CN1030962C - 龋齿预防制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

公开了编码葡聚糖水解酶之基因的分离和克隆，以及外源性葡聚糖酶基因产物在宿主细胞中的表达和分泌。还公开了龋齿预防制剂和其制备方法及应用，包括转化口腔所固有的微生物宿主细胞，以表达和分泌葡聚糖酶基因产物。

Description

龋齿预防制剂的制备方法

本发明一般涉及用于确保外源基因产物的微生物表达的重组方法和材料。特别是涉及用于预防龋齿的微生物制剂和其生产方法。

变形链球菌(Streptococcus mutans)通过由蔗糖合成细胞外多糖聚合物粘附于牙釉质的表面，而引起龋齿。这些多糖中最重要的就是葡聚糖。第一种类型的葡聚糖主要含有α-1，6键(见图1)，类似于经典的右旋糖酐(dertrans)。第二种类型的葡聚糖则主要含有α-1，3键，且不易溶于水。变形链球菌和其它致龋微生物粘附于牙齿表面并分泌有机酸和其它物质腐蚀牙齿，其分泌的有机酸和其它物质可引起牙齿结构之无机成分的脱矿质作用，以及残存有机基质的溶解作用。

过去是用牙刷和牙线刷牙，其械地除去牙齿噬斑(噬斑为一种生龋细菌、不溶性葡聚糖和其它材料的复合物)。然而，重要的是在牙齿被强力刷净之后，细菌又迅速地在几分钟内吸附于牙釉质表面，之后在一、两天内又出现放大镜下可见的菌落。另外，因为噬斑常完整地保留在牙刷或牙线难于达到的部位，故很难确保彻底地清洁牙齿。

最近出现了一系列通过酶分解不溶性葡聚糖聚合物的α-1，3和α-1，6糖苷键的牙膏。这类牙膏的特点是含有α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶(α-1，6葡聚糖酶或右旋糖酐酶)或α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶(α-1，3葡聚糖酶)。在美国专利4,486,330号中，Yoshida等人公开了用于人假牙的清洁组合物，是含有溶于适当缓冲液的β-1，3葡聚糖酶。Simonson等人在美国4,328,313号专利中，Guggenheim等人在美国4,353,891号专利中，分别公开了用于噬斑扩散的α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的生产方法。在美国4,438,093号专利中，Shimada等人则公开了一种用于预防和抑制口腔疾病的口服组合物，由存在于药用载体上的α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶组成。应用含有裂解这种不溶性葡聚糖的酶的牙膏，在刷牙之后不能期望具有分解牙齿噬斑的明显作用，这是因为牙膏的酶成分在刷牙后例行的冲洗时趋于流失。

迄今尚没有使用重组方法克隆和分离α-1，3或α-1，6葡聚糖酶基因的报导。

根据上面对现有技术的描述，显然需要有一种技术来改进在人类口腔中提供葡聚糖酶活性的方法和材料。这样的方法和材料最好应能长时期恒定地提供葡聚糖酶活性，并最好不需要频繁地使用即可达到目的。

本发明提供不同基因组的DNA组成的重组DNA分子，此重组DNA是在活细胞外末端连接起来的，且具有转化宿主细胞并继续存在于宿主细胞和其后代中的能力。此重组DNA含有选自一组编码α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的DNA序列，并含有为表达编码α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的前导DNA片段杂交的DNA片段。本发明还提供表达α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的DNA分子来转化的宿主细胞。特别举例说明的是大肠杆菌和链球菌宿主。本发明也提供含有编码α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶的基因的重组DNA分子。

本发明进一步提供在口腔内引入和长期维持葡聚糖酶活性的方法和材料。明确地说，本发明包括(1)克隆一种产生α-1，3葡聚糖酶、α-1，6葡聚糖酶或其两者的细菌的基因，(2)用此等基因转化一种口腔固有的细菌，以使其表达和分泌该基因产物，以及(3)将转化了的细菌引入口腔内。引入口腔内的转化之生物体的浓度，应能持续地在口腔中表达和分泌足够水平的α-1，3葡聚糖酶、α-1，6葡聚糖酶或其两者，以便降解牙齿噬斑的葡聚糖并防止这种噬斑的聚集，同时防止生龋细菌粘附于牙齿上。对于降解构成牙齿噬斑的不溶性葡聚糖物质来说，结合使用α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶，可产生协同作用。因此，可分别或同时将用于表达和分泌这两种类型葡聚糖酶的基因，引入口腔所固有的一种或不同种转化菌内，并施用于本发明的方法。

