阅读框的单一或多个核苷酸碱基***。