CN103097413A - 脂质缀合抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防疾病的新型脂质缀合抗体，所述疾病包括但不限于癌症；代谢病，包括但不限于高血糖症和糖尿病；肥胖症；高血压；高胆固醇血症；***反应；哮喘；阿尔兹海默病；和感染性疾病，包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病。

Description

脂质缀合抗体
本发明涉及用于治疗或预防疾病的新型脂质缀合抗体，所述疾病包括但不限于癌症；代谢病，包括但不限于高血糖症和糖尿病；肥胖症；高血压；高胆固醇血症；***反应；哮喘；阿尔兹海默病；和感染性疾病，包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病。
发明背景
生物膜在细胞的生理和病理中发挥着关键作用。大多数生理和病理现象由嵌入生物膜(包括质膜和细胞内膜二者)或与其连接的受体介导。这些蛋白质和蛋白质复合物经常位于称为“脂质筏(lipid raft)”的膜微结构域中，其中尤其富含脂质，例如胆固醇和鞘脂(B.Alberts等，Molecularbiology of the cell，第五版，Garland Science 2008)。
例如，被来源于宿主质膜之脂质双层包围的“包膜病毒”(如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒、黄病毒、弹状病毒和甲病毒)(Ono and Freed，Adv.Virus Res.，2005，273，5419-5442)感染细胞需要病毒糖蛋白与质膜上展示的特异性受体相结合并且将病毒与宿主细胞膜融合。通过靶向病毒糖蛋白或细胞受体来干扰这两个步骤中的任何一个是用于预防或治疗病毒感染的可行策略。
在癌症中，质膜上展示的蛋白质的过表达是肿瘤细胞的特征并且甚至可为肿瘤细胞与正常细胞的区分提供选择优势(肿瘤相关抗原)。同样，在这种情况下，靶向这些膜相关蛋白是抗癌治疗的有效策略。对于许多包膜病毒，目前还没有批准的疫苗和治疗性物质。另外，现有的针对病毒和多种其他疾病(例如癌症、代谢病、肥胖症、高血压、高胆固醇血症、***反应、哮喘和阿尔兹海默病)的治疗性物质仍然表现出严重的副作用。该情况时常发生，这是由于这些药物以干扰致病事件(例如，病毒进入或细胞机制异常)所需的极大剂量施用。
总之，需要开发更有效的药物，其可以以较小剂量施用并且优选对对抗上述疾病有效，从而提供有效且通用的治疗和预防途径。
通过将结合脂质膜的能力构建到抗体中来改善针对病毒或细胞表面展示蛋白的抗体的结合效力是产生更有效且耐受性更好的治疗剂和预防剂的一般性方法。
发明概述
尤其对癌症、代谢病(包括但不限于高血糖症和糖尿病)、肥胖症、高血压、高胆固醇血症、***反应、哮喘、阿尔兹海默病和感染性疾病(包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病)有效的优选药剂还包括治疗性抗体和预防性抗体。
本发明人已鉴定了具有优良药物特性和大幅度改善的生物效力的新型改良抗体。已经表明可将能够特异性结合其各自表位的抗体修饰成额外地结合靶细胞(例如癌细胞)的质膜或病原性包膜病原性病毒的质膜。出乎意料的是，这样的修饰能够增加抗体的效力，从而允许减少达到期望治疗效果所需的剂量。因此，本发明的目标问题是通过将脂质与治疗性、预防性或诊断性抗体共价连接(任选地通过接头)来解决。对于由包膜病毒引起的疾病的治疗，已证明特别有效的是将抗体(任选地通过本文所述的接头)与胆固醇或其衍生物连接。
因此，在第一方面，本发明提供了抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与脂质共价连接，任选地通过接头共价连接，其中所述脂质或所述接头与所述抗体或其片段的抗体结构域(选自VL、VH、CL、CH1、CH2和CH3)中的氨基酸共价连接。
在第二方面，本发明提供了用于治疗或预防疾病的本发明抗体或片段，所述疾病选自癌症、代谢病(包括但不限于高血糖症和糖尿病)、肥胖症、高血压、高胆固醇血症、***反应、哮喘、阿尔兹海默病和感染性疾病(包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病)。本发明抗体或片段可用于治疗或预防疾病的方法中，所述疾病选自癌症、代谢病(包括但不限于高血糖症和糖尿病)、肥胖症、高血压、高胆固醇血症、***反应、哮喘、阿尔兹海默病和感染性疾病(包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病)。本发明抗体或片段可用于制备用于治疗或预防疾病的药物，所述疾病选自癌症、代谢病(包括但不限于高血糖症和糖尿病)、肥胖症、高血压、高胆固醇血症、***反应、哮喘、阿尔兹海默病和感染性疾病(包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病)。
发明详述
在以下对本发明进行详细描述之前，应理解本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方案，并不旨在限制本发明的范围，所述范围仅受限于所附权利要求。除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语的意义与本领域普通技术人员通常理解的相同。
优选地，如″A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger；H.G.W，Nagel，B.和Klbl，H.编辑.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland)；AxelKleemann和Jurgen Engel的″Pharmaceutical Substances：Syntheses，Patents，Applications″，Thieme Medical Publishing，1999；Susan Budavari等编的″Merck Index：An Encyclopedia of Chemicals，Drugs，andBiologicals″，CRC Press，1996；以及2001年由the United StatesPharmcopeial Convention，Inc.，Rockville Md.出版的美国药典-25/国家处方集-20中所述来定义本文所用术语。除非另有说明，否则本发明的治疗性和预防性抗体包含的氨基酸根据WIPO标准ST.25的标准单字母或三字母代码表示。
在本说明书和所附权利要求书全文中，除非上下文另有需要，否则词语“包含”和“包括”将理解为表示包括指出的特征、整数或步骤或者特征、整数或步骤的组，但是并不排除任何其他的特征、整数或步骤或整数或步骤的组。在下文中对本发明的不同方面进行更详细地定义。除非另有相反的说明，否则如此定义的每一方面可与任何其他的一方面或多个方面相组合。特别地，指明是优选或有利的任何特性可与指明是优选或有利的任何其他一个或更多个特性相组合。
在本说明书全文中引用了多个文件。无论在上文还是下文中，本文所引用的每个文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书等)均通过引用整体并入本文。本文不应解释为承认本发明不享有借助在先发明先于这种公开内容的权利。
本文使用的术语“抗体或其片段”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，包含特异性结合抗原之抗原结合位置的分子)。还包括的是免疫球蛋白样蛋白质，其通过技术(包括，例如特异性结合靶分子或靶蛋白的噬菌体展示)被选出。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚型。适用于本发明的“抗体及其片段”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、一价抗体、双特异性抗体、异源缀合(heteroconjugate)抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(尤其是CDR移植抗体)、去免疫化抗体或嵌合抗体、单链抗体(如scFv)、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、双功能抗体(diabodies)或四功能抗体(tetrabodies)(HolligerP.等，1993)、纳米抗体(nanobodies)、抗独特型(anti-idiotypic，anti-Id)抗体(包括，例如本发明抗体的anti-Id抗体)和上述任何一种的表位结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体片段是哺乳动物(优选人)的本发明抗原结合抗体片段，并且其包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH结构域之一的片段。抗原结合抗体片段(包括单链抗体)可包含单独的可变结构域或与以下的整体或部分组合的可变结构域：铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其也包含可变结构域与铰链区、CL、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。
可用于本发明的抗体可来源于任何动物，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体来源于人、类人猿(例如黑猩猩、倭黑猩猩、猕猴)、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔子、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。尤其优选地，抗体来源于人或鼠。本文使用的“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体，或分离自动物的抗体，所述动物因转基因而具有一种或多种人免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白，例如如Kucherlapati和Jakobovits的美国专利No.5,939,598中所述。
在本发明的上下文中，被本发明抗体或其片段识别的抗原的独特部分被称为“表位”。抗体包含的不同区域为本领域所公知，并且在例如Janeway CA，Jr等.(2001)，Immunobiology，第5版，Garland Publishing中描述。
如本文所用，如果本发明的抗体或抗体片段对于第二化合物(例如，抗原，如靶蛋白)的解离常数KD为100μM或更小、优选50μM或更小、优选30μM或更小、优选20μM或更小、优选10μM或更小、优选5μM或更小、更优选1μM或更小、更优选900nM或更小、更优选800nM或更小、更优选700nM或更小、更优选600nM或更小、更优选500nM或更小、更优选400nM或更小、更优选300nM或更小、更优选200nM或更小、甚至更优选100nM或更小、甚至更优选90nM或更小、甚至更优选80nM或更小、甚至更优选70nM或更小、甚至更优选60nM或更小、甚至更优选50nM或更小、甚至更优选40nM或更小、甚至更优选30nM或更小、甚至更优选20nM或更小以及甚至更优选10nM或更小，则认为本发明的抗体或抗体片段“特异性结合”所述第二化合物。
“可药用”意指被联邦管理机构或国家政府批准，或者美国药典或其它公认药典列出用于动物，更特别地用于人。
本文使用的术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”在全文中可互换使用。这些术语指天然肽以及可包含天然或非天然氨基酸的合成肽二者。还可以通过修饰天然或非天然氨基酸的侧链或游离氨基端或羧基端对肽进行化学修饰。这种化学修饰包括添加另外的化学部分以及修饰氨基酸侧链中的官能团(例如糖基化)。肽是多聚体，其优选具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95个或至少100个氨基酸，最优选至少30个氨基酸。