下列对本发明的优选实施方案的详细描述，将使本发明的其它方面变得更为清楚。

图1显示不溶性葡聚糖的结构；

图2是存在于大肠杆菌胞浆中的PYEJ001质粒的基因图；

图3是存在于血链球菌(Streptococcus sanguis)胞浆中的pGB301质粒的基因图；

图4是制备穿梭载体pMN1的图解说明，该载体是经分别用Hae III和Sma I切断血链球菌的质粒pGB301(9，8Kb)和大肠杆菌的质粒pUc9(2.8Kb)，并用T4连接酶将它们连接在一起而制得的；

图5显示克隆在pYEJ001中的α-1，3葡聚糖酶基因的转录方向(与Cm^r基因的方向相反，而C_m ^r基因是从合成启动子开始转录的)；

图6a是图解说明pMN2的制备；

图6b是图解说明pMN3的制备。

下列实施例分别说明含表达葡聚糖酶活性之基因的细菌的分离、编码该活性的基因的克隆和表达、编码该活性之基因向口腔所固有的细菌内的引入，以及葡聚糖酶基因产物的表达和分泌。

                  实施例1

本实施例涉及从土壤样品中分离能产生葡聚糖酶的生物体的一般实用方法。更明确地说，即将得自本发明人花园中的pH约为6的混有泥煤的风化花岗石土壤样品，加到无菌磷酸盐缓冲(pH7)基本培养基内，该培养基含有0.1％(按重量计)(NH₄)₂SO₄、0.0005％MgSO₄·7H₂O，0.0005％FeCl₂·6H₂O和得自生龋细菌变形链球菌菌株OMZ 176的0.03％不溶性葡聚糖(该菌以其作为唯一碳源)。将土壤样品在此培养基内于28℃温育3天。不溶性葡聚糖的制备参照Ebisu的方法(Osaka Univer-sity Journal of Dentistry，Vol.21，No.1，1976)。

将在培养基内培养的各种细菌继续传代培养十二次并浓缩之。制

备含有1.2％(按重量计)琼脂的琼脂平板，其中已加有0.2％不溶性葡聚糖和上述的基本培养基。之后在平板上接种浓缩的细菌并培养形成菌落。于30℃培养几天后，根据菌落周围有透明环形成来鉴定具葡聚糖酶活性和能降解不溶性葡聚糖的细菌。

鉴定出4个表达葡聚糖酶活性的特殊菌株，加以培养并定性。形成最明显透明环的细菌鉴定为环状芽孢杆菌BC-8(Bacilluscirculans BC-8)，并寄存于日本工业科学和技术厅所属的微生物工业技术研究所(登记号FERM BP-733)，1986年3月25日寄存于中国典型培养物保藏中心(登记号CCTCC-86020)。另一个形成最明显透明环的细菌鉴定为节细菌CB-8(Arthrobacter Sp.CB-8)(登记号：FERM BP-995)，1986年4月9日寄存于中国典型培养物保藏中心(登记号CCTCC-86021)。显示模糊环的是两个鉴定为假单胞杆菌属的菌落。

                    实施例2

本实施例是测定BC-8所产生的葡聚糖酶的活性。为测定葡聚糖酶的活性，将经超声波处理粉碎了的不溶性葡聚糖悬浮液用作底物。将环状芽孢杆菌BC-8(以下简称“BC-8”)于30℃在三联大豆肉汤培养基(tripticase soy broth)(Difco实验室，底特律、密执安州)中保温。只有向培养基内加入不溶性葡聚糖时才诱导葡聚糖酶的表达。离心得到含酶的上清液样品并将培养液浓缩十倍。或者是用75％硫酸铵处理上清液，以使酶沉淀。1单位酶活性定义为：于37℃、在16小时内用不溶性葡聚糖为底物产生0.1微摩尔葡萄糖的酶量。

                      实施例3

本实施例是通过培养细菌BC-8以制取有α-1，3和α-1，6活性的葡聚糖酶。将细菌BC-8的培养物在500毫升三联大豆、肉汤培养基(含0.3％不溶性葡聚糖)中于30℃培养3天。离心得到培养上清液，并用75％硫酸铵处理以沉淀酶。将所得之沉淀物溶解于50毫摩尔磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，之后将该溶液加到DE-52纤维素柱上。用加有NaCl的50毫摩尔磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)洗柱，其中NaCl的浓度由0渐增至0.5摩尔。

