CN103086923B

CN103086923B - 肼腈类组织蛋白酶k抑制剂及其在治疗骨质疏松症方面的应用

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Publication number: CN103086923B
Application number: CN201310021388.9A
Authority: CN
Inventors: 吴玉清; 原晓喻; 李洪伟
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-01-21
Filing date: 2013-01-21
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-01-21
Also published as: CN103086923A

Abstract

肼腈类组织蛋白酶K抑制剂及其在治疗骨质疏松症方面的应用，属于组织蛋白酶（Cathepsins）抑制剂技术领域。该类抑制剂不具有P2-P3连接部位，但具有不同P3位结构。其结构如下式所示，其中P3是芳基，包括对位联苯、对位苯-吡啶、对位苯-噻吩、对位三联苯及其间位三联苯。本发明设计、合成的非肽肼腈类抑制剂具有结构相对简单、原料易得、合成方便、产率高的优点；母体结构的设计和合成极大地方便了后续终产物的合成。其对组织蛋白酶K的抑制效应在亚纳摩尔水平上，对B和S的抑制效应在微摩尔水平上，且使同源性极高的组织蛋白酶K和L的抑制效应差别被拉大，从而增加了抑制剂作为治疗骨质疏松症药物开发的可能性。

Description

肼腈类组织蛋白酶K抑制剂及其在治疗骨质疏松症方面的应用

技术领域

本发明属于组织蛋白酶抑制剂技术领域，具体涉及一类具有高选择性、新型的肼腈类组织蛋白酶抑制剂。这类抑制剂具有非肽类的结构（P2-P3部位直接相连），且对组织蛋白酶K的抑制有很强的专一性，从而在临床上对于骨质疏松症及相关疾病的治疗具有潜在的应用前景。

背景技术

人体内正常的骨代谢基于骨形成和骨吸收之间的动态平衡^[1]，而骨质疏松即是骨代谢失衡——骨吸收大于骨形成的体现。此类病症多见于中老年人，尤其是绝经期及绝经后的妇女群体中^[2，3]。在骨吸收过程中，破骨细胞首先附着在骨骼表面，形成一个相对密封的骨吸收腔隙。破骨细胞在由H⁺-ATP酶酸化成的微酸性环境中分泌质子和蛋白水解酶，这些酶先溶解骨骼中的矿物质，继而降解骨基质，最后导致骨空洞的形成。在溶骨过程中参与骨基质降解的酶主要有两种——半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPs），其中发挥主要作用的是半胱氨酸蛋白酶家族中的组织蛋白酶K（Cathepsin K），其生理作用底物正是在有机骨基质中含量高达95％的Ⅰ型胶原蛋白。组织蛋白酶K是破骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强的一种半胱氨酸蛋白酶，也是骨吸收过程中的一个关键酶^[4-6]。因此，通过利用组织蛋白酶K的高效抑制剂来调节骨代谢平衡，为治疗骨质疏松症提供了一种新思路。

早期报道的Cathepsin K的抑制剂多是不可逆的的抑制剂，如：乙烯基砜、氮丙啶衍生物、环氧化物、卤甲基酮、重氮甲基酮、酰氧甲基酮、以及其它通过迈克尔加成反应与组织蛋白酶K作用的一些受体^[7，8]。由于这类抑制剂能与Cathepsin K中25位半胱氨酸上的巯基发生非可逆的反应，使其具有很大的毒副作用，从而不具备药物开发的潜在性。而作为目前最有药物研发潜能的、可逆类抑制剂——肼腈化合物，它们主要具有以下3个优点：第一：避免了非可逆抑制剂潜在的毒副作用；第二：与同类的可逆抑制剂如酮类/醛类相比，具备更好的稳定性；第三：P1位的肼腈结构使进攻基团的亲电性更强，具有更好的抑制效应。因此，设计、合成肼腈类小分子抑制剂是我们开展研究工作的首选。

