发明内容
本发明的目的为提供生产用地小,劳动强度大大降低,生产成本相对较低,操作工艺程序不繁琐,批间差异小,产品质量高且稳定的一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。
为了实现以上目的,本发明采用以下技术方案:
该利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法,所述的生物反应器为激流式生物反应器,通过灌注袋和激流袋形成循环***,灌注袋内置有细胞培养袋,细胞培养袋内有纸片载体,所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
1)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞,细胞接种量为2-5×109个PK-15细胞,在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5℃及溶氧DO60%-90%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50-60rpm,培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层,弃去细胞生长液;
2)加入病毒维持液,接种猪圆环病毒2型,病毒接种量为生物反应器工作体积的5%,在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5-37℃及溶氧DO60-90%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50-60rpm培养猪圆环病毒2型;
3)培养猪圆环病毒2型72-120h后,每隔6-12h取病毒维持液测糖耗,糖耗下降时收获病毒液,-15℃以下冷冻保存;
4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
进一步,所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式,维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
进一步,所述的纸片载体密度为15-20g/L。
进一步,所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基,病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
本发明采用以上技术方案,通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗,生产用地小,劳动强度大大降低,生产成本相对较低;操作工艺程序简单,能达到全自动微电脑控制;批间差异小,产品质量高且稳定;生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高,副作用小,对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
具体实施方式
本发明的技术方案为:本发明所述的生物反应器为激流式生物反应器,通过灌注袋1和激流袋2形成循环***,灌注袋1内置有细胞培养袋,细胞培养袋内有纸片载体,所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
1)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞,细胞接种量为2-5×109个PK-15细胞,在培养条件为pH值7.2-7.4、温度36.8-37.5℃及溶氧DO60%-90%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min、振荡器转速50-60rpm,培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层,弃去细胞生长液;
2)加入病毒维持液,接种猪圆环病毒2型,病毒接种量为生物反应器工作体积的5%,在培养条件为pH值7.4-7.6、温度36.5-37℃及溶氧DO60-90%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度450-500mL/min和振荡器转速50-60rpm培养猪圆环病毒2型;
3)培养猪圆环病毒2型72-120h后,每隔6-12h取病毒维持液测糖耗,糖耗下降时收获病毒液,-15℃以下冷冻保存;
4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
进一步,所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式,维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
进一步,所述的纸片载体密度为15-20g/L。
进一步,所述的细胞生长液为含体积浓度为8-10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基,病毒维持液为含体积浓度为1-2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
本发明采用以上技术方案,通过激流式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗,生产用地小,劳动强度大大降低,生产成本相对较低;操作工艺程序简单,能达到全自动微电脑控制;批间差异小,产品质量高且稳定;生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗安全性好、免疫效力高,副作用小,对猪圆环2型病毒强毒攻击具有较好的免疫保护作用。
所用的激流式生物反应器工作体积可为5L,10L,20L,50L等。
下面将结合附图1-2之一所示和以激流式生物反应器的工作体积10L为具体实施例对本发明进一步说明:
实施例1
激流式生物反应器,生产厂家:杭州安普生物工程有限公司;型号:AP20SC II;工作体积:10L。
通过灌注袋和激流袋形成循环***,灌注袋内置有细胞培养袋,细胞培养袋内有纸片载体,所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式,维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
所用纸片载体密度为20g/L,即纸片载体的质量为20g/L×10L为200g。
配制细胞生长液:含体积浓度为10%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基;
配制病毒维持液:含体积浓度为2%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
1)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞,细胞接种量为5×109个PK-15细胞,在培养条件为pH值7.4、温度37.5℃及溶氧DO90%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度500mL/min、振荡器转速60rpm,培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层,弃去细胞生长液;