将显示有峰值活性的洗脱部分过Sephadex G-150柱。SDS凝胶电泳结果显示有两条带，一条为分子量68千道尔顿，另一条为分子量54千道尔顿。这两条带中，68千道尔顿带的蛋白质鉴定为α-1，3葡聚糖酶，而54千道尔顿带的蛋白质鉴定为有α-1，6葡聚糖酶活性者。

按上述方法纯化68千道尔顿蛋白，并用以处理只有α-1，3键的葡聚糖，此葡聚糖的α-1，6键已经用过碘酸处理或用市售的右旋糖酐酶处理而破坏。结果发现68千道尔顿蛋白可降解α-1，3键，产生还原糖。当用68千道尔顿酶处理具有α-1，6键的市售右旋糖酐时，则几乎没有还原糖产生，这就表明该酶是α-1，3葡聚糖酶。酶处理期间加入已糖激酶，确定有葡萄糖单糖的存在，因此表明该葡聚糖酶是前面作为α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶分类的内型葡聚糖酶。对54千道尔顿酶作相似试验，发现该酶具有对α-1，6键特异的葡聚糖酶活性，故为一种α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶。

虽然已经知道不溶性葡聚糖的键主要是α-1，3键，且α-1，3葡聚糖酶在不溶性葡聚糖的酶促降解中起主要作用，但也发现α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶的结合，对于降解不溶性葡聚糖具有协同作用。因此，为了除去不溶性葡聚糖，要求克隆编码α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶的两种基因，并将它们连接到一个质粒中。

                      实施例4

本实施例中，将用于表达编码α-1，3葡聚糖酶的基因克隆到一大肠杆菌表达载体中并转入大肠杆菌。用三联大豆肉汤培养基培养细菌BC-8，根据Marmur的方法(J.Mol，Bio.Vol.3，pp208，1961)提取DNA。将该材料用CsCl-EtBr平衡密度梯度离心法离心，结果表明其不含质粒DNA。之后将唯一的一条染色体DNA带分离并纯化之。再将此纯化的DNA透析并用核酸内切酶EcoR I切断。

同时，用300毫升L-肉汤培养基〔含10克胨、5克酵母提取液、1克葡萄糖、5克NaCl和1000毫升水(调到pH7.2)〕培养携带有市售表达载体pYEJ001质粒(pharmacia p-LBiochemicals出品，乌甫萨拉，瑞典)的大肠杆菌HB101。之后提取和分离pYEJ001质粒DNA，并用EcoR1裂解之。

之后在1单位T4连接酶存在下，使如此得到的1微克细菌BC-8 EcoRl DNA片段与1微克pYEJ001质粒DNA混合，于4℃温育12小时。经两DNA片段重组而产生重组质粒DNA，然后于10毫摩尔Tris-HCl溶液(pH7.5，1毫摩尔EDTA)中透析。将此重组质粒DNA转化到大肠杆菌K12菌株HB101中。

                   实施例5

本实施例为筛选被α-1，3葡聚糖酶基因转化的大肠杆菌K12菌株HB101。

如图2所示，如果某一DNA片段被***到pYEJ001质粒的氯霉素抗性基因(C_m ^r)的EcoR1位点，则细菌将变成对氯霉素敏感的。另外，由于合成启动子存在于该位点的上游，则被***到那个位点的任何基因，都将处于合适的(3′至5′)方向和合适的读码方式的位置，因而能有效地表达。

使已经用重组pYEJ001质粒转化的大肠杆菌的培养物在含有氨苄青霉素的琼脂平板上长成菌落，用无菌棒将每个菌落都转移到一含有氯霉素的L-琼脂板(含1.5％琼脂的L-肉汤培养基)上。显示有氯霉素敏感性的大肠杆菌培养物即为在EcoR 1位点上***某些DNA片段的细菌。

之后必须再从显示有氯霉素敏感性的菌落中鉴定出那些是成功地插有α-1，3葡聚糖酶基因的。因为大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌(并且与细菌BC-8不同，它不能分泌葡聚糖酶)，所以在转移到含有不溶性葡聚糖的平板上的几千个菌落中，没有发现分泌出葡聚糖酶的转化体。