在已报道的文献中，将腈类抑制中α-碳替换为氮后所形成的肼腈类小分子抑制剂对组织蛋白酶K的抑制效应提高到了皮摩尔浓度（pM）级。其进攻基团与组织蛋白酶的活性位点有极强的结合力，致使它们对组织蛋白酶的抑制效应大幅度提高；但是，抑制效应的大幅度提高最终导致了对不同种型组织蛋白酶选择性大多都不太理想^[9]。而且，在人体内，组织蛋白酶K对生理过程的作用十分重要而且极其复杂。为了避免广谱性抑制造成临床以外的其它副作用^[10-12]，因此设计合成高选择性的高效抑制剂迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一系列新型的、非肽类（P2与P3部位直接相连）的组织蛋白酶K的抑制剂，它们结构简单、易于合成。其对组织蛋白酶K的抑制效应在亚纳摩尔水平上，对B和S的抑制效应在微摩尔水平上，且使同源性极高的组织蛋白酶K和L的抑制效应差别被拉大，从而增加了抑制剂作为治疗骨质疏松症药物开发的可能性。

我们通过改变进攻基团P1以外的其它部位的结构，使抑制剂分子的大小、取向、亲疏水性等与组织蛋白酶K的活性部位口袋结构更加匹配，从而提高其对不同类型组织蛋白酶的选择性。新抑制剂的结构改进主要从以下几个方面入手：第一：去掉了P2-P3的连接部位，使其成为非肽类抑制剂；第二：改变了P3位的结构、大小、亲疏水性等，以便与组织蛋白酶K的S3口袋更好地吻合，其母体结构的设计和合成极大地方便了后续终产物的合成。所合成的化合物对组织蛋白酶K的抑制具有很强的专一性，大幅度提高了对组织蛋白酶B、S的选择性（>300倍和>550倍），且对结构与组织蛋白酶K极其相近的组织蛋白酶L也表现出很好的选择性（31～317倍）。

本发明中所述的组织蛋白酶K的高选择性抑制剂的结构通式如下：

通式中，R代表P3部位的不同结构基团，即对位三联苯、间位三联苯、联苯、苯-吡啶、苯-噻吩基团，其对应结构式如下表所示：

该系列抑制剂小分子的结构简单，合成原料易得，步骤简单、易于操作，且产率很高。可通过如下的合成路线得到：

路线Ⅰ：

路线Ⅱ：

其中，路线Ⅰ是针对P3位是苯的对位衍生物的抑制剂的合成步骤；而路线Ⅱ是针对P3位是苯的间位衍生物的抑制剂的合成步骤。在抑制剂小分子的合成过程中，先后采用了对/间溴苯乙酸和LDA参与的亲核反应、氯甲酸异丁酯和氮甲基吗啉参与的酰胺化反应、以及芳基硼酸和溴代芳烃参与的Suzuki反应等。

上述通式所代表的组织蛋白酶的小分子抑制剂中，P3位是对位三联苯的化合物E8使组织蛋白酶K对B、S具有很高的选择性；P3位是间位三联苯的E13在基于选择性很好的前提下，大幅地提高了对组织蛋白酶K的抑制效应；P3位是苯-吡啶基团的E6在很大程度上提高了对结构极其相似的组织蛋白酶K和L的选择性；而P3位是联苯基团的E5在对K和B、S的选择性上也有很大提高。

对于这一系列的小分子抑制剂，其中P1位的腈基(-C≡N)为进攻基团，与组织蛋白酶K25位的半胱氨酸(Cys25)发生可逆、稳定的共价结合；P2部位的异丁基极大地提高了其对组织蛋白酶K的抑制效应；而P3部位的结构、大小、取向和亲疏水性决定了其对不同的组织蛋白酶的抑制选择性。

母体化合物E4的合成步骤描述如下：称取1.07g对溴苯乙酸（E1），加入100mL的圆底烧瓶中，三充三抽之后加入50mL THF。在冰盐浴下，缓慢加入5mL2-异丙基胺基锂（LDA），边滴加边摇晃圆底烧瓶，以阻止凝结成块而无法持续反应。20min之后，将反应容器从低温反应浴中取出，常温下搅拌2h。之后再在低温反应浴中将690μL的碘代异丁烷注入圆底烧瓶。混合体系继续在冰盐浴下反应并搅拌20～30min，然后在室温下再反应2h。之后加水淬灭反应，低温下滴加盐酸，酸化后使反应10h以上，使用薄层色谱（TLC）检测反应是否完全；待反应完毕后，用旋转蒸发器将体系中的THF蒸干，再加入乙酸乙酯萃取水相（3次）；合并有机相，用无水硫酸钠干燥（每10ml溶液用0.5～1.0g干燥剂），过滤并蒸干溶剂。最后用乙酸乙酯：石油醚：甲酸＝1∶2∶0.005作展开剂进行硅胶柱层析分离提纯，得到白色粉末状的固体(E2)，产率95％。