本文使用的术语“碳水化合物”指任何有机化合物，其包括但不限于单糖、二糖、寡糖和多糖，优选抗体研究领域中所公知的N连接或O连接的寡糖和多糖，其可包括己糖分子、脱氧己糖分子、氨基己糖分子、氨基尤罗索尼克酸(aminononulosonic acid)、唾液酸、戊糖分子(如木糖)和其他分子(包括糖基化蛋白中通常包含的那些)。
在本发明抗体或其片段的背景下，术语“CDR”指任意抗体互补决定区。在抗体的可变(V)结构域中有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。因为抗体通常由两条多肽链构成，所以对于每个抗原受体通常约有6个CDR可与抗原相接触(重链和轻链各包含三个CDR)。其中，CDR3显示最大的可变性。CDR结构域已被广泛研究，因此，一般技术人员能够很好地鉴定抗原受体VL和VH结构域多肽序列中的CDR区域(即，CDR1、CDR2和CDR3)。在一种优选方法中，VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3区如以下所述确定：
VL结构域的CDR1：
CDR1的第一氨基酸位于VL结构域的约23或24位残基。CDR1第一氨基酸之前的残基是保守的Cys残基。CDR1区最后一个氨基酸之后的残基为保守的Trp残基，其后通常是Tyr-Gln，但也有Leu-Gln、Phe-Gln或Tyr-Leu。VL结构域的CDR1的长度为10至17个残基。
VL结构域的CDR2：
CDR2一般位于CDR1结束后的第16个残基。CDR2第一氨基酸之前的残基一般是Ile-Tyr，但也有Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe或类似的。CDR2区的长度一般是7个残基。
VL结构域的CDR3：
VL结构域的CDR3区开始于CDR2区结束后第33个残基。CDR3第一氨基酸之前的残基总是Cys。CDR3之后的氨基酸是Phe-Gly-XXX-Gly。CDR3区的长度通常是7至11个残基。
在一种优选方法中，VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3区如以下所述确定：
VH结构域的CDR1：
CDR1的第一氨基酸位于VH结构域的约26位残基(总是在Cys后约4或5个残基)。CDR1之后的氨基酸是Trp(通常是Trp-Val，但也有Trp-Ile或Trp-Ala)。VH结构域的CDR1的长度为10至12个残基。
VH结构域的CDR2：
CDR2结构域开始于VH结构域CDR1结束后第15个残基。CDR2结构域之前通常是氨基酸Leu-Glu-Trp-Ile-Gly或其变体。CDR2结构域之后是三个氨基酸(Lys/Arg)-(Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala)-(Thr/Ser/Ile/Ala)并且总共包含约16至19个残基。
VH结构域的CDR3：
VH结构域的CDR3的第一氨基酸位于VH结构域CDR2结束后第33个残基，并且总是开始于保守Cys残基后第3个氨基酸(前面的序列通常是Cys-Ala-Arg)。CDR3之后的残基是Trp-Gly-XXX-Gly。VH结构域的CDR3的长度通常是3至25个残基。
下表1提供了本文涉及抗体的汇总：
Figure BDA00002720262200061
Figure BDA00002720262200071
下表2提供了本文涉及序列的汇总：
Figure BDA00002720262200072
Figure BDA00002720262200081
Figure BDA00002720262200091
本发明人已鉴定了具有改善的效力的新型脂质缀合抗体。例如，与脂质连接将使起病毒融合抑制剂作用的抗体更为有效。例如，不受理论束缚，推测通过与脂质连接进行修饰的抗体表现出细胞外基质中的抗体与脂质膜(例如细胞或包膜病毒颗粒的膜)结合的抗体之间分配比率的提高。例如，本发明抗体及其片段偏好性地定位于质膜，尤其是质膜的脂质筏微结构域，在此处它们可例如更加有效地阻止病毒进入。这使得允许施用减少量的治疗性和预防性抗体，以在低剂量下达到与现有技术之相应非修饰抗体以各自较大剂量所达到的相同的健康益处。此外，本发明抗体的脂质部分还可有助于细胞摄取这些抗体，例如，允许将治疗性运载物(cargo)或甚至细胞毒性运载物(适合于特异性移除例如癌细胞)运输至靶细胞。
在第一方面，本发明提供了抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与脂质任选地通过接头共价连接，其中所述脂质或所述接头与所述抗体或其片段的抗体结构域(选自VL、VH、CL、CH1、CH2和CH3)中的氨基酸共价连接。
在一些优选实施方案中，可对本发明抗体及其片段进行修饰以增强稳定性以及增强抗原结合。影响稳定性的因素包括隐藏在全Ig分子界面之恒定区界面的疏水残基的暴露；引起分子间相互作用的Fv表面上疏水区的暴露；和Fvβ折叠内部或VH与VL正常界面上的亲水残基(Chowdhury等，Engineering scFvs for Improved Stability，Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(Welschof和Krauss编辑)，第237-254页，Humana Press，Totowa，New Jersey，2003.)。通过替换影响稳定性的带来问题的残基可增强稳定性。这种修饰可通过以下方法实现：例如，在本发明抗体或其片段的多肽链中进行多至一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或多至十个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***，优选至多三个并且最优选一个单替换、缺失、修饰和/或***。考虑带来问题的残基来增强单链抗体稳定性的技术为本领域所公知(Chowdhury等，Engineering scFvs for Improved Stability(Welschof和Krauss编辑)，第237-254页，Humana Press，Totowa，New Jersey，2003.)。
在一个优选实施方案中，本发明抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双功能抗体、四功能抗体、纳米抗体、嵌合抗体和去免疫化抗体(deimmunized antibody)。
在一个优选实施方案中，本发明抗体的片段是选自以下的抗体片段：Fab、F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv和二硫键连接的Fv(dsFv)。本发明抗体或其片段优选能够结合脂质膜。此外，本发明抗体或片段优选能够：
(i)被内化至细胞内；
(ii)结合细胞质膜和/或
(iii)结合包膜病毒的脂质膜。
在一些优选实施方案中，上面提到的本发明抗体或其片段的脂质允许其通过脂质筏结合质膜，和/或优选通过脂质筏被内化至细胞内。许多病原体(例如流感病毒)通过脂质筏进入细胞，因而有利的是本发明抗体不仅在细胞表面还在细胞内表现出中和这些病原体的能力。内化可通过多种方法进行研究，例如Dyer&Benjamins，J.Neurosci.(1988)883-891；D.C.Blakey1等，J.Cell Biochem.Biophys.24-25(1994)175-183；Coffey等，J.Pharmacol.Exp.Ther.310(2004)896-904中描述的那些。
一般技术人员也完全能够没有过度负担地测试抗体或其片段是否结合例如细胞或包膜病毒的脂质膜，所述包膜病毒例如HIV、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鼻病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗病毒、登革病毒、SARS-CoV、水痘-带状疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水疱性口炎病毒、博尔纳病病毒(Borna disease virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、疫苗病毒(Vaccinia virus)、轮状病毒、仙台病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、亨德拉病毒(Hendra virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、埃博拉病毒、马尔堡病毒(Marburg virus)、胡宁病毒(Junin virus)、马丘波病毒(Machupovirus)、Guanairito病毒或拉沙热病毒(Lassa virus)。
对于这种分析而言，多种手段(例如基于荧光的方法(例如共定位研究、淬灭等)、电子显微镜研究等)是易获得并且适合的。
在本发明抗体或其片段的一个实施方案中，除脂质膜(例如质膜)之外，抗体还结合(优选特异性结合)选自以下的多肽：HIV gp41(例如登录号AAA19156.1)、HIV gp120、流感血凝素(例如，登录号AAA43099.1或CAA40728.1)、副粘病毒的蛋白F(例如，登录号AAV54052.1)、丝状病毒的蛋白GP2(例如，登录号Q89853.1或AAV48577.1)、黄病毒的蛋白E(例如，登录号AAR87742.1)、冠状病毒的蛋白S(例如，登录号AAP33697.1或BAC81404.1)和沙粒病毒的蛋白G2(例如，登录号BAA00964.2或P03540)。
在本发明抗体或其片段的另一实施方案中，除脂质膜(例如质膜)之外，抗体还结合(优选特异性结合)选自以下的多肽：HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、CD20、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)和清道夫受体B1(scavanger receptor B1，SR-B1)。
本领域技术人员能够通过通过实验(也可以通过其他方式)测定本发明抗体或其片段是否结合抗原(例如上面提到的多肽之一)。例如，可以使用下拉测定(pull down assay)分析抗体或其片段与多肽或蛋白质之间的相互作用。例如，多肽可被纯化并固定于固相(例如珠)上。在一个实施方案中，可使与多肽连接的珠与抗体或其片段相接触，洗涤，并使用现有技术中已有的对抗体或其片段的不可变部分特异的第二抗体进行探测。也可使用本领域公知且适于测定两种结合伴侣之间的亲和力的其他结合测定，例如基于ELISA的测定、基于荧光共振能量转移(FRET)的测定、免疫共沉淀测定和等离子体共振测定。可通过荧光方法(例如，使用荧光标记的第二抗体)或本领域公知的酶促方法对结合进行检测。也可使用放射性测定评价结合。因此，上述示例性方法中的任何一种可用于测定本发明抗体或其片段是否结合特定多肽，并且任选地测定抗体或其片段结合上述抗原的解离常数KD。
本发明抗体或其片段的脂质与所述抗体或其片段的氨基酸(任选地通过接头)连接。优选地，氨基酸位于：
(1)所述抗体或其片段VL结构域的CDR-1区的N端；
(2)所述抗体或其片段VH结构域的CDR-1区的N端；
(3)所述抗体或其片段VL结构域的CDR-3区内；或
(4)所述抗体或其片段VH结构域的CDR-3区内。
如上所述，抗体的CDR区在本领域中被很好地表征，并且对于任何抗体或抗体片段技术人员都可确定抗体的CDR区。以下示出的实施例9-11和图8-16具体指出可用于共价连接脂质(任选通过接头)的特别优选的抗体Fab片段轻链和重链氨基酸。
氨基酸的优选位置是：
(1)所述抗体或其片段VL结构域的20位或22位；
(2)所述抗体或其片段VL结构域的19位或21位；
(3)所述抗体或其片段VH结构域的7位或25位；
(4)所述抗体或其片段CL结构域的197位；
(5)所述抗体或其片段CH1结构域的125位；
(6)所述抗体或其片段CH2结构域的248或326位；或
(7)所述抗体或其片段CH3结构域的415或442位；
