CN103070983B - 一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用 - Google Patents
一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103070983B CN103070983B CN201310010855.8A CN201310010855A CN103070983B CN 103070983 B CN103070983 B CN 103070983B CN 201310010855 A CN201310010855 A CN 201310010855A CN 103070983 B CN103070983 B CN 103070983B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- dna
- present
- compositions
- chemotherapy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 129
- 235000019224 Camellia sinensis var Qingmao Nutrition 0.000 title abstract 2
- 235000020339 pu-erh tea Nutrition 0.000 title abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 claims abstract description 19
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 37
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 abstract description 18
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 abstract description 10
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 abstract description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 9
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 abstract description 7
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 6
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 239000001058 brown pigment Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 54
- 230000008569 process Effects 0.000 description 49
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 48
- 229930195573 Amycin Natural products 0.000 description 48
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 38
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 38
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 15
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 13
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 12
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 11
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 description 11
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 11
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- 238000011226 adjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 230000036541 health Effects 0.000 description 8
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 7
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 5
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000031320 Teratogenesis Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 2
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004148 unit process Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000037488 Coccoloba pubescens Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710127774 Stress response protein Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000035568 catharsis Effects 0.000 description 1
- 230000007960 cellular response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003419 expectorant effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000011227 neoadjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用,该组合物包括茶褐素、茶多糖、茶多酚、咖啡因、γ-氨基丁酸和没食子酸;利用野生型的小鼠胚胎成纤维细胞测试DNA毒性化学物质对正常细胞的杀伤作用,及本发明组合物保护正常细胞不受DNA损伤、进而不发生凋亡的效果,结果表明本发明组合物可有效地预防DNA毒性化学物质导致的正常细胞死亡,进一步的研究表明本发明组合物对DNA毒性化合物导致的肿瘤细胞死亡没有保护作用,相反,本发明组合物可促进DNA毒性化合物对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,该组合物可以在肿瘤病人化疗中用来保护正常细胞,减轻肿瘤化疗导致的毒副作用,同时增敏化疗药物,增强化疗效果,提高化疗病人生存质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用,更具体地说,本发明涉及该组合物在预防DNA毒性的化学物质生物危害中的应用。
背景技术
DNA毒性或基因毒性(genotoxic)的化学物质,是指一大类可以导致DNA损伤,进而导致基因突变、细胞死亡或肿瘤发生的化学物质。其中包含直接结合到DNA上,对DNA进行化学修饰,导致DNA损伤;或作用于DNA结合相关蛋白,对DNA造成损伤等。大部分致畸、致突、致癌的化合物都属于这一类,这类化合物也是人们日常生活中经常遇到的,如汽车尾气,香烟烟雾、厨房油烟等等。
由于肿瘤细胞异常活跃的增殖能力,细胞内DNA复制非常活跃,也成为这类基因毒性化合物的主要靶点。目前,临床上普遍应用的肿瘤化疗药物,如顺铂及其衍生物卡铂,环磷酰胺,阿霉素等等,都是这一类的化合物。由于这些化合物对正常细胞的DNA也有损伤,接受化疗的肿瘤病人通常会出现严重的毒副作用,如白细胞下降、呕吐、腹泻等等。
因此,DNA毒性化合物对人类的生物毒性作用越来越受到人们的广泛关注,如何预防其致畸、致突、致癌作用也已成为人们广泛关注的话题。在临床上,如何减轻化疗的毒副作用也已成为重要的问题。研发防治DNA毒性化合物对人类危害的保健品,有重要的社会和经济价值。
普洱茶是以云南原产地的大叶种晒青茶加工而成,是人们常用的茶饮料。普洱茶具有性温味香,解油腻牛羊毒,苦涩逐痰,刮肠通泄等功效。现代生物医学研究也表明,普洱茶具有降血糖、降血脂、降血压、抗炎等功效,使普洱茶成为人们喜爱的保健饮品。但迄今为止,普洱茶用于预防DNA毒性化合物的生物危害尚未发现相关资料报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于普洱茶主要成分的组合物,该组合物的组成成分及其质量百分比为:5-50%茶褐素、5-40%茶多糖、10-50%茶多酚、5-30%咖啡因、0.1-2%γ-氨基丁酸和0.1-2%没食子酸。
本发明另一目的是提供一种基于普洱茶主要成分的组合物新用途,即以基于普洱茶主要成分的组合物作为有效成分,在制备预防DNA毒性化学物质的生物危害的药物中的应用。
将基于普洱茶主要成分的组合物应用在制备增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的药物,以及用于制备保护化疗药物对肿瘤病人正常细胞的毒副作用药物中的应用。
本发明的基于普洱茶主要成分的组合物作为其新用途的主要活性成分,可进一步将组合物制成浸膏、丸剂、口服液、片剂、针剂、皮肤护理用品等衍生产品,其中可添加一种或多种药物上可接受的辅料,以改善衍生产品的吸收效果或便于服用。
本发明另一目的是将基于普洱茶主要成分的组合物应用在制备预防DNA毒性化学物质生物危害的保健品或日用品中,即以本发明组合物作为主要有效活性成分,将组合物制成保健品或日用品,必要时添加一些保健品或日用品中可接受的辅料,用于日常生活中预防DNA毒性化学物质对正常细胞的毒性。
本发明利用野生型的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)测试DNA毒性化合物对正常细胞的杀伤作用,同时测试基于普洱茶主要成分的组合物对正常细胞的保护作用,从而揭示这种组合物在预防DNA毒性化合物生物危害的功效。
本发明利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测DNA毒性化学物质处理后细胞的凋亡及本发明组合物的保护作用;
检测所依据的原理如下:Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸,磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧,即与细胞浆相邻的一侧,在细胞发生凋亡的早期,不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面,即细胞膜外侧;磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应;而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性;用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V,即AnnexinV-FITC,就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征,用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后,正常的活细胞不被AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色;凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色,碘化丙啶染色呈阴性;坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色。