将1.08g E2用15mL THF溶解后，放入冰盐浴中；先加入624μL的氯甲酸异丁酯，再加入527μL的N-甲基吗啉，得到溶液体系Ⅰ。分别将0.79g的N，N－二甲基腈和0.48g的NaOH的饱和溶液，然后混合，得溶液体系Ⅱ。将体系Ⅱ中的溶液滴加入到体系Ⅰ中，在冰浴中搅拌30min后取出，常温下再搅拌2h。使用薄层色谱（TLC）检测反应是否完全；待反应完毕后，将体系中的四氢呋喃在旋转蒸发器上蒸干，用乙酸乙酯萃取水相2～3遍，合并有机相。先后用水(1次)、饱和NaHCO₃(2次)、水（1次）、饱和NaCl（1次）依次洗涤有机相。最后用无水Na₂SO₄将有机相干燥，蒸干后得到油状粘稠物E3。

在100mL的圆底烧瓶中加入30mL无水甲醇、0.94g E3和0.64g无水乙酸钠，常温搅拌使其混匀。在极其严格的防毒措施保护下，加入0.26g溴氰，常温下搅拌4～5h。然后将甲醇溶剂在旋转蒸发器上蒸干，加水溶解残渣之后，用10％的KHSO₄调节水溶液pH至1～2；再用乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相。先后用水(1次)、饱和NaHCO₃(2次)、水（1次）、饱和NaCl（1次）依次洗涤有机相。最后用无水Na₂SO₄干燥，蒸干后得到得母体化合物E4的粗产物，为无色透明的油状液体。再用四氢呋喃：石油醚=1：5作展开剂进行硅胶柱层析分离提纯，产率75％。

抑制剂E5到E8的合成步骤参见路线Ⅰ；具体操作描述和表征见下面的实施例1-4。

合成路线Ⅱ中，间位化合物的合成方案同上，只是将其中的原料E1换为原料E9即可；其它原料和反应条件基本不变，最后得母体化合物E12，产率75％。

抑制剂E13的合成步骤参见路线Ⅱ；具体操作描述和表征见下面的实施例5。

抑制剂对酶的抑制效应检测

1.酶活力（enzyme activity）也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。荧光底物在浓度相当高时，被酶水解后其荧光强度随着时间变化，呈一级反应关系，其中直线的斜率表示组织蛋白酶分解底物的初速度，而初速度的大小即代表酶的活性强弱。将不同抑制剂浓度存在下的斜率分别除以对照组（即不加抑制剂时）的斜率，即得到在特定抑制剂浓度存在下酶的残余活力的百分比。再将一定条件下的残余活力百分比对抑制剂浓度作图，即可得到抑制剂对酶的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

抑制剂对酶的抑制效应主要通过IC₅₀和K_i值来表示，其中IC₅₀是半数抑制浓度，是指在一定的实验条件下将酶的活性降到原有活力一半时所需抑制剂的浓度；K_i是抑制剂与酶作用的解离常数，也称作抑制剂的抑制常数。

2.酶活检测条件如下：

组织蛋白酶K：pH值为5.5的MES-NaOH缓冲溶液，含2.5mM EDTA、2.5mM DTT和10％DMSO。以20μM的Z-Phe-Arg-AMC为荧光底物。

组织蛋白酶L：检测条件、荧光底物均与组织蛋白酶K相同。

组织蛋白酶B：pH值为6.0的MES-NaOH缓冲溶液，含2.5mM EDTA、2.5mM DTT、10％DMSO和0.001％Tween20。以20μM的Z-Phe-Arg-AMC为荧光底物。

组织蛋白酶S：pH值为6.5的MES-NaOH缓冲溶液，含2.5mM EDTA、2.5mM DTT、10％DMSO和0.001％BSA。以40μM的Z-VVR-AMC为荧光底物。

3.酶动力学检测过程

首先分别配置酶、底物和抑制剂的贮备液；然后根据需要将抑制剂稀释至一系列的浓度梯度，采用酶标仪来监测酶的反应速率；根据酶的剩余活力和抑制剂浓度作图，算出酶的半数抑制浓度IC₅₀，进而计算出K_i；并对其进行构-效关系分析，最终选择出抑制效应高和选择性好的抑制剂。