最优选的位置是VL结构域的19、20、21和22位。本文使用的“位/位置”指所述氨基酸在抗体或其片段重链或轻链内的位置。所述位置具体指明氨基酸位于所述相应抗体或其片段轻链或重链的第一个N端氨基酸下游所示数目处。以下实施例9-11提供了所提到的优选Fab片段及其各自优选的氨基酸位置的几个实例(也参见图8-16)。使用序列比对，一般技术人员完全能够确定任何给定抗体中VL或VH结构域内的这些和上述氨基酸位置，优选从所述VL或VH结构域N端进行计数。
本文使用的“脂质”可以是任何脂质，只要它能够***细胞膜或等价的脂质双层。优选地，“脂质”及其衍生物能够整合入和/或形成筏，如Xu，J.Biol.Chem.276，(2001)33540-33546和Wang，Biochemistry 43，(2004)1010-8中所述。
本发明的一些优选实施方案包括本发明抗体及其片段，其中脂质选自胆固醇、鞘脂、糖脂、甘油磷脂及其衍生物或可药用盐。
在所述抗体或其片段的一个优选实施方案中，脂质是糖脂，其选自神经节苷脂、脑苷脂、红细胞糖苷酯和硫苷酯(sulfatide)。神经节苷脂可选自例如GD1a、GD1b、GM1、GD3、GM2、GM3、GQ1a和GQ1b。
在所述抗体或其片段的另一优选实施方案中，脂质是鞘磷脂或神经酰胺。在一个优选实施方案中，如果脂质是甘油磷脂，则甘油磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸。
胆固醇能够***细胞膜内。这种特性似乎至少是造成本发明抗体及其片段有利特性的原因的一部分。因此，还优选这样的本发明抗体或其片段，其中脂质是胆固醇或胆固醇的衍生物。这样的衍生物在结构上与胆固醇相关，因为它们具有相同的类固醇基本结构(即，(8R，9S，10R，13S，14S)-10，13-二甲基-1，2，6，7，8，9，11，12，14，15，16，17-十二氢环戊[a]菲)，并且优选具有这样的相似能力：***具有如人细胞中发现之脂质组成的脂质双层内。胆固醇的优选整合衍生物包括麦角固醇、7-二氢胆固醇和豆甾醇。可以通过本领域已知方法例如荧光标记的胆固醇及其结构衍生物在人工脂质双层上测试***脂质双层的能力。在一个优选实施方案中，用于本发明的脂质的整合衍生物能够整合入细胞膜所包含的脂质筏。可整合入脂质筏的脂质一般也可形成脂质筏。因此，可例如使用Xu，J.Biol.Chem.276，(2001)33540-33546和Wang，Biochemistry 43，(2004)1010-8所述测试脂质是否可整合入脂质筏并从而形成脂质筏。
优选地，与抗体或其片段任选地通过接头共价连接的脂质是非极性的，例如，它不包含任何带电取代基。此外，优选地，正如上面还提到的，所述脂质能够***(segregate)细胞膜的脂质筏结构域。这意味着用于本发明的脂质优选地在脂质筏中选择性积累。可以如上面提到的或者例如通过使细胞与包含放射性同位素的脂质相接触，然后通过例如蔗糖梯度离心从这些细胞中分离脂质筏微结构域(如RADEVA等，Biochem.J.(2004)380，p.219-230和Kim等，“The Isolation of Detergent-ResistantLipid Rafts for Two-Dimensional Electrophoresis”.Methods in MolecularBiology(2008)，第424卷，第413-422页)来容易地测试脂质是否***脂质筏。因此，特异性结合和/或***脂质筏微结构域的本发明优选脂质与脂质筏共分级(co-fractionate)。在上述实例中，在分离的脂质筏中将检测到放射性脂质，即脂质筏级分中存在的放射性总量大于未与筏一起分离的剩余脂质级分的放射性总量。
在一个优选实施方案中，脂质是荧光脂质，优选能够***脂质筏的荧光脂质，最优选具有式(I)-(III)中任何一种结构的脂质：
Figure BDA00002720262200141
其中R表示与所述接头(如果存在)或者抗体或其片段的氨基酸(优选所述氨基酸含硫部分(例如巯基))所成的键。
术语“共价连接”指抗体或其片段的氨基酸与脂质(例如胆固醇)或本文所述接头(可位于抗体或其片段与所述脂质之间)之间的共价键。
在抗体或其片段的一些优选实施方案中，所述脂质选自鞘脂、糖脂和甘油磷脂，其经由脂质的游离-OH、-NH3或-COOH基团任选地通过所述接头与本发明所述抗体或其片段轻链或重链的C端共价连接。
优选地，脂质是具有式IV结构的鞘脂：
其中
＊表示脂质与接头或本发明所述抗体或其片段的所述氨基酸连接之处，并且其中R1至R4选自下表：
R1 R2 R3 R4
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NHCO (CH2)14CH3
COCH2O (CH2)12CH3 NHCO (CH2)14CH3
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NHCO (CH2)14CH3
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NHCO (CH2)18CH3
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NHCO (CH2)7CHCH(CH2)5CH3
COCH2CH2COO (CH2)17CH3 NHCO (CH2)28CH3
COCH2CH2CONH (CH2)12CH3 NHCO (CH2)14CH3
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NH (CH2)15CH3
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NHSO2 (CH2)14CH3
COCH2CH2COO (CH2)12CH3 NHCONH (CH2)17CH3
COCH2CH2COO (CH2)17CH3 OCO (CH2)28CH3
COC H2CH2COO (CH2)12CH3 NHCONH (CH2)15CH3
本发明抗体或其片段还包括其可药用盐。术语“可药用盐”指本专利申请中指出的化合物的盐，其包括酸加成盐，其可例如通过将本发明抗体或其片段或本发明脂质的溶液与可药用酸的溶液混合形成，所述可药用酸例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。此外，当本发明抗体或其片段带有酸性部分时，其合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)；以及与合适有机配体形成的盐(例如，使用反阴离子(如卤素、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸基和芳基磺酸基)形成的铵、季铵和胺阳离子)。可药用盐的示例性实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐(camsylate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙烷磺酸盐(ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡庚糖酸盐(glucoheptonate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、glycolylarsanilate、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明盐(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、异硫化羟酸盐(isothionate)、乳酸盐、乳糖醛酸盐(lactobionate)、月桂酸盐、月桂硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、甲烷磺酸盐(methanesulfonate)、甲基硫酸盐、粘液酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、苦味酸盐、特戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙基碘、十一酸盐、戊酸盐等(参见例如Berge，S.M.等，″Pharmaceutical Salts″，Journal of PharmaceuticalScience，1977，66，1-19)。本发明抗体及其片段一般包含碱性和酸性两种官能性(例如Glu、Asp、Gln、Asn、Lys或Arg)，从而允许化合物转化为碱加成盐或酸加成盐。
术语接头优选地指采用线性构象的有机分子。所述接头(优选不可切割的接头)的优选长度为0.4nm至15nm。接头长度的这种特定优选范围赋予本发明抗体及片段以最佳活性(例如抗病毒活性)。因此，在这种情况下优选接头长度为0.4nm至15nm并且抗体特异性结合选自以下的多肽：HIV gp41(例如登录号AAA19156.1)、HIV gp120、流感血凝素(例如，登录号AAA43099.1或CAA40728.1)、副粘病毒的蛋白F(例如，登录号AAV54052.1)、丝状病毒的蛋白GP2(例如，登录号Q89853.1或AAV48577.1)、黄病毒的蛋白E(例如，登录号AAR87742.1)、冠状病毒的蛋白S(例如，登录号AAP33697.1或BAC81404.1)和沙粒病毒的蛋白G2(例如，登录号BAA00964.2或P03540)。
这种情况下还优选接头长度为0.4nm至15nm并且抗体特异性结合选自以下的多肽：HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、CD20、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)和清道夫受体B1(SR-B1)。
本发明抗体或其片段的一个优选实施方案的典型接头可包括聚合间隔单元(polymeric spacer unit)，其优选具有给定单体的1至30个重复；并且在间隔单元一端具有允许连接氨基酸的部分，优选这样的的氨基酸，其包含化学官能团(像-SH、-OH、-COOH、-NH2、-HC＝O、-RC＝O、-O-NH2、-N＝N＝N、-C＝C-、-C≡C或-NH-NH2)，并且在另一端具有允许连接所述脂质(例如胆固醇或其衍生物)(优选经由类固醇结构的3-氧部分)的部分。
优选地，本发明抗体或其片段的脂质或接头与所述抗体或其片段通过选自以下的键共价连接：酰胺键、酯键、硫醚键、硫酯键、醛键和肟键。可用于本发明的不可切割的接头***的实例包括本领域所公知的碳二亚胺(EDC)、巯基-马来酰亚胺和高碘酸***。在碳二亚胺***中，水溶性碳二亚胺与脂质或者抗体或其片段的羧酸基反应，导致该羧基活化。随后使羧基偶联至脂质或者抗体或其片段上存在的氨基。该反应的结果是脂质与抗体或其片段之间不可切割的酰胺键。在巯基-马来酰亚胺***中，例如使用化合物(如Traut’s试剂)将巯基引入到抗体或其片段的胺基上。然后使脂质或包含脂质的接头与NHS酯(例如γ-马来酰亚胺丁酸NHS酯(GMBS))反应形成与巯基有反应性的马来酰亚胺衍生物。然后两种被活化的化合物(如抗体和脂质)反应形成不可切割的共价键。高碘酸偶联需要可存在于抗体或其片段上的寡糖基团的存在。这允许由可存在于抗体或其片段上的碳水化合物基团形成活性醛基。然后这些基团可与脂质或接头上的氨基反应产生稳定的缀合物。或者，高碘酸氧化的抗体可与脂质或接头的酰肼衍生物反应，这也产生稳定的缀合物。
优选地，接头或脂质与本发明所述抗体或其片段的半胱氨酸共价连接。接头的优选实例包括Y、-(CH2)n-、-(CH2CH2X)n-、-(CH2CH2CH2X)n-、-Y-(CH2CH2X)n-、-Y-(CH2CH2CH2X)n-、-Y-(CH2CH2X)n-Z、-Y-(CH2CH2CH2X)n-Z、-Y-(CH2CH2X)n-CH2-Z、-Y-(CH2CH2CH2X)n-CH2-Z、-Y-(CH2CH2X)n-CH2-CH2-Z、-Y-(CH2CH2CH2X)n-CH2-CH2-Z、糖基磷脂酰肌醇(GPI)、多核苷酸、氨基酸、多肽、碳水化合物及其组合；其中X是-O-或-NH-，Y是-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-CH2-(C＝O)-NH-或-CH2-，Z是-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-，并且n是0至40的整数(即，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40)；更优选n是4至24的整数(即，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)。