细胞凋亡检测表明,部分细胞在阿霉素处理后Annexin V染色为阳性,表明阿霉素启动了细胞凋亡程序,阿霉素(Doxorubicin,Dox)对正常细胞有毒性;而预先加入本发明组合物进行保护的细胞,在阿霉素处理后Annexin V染色为阳性的细胞数量明显减少,表明本发明组合物对阿霉素诱导的正常细胞的凋亡有很好的保护作用。
本发明通过免疫印迹检测DNA损伤应激相关蛋白p53、HSP70的表达水平,实验结果表明,DNA毒性化合物处理后,正常细胞中p53、HSP70等蛋白会应激表达升高;而在本发明组合物的保护下,降低了DNA毒性化合物诱导的应激反应,表明本发明组合物减轻了毒性化合物导致的DNA损伤。
本发明利用肿瘤细胞p53-/-+S+Ras测试DNA毒性化合物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时测试本发明组合物对这种杀伤的增敏作用,从而揭示这种组合物在临床辅助化疗中的功效,实验数据表明,DNA毒性化合物处理后,Annexin V染色结果表明,在使用DNA毒性化合物处理肿瘤细胞后细胞出现凋亡;使用本发明组合物和DNA毒性化合物共同处理,可以使肿瘤细胞的凋亡率明显上升,该结果表明本发明组合物可以增强肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性,可以应用于临床辅助化疗。
因此,本发明的实验研究表明,本发明组合物对化疗药物导致的正常细胞的毒性有很好的保护作用,而对于肿瘤细胞则有增强化疗药物的杀伤作用的辅助效果。本发明组合物的这一特性可以用于临床辅助化疗:在化疗过程中保护病人的正常细胞,减轻毒副反应,同时还可增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。这一结果预示着本发明组合物在临床医学上辅助化疗,降低毒副作用方面有很好的应用前景。另外,本发明组合物在日常生活中用于制备消除DNA毒性化合物生物危害的保健品、日用品方面也有很好的应用前景。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明涉及保健医学、毒物化学、肿瘤学、细胞生物学领域的研究与应用,首次提出应用基于普洱茶主要成分的组合物防治DNA毒性化合物所致的生物危害,为普洱茶用于防治DNA毒性化合物生物危害提供了科学依据。
2、本发明组合物可以防止暴露于DNA毒性化合物后导致的正常细胞死亡,避免其生物毒性;将制剂用于研发抗DNA损伤保健品,预防吸烟危害的保健品,临床医学中肿瘤辅助化疗,日化行业等。
3、提供了经济实惠、简单易行的DNA毒性化合物的防治方法,揭示了普洱茶的新用途,开拓了一个新的应用领域。
4、提供了经济实惠、简单易行的化疗药物增敏方法,为临床肿瘤化疗提高效果、降低毒副作用提供了新的策略。
附图说明
图1是DNA毒性化合物阿霉素处理后正常细胞凋亡情况荧光染色示意图;其中A为正常细胞经阿霉素处理12小时后细胞Annexin V-FITC染色;B为正常细胞经阿霉素处理12小时后碘化丙啶染色;C为微分干涉显微成像(DIC)观察到的细胞形态示意图;
图2是在加入本发明组合物保护的情况下,DNA毒性化合物阿霉素处理后正常细胞凋亡的情况示意图;其中A为本发明组合物保护下,正常细胞经阿霉素处理12小时后细胞AnnexinV-FITC染色;B为组合物保护下,正常细胞经阿霉素处理12小时后碘化丙啶染色,;C为微分干涉显微成像观察到的细胞形态;
图3是定量添加本发明组合物前后,阿霉素导致正常细胞凋亡率的变化示意图;图中Dox为未添加组合物的阿霉素导致正常细胞的凋亡率;Dox+Pure是添加本发明组合物后阿霉素导致正常细胞的凋亡率;
图4是本发明从分子水平,检测正常细胞应激反应蛋白表达水平示意图;图中WT为未经任何处理的正常细胞对照(野生型);WT+Pure为正常细胞添加本发明组合物处理;WT+Pure+Dox0.1是正常细胞添加本发明组合物处理保护后,再加入剂量为0.1ug/ml的DNA毒性化合物阿霉素处理;WT+Dox0.1是正常细胞直接加入剂量为0.1ug/ml的DNA毒性化合物阿霉素处理;WT+Pure+Dox0.5是正常细胞添加本发明组合物处理保护后,再加入剂量为0.5ug/ml的DNA毒性化合物阿霉素处理;WT+Dox0.5是正常细胞直接加入剂量为0.5ug/ml的DNA毒性化合物阿霉素处理;
图5是DNA毒性化合物阿霉素处理后肿瘤细胞凋亡的情况示意图;其中A为肿瘤细胞经阿霉素处理后12小时后细胞Annexin V-FITC染色;B为肿瘤细胞经阿霉素处理后12小时后碘化丙啶染色;C为微分干涉显微成像观察到的细胞形态;
图6是在加入本发明组合物的情况下,DNA毒性化合物阿霉素处理后肿瘤细胞凋亡的情况示意图;其中A为本发明组合物作用下,肿瘤细胞经阿霉素处理12小时后细胞AnnexinV-FITC染色;B为本发明组合物作用下,肿瘤细胞经阿霉素处理12小时后碘化丙啶染色;C为微分干涉显微成像观察到的细胞形态;
图7是定量比较添加本发明组合物前后,阿霉素导致肿瘤细胞凋亡率的变化示意图;图中Dox为未添加本发明组合物的阿霉素导致肿瘤细胞的凋亡率;Dox+Pure是添加本发明组合物后阿霉素导致肿瘤细胞的凋亡率;