设置仪器参数之后，接下来进行酶活检测：首先，在96孔板的前三个孔中平行做3个空白对照实验，在后面9个孔中依次加入1μL不同浓度的抑制剂；再在12个孔中加入10μL的酶；加入酶之后，分别在前3个孔依次加入40μL的缓冲溶液，后9个孔中依次加入39μL的缓冲溶液，使每个孔中溶液的总体积达50μL。放入37℃恒温培养箱中孵育30min之后，加入50μL对应的底物，然后混匀，立即进行进行酶效应检测。

4.抑制剂对酶抑制效应检测结果如表1所示：

表1：抑制剂对四种酶的IC₅₀数据

根据已报道的、在相同条件下测得的米氏常数K_m ^[12]：组织蛋白酶K，K_m=18.06±0.22μM；组织蛋白酶L，K_m=3.525±0.405μM；组织蛋白酶B，K_m=157.5±2.5μM；组织蛋白酶S，K_m=102.19±1.51μM‘基于公式K_i=IC₅₀/(1+[S]/K_m)，将IC₅₀值转换成K_i值，结果见表2，其中[S]为底物浓度，K_m为米氏常数。

表2：抑制剂对四种酶的K_i数据

由以上表格结果可以看出，这一系列的新型抑制剂对组织蛋白酶K的抑制效应都在纳摩尔浓度(nM)水平，E13对其的抑制常数甚至达到0.29nM；抑制常数越低，抑制效应越好。该系列抑制剂对同源性极高的组织蛋白酶K和L的抑制效应差别被拉大，同时，由于该系列抑制剂对组织蛋白酶S的抑制效应不是很高，故对组织蛋白酶S也有出色的选择性，尤其值得指出的是，抑制剂对组织蛋白酶B的抑制效应极其微弱，故极大地提高了对组织蛋白酶B的选择性，从而避免了该抑制剂对组织蛋白酶B可能产生的副作用。

实施例的数据表明：当芳基是对位联苯时，其对组织蛋白酶K的抑制效应是对组织蛋白酶L、S、B的154、328、577倍。当芳基是对位苯-吡啶时，其对组织蛋白酶K的抑制效应是对组织蛋白酶L、S、B的317、789、714倍。当芳基是对位苯-噻吩时，其对组织蛋白酶K的抑制效应是对组织蛋白酶L、S、B的156、964、1774倍。当芳基是对位三联苯时，其对组织蛋白酶K的抑制效应是对组织蛋白酶L、S、B的31、324、>10000倍。当芳基是间位三联苯时，其对组织蛋白酶K的抑制效应是对组织蛋白酶L、S、B的310、1725、8280倍。

因此，本发明设计、合成了一系列高选择性、新型肼腈类抑制剂。这类小分子抑制剂结构简单、易于合成、产率高，且它们对组织蛋白酶K的抑制具有很强的专一性，大幅地提高了对组织蛋白酶L、B和S的选择性。值得一提的是，这些抑制剂对结构极其相近的组织蛋白酶K和L也具有很好的选择性。这种新型的、高效的肼腈类抑制剂对组织蛋白酶K的选择性很好，极大地提高了其作为药物开发的可能性，预计将对治疗骨质疏松、关节炎等疾病将有着极其重要的现实意义。

附图说明

图1：化合物E5抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图2：化合物E5抑制组织蛋白酶L的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图3：化合物E5抑制组织蛋白酶S的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图4：化合物E5抑制组织蛋白酶B的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图5：化合物E6抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图6：化合物E6抑制组织蛋白酶L的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图7：化合物E6抑制组织蛋白酶S的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图8：化合物E6抑制组织蛋白酶B的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图9：化合物E7抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图10：化合物E7抑制组织蛋白酶L的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图11：化合物E7抑制组织蛋白酶S的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图12：化合物E7抑制组织蛋白酶B的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图13：化合物E8抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图14：化合物E8抑制组织蛋白酶L的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图15：化合物E8抑制组织蛋白酶S的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图16：化合物E8抑制组织蛋白酶B的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图17：化合物E13抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图18：化合物E13抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图19：化合物E13抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图20：化合物E13抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度（IC₅₀）测量曲线；