如果与本发明抗体或其片段连接(任选地通过所述接头)的脂质是胆固醇或其衍生物，则优选该脂质通过胆固醇或其衍生物3位上的氧部分直接或通过接头与抗体或其片段连接。
在一个优选实施方案中，脂质(优选胆固醇)或接头与Cys氨基酸的巯基部分连接，所述Cys氨基酸是抗体或其抗体片段中天然存在的或者通过诱变被引入到所述抗体或其片段中。
胆固醇和本发明抗体或其片段的接头部分的特别优选结构示于式(V)至(XIV)：
Figure BDA00002720262200181
Figure BDA00002720262200191
Figure BDA00002720262200201
其中在每个实例中X独立地选自-NH-、-CH2-和-O-；Y选自-CH2-、-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-CH2-(C＝O)-NH-和-CH2-；Z是-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-；
R表示与接头或抗体或其片段(优选与其氨基酸的含硫部分(例如，巯基))连接的键；并且
n是0至40的整数(即，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)，更优选n是4至24的整数(即，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)；并且j是选自0至40的整数(即，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)，更优选j是4至24的整数(即，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)。
在本发明抗体或其片段的一些优选实施方案中，与所述脂质或所述接头共价连接的所述氨基酸包含于所述抗体或其片段的轻链中，并且最优选包含于所述抗体或其片段的VL结构域中。
在一个优选实施方案中，本发明抗体或其片段包含带有VH结构域的重链和带有VL结构域的轻链，其中所述VH和VL结构域分别具有i)至xxiv)中任一种的氨基酸序列：
Figure BDA00002720262200211
并且其中轻链和重链总共任选地包含一个、两个或三个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***。优选地，上述实施方案(i)、(iii)、(v)、(ix)、(xi)、(xv)、(xvii)、(xix)、(xxi)和(xxiii)中的所述脂质或所述接头与本发明抗体或其片段各自VL结构域第20位的氨基酸(优选半胱氨酸)共价连接。优选地，上述实施方案(ii)、(iv)、(vi)、(viii)、(x)、(xii)、(xvi)、(xviii)、(xx)、(xxii)和(xxiv)中的所述脂质或所述接头与本发明抗体或其片段各自VL结构域第22位的氨基酸(优选半胱氨酸)共价连接。还优选地，上述实施方案(xiii)中的所述脂质或所述接头与本发明抗体或其片段各自VL结构域第19位的氨基酸(优选半胱氨酸)共价连接。还优选地，上述实施方案(xiv)中的所述脂质或所述接头与本发明抗体或其片段各自VL结构域第21位的氨基酸(优选半胱氨酸)共价连接。
优选地，上述抗体及其片段还能够通过所述脂质特异性结合脂质膜，例如质膜中的脂质筏微结构域。
在本发明抗体或其片段的另一更优选实施方案中，所述抗体选自单克隆抗体，所述单克隆抗体选自MAB F10、MAB CR6261、MAB D5、MAB2F5、MAB 4E10、MAB VRC01、MAB VRC02、帕利珠单抗、莫维珠单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗(bevacizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、西妥昔单抗、兰尼单抗(ranibizumab)、英利昔单抗(infliximab)，其中所述单克隆抗体任选地包含一个或两个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***。
本申请全文中使用的短语蛋白质或多肽的“单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***”一般指所述蛋白质或多肽的修饰形式，例如，所述蛋白质或多肽的一个氨基酸可以被缺失、***、修饰和/或替换。如果多肽或蛋白质包含数个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***，则在每种情况下指出这种替换、缺失、修饰和/或***的总数。所述***是将指定数目的单氨基酸***到初始多肽或蛋白质中。蛋白质或多肽的氨基酸也可被指定总数的修饰所修饰，例如化学修饰。例如，蛋白质或多肽氨基酸的侧链或游离氨基或羧基可通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等进行修饰。正如本领域所公知的，化学修饰可以在体内(如宿主细胞中)发生。例如，存在于蛋白质氨基酸序列中的合适的化学修饰基序(如糖基化基序)使蛋白质被糖基化。如果多肽或蛋白质包含一个或多个单氨基酸替换，则在每种情况下所述替换可以独立的为保守或非保守替换，优选保守替换。在一个最优选实施方案中，所有替换都具有以下进一步限定的保守性质。在一些实施方案中，替换还包括将天然氨基酸替换为非天然氨基酸。保守替换包括将氨基酸替换为与被替换氨基酸具有类似化学性质的另一氨基酸。优选地，所述保守替换为选自以下的替换：
(i)将碱性氨基酸替换为另一不同的碱性氨基酸；
(ii)将酸性氨基酸替换为另一不同的酸性氨基酸；
(iii)将芳族氨基酸替换为另一不同的芳族氨基酸；
(iv)将非极性脂肪族氨基酸替换为另一不同的非极性脂肪族氨基酸；
以及
(v)将极性不带电氨基酸替换为另一极性不带电氨基酸。
碱性氨基酸优选地选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸。芳族氨基酸优选选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂肪族氨基酸优选选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性不带电氨基酸优选选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸替换不同的是，非保守氨基酸是将一个氨基酸替换为不属于以上概括的(i)至(v)的保守替换的任何氨基酸。
如果蛋白质或多肽包含一个或指定数目的单氨基酸缺失，则存在于参照多肽或蛋白质序列中的所述氨基酸被移除。
在另一个实施方案中，本发明抗体或其片段重链的CDR3结构域包含以下序列或由其组成：
RRGPTTXXXXXXARGPVNAMDV(SEQ ID NO：46)或
EGTTGXXXXXXPIGAFAH(SEQ ID NO：47)；
其中在每种情况下X可以是任何氨基酸并且其中脂质与命名为X的氨基酸之一共价结合；并且
其中根据SEQ ID NO：46或47的所述序列任选包含一个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明抗体或其片段，还包含一种或更多种可药用稀释剂；载体；赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂；辅剂和/或防腐剂。
特别优选地，本发明药物组合物可以以全身施用药剂的形式使用。这包括肠胃外施用，其包括注射剂和输液剂等。注射剂被配制成安瓿或所谓即用注射剂形式，例如即用注射器或一次性注射器以及除此以外的用于多次吸取的可穿刺瓶。注射剂的施用可以是皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)或皮内(i.c.)施用形式。特别地，可分别将合适的注射制剂生产为晶体悬液、溶液、纳米颗粒或胶体分散体系(如水溶胶)。
注射制剂还可被生产为浓缩液，其可用水性等渗稀释剂溶解或分散。输液剂也可制备成等渗溶液、脂肪乳剂、脂质体制剂和微乳剂的形式。与注射剂类似，输液制剂也可制备成用于稀释的浓缩液形式。注射制剂也可以在住院患者和不住院治疗的两种治疗中以长期输注形式施用，例如通过微型泵。
可向肠胃外药物制剂中添加例如白蛋白、等离子体、膨胀剂、表面活性物质、有机稀释剂、影响pH的物质、复合物质或聚合物质，尤其是作为影响本发明药物组合物吸附蛋白质或聚合物的物质，或者也可添加它们以降低本发明药物组合物在材料(像注射仪器或包装材料，如塑料或玻璃)上的吸附。
在一些实施方案中，本发明药物组合物还可与肠胃外制剂的微载体或纳米颗粒结合，例如与基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸酯、聚甘醇酸酯、聚氨基酸或聚醚氨酯的细分散颗粒结合。本发明药物组合物还可被改造为储库制剂(depot preparation)，例如，如果分别以细分散、分散或悬浮形式或者药剂中晶体的悬液的形式引入本发明组合物，则基于“多单元原则”；或者，如果本发明组合物包封在制剂(例如，片剂或随后将植入的棒)中，则基于“单单元原则”。单单元和多单元制剂中的这些植入物或储库药剂经常由所谓的生物可降解聚合物(例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖)制成。
本发明组合物中的辅剂可优选是无菌水，影响pH值的物质例如有机或无机酸或碱以及其盐、调节pH值的缓冲物质、等渗物质例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖、表面活化剂(tenside)和表面活性剂，和乳化剂例如聚乙二醇山梨糖醇酐的脂肪酸的偏酯如
Figure BDA00002720262200241
或者例如聚乙二醇的脂肪酸酯如
Figure BDA00002720262200242
脂肪油例如花生油、豆油或蓖麻油、脂肪酸的合成酯例如油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和中性油(如
Figure BDA00002720262200243
以及聚合的辅剂例如明胶、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、增加有机溶剂溶解度的添加剂例如丙二醇、乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇或形成复合物的物质例如柠檬酸酯和尿素、防腐剂例如苯甲酸羟丙酯和甲酯、苄醇、抗氧化剂例如亚硫酸钠和稳定剂如EDTA。
在一个优选实施方案中，当将本发明药物组合物配制为悬液时，添加防止本发明药物组合物沉降的增稠剂、或确保沉淀的再悬浮能力的表面活化剂和聚电解质和/或复合物形成剂(例如EDTA)。还可形成活性成分与多种聚合物的复合物。这些聚合物的实例是聚乙二醇、聚苯乙烯、羟甲基纤维素、
Figure BDA00002720262200244
或聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯。在一些具体实施方案中，可添加分散剂作为另外的辅剂。为了生产冻干制剂，可使用支架剂(scaffolding agent)如甘露醇、葡聚糖、蔗糖、人白蛋白、乳糖、PVP或多种明胶。