图8是MTT定量检测添加本发明组合物前后,环磷酰胺导致肿瘤细胞死亡程度的变化;图中横坐标为环磷酰胺浓度,纵坐标为细胞存活程度,puer为添加本发明组合物的测试组,control为未添加本发明组合物的对照组;
图9是MTT定量检测添加本发明组合物前后,卡铂导致肿瘤细胞死亡程度的变化;图中横坐标为卡铂浓度,纵坐标为细胞存活程度,puer为添加本发明组合物的测试组,control为未添加本发明组合物的对照组。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明保护范围不局限于所述内容,本实施例中使用的方法如无特殊说明均为常规方法,本实施例中使用试剂如无特殊说明,均为市售常规试剂。
实施例1:本发明中基于普洱茶主要成分的组合物,其组成物及质量百分比为50%茶褐素、30%茶多糖、11%茶多酚、5%咖啡因、2%γ-氨基丁酸和2%没食子酸。
本实施例利用野生型的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)测试DNA毒性化合物对正常细胞的杀伤作用,同时测试本发明组合物对正常细胞的保护作用,从而揭示这种组合物在预防DNA毒性化合物生物危害的功效;
本实施例利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡和组合物的保护作用,具体操作如下:接种浓度为1×105个小鼠胚胎成纤维细胞到六孔细胞培养板中的玻璃载玻片上,使用DMEM+10%胎牛血清培养基,在37℃、5%CO2、3%O2培养箱中培养至细胞贴壁;将细胞分为测试组和对照组,在测试组中加入本实施例组合物共培养,对照组不加本实施例组合物共培养,培养12小时后,在本实施例组合物测试组细胞和对照组细胞中分别添加0.1μg/mL或0.5μg/mL的阿霉素进行处理,处理12h后,对细胞进行Annexin V荧光染色,染色具体步骤如下:
1、吸除细胞培养板玻璃载玻片上的细胞培养液,加入PBS缓冲液洗涤一次;
2、加入195μl Annexin V-FITC结合液;
3、加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温25℃避光孵育10分钟;
4、吸除染色液,加入190μl Annexin V-FITC结合液;
5、加入10μl碘化丙啶染色液,轻轻混匀,室温避光放置;
在荧光显微镜下进行Annexin V荧光染色观察,Annexin V-FITC为绿色荧光,碘化丙啶为红色荧光,辅助以微分干涉成像显微技术观察细胞的形态变化。
结果见图1-4,图1-A图中荧光染色亮点为正常细胞经阿霉素处理后12小时后发生早期凋亡的阳性细胞;B图中荧光染色亮点为正常细胞经阿霉素处理后12小时后发生晚期凋亡或坏死的细胞;
图2-A图中荧光染色亮点为本实施例组合物保护下,正常细胞经阿霉素处理12小时后发生早期凋亡的阳性细胞;B图中荧光染色亮点为组合物保护下,正常细胞经阿霉素处理12小时发生晚期凋亡或坏死的细胞;
图3是对图1-2的定量结果,显示本实施例组合物使阿霉素处理后正常细胞凋亡率从18%降低到4%,显示了很好的保护效果;
从以上结果可以看出:约18%的细胞在阿霉素处理后Annexin V染色为阳性,表明阿霉素启动了正常细胞的凋亡程序,阿霉素(Doxorubicin,Dox)对正常细胞有毒性;而预先加入本实施例组合物进行保护的细胞,在添加阿霉素处理后只有约4%Annexin V染色为阳性,表明本发明组合物对阿霉素诱导的正常细胞的凋亡有很好的保护作用。
图4是从分子水平通过免疫印迹检测DNA损伤应激相关蛋白p53、HSP70的表达水平。实验结果表明,正常MEF细胞经过0.1μg/mL或0.5μg/mL的阿霉素处理后,细胞中p53、HSP70等蛋白会应激表达升高(WT+Dox0.1,WT+Dox0.5);而在本实施例组合物的保护下,降低了DNA毒性化合物阿霉素诱导的p53、HSP70等蛋白的应激反应(WT+Pure+Dox0.1,WT+Pure+Dox0.5),表明本实施例组合物减轻了毒性化合物阿霉素导致的DNA损伤。
实施例2:本发明中基于普洱茶主要成分的组合物,其组成物及质量百分比为5%茶褐素、40%茶多糖、30%茶多酚、23%咖啡因、1%γ-氨基丁酸和1%没食子酸。
本实施例利用肿瘤细胞p53-/-+S+Ras测试DNA毒性化合物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时测试本实施例组合物对这种杀伤的增敏作用,从而揭示这种组合物在临床辅助化疗中的功效,具体操作如下:接种浓度为1×105个肿瘤细胞p53-/-+S+Ras到六孔细胞培养板中的玻璃载玻片上,使用DMEM+10%胎牛血清培养基,在37℃、5%CO2、3%O2培养箱中培养至细胞贴壁;将细胞分为测试组和对照组,在测试组中加入本实施例组合物共培养,对照组不加本实施例组合物共培养,培养12小时后,对本实施例组合物测试组细胞和对照组细胞分别添加0.1μg/mL或0.5μg/mL的阿霉素进行处理,处理12h后,对细胞进行Annexin V荧光染色,染色步骤如下:
1、吸除细胞培养板玻璃载玻片上的细胞培养液,加入PBS缓冲液洗涤一次;
2、加入195μl Annexin V-FITC结合液;
3、加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温20℃避光孵育10分钟;
4、吸除染色液,加入190μl Annexin V-FITC结合液;
5、加入10μl碘化丙啶染色液,轻轻混匀,室温避光放置。
在荧光显微镜下进行Annexin V荧光染色观察,Annexin V-FITC为绿色荧光,碘化丙啶为红色荧光,辅助以微分干涉成像显微技术观察细胞的形态变化。
结果见图5-7,图5-A中荧光染色亮点为肿瘤细胞经阿霉素处理后12小时后发生早期凋亡的阳性细胞;B图中荧光染色亮点为肿瘤细胞经阿霉素处理后12小时后发生晚期凋亡或坏死的细胞;
图6-A中为荧光染色亮点为本实施例组合物作用下,肿瘤细胞经阿霉素处理12小时后发生早期凋亡的阳性细胞;B图中荧光染色亮点为本实施例组合物作用下,肿瘤细胞经阿霉素处理12小时后发生晚期凋亡或坏死的细胞;