2)加入病毒维持液9.5L,接种猪圆环病毒2型,病毒接种量为0.5L,在培养条件为pH值7.4、温度37℃及溶氧DO90%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度500mL/min和振荡器转速60rpm培养猪圆环病毒2型;
3)培养猪圆环病毒2型120h后,每隔6h取病毒维持液测糖耗,糖耗下降时收获病毒液,-15℃以下冷冻保存;
4)采用常用方法制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
表1为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
表1本发明与传统转瓶比较
比较项目 |
传统转瓶 |
本发明 |
表面积 |
4500cm2 |
约19.2m2 |
病毒数(产毒量) |
1.5L液,5.0的毒价 |
10L液,5.5-5.7的毒价 |
500个转瓶所需的种毒 |
7500mL |
50-150mL |
500个转瓶所需的培养基 |
1500L |
20-30L |
500个转瓶所需的血清 |
90000mL |
1540-2240mL |
时间(1个转瓶为基础) |
17-18天 |
12-13天 |
人员 |
15-20人 |
2-3人 |
从表1中,可以看出本发明生产用地小,劳动强度大大降低,生产成本相对较低;种毒需要量小,所需培养基和血清量少,所需时间短,人员少。
实施例2
激流式生物反应器,生产厂家:杭州安普生物工程有限公司;型号:AP20SC II;工作体积:10L。
通过灌注袋和激流袋形成循环***,灌注袋内置有细胞培养袋,细胞培养袋内有纸片载体,所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式,维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
所用纸片载体密度为15g/L,即纸片载体的质量为15g/L×10L为150g。
配制细胞生长液:含体积浓度为8%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基;
配制病毒维持液:含体积浓度为1%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
1)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞,细胞接种量为2×109个PK-15细胞,在培养条件为pH值7.2、温度36.8℃及溶氧DO60%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度450mL/min、振荡器转速50rpm,培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层,弃去细胞生长液;
2)加入病毒维持液9.5L,接种猪圆环病毒2型,病毒接种量为0.5L,在培养条件为pH值7.4、温度36.5℃及溶氧DO60%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度450mL/min和振荡器转速50rpm培养猪圆环病毒2型;
3)培养猪圆环病毒2型72h后,每隔12h取病毒维持液测糖耗,糖耗下降时收获病毒液,-15℃以下冷冻保存;
4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
表2为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
表2本发明与传统转瓶比较
比较项目 |
传统转瓶 |
本发明 |
表面积 |
4500cm2 |
约19.2m2 |
病毒数(产毒量) |
1.5L液,5.0的毒价 |
10L液,5.5-5.7的毒价 |
500个转瓶所需的种毒 |
7500mL |
50-150mL |
500个转瓶所需的培养基 |
1500L |
20-30L |
500个转瓶所需的血清 |
88650mL |
1517-2206mL |
时间(1个转瓶为基础) |
17-18天 |
12-13天 |
人员 |
15-20人 |
2-3人 |
从表2中,可以看出本发明生产用地小,劳动强度大大降低,生产成本相对较低;种毒需要量小,所需培养基和血清量少,所需时间短,人员少。
实施例3
激流式生物反应器,生产厂家:杭州安普生物工程有限公司;型号:AP20SC II;工作体积:10L。
通过灌注袋和激流袋形成循环***,灌注袋内置有细胞培养袋,细胞培养袋内有纸片载体,所述生物反应器的培养采用灌注培养的方式,维持细胞生长液或病毒维持液的体积不变。
所用纸片载体密度为18g/L,即纸片载体的质量为18g/L×10L为180g。
配制细胞生长液:含体积浓度为9%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基;
配制病毒维持液:含体积浓度为1.5%小牛血清的MEM粉剂细胞培养基。
所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法包括以下步骤:
1)在已灭菌的激流式生物反应器中培养PK-15细胞,细胞接种量为3×109个PK-15细胞,在培养条件为pH值7.3、温度37℃及溶氧DO75%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度470mL/min、振荡器转速55rpm,培养PK-15细胞至纸片载体上形成致密的单层,弃去细胞生长液;
2)加入病毒维持液9.5L,接种猪圆环病毒2型,病毒接种量为0.5L,在培养条件为pH值7.5、温度36.8℃及溶氧DO75%的条件下,以激流式生物反应器的循环速度470mL/min和振荡器转速55rpm培养猪圆环病毒2型;
3)培养猪圆环病毒2型90h后,每隔9h取病毒维持液测糖耗,糖耗下降时收获病毒液,-15℃以下冷冻保存;
4)制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。
表3为本发明生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗与普通转瓶方法生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗的比较。
表3本发明与传统转瓶比较
比较项目 |
传统转瓶 |
本发明 |
表面积 |
4500cm2 |
约19.2m2 |
病毒数(产毒量) |
1.5L液,5.0的毒价 |
10L液,5.5-5.7的毒价 |
500个转瓶所需的种毒 |
7500mL |
50-150mL |
500个转瓶所需的培养基 |
1500L |
20-30L |
500个转瓶所需的血清 |
85500mL |
1463-2128mL |
时间(1个转瓶为基础) |
17-18天 |
12-13天 |
人员 |
15-20人 |
2-3人 |
从表3中,可以看出本发明生产用地小,劳动强度大大降低,生产成本相对较低;种毒需要量小,所需培养基和血清量少,所需时间短,人员少。