在另一方面，本发明提供了本发明抗体或其片段或药物组合物用于治疗或预防选自以下的疾病：癌症、代谢病(包括但不限于高血糖症和糖尿病)、肥胖症、高血压、高胆固醇血症、***反应、哮喘、阿尔兹海默病和感染性疾病(包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病)。优选地，由病毒引起的疾病是由选自以下的病毒引起：HIV、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鼻病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗病毒、登革病毒、SARS-CoV、水痘-带状疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水疱性口炎病毒、博尔纳病病毒、新城疫病毒、疫苗病毒、轮状病毒、仙台病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、Guanairito病毒或拉沙热病毒。
优选地，一定量的本发明抗体、其片段和药物组合物用于治疗疾病，例如患者的每平方米体表为5至400mg，更优选10至375mg，最优选20至100mg的抗体或其片段。但是，应理解根据疾病的严重性、疾病类型以及待治疗的相应患者(如患者的一般健康状态等)，需要不同剂量的本发明药物组合物来引出治疗效果。如果将公知且已充分表征的抗体与本发明的脂质缀合，则优选本发明的经修饰抗体以比对原始未修饰抗体所建议的剂量低1/3至2/3的剂量施用。适当剂量的确定由主治医生判断。
在不偏离本发明范围的情况下，本发明的多种修饰和变化形式对于本领域技术人员是显而易见的。尽管通过具体的优选实施方案已对本发明进行了描述，但是应理解所要求保护的本发明不应过度受限于这些具体实施方案。事实上，本发明旨在涵盖对于相关领域技术人员明显的进行本发明的所述方法的多种修饰。
以下附图仅仅是说明本发明，并且不应解释为以任何方式限制所附权利要求指定的本发明范围。
附图说明
图1.MAB D5的胆固醇结合位置。该图基于具有5个螺旋的Fab D5复合物的晶体结构(如Luftig等，Nat.Struct.Mol.Biol.13(2006)740-746所报道)。所选择的用于结合胆固醇的残基(VL的T20、T22)被描绘成球体。(A)侧视图，大概垂直于膜平面。(B)顶视图，从靶细胞膜向病毒细胞膜看。将Fab旋转90°，表明D5的胆固醇结合位置与抗原结合表面之间不存在空间位阻。
图2.MAB 2F5的胆固醇结合位置。该图基于Fab 2F5与对应于gp41上其表位的肽的复合物的晶体结构(如Ofek，G.等，2010，Relationshipbetween Antibody 2F5 Neutralization of HIV-1and Hydrophobicity of ItsHeavy Chain Third Complementarity-Determining Region.J Virol84：2955-2962和Ofek，G.等，2004，Structure and mechanistic analysis ofthe anti-human immunodeficiency Virus type 1antibody 2F5 in complexwith its gp41 epitope.J Virol 78：10724-37所报道)。所选择的结合胆固醇的残基(VL的T20、T22)被描绘成球体。与Fab 2F5缀合的接头和胆固醇、剩余的gp41胞外结构域和跨膜结构域以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。
图3.MAB 4E10的胆固醇结合位置。该图基于Fab 4E10与对应于gp41上其表位的肽的复合物的晶体结构(如Cardoso，R.M.F.等，2005；Broadly Neutralizing Anti-HIV Antibody 4E10Recognizes a HelicalConformation of a Highly Conserved Fusion-Associated Motif in gp41.Immunity 22：163-173所报道)。所选择的结合胆固醇的残基(VL的T20、S22)被描绘成球体。与Fab 4E10缀合的接头和胆固醇、剩余的gp41胞外结构域和跨膜结构域以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。
图4.MABVRC01的胆固醇结合位置。该图基于Fab VRC01与gp120之复合物的晶体结构(如Zhu，T.等，2010；Structural Basis for Broad andPotent Neutralization of HIV-1by Antibody VRC01.Science 2010年7月，DOI：10.1126/science.1192819所报道)。所选择的结合胆固醇的残基(VL的I20、S22)被描绘成球体。与Fab VRC01缀合的接头和胆固醇、剩余的gp120以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。
图5.MAB CR6261的胆固醇结合位置。该图基于Fab CR6261与H5N1流感病毒血凝素(HA)之复合物的晶体结构(如Ekiert，D.C.等，2009；Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope，Science，324：246-51所报道)。所选择的结合胆固醇的残基(VL的T19、S21)被描绘成球体。与Fab CR6261缀合的接头和胆固醇、HA的C端序列及其跨膜结构域以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。
图6.利妥昔单抗的胆固醇结合位置。该图基于利妥昔单抗Fab与对应于CD20胞外结构域中其表位的肽的复合物的晶体结构(如Du，J.等，2007；Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibodyRituximab，J.Biol.Chem.，282：15073-15080所报道)。所选择的结合胆固醇残基(VL的T20、S22)被描绘成球体。与利妥昔单抗Fab缀合的接头和胆固醇以及CD20的跨膜结构域以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。
图7.曲妥珠单抗的胆固醇结合位置。该图基于曲妥珠单抗Fab与HER2胞外域的近膜区的复合物的晶体结构(如Cho H.-S.等，2004；Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex withthe Herceptin Fab，Nature，421：756-60所报道)。所选择的结合胆固醇的残基(VL的T20、T22)被描绘成球体。与曲妥珠单抗Fab缀合的接头和胆固醇、HER2的C端序列及其跨膜结构域以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。
图8.西妥昔单抗的胆固醇结合位置。该图基于西妥昔单抗Fab与EGFR胞外结构域的复合物的晶体结构(如Li，S.等，2005；Structural basisfor inhibition of the Epidermal Growth Factor receptor by cetuximab，Cancer Cell，7：301-311所报道)。所选择的结合胆固醇的残基(VL的S20、S22)被描绘成球体。与西妥昔单抗Fab缀合的接头和胆固醇、EGFR的C端序列及其跨膜结构域以手绘图呈现，以示出其相对于膜平面的大概几何结构。与曲妥珠单抗-HER2复合物结构(图5)的对比表明需要不同长度的接头。
图9.显示MAB D5的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图10.显示MAB 2F5的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。还示出没有抗病毒活性的Fab 2F5双突变体。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图11.显示MAB 4E10的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图12.显示MAB VRC01的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图13.显示MAB VRC02的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图14.显示mAb CR6261的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图15.显示帕利珠单抗的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图16.显示莫维珠单抗的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图17.显示利妥昔单抗的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图18.显示曲妥珠单抗的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图19.显示西妥昔单抗的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和最佳位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图20.显示曲妥珠单抗重链和轻链的氨基酸序列以及曲妥珠单抗轻链突变体A(Thr20Cys)(TrastuzumabC20，HerceptinC20)中引入半胱氨酸的位置。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
图21.在与胆固醇-PEPG12-马来酰亚胺反应之后，TrastuzumabC20mAb轻链的重建MS谱(Reconstructed MS spectrum)。质量＝23,436和质量＝24,589的两个峰分别对应还原和烷基化之后未缀合和缀合的轻链(计算的质量差：1151.5，测定值：1153)。
图22.在ErbB2阳性SKBR3细胞上未缀合的(TrastuzumabC20，HerceptinC20)和胆固醇缀合的(TrastuzumabC20-CHOL，HerceptinC20-CHOL)mAb的细胞-ELISA。
实验详述
实施例1.脂质连接抗体的合成。制备包含天然和非天然氨基酸的抗体的方法为本领域所公知。可以使用合成或微生物方法。引入到抗体中的游离半胱氨酸提供了与本发明脂质或接头缀合的可能性。对于抗体衍生化，硫醇反应化学也非常方便，因为大多数抗体除链间和链内二硫键中包含的半胱氨酸之外缺少半胱氨酸。多个作者已表明可在抗体中改造出不成对的半胱氨酸，并将它们用于生物素与细胞毒性药物的区域选择性缀合，从而用于靶向治疗(31、32、43、70、74)。作为硫醇反应化学的一个实例，与胆固醇缀合可通过溴乙酰基胆固醇衍生物与抗体中的游离半胱氨酸残基反应来实现。虽然硫醇反应化学非常方便并且被用于以下实施例，但是其不应被当做在抗体选定位置处连接脂质的唯一可能方法。
实施例2.合成胆固醇衍生化抗体或其衍生物的一般方案。胆固醇部分通过与抗体中半胱氨酸残基之硫醇基所成的硫醚键与抗体连接。缀合物通过(胆固醇上的)溴乙酰基与(抗体上的)游离硫醇之间的化学选择反应来制备(如Zeng等，Vaccine，2001，19，3843-3852中所述)。
Figure BDA00002720262200291
或者，缀合物可通过(胆固醇上的)马来酰亚胺基团与(抗体上的)游离硫醇之间的反应来制备。
Figure BDA00002720262200301
如实施例所述，或者通过其类似方法，通过使用市售化合物或通过公知方法，可制备具有溴乙酰基或马来酰亚胺基的所需胆固醇衍生物。胆固醇衍生物是市售的并且可通过公知方法由市售材料制成。
实施例3.合成溴乙酰基胆固醇
Figure BDA00002720262200302