图7是对图5-6的定量结果,显示了本实施例组合物使阿霉素处理后肿瘤细胞凋亡率从12%增加到22%,显示了组合物很好的增敏化疗、辅助杀伤的效果;
从以上结果可以看出:DNA毒性化合物处理后,Annexin V染色结果表明,肿瘤细胞约12%细胞出现凋亡,使用本实施例组合物和DNA毒性化合物共同处理,可以使肿瘤细胞的凋亡率上升到22%;该结果表明该实施例组合物可以增强肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性,可以应用于临床辅助化疗。
实施例3:本发明中基于普洱茶主要成分的组合物,其组成物及质量百分比为14.8%茶褐素、5%茶多糖、50%茶多酚、30%咖啡因、0.1%γ-氨基丁酸和0.1%没食子酸。
本实施例以环磷酰胺作为DNA毒性化合物,利用肿瘤细胞p53-/-+S+Ras测试DNA毒性化合物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时测试本实施例组合物对这种杀伤的增敏作用,从而揭示这种组合物在临床辅助化疗中的功效,具体操作如下:接种5×103个肿瘤细胞p53-/-+S+Ras到96孔细胞培养板中,使用DMEM+10%FBS培养基,将检测样品分为测试组和对照组,在测试组中加入本实施例组合物共培养,对照组不加本实施例组合物共培养,在37℃,5%CO2,3%O2培养箱中培养,分别培养24小时,然后在本实施例组合物保护组细胞和对照组细胞分别添加0.05、0.1、0.5、1、5μg/mL的环磷酰胺进行处理,继续培养48h后,进行MTT定量检测,MTT检测具体步骤如下:
1、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4小时;
2、终止培养,小心吸去孔内培养液,加入PBS缓冲液洗涤一次;
3、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡5min,使结晶物充分溶解;在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
结果见图8,MTT定量检测表明,添加本发明组合物后,环磷酰胺导致肿瘤细胞存活度比未添加本发明组合物的对照组(control)明显减少,也即死亡程度比对照组明显增加,表明本发明组合物可以增敏环磷酰胺对肿瘤细胞的杀伤。
实施例4:本发明中基于普洱茶主要成分的组合物,其组成物及质量百分比为30%茶褐素、39%茶多糖、10%茶多酚、20%咖啡因、0.5%γ-氨基丁酸和0.5%没食子酸。
本实施例以卡铂作为DNA毒性化合物,利用肿瘤细胞p53-/-+S+Ras测试DNA毒性化合物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时测试本实施例组合物对这种杀伤的增敏作用,从而揭示这种组合物在临床辅助化疗中的功效,具体操作如下:接种5×103个肿瘤细胞p53-/-+S+Ras到96孔细胞培养板中,使用DMEM+10%FBS培养基,将检测样品分为测试组和对照组,在测试组中加入本实施例组合物共培养,对照组不加本实施例组合物共培养,在37℃,5%CO2,3%O2培养箱中培养,分别培养24小时,然后在本实施例组合物保护组细胞和对照组细胞分别添加0.05、0.1、0.5、1、5μg/mL的卡铂进行处理。继续培养48h后,进行MTT定量检测,MTT检测步骤如下:
1、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4小时;
2、终止培养,小心吸去孔内培养液,加入PBS洗涤一次;
3、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡5min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
结果见图9,MTT定量检测表明,添加本发明组合物后,卡铂导致肿瘤细胞存活度比未添加本发明组合物的对照组(control)明显减少,也即死亡程度比对照组明显增加。表明本发明组合物可以增敏卡铂对肿瘤细胞的杀伤。
实施例5:本发明中基于普洱茶主要成分的组合物,其组成物及质量百分比为50%茶褐素、30%茶多糖、11%茶多酚、5%咖啡因、2%γ-氨基丁酸和2%没食子酸。
本实施例利用野生型的小鼠胚胎成纤维细胞测试DNA毒性化合物环磷酰胺对正常细胞的杀伤作用,同时测试本发明组合物对正常细胞的保护作用,从而揭示这种组合物在减轻环磷酰胺毒副作用中的功效;
具体操作如下:接种浓度为1×105个小鼠胚胎成纤维细胞到六孔细胞培养板中的玻璃载玻片上,使用DMEM+10%胎牛血清培养基,在37℃、5%CO2、3%O2培养箱中培养至细胞贴壁;将细胞分为测试组和对照组,在测试组中加入本实施例组合物共培养,对照组不加本实施例组合物共培养,培养12小时后,在本实施例组合物测试组细胞和对照组细胞中分别添加0.5μg/mL的环磷酰胺进行处理,处理12h后,对细胞进行观察;实验结果显示:本实施例组合物保护前细胞死亡率为20%,在添加本实施例组合物保护后细胞死亡率为8%,测试组细胞与对照组细胞相比,漂浮的死亡细胞数量明显减少,表明本实施例组合物可减轻环磷酰胺对正常细胞的杀伤作用。
实施例6:本发明中基于普洱茶主要成分的组合物,其组成物及质量百分比为30%茶褐素、39%茶多糖、10%茶多酚、20%咖啡因、0.5%γ-氨基丁酸和0.5%没食子酸。
本实施例利用野生型的小鼠胚胎成纤维细胞测试DNA毒性化合物卡铂对正常细胞的杀伤作用,同时测试本发明组合物对正常细胞的保护作用,从而揭示这种组合物在减轻卡铂毒副作用中的功效;