因为宿主细菌HB101需要如苏氨酸、亮氨酸和脯氨酸等氨基酸，故可将氯霉素敏感的(Cm^s)大肠杆菌菌落培养在含有小量酪蛋白水解物和0.2％不溶性葡聚糖(已用超声波粉碎，作为仅有的碳源)的合成之基本培养基上。虽然没有环形成，可认为转化体不能够分泌α-1，3葡聚糖酶，但有些被观察的菌落能够生长这一事实却表明它们表达了α-1，3葡聚糖酶基因的产物，并且获得了降解和利用不溶性葡聚糖作为碳源的能力。

之后将观察到生长的那些转化体以一稍为大的量(1升)进行培养，提取其质粒DNA并用EcoRI裂解。用凝胶电泳方法检测被消化的DNA，结果发现含有-3.0Kb的DNA片段。该片段的大小被认为足可编码一大小为68千道尔顿分子量的基因产物(该蛋白质经计算为实施例3中所鉴定的α-1，3葡聚糖酶)。

为了证明α-1，3葡聚糖酶基因存在于这个3.0Kb DNA片段中，将各种细菌培养物加在含有0.2％不溶性葡聚糖的30毫升基本培养基中温育。所加培养物包括：(1)大肠杆菌HB101；(2)用质粒pYEJ001转化的细菌HB101；以及(3)用包含3.0Kb DNA片段***物的质粒pYEJ001转化的细菌HB101。取离心得到的三种培养物的融解细胞的上清液，按实施例2的方法分析葡聚糖酶活性，结果只有用包含有3.0Kb片段的质粒pYEJ001转化的细菌显现了葡聚糖酶活性，从而证明细菌BC-8的α-1，3葡聚糖酶基因已成功地克隆到了大肠杆菌的pYEJ001质粒中。此外，只有用包含3.0Kb***片段的pYEJ001转化的HB101细胞才能够在上述含酪蛋白水解物和不溶性葡聚糖的培养基中存活。

                      实施例6

本实施例中用编码α-1，3葡聚糖的基因成功地转化血链球菌Strep-tococcus sanguis)Challis菌株(NCTC7868)，该细菌为一种正常存在于口腔菌群中的细菌。存在于口腔中的各种细菌中，血链球菌和唾液链球菌(Srtreptococcus salivarius)是毒性最小的，特别是血链球菌Challis菌株(NCTC7868)，是其遗传学和转化作用相对了解得很清楚的一种材料。质粒pGB301〔见图3，Behnke等，M.G.G.Molecular and Genetics，184，115-120，(1981)；Behnke等，Micro-biology，American Society for Micrcobiology，239-242(1982)〕被用作转化载体。

如图3所示，存在于血链球菌Challis菌株之胞浆中的pGB301质粒DNA具有两个抗药标志：Em^r(抗红霉素)和Cm^r(抗氯霉素)，且唯一的BstE II位点是在Cm^r基因内。用限制性内切酶BstE II切断pGB301质粒DNA，并用DNA聚合酶I使其末端成为平头。

同时，用内切酶EcoR I处理含有编码α-1，3葡聚糖酶基因的3.0Kb片段的pYEJ001质粒，并用DNA聚合酶I处理使其末端成为平头。之后以1微克对1微克的比例混合pGB301质粒DNA片段和α-1，3葡聚糖酶基因DNA片段，并用100单位T4连接酶连接它们的平端，以重新形成一质粒。在如此得到的重组质粒中，Cm^r基因被切断，而所***的α-1，3葡聚糖酶基因是完整的，并可完成表型表达。

从而，由于含有3.0Kb片段(该片段携带有α-1，3葡聚糖酶基因)的修变之pGB301质粒的***，使血链球菌Cha-llis菌株被转化。转化作用是依据Le Blanc和Hassell〔J.of Bacteriol.，128(1)，347-355，(1976)〕和Macrina等人〔Infec.和Imm.，28(3)，692-699(1980)〕的方法完成的。将已接受了含有α-1，3葡聚糖酶基因的pGB301质粒的血链球菌Challis之菌落，培养在含有红霉素(50微克/毫升)的脑心灌流液(B.H.I.)琼脂平板(Difco实验室)上。再将每一菌落转移到含有氯霉素(10微克/毫升)的B.H.I.琼脂平板上，以检测Cm^s(氯霉素敏感)菌落的存在。可望显示有氯霉素敏感性的血链球菌