将100mg胆固醇和40mg溴乙酸(1.1当量)的混合物溶解于10mL无水二氯甲烷。然后加入44μl(1.1当量)的DIPC(N，N-二异丙基碳二亚胺)和1.5mg(0.05当量)的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)。将溶液在室温下搅拌48小时，并使用正己烷/EtOAc 10/1作为溶剂体系通过TLC进行分析。使溶剂蒸发，然后将反应产物通过硅胶快速色谱在正己烷/二氯甲烷1/1中纯化。合并包含产物的级分，蒸发，然后在水/乙腈20/80中冻干。纯化的产物通过NMR进行分析。产率：73％。
实施例4.合成溴乙酰基-PEG4-胆固醇
Figure BDA00002720262200311
4.1胆甾-5-烯-3-基-2，2-二甲基-4-氧代-3，8，11，14，17-五氧杂-5-氮杂二十烷-20-酸酯(1)：将N-t-boc-氨基-dPEG4 TM酸(1g，2.7mmol，产品N°10220，Quanta BioDesign，Ltd.)加入到胆固醇(0.99g，2.7mmol)的40mL CH2Cl2溶液中，然后加入N，N’-二异丙基碳二亚胺(0.43mL，3.2mmol)和4-二甲基氨基吡啶(16mg，5％)。将混合物在室温下搅拌过夜并在真空下蒸发溶剂。将粗品溶解于EtOAc，经HCl 1N、饱和NH4Cl和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。粗品在硅胶上经快速柱色谱(BIOTAGE)以石油醚中25-50％EtOAc的梯度进行纯化，得到作为无色(incolor)油的1.48g期望化合物(产率75％)。
4.21-溴-2-氧代-6，9，12，15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸-胆甾-5-烯-3-基酯(2)：将三氟乙酸(2mL，26mmol)加入到1(1.48g，2mmol)的10mlCH2Cl2溶液中，然后将混合物在室温下搅拌3小时。在真空下除去所有的挥发物，并且使粗品冻干得到无色油，将其溶解于60mL CH2Cl2。加入溴代乙酸酐(0.62g，2.4mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.65mL，3.7mmol)，将混合物在室温下搅拌3小时。在真空下除去溶剂，并且粗品在硅胶(BIOTAGE)上经快速柱色谱以石油醚中50-90％EtOAc的梯度进行纯化，得到作为无色(colourless)油的1.1g期望化合物(两步的产率为74％)。
实施例5.合成溴乙酰基-PEG12-胆固醇
Figure BDA00002720262200321
5.1胆甾-5-烯-3-基-2，2-二甲基-4-氧代-3，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35，38，41-十三氧杂-5-氮杂四十四烷-44-酸酯(3)：
将胺-dPEG12 TM-酸(1.65g，2.7mmol，产品N°10287，QuantaBioDesign，Ltd.)溶解于15mL二氯甲烷，加入Boc-酸酐(0.7g，3.2mmol)，然后加入三乙胺(0.75ml，5.4mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后在减压下蒸发溶剂。
将粗品N-Boc-氨基-dPEG12 TM-酸加入到胆固醇(1.24g，3.2mmol)的55mL CH2Cl2溶液中，然后加入N，N’-二异丙基碳二亚胺(0.62mL，4mmol)和4-二甲基氨基吡啶(16mg，5％)。将混合物在室温下搅拌4小时，在真空中蒸发溶剂。粗品在硅胶上经快速柱色谱(BIOTAGE)以二氯甲烷中2-5％MeOH的梯度进行纯化，得到作为无色油的1.57g期望化合物(两步的产率为55％)。
5.2胆甾-5-烯-3-基-1-溴-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷-42-酸酯(4)：
将三氟乙酸(1.7mL，22mmol)添加到3(1.57g，1.5mmol)的8.5mlCH2Cl2溶液中，然后将混合物在室温下搅拌3小时直至原材料消失。在真空下除去所有的挥发物，并且使粗品冻干得到无色油，将其溶解于45mL CH2Cl2。加入溴代乙酸酐(0.48g，1.8mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.52mL，3mmol)，将混合物在室温下搅拌4小时。在真空下除去溶剂，并且粗品在硅胶(BIOTAGE)上经快速柱色谱以二氯甲烷中2-4％MeOH的梯度进行纯化，得到作为无色油的1.11g期望化合物(两步的产率为67％)。
实施例6.合成胆固醇连接抗体
通过使溴乙酰基胆固醇与抗体缀合来制备抗体。将胆固醇衍生物与抗体以摩尔比10∶1在室温下孵育3-12小时。为了确保抗体硫醇基的反应性不参与形成二硫键，在缀合之前用温和的还原剂例如三-2-羧乙基-膦盐酸盐(TCEP)或游离半胱氨酸处理抗体。胆固醇-抗体产物在HiTrap S柱(GE Helthcare Biosciences)上纯化以除去过量的试剂。缀合抗体在50mM磷酸盐缓冲液pH 7中进行缓冲液置换，并在分子量截断值为30kDa的旋转过滤器上浓缩至约20mg/mL。或者，胆固醇衍生化抗体可通过本领域公知的蛋白A或蛋白G Agarose柱进行纯化。
实施例7.合成PEG4-胆固醇缀合抗体
通过使溴乙酰基-PEG4-胆固醇与抗体缀合来制备抗体。将PEG4-胆固醇衍生物与抗体以摩尔比10∶1在室温下孵育3-12小时。为了确保抗体硫醇基的反应性不参与形成二硫键，在缀合之前用温和的还原剂例如，三-2-羧乙基-膦盐酸盐(TCEP)或游离半胱氨酸处理抗体。胆固醇-抗体产物在HiTrap S柱(GE Helthcare Biosciences)上纯化以除去过量的试剂。缀合抗体在50mM磷酸盐缓冲液pH 7中进行缓冲液置换，并在分子量截断值为30kDa的旋转过滤器上浓缩至约20mg/mL。或者，胆固醇衍生化抗体可通过本领域公知的蛋白A或蛋白GAgarose柱进行纯化。
实施例8.合成PE G12-胆固醇缀合抗体
通过使溴乙酰基-PE G12-胆固醇与抗体缀合来制备抗体。将PE G12-胆固醇衍生物与抗体以摩尔比10∶1在室温下孵育3-12小时。为了确保抗体硫醇基的反应性不参与形成二硫键，在缀合之前用温和的还原剂例如三-2-羧乙基-膦盐酸盐(TCEP)或游离半胱氨酸处理抗体。胆固醇-抗体产物在HiTrap S柱(GE Helthcare Biosciences)上纯化以除去过量的试剂。缀合抗体在50mM磷酸盐缓冲液pH 7中进行缓冲液置换，并在分子量截断值为30kDa的旋转过滤器上浓缩至约20mg/mL。或者，胆固醇衍生化抗体可通过本领域公知的蛋白A或蛋白G Agarose柱进行纯化。
实施例9.选择抗体内的优选缀合位置
在用于引入例如反应性半胱氨酸的许多可能位置中，优选选择这样的抗体氨基酸用于缀合：其允许缀合的脂质部分与靶标膜脂质筏之间的相互作用，但是不干扰抗体特异性结合其蛋白质表位的能力。
在下文中，给出了已知抗病毒抗体与本发明胆固醇缀合的多个实例。出乎意料地，对于所有的抗体，轻链中的特定位置(轻链的19或20位和21或22位残基)代表用于胆固醇结合的可替换的最佳位置。这些位置是根据Voynov等(Voynov，V.，N.Chennamsetty，V.Kayser，H.J.Wallny，B.Helk和B.L.Trout.2010.Design and application of antibody cysteinevariants.Bioconjug Chem 21：385-92)定义的I类变体，即它们与经改造半胱氨酸上独有性标记的小荧光团形成缀合物，并且在缀合之后保持单体构造和稳定。任一残基上缀合胆固醇使抗体具有优良的药物特性和大幅度改善的抗病毒效力。
1.HIV MAB D5的胆固醇衍生物
图1示出MAB D5与其肽表位之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Thr22的位置(Thr20和Thr22表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物(Luftig，M.A.等，2006；Structural basis for HIV-1neutralization by a gp41 fusion intermediate-directed antibody.Nat StructMol Biol 13：740-7)，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为来实现。
2.HIVMAB 2F5的胆固醇衍生物
图2示出MAB 2F5与其肽表位之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Thr22的位置(Thr20和Thr22表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物(Ofek，G.等，2010；Relationship between Antibody 2F5Neutralization of HIV-1and Hydrophobicity of Its Heavy Chain ThirdComplementarity-Determining Region.J Virol 84：2955-2962；并且根据Ofek，G.等，2004；Structure and mechanistic analysis of the anti-humanimmunodeficiency virus type 1antibody 2F5in complex with its gp41epitope.J Virol 78：10724-37)，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为来实现。
3.HIV MAB 4E10的胆固醇衍生物
图3示出mAb 4E10与其肽表位之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Ser22的位置(Thr20和Ser22表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物(Cardoso，R.M.F.等，2005；Broadly NeutralizingAnti-HIV Antibody 4E 10Recognizes a Helical Conformation of a HighlyConserved Fusion-Associated Motif in gp41.Immunity 22：163-173)，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200351
来实现。
4.HIVMABVRC01的胆固醇衍生物。
图4示出mAb VRC01与gp120之复合物的晶体结构中轻链的Ile20和Ser22的位置(Ile20和Ser22表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物(Zhu，T.等，2010；Structural Basis for Broad andPotent Neutralization of HIV-1by Antibody VRC01.Science 2010年7月，DOI：10.1126/science.1192819)，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200352
来实现。
5.流感MAB CR6261的胆固醇衍生物。
图5示出mAb CR6261与流感血凝素3之复合物的晶体结构中轻链Thr19和Ser21的位置(Thr19和Ser21表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物(Ekiert，D.C.等，2009；Antibody recognitionof a highly conserved influenza virus epitope，Science，324：246-51)，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200353
来实现。
6.利妥昔单抗的胆固醇衍生物。
图3示出利妥昔单抗Fab与对应于CD20胞外结构域中其表位之肽的复合物的晶体结构中轻链Thr20和Ser22的位置(如Du，J.等，2007；Structural basis for recognition of CD20by therapeutic antibodyRituximab，J.Biol.Chem.，282：15073-15080所报道)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200354
来实现。
7.曲妥珠单抗的胆固醇衍生物。
图7示出曲妥珠单抗Fab与HER2胞外结构域近膜区之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Thr22的位置(如Cho H.-S.等，2004；Structure of theextracellular region of HER2alone and in complex with the HerceptinFab，Nature，421：756-60所报道)。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200361
来实现。
8.西妥昔单抗的胆固醇衍生物。
图8示出西妥昔单抗Fab与EGFR胞外结构域之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Thr22的位置(如Li，S.等，2005；Structural basis forinhibition of the Epidermal Growth Factor receptor by cetuximab，CancerCell，7：301-311所报道)。与曲妥珠单抗-HER2复合物结构(图7)的比较表明需要不同长度的接头。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200362
来实现。
实施例10.HIV mAb D5的胆固醇衍生物
图1示出mAb D5与其肽表位之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Thr22的位置(Thr20和Thr22表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200363
来实现。
与结合接近病毒性膜之gp41近膜端外部区(membrane-proximalexternal region)的mAb 2F5和4E10不同，mAb D5结合gp41的HR1结构域中的疏水袋，因此更接近于靶细胞膜。
图9显示MAB D5的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优选和优化位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
实施例11.HIV mAb 2F5的胆固醇衍生物
图2示出mAb 2F5与其肽表位之复合物的晶体结构中轻链Thr20和Thr22的位置(参见Ofek，G.等，2004；Structure and mechanistic analysis ofthe anti-human immunodeficiency virus type 1antibody 2F5 in complexwith its gp41 epitope.J Virol 78：10724-37)(Thr20和Thr22表示为球体)。根据目前公认的模型相对于病毒膜来定向复合物，以突出胆固醇基团可如何结合膜而不干扰抗原结合。最佳抗病毒活性通过选择半胱氨酸与胆固醇之间的接头长度(范围为
Figure BDA00002720262200364
来实现。
为了测试胆固醇将替换天然2F5CDR3环的膜筏结合活性的观点，还在环中引入了这样两个突变，其保持对于肽表位的完整结合效力，但是完全破坏抗病毒活性(如Ofek等，J.Virol.84(2010)2955-2962：Leu100ASerand Phe100BSer所述)。
图10显示mAb 2F5的Fab结构域中半胱氨酸氨基酸的优化和优选位置，其定位对于与脂质或包含本发明脂质的接头的共价连接是理想的。还示出没有抗病毒活性的Fab 2F5双突变体。(＊)标记引入的半胱氨酸氨基酸。
实施例12.抗体的抗病毒活性
如Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(2005)14759-14764和Ingallinella等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(2009)5801-5806所述评价抗体对HIV的抗病毒活性，并且如Throsby等，PLoS ONE 3(2008)e3942所述评价抗体对流感的抗病毒活性。
实施例13.胆固醇与抗ErbB2mAb曲妥珠单抗的缀合
产生编码抗ErbB2mAb曲妥珠单抗(
Figure BDA00002720262200371
重链和轻链的表达质粒。还产生编码抗ErbB2mAb曲妥珠单抗的突变轻链(TrastuzumabC20，HerceptinC20)(特征为20位Thr被替换为Cys)的表达质粒。使用Lipofectamine(Invitrogen)将重链和轻链表达质粒瞬时共转染入HEK-293EBNA细胞内，产生野生型和T20→C TrastuzumabC20突变mAb，并且通过Hi-Trap蛋白A柱(Amersham Biosciences)从培养基中纯化全人IgG。
在37℃和N2气氛下将8mg(1.15ml)TrastuzumabC20mAb(7mg/ml-45μM)与200倍过量(9mM)的L-半胱氨酸(128μl的90mML-半胱氨酸的TE pH 8.0原液)孵育4小时，然后将缓冲液更换为TE pH8.0。在室温下将6mg还原的TrastuzumabC20(3.15mg/ml-20μM)与10倍摩尔过量的胆固醇-PEPG12-马来酰亚胺(参见以下结构)(溶解于TEpH 8.0中，终浓度为200μM)孵育45分钟，然后将缓冲液更换为PBS。
通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析确定胆固醇部分与mAb的缀合。在分析之前，在6M盐酸胍，0.1M TRIS氯化物缓冲液pH 8.4中通过5mM DTT或1％β-巯基乙醇(90min，37℃)还原mAb，并通过12.5mM碘乙酰胺或5mM 4-乙烯基吡啶(90min，室温，黑暗)使其烷基化。然后将2.5-5μg经还原和烷基化的mAb注入C8RP柱(ACE 2.1×50mm，
Figure BDA00002720262200381
上并通过包含5％甲醇、0.08％甲酸和0.02％TFA的H2O中的乙腈进行梯度洗脱。将样品直接洗脱到Q-ToF MS杂交***中并进行分析。
图21示出在与胆固醇-PEP G12-马来酰亚胺反应之后，TrastuzumabC20mAb轻链的重建MS谱。质量＝23,436和质量＝24,589的两个峰分别对应还原和烷基化之后未缀合和缀合的轻链(计算的质量差为1151.5，测定值：1153)。图21示出的结果证实多于50％的TrastuzumabC20mAb被胆固醇衍生化。
实施例14.与胆固醇缀合之抗ErbB2mAb曲妥珠单抗与活细胞上展示的靶抗原的结合
对在非酶解离溶液(Sigma)中获得的ErbB2阳性SKBR3细胞(ATCCHTB-30)和ErbB2阴性A431对照细胞(ATCC CRL-1555)进行洗涤，然后转移到U型底微量滴定板(2×105个细胞/孔)。用包含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭之后，将细胞与ELISA缓冲液(PBS/BSA 3％)中100nM的实施例13所述的纯化抗体一起孵育并使其在室温下结合2小时。离心并移除上清液之后，将沉淀细胞在200μl PBS中洗涤两次，重悬于100μl ELISA缓冲液并与过氧化物酶缀合的抗人IgG(Fc特异性)抗体(Sigma)孵育，以检测实施例13的TrastuzumabC20(HerceptinC20)和TrastuzumabC20-CHOL  (包含PEG12-胆固醇部分的HerceptinC20-CHOL)抗体。1小时后，对板进行离心，用PBS洗涤，然后与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma)反应。结合值由450nm吸光度测定，并且报告为至少三次测定的平均值(标准偏差＜5％)。
图21中报告的结果表明，相对于未缀合抗体，TrastuzumabC20-CHOL(HerceptinC20-CHOL)的结合效力增加。在ErbB2阴性A431对照细胞上没有观察到结合。
Figure IDA00002720263100011
Figure IDA00002720263100021
Figure IDA00002720263100031
Figure IDA00002720263100041
Figure IDA00002720263100051
Figure IDA00002720263100061
Figure IDA00002720263100071
Figure IDA00002720263100081
Figure IDA00002720263100091
Figure IDA00002720263100101
Figure IDA00002720263100111
Figure IDA00002720263100131
Figure IDA00002720263100141
Figure IDA00002720263100151
Figure IDA00002720263100161
Figure IDA00002720263100191
Figure IDA00002720263100201
Figure IDA00002720263100211
Figure IDA00002720263100221
Figure IDA00002720263100231
Figure IDA00002720263100251
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Figure IDA00002720263100281
Figure IDA00002720263100291
Figure IDA00002720263100301
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Figure IDA00002720263100401
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Figure IDA00002720263100421
Figure IDA00002720263100431
Figure IDA00002720263100441
Figure IDA00002720263100451

Claims (18)

1.抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与脂质共价连接，任选地通过接头共价连接，其中所述脂质或所述接头与所述抗体或其片段中抗体结构域的氨基酸共价连接，所述抗体结构域选自VL、VH、CL、CH1、CH2和CH3。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能够：
(i)内化入细胞中；
(ii)与细胞的脂质膜结合和/或
(iii)与包膜病毒的脂质膜结合。
3.权利要求1或2的抗体或其片段，其中所述抗体结合选自以下的多肽：HIV gp41、HIV gp120、流感血凝素、副粘病毒的蛋白F、丝状病毒的蛋白GP2、黄病毒的蛋白E、冠状病毒的蛋白S和沙粒病毒的蛋白G2。
4.权利要求1或2的抗体或其片段，其中所述抗体与多肽结合，所述多肽与质膜相关联并且介导选自以下的病毒的结合和进入：逆转录病毒、流感病毒、副粘病毒、丝状病毒、黄病毒、冠状病毒和沙粒病毒。
5.权利要求1或2的抗体或其片段，其中所述抗体结合质膜相关癌抗原。