图21：随着时间的延长，底物被酶水解后其荧光强度随时间的变化(以E5抑制组织蛋白酶L为例)。

具体实施方式

实施例1：

在100mL的圆底烧瓶中依次加入0.61g E4，0.44g苯硼酸，0.0653gPd(dppf)Cl₂和0.5g K₂CO₃，用35mL的THF作反应溶剂，再加2mL水，三充三抽之后，回流。6h之后将体系中的THF用旋转蒸发器蒸干，加入乙酸乙酯溶解残渣，先后用水(1次)、饱和NaHCO₃(2次)、水（1次）、饱和NaCl（1次）依次洗涤有机相。最后用无水Na₂SO₄干燥，蒸干，再用THF：PE=1∶8体系作展开剂进行硅胶柱层析分离提纯，得白色粉末状固体E5。其表征结果如下：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ7.86(d，J=5.6Hz，2H)，7.64(dt，J=8.6，6.1Hz，4H)，7.46(t，J=7.6Hz，2H)，7.39(t，J=7.3Hz，1H)，6.64(d，J=8.3Hz，1H)，5.34(td，J=10.1，3.7Hz，1H)，3.36(s，3H)，3.24(s，3H)，1.82(dd，J=12.1，5.4Hz，1H)，1.77-1.63(m，2H)，1.12-1.00(m，6H).

MS(ESI)m/z：[M+H]⁺：336.2

实施例2：

将0.41g的吡啶硼酸和0.39g的频哪醇置于50mL的圆底烧瓶中，加入适量甲苯作为溶剂，回流。整个过程中，不断的将蒸出的水分从体系中放出。4h后停止反应，使用薄层色谱（TLC）检测反应是否完全。将圆底烧瓶置于常温下冷却，抽滤，得到得吡啶硼酸酯为白色固体0.67g。取0.6g吡啶硼酸酯，其它反应原料、条件、后处理过程均与合成E5路线相同。最后得结晶状固体E6。其表征结果如下：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ8.67(d，J=4.3Hz，2H).7.64(d，J=8.1Hz，2H)，7.53-7.40(m，4H)，δ4.23(t，J=7.4Hz，1H)，3.20(s，4H)，2.58(s，2H)，δ2.10(m，1H)，1.55(ddd，J=20.1，17.8，11.1Hz，2H)，1.01-0.96(m，6H).

MS(ESI)m/z：[M+H]⁺：337.2

实施例3：

取0.46g噻吩硼酸，其它反应原料、条件、后处理过程均与合成E5路线相同。最后得结晶状固体E7。其表征结果如下：

¹H NMR(500MHz，DMSO)：δ7.64(d，J=7.7Hz，1H)，7.52(dd，J=19.7，4.1Hz，1H)，7.36(t，J=7.4Hz，1H)，7.14(dd，J=5.0，3.7Hz，1H)，δ4.23(t，J=7.4Hz，1H)，3.20(s，4H)，2.58(s，2H)，δ2.10(m，1H)，1.55(ddd，J=20.1，17.8，11.1Hz，2H)，1.01-0.96(m，6H).

MS(ESI)m/z：[M+H]⁺：342.2.

实施例4：

0.71g联苯硼酸，其它反应原料、条件、后处理过程均与合成E5路线相同。最后得结晶状固体E8。其表征结果如下：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ7.70(d，J=1.9Hz，1H)，7.69(d，J=2.4Hz，1H)，7.69-7.63(m，6H)，7.49(t，J=7.6Hz，2H)，7.39(d，J=3.4Hz，3H)，δ4.23(t，J=7.4Hz，1H)，3.20(s，4H)，2.58(s，2H)，δ2.10(m，1H)，1.55(ddd，J=20.1，17.8，11.1Hz，2H)，1.01-0.96(m，6H).

MS(ESI)m/z：[M+H]⁺：412.2.

实施例5：

将原料E4换成原料E12，其它反应与合成E8的方法相同。最后的白色粉末状固体E13。其表征结果如下：

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ7.70(d，J=3.5Hz，3H)，7.67(d，J=7.4Hz，3H)，7.57(d，J=7.7Hz，2H)，7.50(t，J=7.4Hz，2H)，7.45(t，J=7.6Hz，2H)，7.30(s，1H)，δ4.23(t，J=7.4Hz，1H)，3.20(s，4H)，2.58(s，2H)，δ2.10(m，1H)，1.55(ddd，J=20.1，17.8，11.1Hz，2H)，1.01-0.96(m，6H).

MS(ESI)m/z：[M+H]⁺：412.2.

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Claims

1.一种肼腈类组织蛋白酶K抑制剂，其结构式如下所示：

其中，R为

2.权利要求1所述的肼腈类组织蛋白酶K抑制剂在制备治疗骨质疏松症药物方面的应用。