具体操作如下:接种浓度为1×105个小鼠胚胎成纤维细胞到六孔细胞培养板中的玻璃载玻片上,使用DMEM+10%胎牛血清培养基,在37℃、5%CO2、3%O2培养箱中培养至细胞贴壁;将细胞分为测试组和对照组,在测试组中加入本实施例组合物共培养,对照组不加本实施例组合物共培养,培养12小时后,在本实施例组合物测试组细胞和对照组细胞中分别添加0.5μg/mL的卡铂进行处理,处理12h后,对细胞进行观察,实验结果显示:本实施例组合物保护前细胞死亡率为10%,在添加本实施例组合物保护后细胞死亡率为5%,测试组细胞与对照组细胞相比,漂浮的死亡细胞数量明显减少,表明本实施例组合物可减轻卡铂对正常细胞的杀伤作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种基于普洱茶主要成分的组合物作为唯一活性成分在制备增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时保护正常细胞免受化疗药物杀伤的药物中的应用;
所述基于普洱茶主要成分的组合物的组成成分及质量百分比为:5-50%茶褐素、5-40%茶多糖、10-50%茶多酚、5-30%咖啡因、0.1-2%γ-氨基丁酸和0.1-2%没食子酸。
2.根据权利要求1所述基于普洱茶主要成分的组合物的应用,其特征在于:组合物为浸膏、丸剂、口服液、片剂或针剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310010855.8A CN103070983B (zh) | 2013-01-11 | 2013-01-11 | 一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310010855.8A CN103070983B (zh) | 2013-01-11 | 2013-01-11 | 一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103070983A CN103070983A (zh) | 2013-05-01 |
CN103070983B true CN103070983B (zh) | 2015-06-03 |
Family
ID=48147829
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310010855.8A Expired - Fee Related CN103070983B (zh) | 2013-01-11 | 2013-01-11 | 一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103070983B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105534966B (zh) * | 2016-01-12 | 2019-03-22 | 上海交通大学 | γ-氨基丁酸作为增强化疗敏感性的活性成分的应用 |
CN106177187B (zh) * | 2016-07-26 | 2020-02-21 | 天津大学 | 具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物 |
CN111840412B (zh) * | 2020-08-21 | 2022-03-08 | 杭州茗褐生物科技有限公司 | 茶褐素在制备抗黑色素瘤药物中的应用 |
CN112957406A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-06-15 | 吉林大学 | 普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药物中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002091845A1 (en) * | 2001-05-17 | 2002-11-21 | Korea Confidence Co., Ltd | Lingering intoxication aquaous tea comprising puerh extract as an effective component and process for preparation thereof |
CN101961422A (zh) * | 2009-07-24 | 2011-02-02 | 天津天士力现代中药资源有限公司 | 普洱茶提取物及其制备 |
CN101961059A (zh) * | 2009-07-24 | 2011-02-02 | 天津天士力现代中药资源有限公司 | 一种普洱茶提取物及制备方法和应用 |
WO2012055010A1 (en) * | 2010-10-25 | 2012-05-03 | Fédération Des Producteurs Acéricoles Du Québec | Maple tree-derived products and uses thereof |
-
2013
- 2013-01-11 CN CN201310010855.8A patent/CN103070983B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002091845A1 (en) * | 2001-05-17 | 2002-11-21 | Korea Confidence Co., Ltd | Lingering intoxication aquaous tea comprising puerh extract as an effective component and process for preparation thereof |
CN101961422A (zh) * | 2009-07-24 | 2011-02-02 | 天津天士力现代中药资源有限公司 | 普洱茶提取物及其制备 |
CN101961059A (zh) * | 2009-07-24 | 2011-02-02 | 天津天士力现代中药资源有限公司 | 一种普洱茶提取物及制备方法和应用 |