6.权利要求1至5中任一项的抗体或其片段，其中所述氨基酸位于：
(1)所述抗体或其片段VL结构域CDR-1区的N端；
(2)所述抗体或其片段VH结构域CDR-1区的N端；
(3)所述抗体或其片段VL结构域CDR-3区内；或
(4)所述抗体或其片段VH结构域CDR-3区内。
7.权利要求1至5中任一项的抗体或其片段，其中所述氨基酸位于：
(1)所述抗体或其片段VL结构域的第20位或22位；
(2)所述抗体或其片段VL结构域的第19位或21位；
(3)所述抗体或其片段VH结构域的第7位或25位；
(4)所述抗体或其片段CL结构域的第197位；
(5)所述抗体或其片段CH1结构域的第125位；
(6)所述抗体或其片段CH2结构域的第248或326位；或
(7)所述抗体或其片段CH3结构域的415或442位。
8.权利要求1至7中任一项的抗体或其片段，其中所述脂质选自胆固醇、鞘脂、糖脂、甘油磷脂及其衍生物或可药用盐。
9.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段，其中所述脂质通过接头与所述抗体或其片段共价连接，其中所述接头的长度为0.4nm至15nm，所述接头优选为不可切割的接头。
10.权利要求1至9中任一项的抗体或其片段，其中所述接头或脂质通过选自以下的键与所述抗体或其片段共价连接：酰胺键、酯键、硫醚键、硫酯键、醛键和肟键。
11.权利要求1至10中任一项的抗体或其片段，其中所述接头或脂质与所述抗体或其片段的半胱氨酸共价连接。
12.权利要求1至11中任一项的抗体或其片段，其中所述接头包含选自以下的部分或由其组成：Y、-(CH2)n-、-(CH2CH2X)n-、-(CH2CH2CH2X)n-、-Y-(CH2CH2X)n-、-Y-(CH2CH2CH2X)n-、-Y-(CH2CH2X)n-Z、-Y-(CH2CH2CH2X)n-Z、-Y-(CH2CH2X)n-CH2-Z、-Y-(CH2CH2CH2X)n-CH2-Z、-Y-(CH2CH2X)n-CH2-CH2-Z、-Y-(CH2CH2CH2X)n-CH2-CH2-Z、糖基磷脂酰肌醇(GPI)、多核苷酸、氨基酸、多肽、碳水化合物及其组合；其中X是-O-或-NH-，Y是-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-CH2-(C＝O)-NH-或-CH2-，Z是-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-，并且n是0至40的整数。
13.权利要求1至12中任一项的抗体或其片段，其中所述脂质是胆固醇或其衍生物，并且其中所述脂质通过所述胆固醇或其衍生物3位上的氧部分直接地或通过所述接头与所述抗体或其片段连接。
14.权利要求1至13中任一项的抗体或其片段，其中所述脂质是胆固醇并且所述胆固醇和所述接头部分的结构如式(V)至(XIV)所示：
Figure FDA00002720262100031
Figure FDA00002720262100041
Figure FDA00002720262100051
其中在每种情况下X独立地选自-NH-、-CH2-和-O-；Y选自-CH2-、-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-CH2-(C＝O)-NH-和-CH2-；Z是-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-；
R表示与所述接头或所述抗体或其片段优选与其氨基酸的含硫部分连接的键；以及
n是0至40的整数；以及
j是选自0至40的整数。
15.权利要求1至14中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体选自单克隆抗体，所述单克隆抗体选自MAB F10、MAB CR6261、MAB D5、MAB 2F5、MAB 4E10、MAB VRC01、MAB VRC02、帕利珠单抗、莫维珠单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、阿达木单抗、西妥昔单抗、兰尼单抗、英利昔单抗，其中所述单克隆抗体任选地包含一个或两个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***。
16.权利要求1至5和8至13中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段重链的CDR3结构域包含以下序列或由其组成：
RRGPTTXXXXXXARGPVNAMDV(SEQ ID NO：46)或
EGTTGXXXXXXPIGAFAH(SEQ ID NO：47)；
其中X可以是任何氨基酸，并且其中所述脂质与命名为X的氨基酸之一共价结合；并且
其中SEQ ID NO：46或47的所述序列任选地包含一个单氨基酸替换、缺失、修饰和/或***。
17.权利要求1至16中任一项的抗体或其片段，其用于治疗或预防选自以下的疾病：癌症；代谢病，包括但不限于高血糖症和糖尿病；肥胖症；高血压；高胆固醇血症；***反应；哮喘；阿尔兹海默病；以及感染性疾病，包括但不限于由病毒、细菌和真菌引起的疾病。
18.权利要求17中任一项的抗体或其片段，其中所述由病毒引起的疾病由选自以下的病毒引起：HIV、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鼻病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗病毒、登革病毒、SARS-CoV、水痘-带状疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水疱性口炎病毒、博尔纳病病毒、新城疫病毒、疫苗病毒、轮状病毒、仙台病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、Guanairito病毒或拉沙热病毒。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110672844A (zh) * 2019-10-29 2020-01-10 华中科技大学 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013110790A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Vaccine compositions for hiv prevention and treatment
AU2013229786B2 (en) 2012-03-08 2017-06-22 Halozyme, Inc. Conditionally active anti-epidermal growth factor receptor antibodies and methods of use thereof
MX2015007575A (es) * 2012-12-13 2016-03-15 Univ Pennsylvania Construcciones de anticuerpos de adn y metodo para utilizarlas.
MX2016003256A (es) 2013-09-12 2016-06-07 Halozyme Inc Anticuerpos modificados del receptor de factor de crecimiento anti-epidermico y metodos de uso de los mismos.
JP6822839B2 (ja) * 2013-09-13 2021-01-27 ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート 修飾された治療剤、及びその組成物
AU2014364589B2 (en) 2013-12-18 2020-02-27 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof
DE102014226903A1 (de) * 2014-12-23 2016-06-23 Olympus Winter & Ibe Gmbh HF-Hilfsstoff, medizinisches System und Verfahren zum selektiven Behandeln von Krebsgewebe
WO2017161206A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Halozyme, Inc. Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use
JP6727610B2 (ja) * 2016-09-05 2020-07-22 国立研究開発法人情報通信研究機構 文脈解析装置及びそのためのコンピュータプログラム
WO2018183139A1 (en) * 2017-03-30 2018-10-04 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-CD3/gp120 AND ANTI-CD3/gp41 BISPECIFIC ANTIBODIES
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
IL295413A (en) * 2020-02-27 2022-10-01 Phanes Therapeutics Inc Antibodies conjugated with fatty acid molecules and their uses
WO2022235923A2 (en) * 2021-05-05 2022-11-10 Arcturus Therapeutics, Inc. Peptide-lipid conjugates

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1972711A (zh) * 2004-04-12 2007-05-30 维克托·阿诺玛·恩古 脱脂治疗性疫苗及其使用方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
EP1871424A2 (en) * 2005-04-22 2008-01-02 Alza Corporation Immunoliposome composition for targeting to a her2 cell receptor
FR2924118B1 (fr) * 2007-11-22 2015-02-13 Centre Nat Rech Scient Fragments d'anticorps inhibiteurs de la proteine nef du vih.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1972711A (zh) * 2004-04-12 2007-05-30 维克托·阿诺玛·恩古 脱脂治疗性疫苗及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOGANG PAN: "Synthesis of Cetuximab-Immunoliposomes via a Cholesterol-Based Membrane Anchor for Targeted Delivery of a NeutronCapture Therapy (NCT) Agent to Glioma Cells", 《BIOCONJUG CHEM》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110672844A (zh) * 2019-10-29 2020-01-10 华中科技大学 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

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