Challis菌落，大多已有α-1，3葡聚糖酶基因***到pGB 301质粒中。

既使是这些显示有氯霉素敏感性的血链球菌Challis菌株，也只有在大约三分之一的转化菌落中观察到***之α-1，3葡聚糖酶基因的表型表达。这是因为基因片段可以两个不同的方向被***。用无菌棒将Cm^s细菌菌落转移到含有不溶性葡聚糖的B.H.I.琼脂板上，以试验基因产物的表达。因为血链球菌是一种革兰氏阳性菌，故可望能分泌出任何它所应产生的α-1，3葡聚糖酶。可根据含葡聚糖平板上环的存在来确定葡聚糖酶的表达和分泌。如此α-1，3葡聚糖酶基因即被成功地引入血链球菌细胞(为一种正常存在于口腔中的细菌)内，并在该宿主细菌内完成基因的表型表达。

                       实施例7

在该实施例中，将为表达编码α-1，3葡聚糖酶的基因通过质粒pMN1引入血链球菌内。虽然质粒pGB301(图3)有两个稳定的抗药标志，即E_m ^r(红霉素抗性)和Cm^r(氯霉素抗性)，并且是一种相当小的质粒，但其有效使用仍受到几方面的限制。第一，pGB301在一个血链球菌细胞内的拷贝数只有10个左右；第二，正是因为拷贝数低，故为了作质粒大小等的样品检验，小量培养带有质粒pGB301的血链球菌是相当不够的，而大量培养转化的血链球菌以制备质粒DNA也是效率很低的。

鉴于这些限制，决定使pGB301和大肠杆菌质粒pUC9结合，以便制得一个改良的转化***。质粒pUC9(Pharmacia公司，乌甫萨拉，瑞典)是大肠杆菌的最小质粒之一，具有高拷贝数并有几个多克隆位点。在单一的SmaI限制位点上切断pGB301质粒使之开环并在单一的Sma I位点上切断pUC9使之开环，在两种情况中均产生两头为平端的线性分子。之后将两DNA片段混合并用T₄DNA连接酶连接之，以产生重组质粒。

将所得到的质粒转化到大肠杆菌菌株JM103(P1)-中。向根据Messing等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，3642(1977)和Messing等人，Gene，19，P276(1982)〕的方法制备的选择培养基内加入5-溴-3-氯吲哚基-B-D-半乳糖苷指示剂，制成一适当的指示剂平板，根据在该平板上的兰色菌落中出现白色菌落，确定含有pUC9之IacZ标志的成功地转化了的大肠杆菌。

由这些已鉴定为含有Iac Z标志菌落中提取质粒，其中一个经鉴定其质粒大小为12Kb〔等于pGB301(9.8Kb)和pUC9(2.8Kb)的总合〕并有如图4所示的排列，将其定名为pMN1。如实施例8中所述，之后即可将其用作α-1，3葡聚糖酶基因的克隆载体。

用该质粒作为穿梭载体以转化如上所述的血链球菌，并赋予被转化的血链球菌以抗氨苄青霉素以及抗氯霉素和抗红霉素抗性。

在实施例5中已提到，α-1，3葡聚糖酶基因被***pYEJ001质粒中合成启动子的下游。令人惊奇的是，表达的活性并不象预想的那么强。因而推测α-1，3葡聚糖酶基因是被***在相反于合成启动子的正常方向上了，而且事实上表达是受存在于EcoRI片段上的内源的芽孢样菌启动子调节的。因此，须进行一项实验以确定α-1，3葡聚糖酶基因的***方向。

***质粒pYEJ001(见图5)的α-1，3葡聚糖酶基因可在体外由大肠杆菌RNA聚合酶转录。估计有20个以上的培养物含有一克隆到质粒pYEJ001 EcoRI位点上的3.0Kb片段。从切点与pvu II位点的距离，可确定在所有这些情况下，α-1，3葡聚糖酶基因均以相反方向存在，且mRNA转录是由A向B进行的。

从统计上看，应有大约一半的情况，α-1，3葡聚糖酶基因以相对于合成启动子的正常方向***，即以B到A的方向。这一构型应可望产生有效的表型表达，并亦应产生出大量的α-1，3葡聚糖酶。根据没有分离出这样的菌株这一事实看，似乎细菌BC-8的α-1，3葡聚糖酶基因产物中信号肽，没有被大肠杆菌的信号肽酶切掉。此外，似乎是如果在高效的合成启动子控制下α-1，3葡聚糖酶的产生是过量的，那么在细胞集聚有α-1，3葡聚糖酶的宿主细菌将会死亡。

在这些α-1，3葡聚糖酶基因以相反方向***的情况下，将发生始自细菌BC-8的α-1，3葡聚糖酶基因正常启动子的A至B的转录过程。此转录过程似乎会因为合成启动子转录作用的有力的抵削作用，而被降低到一个很低的水平。这似乎又可通过下述实验进一步证实：即当α-1，3葡聚糖酶基因在非诱导条件下，被***到强诱导***的启动子如大肠杆菌的色氨酸启动子(Ptrp)或乳糖启动子(Plac)的下游，则在这些情况下将获得以正常和相反两个方向***的基因的产物。以正常方向***的基因表现了很强的产生α-1，3葡聚糖酶的能力。

这一研究提示，为了有效地产生葡聚糖酶，应修变α-1，3葡聚糖酶基因产物的分泌信号肽部分，以便使信号肽能很容易地从葡聚糖酶上切掉，并且α-1，3葡聚糖酶基因应该以“正常”方向***到一个高效启动子下游。

                       实施例8

本实施例提供构建编码融合蛋白之质粒的方法，所说的融合蛋白含有β-内酰胺酶(β-Lactamase)的信号肽序列和α-1，3葡聚糖酶基因的“成熟的”、无信号多肽产物。业已发现β-内酰胺酶——氨苄青霉素抗性(Am^r)基因的一种产物，可在大肠杆菌及血链球菌中得以有效地表达。

以制备pGB301的相似方法，做出质粒pMN1使其含有葡聚糖酶基因。方法是：用核酸内切酶BstEI切断pMN1并使成平端。同时用核酸内切酶EcoRI切断质粒pYEJ001，以取出3.0Kb葡聚糖酶基因片段并使其末端成平端。用T₄连接酶将该片段同线性pMN1片段连接。

由pGH54(由Ohgai等人修变成的，Annual Meetingof Japanese Molecular Biology Assn.，日本，东京，1985，12，4)上切下一个含有启动子和编码β-内酰胺酶之分泌信号肽的基因片段，并***到pMN1上编码α-1，3葡聚糖酶基因之DNA内的NurI位点(pMNl内已***了基因)。

已发现NurI位点存在于编码酶的多肽链氨基末端的葡聚糖酶基因的区域中。为了完成这一构建过程，必须使用一个合成的连接子，以使pGH54片段上编码β-内酰胺酶信号肽的DNA与葡聚糖酶基因的其余部分(3′至NurI位点)相接，并反过来构建编码酶之氨基末端的DNA(5′至NurI位点)。所得质粒(定名为pMN2)如图6中图解所示。

                       实施例9

本实施例为构建几种质粒，其编码可表达一种融合蛋白，此融合蛋白包含链激酶的分泌信号肽和α-1，3葡聚糖酶基因的“成熟的”无信号多肽产物。克隆得自类马链球菌(Streptococcus equicimilis)的含链激酶启动子和分泌信号肽的基因片段，并测定其碱基序列〔Malke & Ferretti，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，3557-3561(1984)；Malke等人，Gene，34，357-362(1985)〕。已知该基因序列是编码由类马链球菌及大肠杆菌分泌的链激酶的。合成相应于该酶之启动子和信号肽的一般DNA序列，同时使葡聚糖酶基因以5′至NurI位点方向进行；再将合成的DNA序列连接到pMN1质粒中NurI位点上，其中pMN1经基因操作已包含编码α-1，3葡聚酶蛋白的基因，从而得到质粒pMN3(图6b)。

依据上面公开的方法，用质粒pMN2和pMN3转化大肠杆菌菌株JM103和血链球菌的培养物，以期表达红霉素和氨苄青霉素抗性。预期经转化的细胞在其周质中积聚有大量的α-1，3葡聚糖酶，且转化了的血链球菌细胞可分泌该酶。

按这种方法，预期的α-1，3葡聚糖酶基因的表型表达，已在口腔所固有的血链球菌中被证明是成功的。正如前面所公开的在相对于启动子的正常方向上***葡聚糖酶基因，并且用血链球菌细胞中有功能的肽链置换信号肽，对于大量α-1，3葡聚糖酶的表达和分泌是很重要的。

前已公开了通过克隆基因并将其引入口腔所固有的细菌内，以完成α-1，3葡聚糖酶基因之表型表达的方法。如上述实施例1中已公开的，细菌环状芽孢杆菌BC-8(FERM BP-733)CCCTCC NO.86-02.是能产生α-1，3葡聚糖酶及α-1，6葡聚糖酶的细菌。因此，有可能用相似于前述实施例中公开的方法，在其中克隆α-1，6葡聚糖酶基因，其中改用右旋糖酐作为底物。另外，计划从CB-8(FERM BP-995)中分离α-1，6葡聚糖酶基因。

节细菌CB-8是从分离BC-8的同一地区的土壤样品中分离的。将该样品中的细菌用实施例1中所述的同样基本培养进行培养，不同的是用商品右旋糖酐(Wako Junyaku公司，日本；分子量约100,000-200,000)代替不溶性葡聚糖，作为碳源。之后将再次培养的细菌培养在0.5％蓝色右旋糖酐和0.5％右旋糖酐上。有四个菌株形成了明显的环。经鉴定其中3个是放线菌(Actinomyces sp.)，第四个是节细菌CB-8，该菌株寄存登记号是FERM BP-995，其被用作克隆到血链球菌中的α-1，6葡聚糖酶基因的来源，以完成α-1，6葡聚糖酶的表型表达。

本发明所提供的新的DNA序列不仅用于确保在异源宿主细胞内产生葡聚糖酶，而且用作以已知方法分离各种微生物的编码葡聚糖酶基因的杂交探针。除了克隆得自环状芽孢杆菌BC-8的α-1，3葡聚糖酶基因外，还可能以与上述相似的基因操作技术克隆那些得自假单胞菌SK-01(FERMP-4273)和假单胞菌(NRRL B-12324)的编码α-1，3葡聚糖酶的基因，也可以克隆α-1，6葡聚糖酶基因，此基因得自能产生α-1，6葡聚糖酶之细菌如棒状杆菌AK-01(FERMP-2505)、黄杆菌BK-01-06(FlavobacteriumBK-01-06)(FERM P-1194或FERM-P1285-1288)、拟青霉菌TC1-9001(Paecilomyces TC1-No.9001)(FERM P-6602)和Penicillium Pheni-culosum IAM-7013(FERM P-1290)。之后可将如此分离的葡聚糖酶基因引入血链球菌的细胞内，以促进葡聚糖酶的表型表达。

此外，如实施例5中所公开的，α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶的结合，用于除去不溶性葡聚糖具有协同作用并且是很有效的。制备一个其中α-1，3葡聚糖酶基因和α-1，6葡聚糖酶基因按顺序存在于质粒高效启动子(如β-内酰胺酶或链激酶启动子)下游的质粒，并将其引入血链球菌内，以产生两种酶，便可能最为有效地除去不溶性葡聚糖。亦可将编码一种或两种酶的基因引入要求之宿主的基因组中。

存在于口腔中的、并且在本发明中可能有用的其它细菌(除血链球菌外)，还包括有链球菌属的其它菌种，如唾液链球菌。用上面已公开的转化血链球菌的相似方法，可将基因引入这些细菌内。

如前已公开的，本发明的龋齿预防制剂包含有一种口腔所固有的细菌，经引入α-1，3葡聚糖酶基因、α-1，6葡聚糖酶基因、或其两者，而使其转化。所述的基因产生能分解(由引起龋齿的生龋细菌所产生的)不溶性葡聚糖的酶。因此，可通过适当的方法使本发明的龋齿预防制剂粘附在牙齿上，以表达和分泌葡聚糖酶，从而将基本上连续地分解由口腔中生龋细菌所产生的不溶性葡聚糖。因为可以连续地产生葡聚糖酶，故能可靠地预防龋齿。如已报导的，在牙齿上温育的血链球菌可固定二年以上，而在温育部位可固定六个月〔见Svanberg等人，Archs.Oral.Biol.，31(1)，1-4(1986)〕。

          关于节细菌SP.CB-8(Arthrobacter sp.

                    CB-8)的资料

1、微生物的名字关于节细菌SP.CB-8(Arthrobacter sp.CB-8)

2、寄存单位给的菌株名称在日本寄存的国际承认名称FERM-BP-995

3、菌株危及卫生与环境的特性对人类和环境无害。对动植物亦无害。

4、科学特性及分类位置(科学特性)菌落的状态：此微生物在L-琼脂上产生一种深黄色、圆形的平

        滑菌落。此细菌为革兰氏阳性杆菌。(其它特性见附页)。(分类位置)此微生物是革兰氏阳性菌，属于节细菌属的一种需氧的，无芽孢杆菌。

5、附加资料此微生物产生一种酶，为α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶，

它分解生龋细菌变形链球菌产生的不溶性葡聚糖。

6、寄存者名字：Aizo Matsushiro地址：4-15-2，Aoyama dai，Suita 565，Japan

7、培养条件

(1)培养基名称：基本培养基(加入右旋糖酐作为唯一碳源)

(2)培养基组成：作为一种基本培养基，含有：

   (NH₄)₂SO₄         0.1％

   MgSO₄·7H₂O       0.0005％

   FeCl₂·6H₂O       0.0005％

   右旋糖酐^*            0.2％(^*Wako Junyaku Co.，Ltd出品；

M.W＝100,000-200,000)

并用磷酸缓冲液将pH调至7.0，然后灭菌。

(3)培养基的pH值：pH＝7.0

(4)培养基灭菌条件：121℃，15分(使用高压锅)。

(5)培养温度：30℃。

(6)培养周期：一昼夜。

(7)对氧气需求特点：需氧8、保存条件

(1)此微生物可用干冻法保存(约于+5℃)。

(A)冷冻保护试剂

    (a)成分：蒸馏水(含10％脱脂牛奶)

    (b)pH：7.0

    (c)灭菌条件：121℃，15分钟。

(2)此微生物可冷冻脱水保存(约于-60℃)

    (a)冷冻干燥的条件：无特殊要求

    (b)保护试剂：蒸馏水(含10％脱脂牛奶)

(3)如不能使用干冻法或冷冻干燥法，则用(方法)：在普通琼脂培养基平板上扩增细菌，扩增的细菌用

    铂环收集并悬浮于无菌的生理盐水溶液中，并与脱

    脂牛乳混合得到10％脱脂乳浓度，然后进行冻干。

9、存活测定条件

(1)重新培养(复甦)条件

    (a)使用干冻法时的复甦试剂：

                       温度：30℃

    (b)使用冷冻干燥法时：    30℃

(2)接种、培养和鉴定的条件：

与上述第7条培养条件相同。有关节细菌Sp.CB-8的科学特性的附加资料过氧化氢酶：(+)溶血(羊)：  (-)碳水化物(发酵)：

葡萄糖：  (-)

乳糖：    (-)

麦芽糖：  (-)

甘露糖醇：(-)

柳  醇：  (-)

淀粉：    (-)

白糖(white sugar)：(-)

茧蜜糖：(-)

木糖：(-)Voges-Proskauel试验：(-)七叶甙水解作用：(-)还原硝酸：(-)白明胶的液化：(+)尿素酶：(+)精氨酸水解作用：(-)

Claims (1)

1.制备含有转化的口腔固有细菌的龋齿预防制剂的方法，其中转化的细菌是用包括以下步骤的方法产生的血链球菌(Streptococcussanguis)：

(a)培养环状芽孢杆菌BC-8(Bacillus circulans BC-8)(CCTCC No.86-020)和/或节细菌CB-8(Arthrobacter sp.CB-8)(CCTCC No.86-021)细菌；

(b)从环状芽孢杆菌BC-8(Bacillus circulans BC-8)，(CCTCC No.86-020)提取α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的基因DNA和/或从节细菌CB-8(Arthrobacter sp.CB-8)(CCTCC No.86-021)提取α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶的基因DNA；

(c)通过将所述基因DNA***大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA质粒来建构第一重组质粒DNA；

(d)通过将所述的第一重组质粒DNA引入大肠杆菌(Escherichiacoli)来转化所述大肠杆菌；

(e)选择已被***大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒DNA中并且具有所述步骤(d)中有效转化的大肠杆菌(Escherichia coli)的基团DNA；

(f)通过将所述步骤(e)中选择的所述基因DNA***到血链球菌(Streptococcus sanguis)的质粒DNA中来建构第二重组质粒DNA；以及

(g)通过将所述第二重组质粒DNA引入到血链球菌(Streptococcussanguis)中表达所述基因DNA来转化所述血链球菌。

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