WO2012055010A1 (en) * | 2010-10-25 | 2012-05-03 | Fédération Des Producteurs Acéricoles Du Québec | Maple tree-derived products and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Pu-erh black tea supplementation decreases quinocetone-induced ROS generation and oxidative DNA damage in Balb/c mice;Di Wang et al;《Food and Chemical Toxicology》;20111231(第49期);第477-484页 * |
茶活性因子与茶功效;盛军;《普洱》;20111231(第05期);第50-52页,第51页最后1段-第52页第1段、第52页最后1段 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103070983A (zh) | 2013-05-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ogbolu et al. | In vitro antimicrobial properties of coconut oil on Candida species in Ibadan, Nigeria | |
Xu et al. | Berbamine: a novel inhibitor of bcr/abl fusion gene with potent anti-leukemia activity | |
CN106928246B (zh) | 一种化合物及其制备方法与用途 | |
CN103070983B (zh) | 一种基于普洱茶主要成分的组合物及其应用 | |
Pai et al. | Anticancer activity of Berberis aristata in Ehrlich ascites carcinoma-bearing mice: a preliminary study | |
Oladunmoye | Antioxidant, free radical scavenging capacity and antimicrobial activities of Mirabilis jalapa | |
CN109320570A (zh) | 一种淫羊藿次苷ⅰ类化合物、衍生物、可药用盐及应用 | |
BS | In Vitro α-glucosidase inhibition, antioxidant, anticancer, and antimycobacterial properties of ethyl acetate extract of Aegle tamilnadensis Abdul Kader (Rutaceae) leaf | |
Kamarudin et al. | Induction of apoptosis by Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. bulb extracted under optimised extraction condition on human retinoblastoma cancer cells (WERI-Rb-1) | |
CN100381434C (zh) | 具有抗癌、抗菌作用的余甘子提取物的中药制剂的生产方法 | |
CN100443080C (zh) | 一种预防及治疗癌症的药物组合物 | |
CN103599122A (zh) | 知母中知母皂苷aⅲ在制备抗肿瘤药物的应用 | |
CN104257656B (zh) | 一种协同增强抑制肿瘤生长的药物组合物 | |
CN103142774B (zh) | 裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌与鼻咽癌中的应用 | |
CN104000887B (zh) | 一种用于手、皮肤抗菌的中草药组合物 | |
CN104188962A (zh) | 厚朴酚与唑类药物在制备抗真菌联合用药物中的应用 | |
CN100556404C (zh) | Tagalsin C及其同系物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN106955292A (zh) | 一种治疗食管癌的药物组合物及用途 | |
Alisha et al. | Pharmacognostical overview on Terminalia arjuna: A justification of folkloric belief | |
CN106177035B (zh) | 具有降血糖、抗癌的月季花有效提取物的制备方法及应用 | |
CN100420458C (zh) | 一种复方中药外用制剂及其制备方法 | |
CN107693509A (zh) | Sb‑fi‑26在制备治疗乳腺癌药物中的应用 | |
CN102949399B (zh) | 丹参酮iia在制备抑制角质形成细胞增殖疾病药中的应用 | |
Morah et al. | Euphorbia Sanguinea stem sap as antifungal agent against Onychomycosis | |
CN101301301A (zh) | 芦丁和槲皮素-7-鼠李糖在制备抗肝炎药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150603 Termination date: 20190111 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |