CN103068834A - 用于反向合成rna的亚磷酰胺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了以能够有效地在3'端进行修饰的形式来合成非常纯的RNA的构建单元和方法。开发了用于在5'→3'方向进行RNA合成的反向RNA单体亚磷酰胺，致使能够在3'端纯净有效地引入各种修饰的非常纯净的寡合成。在使用本发明所公开的反向RNA亚胺进行的自动寡合成过程中观察到每步具有更高的偶联效率，使其更有能力达到更高的纯度并产生非常长的寡核苷酸。在本发明的合成过程中使用反向RNA单体亚磷酰胺产生不含N+1种类的寡核苷酸。

Description

用于反向合成RNA的亚磷酰胺
关联申请
本申请要求提交于2010年2月19日的第12/708,827号美国申请的优先权，其为第PCT/US2009/005063号国际专利申请的部分继续申请案，指定美国并提交于2009年9月8日，以英文公布，其要求提交于2008年9月6日的第61/191,065号美国临时申请的权益。
以上各申请所教导的全部内容引入本文作为参考。
发明背景
现在已成功建立了确定序列的RNA在3'→5'方向上的合成，并在当前用于多种治疗级RNA适体、tRNA、siRNA和生物活性RNA分子的合成和开发。由于避免了如通过T7RNA聚合酶在体外转录进行的合成的低效率和规模限制，因此想要进行RNA的化学合成（参见Helm,M.等人,RNA,5:618-621,1999,将其所教导的全部内容以引用方式结合于本文）。RNA的化学合成对于RNA结构和功能的研究而言是想要的，并且可以选择性地实现多种有用的修饰，如位点特异性地引入官能团；即作为RNA三级结构探针的二硫化物交联（参见Maglott,E.J.,Glick,G.D.,Nucl,Acids Res.,26:1301-1308,1999,将其所教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
本方法使用具有合适的N-保护基的核糖核苷：通常为5’-保护基，例如二甲氧基三苯基，即DMT基团；2’-保护基，其中最常见的是叔丁基二甲基硅烷基醚；和3’-亚磷酰胺（phosphoamidite），其中最常见的是氰乙基二异丙基。随后将该组分与带有适当的N-保护基且2’或3’琥珀酸酯连接于固体支持物的核苷偶联。在致使产生二聚体和寡聚核苷酸的活化剂的存在下，在溶液相中也实现了组分1和5’-OH-n-保护的-2’,3’-保护的核苷的偶联，接着进行氧化（3’→5’方向合成），也可产生具有3’→5’-核苷酸间连接的保护二核苷酸，Ogilvie,K.K.,Can.J.Chem.,58,2686,1980（图式1）。
许多这样的合成RNA需要修饰或标记寡核苷酸的3'-端。通常，使用3'→5'合成方法来合成需要亲脂性的长链配体或发色团的3'-端修饰的RNA具有挑战性、难以合成并通常导致低偶联效率和较低的最终寡核苷酸纯度。通常需要附加的纯化。因此，需要新的合成方法来快速、洁净地并以允许在3'端进行修饰的形式来合成RNA分子。
发明概述
本发明提供了以能够有效地在3'端进行修饰的形式来合成非常纯的RNA的构建单元和方法。开发了用于在5'→3'方向进行RNA合成的反向RNA单体亚磷酰胺，致使能够在3'端纯净有效地引入各种修饰的非常纯净的寡合成（oligo synthesis）。
在使用本文所公开的反向RNA亚酰胺（amidite）进行的自动寡合成过程中观察到每步具有更高的偶联效率，使其更有能力达到更高的纯度并产生非常长的寡核苷酸。在本发明的合成过程中使用反向RNA亚磷酰胺产生不含N+1种类的寡核苷酸。在HPLC分析/纯化或凝胶纯化过程中，所述的N+1种类产生使想要的峰变宽的杂质。在同一个偶联循环中添加两个核碱基（nucleobase）而不是一个核碱基时会产生所述的N+1种类。
在第一个实施方案中，本发明涉及如式Ia，Ib，Ic或Id所示的化合物：
Figure BDA00002280522000022
或其盐，其中J为H，
Figure BDA00002280522000023
其中
Figure BDA00002280522000024
表示J连接到O原子的位置；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中所述的烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的（interventing）杂原子；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中所述的烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
或R1与R2与其所连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当结构式Ia或Ib为：
Figure BDA00002280522000031
时；其中R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当结构式Ia或Ib为：
Figure BDA00002280522000032
时；R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基可选地包括独立地选自NH，NR5，O和S的***的杂原子；并且可以任选地以-NR7R8，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-OR9，(C1-C6)烷氧基，苄基或取代苄基，-SR10；或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C 12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选取代的核碱基，任选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化，其中所述核碱基选自：
N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，由-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺取代的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；
其中在核碱基或环外胺中任意可取代的氮原子任选地由芴基甲氧基羰基；-C(=O)OPh；-C(=O)(C1-C16)烷基；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)OH；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)O(C1-C6)烷基；=CR8N(C1-C6)烷基)2；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8(=O)CF3；
-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；和
Figure BDA00002280522000051
所取代；其中在核碱基内任意可取代的氧原子任选地由-C(-O)N(C1-C6烷基)2-C(=O)N(苯基)2所取代。
在第二个实施方案中，本发明涉及如式Ia，Ib，Ic或Id所示的化合物：
Figure BDA00002280522000052
Figure BDA00002280522000053
或其盐，其中J为H，其中
Figure BDA00002280522000055
表示J连接到O原子的位置；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中所述的烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中所述的烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
或R1与R2与其连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当结构式Ia或Ib为：
Figure BDA00002280522000061
时；其中R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当结构式Ia或Ib为：
Figure BDA00002280522000062
时；R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基任选地包括独立地选自NH，NR5，O和S的***的杂原子；并且可以任选地地以-NR7R8，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-OR9，(C1-C6)烷氧基，苄基或取代苄基，-SR10；或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；条件是如果R4为-O-Si(R11)3，并且两个R11基团均为甲基，那么另一个不能为t-丁基，或如果R4为-O-CH2-Si(R11)3，那么三个R11基团不能均为异丙基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选地取代的核碱基，任选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化。
附图的简要说明
图1为使用2分钟的偶联时间，使用活化剂BTT合成的REV-2'-OMe-BTT-rUmrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrAmrA（SEQ ID NO:1）的粗品RNA的毛细管凝胶电泳（CE）分析的图表（BTT为5-苄硫基-1-H-四唑）。纯度：UV200nm：时间=21.837；78.95%。
图2为使用4分钟的偶联时间，使用活化剂（0.25M）ETT（乙基硫代四唑）合成的REV-2'-OMe-硫代磷酸酯-寡rUmrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrAmrA（SEQ ID NO:1）的粗品RNA（经脱盐的）的毛细管凝胶电泳（CE）分析的图表。ESI/MS（粗品）真实值MW:6971.1；实测值：6972.0。纯度：UV200nm：时间=23.046；89.09%。
图3为使用4分钟的偶联时间合成的REV-2'-OMe-磷酸二酯-寡rUmrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrAmrA（SEQ ID NO:1）的粗品RNA（经脱盐的）的毛细管凝胶电泳（CE）分析的图表。纯度：UV200nm:时间=22.396；89.03%。
图4为使用4分钟的偶联时间合成的REV-磷酸二酯-寡rUrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrArC（SEQ ID NO:3）的粗品RNA（经脱盐的）的毛细管凝胶电泳（CE）分析的图表。ESI/MS粗RNA（脱盐）；Calc:MW:6598.9。纯度:UV200nm:时间=22.613；95.29%。
图5为使用6分钟的偶联时间合成的REV-磷酸二酯-寡rUrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrArC（SEQ ID NO:3）的粗品RNA（经脱盐的）的毛细管凝胶电泳（CE）分析的图表。纯度：UV200nm:时间=22.879；93.69%。
图6为3'-DMT-2'-TBDMS-G-(N-iBu)-5'-亚磷酰胺（批号NS-42-19）的31P-NMR谱；通过分析0-200ppm的区域测得为100%。3'-DMT-2'-TBDMS-A(N-Bz)-5'-亚磷酰胺；3'-DMT-2'-TBDMS-C-(N-Ac)-5'-亚磷酰胺；和3'-DMT-2'-TBDMS-U-5'-亚磷酰胺也获得相似的结果。
图7为3'-DMT-2'-TBDMS-G(N-iBu)-5'-亚磷酰胺（批号NS 42-19）的HPLC色谱图；（纯度：保留：时间=7.418，7.754；99.64%）。3'-DMT-2'-TBDMS-A(N-Bz)-5'-亚磷酰胺（纯度：保留：时间=5.067，6.391；98.89%）；3'-DMT-2'-TBDMS-C(N-Ac)-5'-亚磷酰胺（纯度：保留：时间=4.618，6.064；99.04%）；和3'-DMT-2'-TBDMS-U-5'-亚磷酰胺（纯度：保留：时间=4.213，5.098；98.66%）也获得相似的结果。
图8为使用大规模寡核苷酸合成（Large Scale Oligonucleotide Synthesis）使用6分钟的偶联时间合成的
REV-RNA-Me-THIO-rUmrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrAmrA（SEQ ID NO:1）的粗品RNA的毛细管凝胶电泳（CE）分析的图。质谱；真实值：6971.1；实测值：6971.7。纯度：UV200nm：时间=22.408；92.63%，通过HPLC进一步纯化至24.087；98.01%。
图9A和9B为通过传统方法（3'→5'-方向）制备的粗品21-聚体RNA的电泳图的图；粗品纯度；70.73%）（图9A），和通过反向RNA合成方法（5'→3'-方向）制备的粗品21-聚体RNA的电泳图的图表；粗品纯度；78.55%（图9B）。使用Expedite8909-1型（Expedite model 8909-1）微摩尔规模。
图10A和10B为通过传统方法（3'→5'-方向）制备的具有3'-胆固醇CPG的粗品21-聚体RNA的电泳图的图表；粗品纯度；82.83%（图10A），和通过反向RNA合成方法（5'→3'-方向）制备的具有3'-胆固醇CPG的粗品21-聚体RNA的电泳图的图表；（图10B）粗品纯度；85.76%。使用Expedite 8909-1型微摩尔规模。
图11为通过反向RNA合成方法（5'→3'-方向）制备的具有3'-PEG（聚乙二醇；MW 2000）的粗品21-聚体RNA的电泳图的图表。加速模型8909-1微摩尔规模。在最后一步通过相应亚磷酰胺连接PEG-2000；ChemGenes目录；CLP-3119；计算的分子量：8684.1；和实测分子量：8681.1。粗品纯度；91.87%。
图12为支化亚酰胺（I）的PAGE分析的照片。双聚乙二醇RNA；第1道；BPB和二甲苯蓝；第3道-粗品寡核苷酸；第5道-反相HPLC，纯化的寡聚物；（偶联时间-4Min；ETT）。
发明详述
下面是本发明的示例性实施方案的说明。本文所引用的所有专利、公开申请和所引用的文献教导的全部内容以引用方式结合于本文。
在第一或第二实施方案的一个方面中，其中J为
Figure BDA00002280522000091
其中
Figure BDA00002280522000092
表示J连接到O原子的位置。
在第一或第二实施方案的一个方面中，其中所述的化合物表示为式Ia或Ib：
Figure BDA00002280522000093
或其盐。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，Z为非取代或取代芳基，非取代或取代三芳基甲基，非取代或取代三苯甲基，非取代或取代四氢吡喃基，或非取代或取代9-苯基氧杂蒽基基（phenylxanthyl）。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，Z为二-对甲氧基苯基苯基甲基，对氟苯基-1-萘基苯基甲基，对甲氧基苯基-1-萘基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，对甲苯基二苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，或对甲苯基二苯基甲基。
在第一或第二实施方案的又一个方面中，Z由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000094
其中
Figure BDA00002280522000095
表示与3'氧原子的连接，Ra，Rb，和Rc独立地选自以下结构式：
Figure BDA00002280522000096
Figure BDA00002280522000097
在第一或第二实施方案的一个方面中，Z为4-甲氧基三苯甲基，4,4'-二甲氧基三苯甲基，或4,4',4"-三甲氧基三苯甲基。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，在核碱基或环外胺上的可取代的氮原子可选地取代=CHN(CH3)2；C(=O)CH(CH3)2；-C(=O)CH3；=C(CH3)N(CH3)2；-C(=O)OPh    ；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)CH2CH2-C(=O)O(C1-C6)烷基；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺和
Figure BDA00002280522000101
在第一或第二实施方案的又一个方面中，R3为-CH2CH2CN，-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5，-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3，-CH2CH2-C6H4-NO2，-CH2CH2-NH-C(O)-C6H5，或-CH2CH2-O-C6H4-C(O)CH3，并且R4为-O-Si(R11)3。
在第一或第二实施方案的又一个方面中，R4为-O-Si(CH3)2(C(CH3)3)或-O-CH2-Si(CH(CH3)2)3)。
在第一或第二实施方案的一个方面中，所述化合物由下结构式之一表示：
或其盐。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
Figure BDA00002280522000103
或其盐。
在第一或第二实施方案的又一个方面中，R3为-CH2CH2CN。
在第一或第二实施方案的一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
Figure BDA00002280522000111
或其盐。
在第一或第二实施方案的一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
Figure BDA00002280522000112
或其盐。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：或其盐。
在第一或第二实施方案的又一个方面中，R3为CH2CH2CN。
在第一或第二实施方案的一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
或其盐。
在第一或第二实施方案的一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
Figure BDA00002280522000121
或其盐。
在第一或第二实施方案的一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
Figure BDA00002280522000122
或其盐。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，化合物表示为以下结构式之一：
Figure BDA00002280522000123
或其盐。
在第一或第二实施方案的另一个方面中，化合物由以下结构式之一表示：
或其盐。
在第三个实施方案中，本发明涉及由以下结构式表示的化合物：
Figure BDA00002280522000131
或其盐，其中
每个Y独立地为氧或硫；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中所述的烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中所述的烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
或R1与R2与其所连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当R4为核糖构象时，R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当R4为***糖构象时，R4进一步选自-OC(＝O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基可以任选地包括独立地选自NH，NR5，O和S的***的杂原子；并且可选地以-NR7R8，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-OR9，(C1-C6)烷氧基，苄基或取代苄基，-SR10；或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C 12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选地取代的核碱基，任选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化，其中所述核碱基选自：
N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，由-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺取代的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；
其中在核碱基或环外胺中任意可取代的氮原子任选地由芴基甲氧基羰基；-C(=O)OPh；-C(=O)(C1-C16)烷基；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)OH；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)O(C1-C6)烷基；=CR8N(C 1-C6)烷基)2；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；和
Figure BDA00002280522000151
所取代；
其中在核碱基内任意可取代的氧原子任选地由-C(-O)N(C1-C6烷基)2-C(=O)N(苯基)2所取代；
R20为H，-O-Z，或R21；
R21为3'官能团；
Z为对酸不稳定的保护基团；和
n为0至150；
或其盐。
在第三个实施方案的一个方面中，R21为
a）氰乙基磷酸酯-聚乙二醇v，其中v为2-100，是乙二醇单元数；
b）氰乙基磷酸酯-连接子，其连有胆固醇、生物素、荧光素、花青染料、补骨脂素、四甲基罗丹明染料、dabcyl染料、C-3二硫化物、C-6二硫化物、对称和不对称烃链（C2-C50）、末端氨基被CF3C(=O)或邻苯二甲酰胺基或FMOC保护的对称和不对称烃链（C2-C50）、以胺保护基团保护的(C1-C16)亚烷基胺，以叠氮基保护的(C1-C5)亚烷基胺；以乙炔基（C三键CH）保护的(C1-C5)亚烷基胺；
c）以DMT基或其它对酸不稳定的基团保护的氰乙基磷酸酯-2-乙醇，以DMT基或其它酸不稳定基团保护的氰乙基磷酸酯-3-丙醇；
d）具有末端羟基的(C1-C50)亚烷基；
e）脂类，羧基，或肽；或
f）分枝的亚磷酰胺。
在第三个实施方案的另一个方面中，n为5-75。或者，n为76-150。或者，n为10-25。或者n为25-50。或者，n为50-75。或者，n为75-100。
在第三个实施方案的另一个方面中，Z为非取代或取代芳基，非取代或取代三芳基甲基，非取代或取代三苯甲基，非取代或取代四氢吡喃基，或非取代或取代9-苯基氧杂蒽基基。
在第三个实施方案的另一个方面中，Z为二-对甲氧基苯基苯基甲基，对氟苯基-1-萘基苯基甲基，对甲氧基苯基-1-萘基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，对甲苯基二苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，或对甲苯基二苯基甲基。
在第三个实施方案的又一个方面中，Z由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000161
其中表示与3'氧原子连接，Ra，Rb，和Rc独立地选自以下结构式：
Figure BDA00002280522000163
Figure BDA00002280522000164
在第三个实施方案的一个方面中，Z为4-甲氧基三苯甲基，4,4'-二甲氧基三苯甲基，或4,4',4"-三甲氧基三苯甲基。
在第三个实施方案的另一个方面中，在核碱基或环外胺上的可取代的氮原子任选地由=CHN(CH3)2；C(=O)CH(CH3)2；-C(=O)CH3；=C(CH3)N(CH3)2；-C(=O)OPh    ；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)CH2CH2-C(=O)O(C1-C6)烷基；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺和
Figure BDA00002280522000171
取代。
在第三个实施方案的又一个方面中，R3为-CH2CH2CN，-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5，-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3，-CH2CH2-C6H4-NO2，-CH2CH2-NH-C(O)-C6H5，或-CH2CH2-O-C6H4-C(O)CH3，以及R4为-O-Si(R11)3。
在第三个实施方案的又一个方面中，R4为-O-Si(CH3)2(C(CH3)3)或-O-CH2-Si(CH(CH3)2)3)。
在第三个实施方案的又一个方面中，R3为-CH2CH2CN。
本发明的第四个实施方案为合成的RNA分子，其纯度超过97%并由5'亚磷酰胺核苷合成。
第一和第二实施方案及其方面中的混合物可用于以下方法。
本发明的第五个实施方案为通过在5'-至3'-方向形成键以制备用于合成RNA寡聚物及其对映异构体的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤
a）从连接到支持物的化合物上裂解Z保护基团，所述的连接到支持物的化合物由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000172
从而形成由结构式（XX）表示的化合物：
Figure BDA00002280522000173
b）将由结构式XX表示的化合物与结构式为XXI的化合物进行反应：
Figure BDA00002280522000174
从而形成由以下结构式表示的2-聚体化合物：
Figure BDA00002280522000181
c）将该2-聚体与封端剂反应；例如酸酐以封闭未反应的3'羟基；
d）氧化或硫化该2-聚体化合物的三价磷基团，以形成由结构式XXII表示的化合物：
Figure BDA00002280522000182
e）从由结构式XXII表示的化合物将Z保护基团裂解，从而形成由结构式XXIII表示的化合物：
Figure BDA00002280522000183
f）将由结构式XXIII表示的化合物与由以下结构式表示的化合物进行反应：
Figure BDA00002280522000191
从而在氧化或硫化后形成由结构式XXIV表示的3-聚体：
Figure BDA00002280522000192
e）从由结构式XXIV表示的化合物将Z保护基团裂解；
g）重复步骤a）至e）n次，从而形成由以下结构式表示的寡核苷酸：
Figure BDA00002280522000193
或其盐，其中J为
Figure BDA00002280522000194
其中表示J连接到O原子的位置；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
或R1与R2与其所连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基可选地包括独立地选自NH，NR7，O和S的***的杂原子；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当结构式Ia或Ib为：
Figure BDA00002280522000201
时；其中R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当结构式Ia或Ib为：
时；R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基可以任选地包括独立地选自NH，NR5，O和S的***的杂原子；并且可选地以-NR7R8，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-OR9，(C1-C6)烷氧基，苄基或取代苄基，-SR10；或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C 12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选地取代的核碱基，可选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化，其中所述核碱基选自：
N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，由-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺取代的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；
其中在核碱基或环外胺中任意可取代的氮原子任选地由芴基甲氧基羰基；-C(=O)OPh；-C(=O)(C1-C16)烷基；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)OH；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)O(C1-C6)烷基；=CR8N(C 1-C6)烷基)2；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；和
Figure BDA00002280522000221
所取代；其中在核碱基内任意可取代的氧原子任选地由-C(=O)N(C1-C6烷基)2-C(=O)N(苯基)2所取代；n为1至150；或其盐。
在另一个方面中，通过硫化独立地引入每个Y基团以形成硫代磷酸酯连接，或通过氧化独立地引入每个Y基团以形成磷酸酯连接。
在另一个方面中，在氧化后消除R3基团以形成磷酸酯连接。
在另一个方面中，在硫化后消除R3基团以形成硫代磷酸酯连接。
在另一个方面中，使用碱将核碱基保护基团脱保护。
在另一个方面中，所述碱选自氨水，氨的甲醇溶液或氨的乙醇溶液。
在另一个方面中，R4为-OSi(R11)3。
在另一个方面中，所述方法进一步包括使用氟化物盐裂解-OSi(R11)3的步骤。
在另一个方面中，所述氟化物盐为氟化四乙基铵。
在另一个方面中，进一步包括将由以下结构式表示的化合物与3'官能团反应的步骤：
从而形成由以下结构式表示的化合物；
Figure BDA00002280522000231
其中R21为3'官能团或其盐。
在另一个方面中，R21为
a）氰乙基磷酸酯-聚乙二醇v，其中v为2-100，是乙二醇单元数；
b）氰乙基磷酸酯-连接子，其连有胆固醇、生物素、荧光素、花青染料、补骨脂素、四甲基罗丹明染料、dabcyl染料、C-3二硫化物、C-6二硫化物、对称和不对称烃链（C2-C50）、末端氨基被CF3C(=O)或邻苯二甲酰胺基或FMOC保护的对称和不对称烃链（C2-C50）、以胺保护基团保护的(C1-C16)亚烷基胺、以叠氮基保护的(C1-C5)亚烷基胺、以乙炔基（C三键CH）保护的(C1-C5)亚烷基胺；
c）以DMT基或其它对酸不稳定的基团保护的氰乙基磷酸酯-2-乙醇，以DMT基或其它酸不稳定基团保护的氰乙基磷酸酯-3-丙醇；
d）具有末端羟基的(C1-C50)亚烷基；
e）脂类，羧基，或肽；或
f）分枝的亚磷酰胺。
在另一个方面中是按照所要求的方法制备的RNA分子，所述的RNA分子在HPLC，离子交换，或反相色谱纯化之后，纯度为97%或更高。
缩写总结：
mA=2'-O-甲基腺苷，
rA=腺苷，
rC=胞苷，
rU=尿苷，
rG=鸟苷，
2'-OMe=2'-O-甲基
BTT=5-苄基硫代-1-H-四唑，
硫代磷酸酯=五价氧化态的磷以及硫作为P=S存在
Me-THIO=硫代磷酸酯
CE=毛细管电泳
MW=分子量
ESI/MS=电喷雾电离质谱法
DMT=4,4'-二甲氧基三苯甲基
TBDMS=叔丁基二甲基硅烷基
Ac=乙酰基（-COCH3）
Bz=苯
iBu=异丁基（2-甲基丙基）
TOM=三异丙基硅氧基甲基
THIO=硫代磷酸酯，即；硫连接到磷（V）（P=S）
本发明所述的化合物表示为
Figure BDA00002280522000241
或其盐。
在一个具体实施方案中，化合物由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000242
分别与β-D-核糖；β-L-核糖；α-D-核糖，和α-L-核糖相对应。
在另一个实施方案中，化合物由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000243
分别与β-D-***糖；β-L-***糖；α-D-***糖；α-L-***糖相对应。
在一个实施方案中，R6为-H，或-O-Z。在一个具体实施方案中，R6为O-Z，并且化合物由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000251
在一个实施方案中，Z为对酸不稳定的保护基团。对酸不稳定的保护基团为可通过与布朗斯特或路易斯酸接触而除去的保护基团。对酸不稳定的保护基团对于本领域技术人员是已知的。通常以给电子取代基如烷氧基取代三苯甲基。优选的对酸不稳定的保护基团为取代或非取代的三苯甲基，例如4,4'-二甲氧基三苯甲基（以下称作“DMT”）。
在一个具体实施方案中，Z为非取代或取代芳基，非取代或取代三芳基甲基，非取代或取代三苯甲基，非取代或取代四氢吡喃基，或非取代或取代9-苯基氧杂蒽基基。在一个更具体的实施方案中，Z选自以下基团：三苯甲基（三苯基甲基，Tr），甲氧基三苯基甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基，MMT]，二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基，DMT]，4,4',4"-三甲氧基三苯甲基，和9-苯基氧杂蒽基基。在另一个具体实施方案中，Z为4-甲氧基三苯甲基，4,4'-二甲氧基三苯甲基，或4,4',4"-三甲氧基三苯甲基。
在另一个实施方案中，Z为二-对甲氧基苯基苯基甲基、对氟苯基-1-萘基苯基甲基、对甲氧基苯基-1-萘基苯基甲基、二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基、二-邻甲氧基苯基苯基甲基、对甲苯基二苯基甲基、二-对甲氧基苯基苯基甲基、二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基、二-对甲氧基苯基苯基甲基、二-邻甲氧基苯基苯基甲基、二-对甲氧基苯基苯基甲基、或对甲苯基二苯基甲基。
在另一个具体实施方案中，Z表示为以下结构式：
Figure BDA00002280522000261
其中
Figure BDA00002280522000262
表示与3'氧原子连接，并且Ra，Rb，和Rc独立地选自以下结构式：
“烷基酯”基团是指通过-C(O)-部分连接于分子其余部分的C1-C18碳链。所述碳链可为线性或分枝的，饱和或不饱和的，并包含***的杂原子如O，NH，NR4，或S。
如本文所使用，“脂肪族基团”包括完全饱和或含有一个或多个非共轭双键的直链或分枝的C1-C18烃，或完全饱和或含有一个或多个非共轭双键的环状C3-C18烃。烷基为完全饱和的直链或分枝的C1-C8烃或C3-C8环状烃。脂肪族基团优选地为烷基。
术语“烷基”，单独或作为更大部分如“芳烷基”或“环烷基”的一部分使用时，是指具有1-18个碳原子的直链或分枝烃基，包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
术语“亚烷基”是指具有1-18个碳原子的直链或分枝烃二基，包括例如亚甲基（-CH2-）、亚乙基（-CH2CH2-）等。
术语“烯基”是指具有1-18个碳原子和一个或多个双键的直链或分枝烃基。
术语“炔基”是指具有1-18个碳原子和一个或多个三键的直链或分枝烃基。
术语“环烷基”是指具有3-20个碳原子的单环、双环或三环的饱和烃环，并且包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、螺环[4.4]壬基、金刚烷基等。
烷基、乙酰基或环烷基任选地包括独立地选自NH，NR5，O和S的***的杂原子。所述的烷基或环烷基可具有高达10个***的杂原子。具体而言，***的杂原子的数量可为1、2、3或4个。具有***的杂原子的烷基包括例如-OCH2CH2-OH、-OCH2CH2-OCH3、-OCH2CH2-OCH2CH3、-OCH2CH2-OCH2CH2OH    、-OCH2CH2-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2-OCH2CH2OCH2CH3、-CH2CH2-NH2、-SCH2CH2-OCH3等。包括***的杂原子的环烷基包括例如吡啶基、哌嗪基、二氧杂环己基、吗啉基、吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、噻唑烷基等。
“芳基”，单独使用或作为一个更大部分如“芳基烷基”的一部分使用时，是指6-10元碳环芳香性单环或多环***。实例包括苯基和萘基。术语“芳基”还包括稠合到非芳香性碳环或杂环基团的苯环。此术语“芳基”可以与如术语“芳香性基团”、“芳环”、“芳香性环”、“芳基”和“芳香性基团”互换使用。
“杂”是指环***中至少一个碳原子成员被替换成至少一个选自N、S和O的杂原子。杂环中可以有1、2、3或者4个碳原子成员被杂原子取代。
“杂环基”指3至20个原子、3至12个原子或3至8个原子的饱和的或者不饱和的、非芳香的、单环或者多环***，其包含一至四个选自O、N和S的环杂原子。示例性的杂环基包括吡咯、吡咯烷-2-酮，1-甲基吡咯烷-2-酮、哌啶、哌啶-2-酮、2-吡啶酮、4-吡啶酮、哌嗪、1-(2,2,2-三氟乙基)哌嗪、哌嗪-2-酮、5,6-二氢嘧啶-4-酮、嘧啶-4-酮、四氢呋喃、四氢吡喃、四氢噻吩、四氢硫代吡喃、异唑烷、1,3-二氧戊环、1,3-二硫戊环、1,3-二氧六环、1,4-二氧六环、1,3-二噻烷、1,4-二噻烷、唑烷-2-酮、咪唑烷-2-酮、咪唑啉-2,4-二酮、四氢嘧啶-2(1H)-酮、吗啉、N-甲基吗啉、吗啉-3-酮、1,3-嗪-2-酮、硫代吗啉、硫代吗啉1,1-二氧化物、四氢-1,2,5-噻唑-1,1-二氧化物、四氢-2H-1,2-噻嗪-1,1-二氧化物、六氢-1,2,6-噻二嗪-1,1-二氧化物、四氢-1,2,5-噻二唑-1,1-二氧化物和异噻唑烷-1,1-二氧化物。
“杂环基”还包括杂芳基。术语“杂芳基”是指5-10元单价杂芳香性的单环和多环基，其含有1至4个独立地选自N、O和S的杂原子。术语“杂芳基”还包括与非芳香性碳环或者杂环基团稠合的单环杂芳环。杂芳环包括呋喃基、噻吩基、苯硫基、吡咯基、唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异唑基、异噻唑基、二唑基、***基、噻二唑基、吡啶基、吡啶-N-氧化物、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、吲哚基、异吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、2,3-二氢苯并呋喃基、苯并二茂、苯并咪唑、吲唑基、苯并异唑基、苯并唑基、苯并噻唑基、噌嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-萘啶基、1,2,3-***基、1,2,4-***基、1,3,4-二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基-1-氧化物、1,2,5-噻二唑基-1,1-二氧化物、1,3,4-噻二唑基、1,2,4-三吖嗪基、1,3,5-三吖嗪基、四唑基和蝶啶基。术语“杂芳基”、“杂芳环”和“杂芳基团”在此可以互换使用。
胺、羟基和巯的保护基对于本领域的技术人员而言是已知的。胺保护基的实例参见Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis(1991),JohnWiley&Sons,Inc.,第309-405页，将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。优选地，将胺保护为酰胺或者氨基甲酸酯。羟基保护基的实例参见Id.,第10-142页，将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。优选的羟基保护基为叔丁基二甲基硅基。巯基保护基的实例参见Id.,第277-308页，将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。
如本文所使用，“环外胺”是指与核苷的碱基连接的胺。例如，腺嘌呤的环外胺如下所示：
Figure BDA00002280522000281
可对环外胺进行保护（例如，用苯甲酰基）或保护为甲脒（例如-N=CH-N(CH3)2）。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”包括天然存在的寡核苷酸，例如和核糖核酸（以下简称“RNA”）和含有修饰的糖部分、修饰的磷酸酯部分或修饰的核碱基部分的核酸。对糖部分进行的修饰包括将核糖环以己糖环戊基或环己基环进行取代。此外，可使用L-核糖环取代天然存在的核酸的D-核糖环，或使用α-异头物取代天然存在的核酸的β-异头物。寡核苷酸也可包括一个或多个脱碱基部分。修饰的磷酸酯部分包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸甲酯和氨基磷酸酯。该核酸类似物对于本领域技术人员是已知的。可制备包括两种或多种上述混合物的寡核苷酸，例如包括脱氧核糖核苷和核糖核苷的混合物的寡核苷酸，特别是脱氧核糖核苷和'-O-取代核糖核苷的混合物，如2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基核糖核苷。包含核苷混合物的寡核苷酸的实例包括核糖酶。
嵌合寡核苷酸为序列内具有磷酸二酯和硫代磷酸酯键和/或核糖或***糖或修饰核苷（多个修饰核苷），如序列内或末端具有2'-氟、2'-氧甲基、2'-O-、4'-C-亚甲基核糖核苷，反向脱碱基、反向胸腺嘧啶。
合成的寡核苷酸优选具有2至约150个核碱基。更优选地，合成性寡核苷酸优选具有2至约75个核碱基。目前具有治疗意义的许多合成性寡核苷酸包括8至40个核碱基。
核苷碱基
本发明所述化合物包括核苷碱基，表示为Bn。Bn为氢或任选地取代的核碱基，任选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化。
核苷碱基包括天然存在的碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和脲嘧啶、和修饰的碱基如
a）由1至3个选自以下的基团取代的腺嘌呤或鸟嘌呤：卤素、羟基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、-(CH2)mC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)O(C1-C6)烷基、-(CH2)mOC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mNR10C(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)烯基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)炔基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)炔基、-Si((C1-C6)烷基)3、-O-Si((C1-C6)烷基)3、芳基(C1-C4)烷基、卤代(C1-C6)烷基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、***基和氨基烯丙基，其中所述烷基、烯基或炔基可选地取代-C(=O)NHR14；-(CH2)m-氨基(C1-C6)烷基、-(CH2)m-氨基-卤代(C1-C6)烷基、-(CH2)m-邻苯二甲酰亚胺，
b）由1至3个选自以下的基团取代的尿嘧啶或胞嘧啶：卤素、羟基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、-(CH2)mC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)O(C1-C6)烷基、-(CH2)mOC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mNR10C(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)烯基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)炔基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)炔基、-Si((C1-C6)烷基)3、-O-Si((C1-C6)烷基)3、芳基(C1-C4)烷基、卤代(C1-C6)烷基、氧基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、***基和氨基烯丙基，其中所述烷基、烯基或炔基可选地取代-C(=O)NHR14；-(CH2)m-氨基(C1-C6)烷基、-(CH2)m-氨基-卤代(C1-C6)烷基、-(CH2)m-邻苯二甲酰亚胺，
c）胸腺嘧啶、嘧啶或吡啶酮，其各自任选地由卤素、羟基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、-(CH2)mC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)O(C1-C6)烷基、-(CH2)mOC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mNR10C(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)烯基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)炔基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)炔基、-Si((C1-C6)烷基)3、-O-Si((C1-C6)烷基)3、芳基(C1-C4)烷基、卤代(C1-C6)烷基、氧基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、***基和氨基烯丙基，其中所述烷基、烯基或炔基可选地取代-C(=O)NHR14；-(CH2)m-氨基(C1-C6)烷基、-(CH2)m-氨基-卤代(C1-C6)烷基、或-(CH2)m-邻苯二甲酰亚胺所取代，条件是所形成的核碱基不为尿嘧啶或胞嘧啶；
d）嘌呤，其任选地由卤素、羟基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、-(CH2)mC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)O(C1-C6)烷基、-(CH2)mOC(=O)(C 1-C6)烷基、-(CH2)mNR10C(=O)(C 1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)烯基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)炔基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)炔基、-Si((C1-C6)烷基)3、-O-Si((C1-C6)烷基)3、芳基(C1-C4)烷基、卤代(C1-C6)烷基、氧基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、***基和氨基烯丙基，其中所述烷基、烯基或炔基可选地取代-C(=O)NHR14；-(CH2)m-氨基(C1-C6)烷基、-(CH2)m-氨基-卤代(C1-C6)烷基、或-(CH2)m-邻苯二甲酰亚胺所取代；条件是所形成的核碱基不为腺嘌呤或鸟嘌呤；或
e）N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，取代-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；其中每个可选地取代卤素、羟基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、-(CH2)mC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)O(C1-C6)烷基、-(CH2)mOC(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mNR10C(=O)(C1-C6)烷基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)烯基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)烯基、-(CH2)mC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mOC(=O)(C2-C6)炔基、-(CH2)mC(=O)O(C2-C6)炔基、-(CH2)mNR10C(=O)(C2-C6)炔基、-Si((C1-C6)烷基)3、-O-Si((C1-C6)烷基)3、芳基(C1-C4)烷基、卤代(C1-C6)烷基、氧基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、***基和氨基烯丙基，其中所述烷基、烯基或炔基可选地取代-C(=O)NHR14；-(CH2)m-氨基(C1-C6)烷基、-(CH2)m-氨基-卤代(C1-C6)烷基、或-(CH2)m-邻苯二甲酰亚胺；
其中在a）、b）、c）、d）或e）组中的核碱基或环外胺上的任意可取代的氮原子任选地由异丁酰基、苯氧基乙酰基、叔丁基苯氧基乙酰基、异丙基苯氧基乙酰基、乙酰基、-C(O)OCH3、二(C1-C6)烷基甲脒、-氯苯甲酰基、邻氯苯甲酰基、-硝基苯甲酰基、对硝基苯甲酰基、芴基甲氧羰基，硝基苯乙基、邻苯二甲酰基、苄基（Bn）、对甲氧基苄基（PMB）、3,4-二甲氧基苄基（DMPM）、对甲氧基苯基（PMP）和=CR15N((C1-C6)烷基)2所取代，
每个R14或R15独立地为取代或非取代(C1-C6)烷基，取代或非取代(C2-C6)环烷基，或取代或非取代(C2-C6)炔基；和
每个m独立地为0-12。
保护的核苷碱基为碱基的反应性官能团被保护的核苷碱基。类似地，保护的杂环为杂环的反应性取代基被保护的杂环。通常，核苷碱基或者杂环具有可以用胺保护基保护的氨基，如酰胺和氨基甲酸酯。例如，通常分别使用苯甲酰基和烷基酯保护基来保护腺嘌呤和胞嘧啶的氨基，通常使用异丁酰基、乙酰基或者叔丁基苯氧乙酰基来保护鸟嘌呤的氨基。然而，可以使用其它的保护方案。例如，为了快速脱保护，用苯氧乙酰基对腺嘌呤和脲嘧啶的氨基进行保护，用异丁酰基或者乙酰基对胞嘧啶的氨基进行保护。去除核碱基或杂环保护基的条件取决于所使用的保护基。当使用酰胺保护基时，可通过使用碱溶液处理寡核苷酸来去除，所述碱溶液如浓氢氧化铵溶液、N-甲基胺溶液或者叔丁基胺的氢氧化铵溶液。
核苷碱基还包括异胞苷（isoC）和异鸟苷（IsoG）。IsoC和IsoG可用于探索沃森-克里克碱基配对机制，其允许在isoC和isoG之间形成三个氢键，如下所示：
Figure BDA00002280522000321
这些碱基能够以平行和反平行的形式两者进行配对，并且在DNA序列中时可被DNA聚合酶识别，也可以进行链延伸、PCR等。因此作为RNA序列的一部分，这些分子在诊断和治疗性应用中具有显著的重要性（参见S.C.Jurczyk等人，Helvetica Chimica Acta.,81,793-811,1998；和C.Roberts等人,Tetrahedron Lett.,36,21,3601-3604,1995,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
核苷碱基还包括7-脱氮-核糖核苷。可通过引入各种取代基而进一步在7位对这些7-脱氮-核糖核苷（包括7-脱氮尿苷和腺苷和肌苷）进行修饰。例如，修饰可包括连接卤素（如氟、氯、溴或碘）、炔基、三甲基硅烷基炔基、丙炔基氨基三氟甲基、或丙炔基氨基邻苯二酰氨基。（参见Xiaohua Peng和Frank Seela,International Round Table on Nucleosides,Nucleotides and NucleicAcids,IRT-XVII,Sep 3-7,2006,page 82,Bern,Switzerland,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
具体地，7-脱氮-2'-脱氧核苷可代替d鸟苷碱基（dGuanosine）掺入RNA序列以导致寡脱氧核苷酸的夹（clamping）减少，从而在序列分析中具有更好的分辨率。在杂交到互补序列的过程中，该修饰不会使tm值降低。该修饰对于DNA和RNA的诊断和治疗性领域具有许多重要的生物学性（参见N.Ramazaeva等人,XIII International Round Table;Nucleosides,Nucleotidesand Their Biological Application,Montpellier,France Sep.6-10,1998,poster304;Ramazaeva,N.等人,Helv.Chim.Acta 1997,80,1809及其引用的参考文献;Sheela,F.等,Helvetica Chimica Acta,73:1879,1990,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。在RNA中，由于RNA分子具有形成二级结构的强烈倾向，因此G-C碱基配对的作用更加明显。以7-脱氮-核糖鸟苷取代鸟苷在RNA治疗和诊断中具有重要意义。由于各种配体和发色团可连接于7-位而不干扰G-C碱基配对特性，因此7-取代-7-脱氮-核糖核苷具有重要意义。
7-脱氮-核糖核苷的合成可通过所建议的3'-DMT-2'-TBDMS-N-保护-β-D-7-脱氮-鸟苷-5'-亚磷酰胺的合成（图式1）来实现：
图式1：2'-TBDMS-3'-DMT-7-脱氮-r-G(n-ibu)的合成：
化合物（ii）的合成；使用三氯乙酸和二氯甲烷作为溶剂，选择性地将DMT从化合物（i）上脱除以获得（ii）。化合物（iii）；步骤a：在0-5℃温度下使用苯甲酰氯（1.1当量）/吡啶溶剂（10倍v/v）选择性地进行5'-苯甲酰化，产生5'-苯甲酰基；接着进行后处理和柱纯化；（iii；步骤b）；随后在室温下在吡啶中与氯化DMT反应24小时，接着进行后处理；之后的柱色谱产生化合物（iii）。化合物（iv）：通过与2N NaOH水溶液选择性反应实现5'-苯甲酰基的选择性脱除，通过在吡啶溶剂中将iv与2N NaOH水溶液溶剂反应，接着以吡啶Dowex阳离子交换树脂中和，接着过滤除去Dowex树脂以得到粗品iv的溶液，之后色谱分析以得到纯化的（iv）。化合物（v）：在THF中，使用二异丙基乙胺（2当量）中的n,n-二异丙基-2-氰乙基-氯试剂（1.1当量）将（iv）进行磷酰化得到粗vi，接着色谱分析以得到纯亚磷酰胺（v）。
可通过环外胺被适当保护的L-核糖核苷实现3'-DMT-L-核糖核苷寡核苷酸的合成。3'-DMT-L-r-G(n-ibu)-5'-亚磷酰胺的典型实例描述如下：
可通过3'-DMT-2'-TBDMS-N-保护的-β-L-7-脱氮-鸟苷-5'-亚磷酰胺实现7-脱氮-核糖核苷的合成（图式2）：
Figure BDA00002280522000341
图式2：
O-乙酰基-三-O-苯甲酰基-L-核糖（ii）与1-乙酰基-三-O-苯甲酰基-D-核糖相似地进行合成。首先使用双硅烷基三甲基乙酰胺（BSA；5当量）处理将N-异丁酰基鸟嘌呤转化为硅烷基衍生物。然后在SnCl4（Sn(IV)氯化物）存在下将L-糖（iii）连接于硅烷基化的n-异丁酰基-鸟嘌呤上，产生完全保护的粗品三-O-苯甲酰基-N-异丁酰基-L-鸟苷。通过柱色谱在硅胶上纯化该化合物（70-230目；Merck硅胶）。5-10℃下在受控的水解条件下以2N NaOH
Figure BDA00002280522000351
的吡啶/甲醇溶液（80:20）将纯的完全保护的中间化合物选择性水解20分钟，接着以Dowex-吡啶阳离子树脂中和反应混合物产生5',3',2'-三羟基-L-鸟苷(n-ibu)。依次以乙酸乙酯和***洗涤粗品化合物来除去溶剂和苯甲酸副产物，得到纯的5',3',2'-三羟基-L-鸟苷(n-ibu)。随后在5℃下在干燥吡啶中（5',3',2'-三羟基-L-鸟苷(n-ibu)的10倍）以DMT-氯化物（DMT氯化物；1.2当量）处理干燥的化合物3-4小时，产生粗品5'-DMT-2',3'-二羟基-L-鸟苷(n-ibu)（iv）。在硅胶（70-230目，Merck grade）柱上对其进行纯化。合并纯馏分得到纯5'-DMT-2',3'-二羟基-L-鸟苷(n-ibu)（iv；从三羟基化合物得到70-75%的产率）。进行2'-硅烷基化以获得2'和3'-TBDMS保护的核苷的混合物，并将其通过柱色谱分离出纯的5'-DMT-2'-硅基-L-G(n-ibu)核苷（v）。室温下使用三氯乙酸的二氯甲烷溶液（3%溶液，v/v）选择性地从该化合物中脱除DMT基团10分钟。0℃下以10%碳酸氢钠水溶液淬灭此反应混合物以中和反应混合物，产生粗品5,3'-二羟基-2'-TBDMS-L-G-(N-ibu)。通过柱色谱在硅胶上（70-230目；Merck级别）纯化该化合物得到纯的5',3'-二羟基-2'-TBDMS-L-G-(N-ibu)。以苯甲酰氯（1.1当量；-10至0℃)对该化合物进行选择性5'-苯甲酰化1.5小时得到化合物（vi）。对该化合物类似地纯化以产生纯的'-O-苯甲酰基-3'-羟基-2'-TBDMS-L-G-(N-ibu)（化合物vi）。之后在室温下将充分干燥的化合物（vi）与DMT-氯化物（2.5当量；吡啶w/v；1:10）反应24小时，产生化合物（vii）。纯化的（vii）在硅胶柱色谱上纯化。然后将纯化的vii在5℃下以2N NaOH选择性水解分钟，接着以Dowex-吡啶阳离子交换树脂中和反应混合物以产生5'-OH,3'-DMT-2'-TBDMS-L-rG-n-ibu（化合物viii）。以硅胶柱（70-230目，Merck硅胶）色谱纯化粗品化合物。在THF中，以n,n-二异丙基-2-氰乙基-氯试剂（1.1当量）的二异丙基乙胺（2当量）溶液对viii进行磷酰化得到粗品ix，接着色谱分析以得到纯的5'-亚磷酰胺（ix）。
核苷碱基还包括脱碱基核苷。通过失去糖酵解键来以化学或酶方式产生DNA中的脱碱基位点。所产生的嘌呤/嘧啶位点缺少编码信息，并且导致碱基通过聚合酶错误***，并在突变形成中起重要作用。它们最终转化为由亚甲基修饰2'-脱氧核糖的1位的四氢呋喃衍生物。已经合成了具有亚酰胺的2-脱氧和2-羟基-D-核糖的CE亚磷酰胺。反向RNA修饰使得能够有效地合成该RNA、RNA/DNA嵌合体、修饰的RNA（参见Takeshitsa,M.等人，J Biol.Chem.,1987,262,10171-10179;和Kalnik,M.W.等人,Biochemistry,1988,27,924-931,将其教导的所有内容以引用方式结合于本文）。
可通过同样适合3'-DMT-2'-TBDMS-N-保护核苷亚磷酰胺的方法合成脱碱基核苷，如以下图式所示：
Figure BDA00002280522000361
图式：1,1-二氢-D-核糖-3-DMT-2'-硅基-亚磷酰胺。化合物（i）来自ChemGenes Corp.；（ii）在标准条件下实现TBDMS氯的选择性引入（能够容易地分离在该阶段形成的异构体）；（iii）和（iv）选择性脱除5-DMT基团，接着在5-位进行选择性苯甲酰化，（v）DMT氯化物反应导致3-位DMT的引入；（vi）脱除5-位苯甲酰基，接着进行磷酸化并通过色谱法纯化。
核苷碱基还包括2-氨基嘌呤核苷。由于其荧光特性，2-氨基嘌呤为掺入寡核苷酸中以进行致突变研究的修饰核碱基类似物。其与腺嘌呤和鸟嘌呤的结构同源性使其成为通过取代序列中的腺苷和鸟苷而进行酶学研究的重要工具（参见Schmidt,S.等人，Nucleosides&Nucleotides,14(6),1445-1452,1995;和McLaughlin,L.W.等人，Nucleic Acids Res.,1988,16,5631,将其教导的所有内容以引用方式结合于本文）。2-氨基嘌呤核苷的代表性结构为2-氨基嘌呤-3'-DMT-2'-硅基-5'-亚磷酰胺，以如下结构式表示：
Figure BDA00002280522000371
核苷修饰：
5-羟基甲基尿苷和胞苷为本发明所包括的核苷修饰。以-OAc(-O-C(=O)CH3)保护5'-羟基甲基修饰产生5-乙酰氧基甲基胞嘧啶和5-乙酰氧基甲基尿嘧啶。
含有5-羟基甲基胞苷的寡脱氧核苷的固相合成和限制性核酸内切酶酶切在例如"Cytosine methylation and study of its effect";Severine Tardy-Planechaud,June Fujimoto,Susan S.Lin和Lawrence C.Sowers;Nucleic AcidsResearch,Vol.25,No.3,553-558(1997)中有所描述，将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。
Figure BDA00002280522000372
其它修饰的核碱基包括1,N6-亚乙烯基腺苷、3,N4-亚乙烯基胞苷、C-5(rU和rC)芘修饰、C-5(rU和rC)修饰、C-5(rU和rC)丙烯酸-C-6氨基连接子（TFA保护）、C-5(rU和rC)丙烯酸-C-2-氨基连接子（TFA保护）、C-5(rU和rC)丙烯酸-C-6氨基连接子（FMOC保护）、5'-PT修饰物支持物、C-5芘-r-尿苷、C-5-尿苷、(5,6)-吡咯-r-胞苷。
包括核碱基修饰的本发明的代表性化合物显示如下：
8-甲基鸟苷：许多出版物已报导8-甲基鸟苷在寡核苷酸适体设计和ZDNA稳定剂中是非常有用的修饰。参见例如，8-Methylguanosine:A PowerfulDNA Stabilizer;Yan Xu,Reiko Ikeda和Hiroshi Sugiyama,J.AM.Chem.Soc.2003,125,13519-13524-13519,将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。包括8-甲基鸟苷的本发明的代表性化合物如下所示：
Figure BDA00002280522000382
5-氮杂胞苷：提议将5-氮杂胞苷用作反向RNA合成子。5-氮杂-胞苷为众所周知的抗癌剂。
包括5-氮杂胞苷的本发明的代表性化合物如下所示：
Figure BDA00002280522000391
2,6-二氨基嘌呤核苷；参见例如，Pasternak,A.,Nucleic Acids Research2007 35(12):4055-4063,将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。此文章报导了2'-O、4'-C-亚甲基核糖核苷碱基与2,6-二氨基嘌呤核苷组合的应用，以及2’-O-甲基-2,6-二氨基嘌呤和LNA-2,6-二氨基嘌呤核苷对2'-O-甲基RNA-RNA杂双链的热力学性质的影响。
核碱基保护基。
核碱基的保护基在本领域是已知的。参见例如：
1.使用具有不稳定的碱基保护的亚磷酰胺进行的RNA合成：UsersBulletin,Applied Biosystems,Number 69,Instructions for 380B,392 and 394synthesizers，将其教导的所有内容以引用方式结合于本文，以描述二甲基甲酰胺（DMF）和n-异丁酰基保护基的用途。
2.作为新型反应中间体来制备含有寡核苷酸探针和修饰的LCAA（长链烷基氨基）-CPG（可控孔度玻璃）支持物的连接子的N6苯氧基乙酰基脱氧腺苷衍生物在Edyta Krzymanska-Olejnik和Ryszard W.Adamiak,Nucleosides&Nucleotides,10(1-3),595-597(1991)中有所描述，将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。
对于炔丙基修饰的寡核苷酸的合成，可通过反向合成过程将2'-炔丙基-3'-DMT-5'-亚磷酰胺合成子掺入序列中。进一步假设亚磷酰胺具有2'-己炔端基以获得具有自由己基连接子的前体-寡核苷酸，其能够与试剂反应而引入各种报告探针，参见Srivastava等的第5,744,595号美国专利，将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。
Figure BDA00002280522000401
（r-C-N-异丁酰基）（r-C-N-乙酰基和5-修饰的-rC-n-ac）
Figure BDA00002280522000402
（rA-DMF-甲基脒）（N6二苯基氨甲酰基-rG-n-ibu）（N6苯氧基羰基r-A）
3.本领域已知采用容易脱除的2-(乙酰氧基-甲基)苯甲酰基（AMB）作为碱基保护基团来固相合成部分甲基磷酸酯修饰的寡脱氧核苷酸，参见例如W.H.A.Kuijpers等人,Nucleic Acids Research,1993,Vol.21,No.15 3493-3500,将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。AMB保护基团在甲醇碳酸钾中完成。然而，甲基磷酸酯连接对碳酸钾/甲醇的不稳定性排除了该脱保护试剂的使用。后来发现氨的饱和甲醇溶液是AMB脱除的替代试剂。已证明AMB保护基和作为脱保护试剂的氨/甲醇组合可显著提高甲基磷酸酯修饰的DNA片段的合成。室温下温和过夜处理足以完全脱除AMB基团，而传统的保护寡核苷酸的脱保护需要在升高的温度下更长时间地暴露于碱条件中。
Figure BDA00002280522000411
（建议用于我们的反向RNA合成子的AMB-保护的核碱基）
4.发现以下核碱基保护基团非常有用，预期可用于我们的发明N-pent-4-enoyl(PNT)Group As a Universal Nucleobase Protector中所述的单体的核碱基保护，参见例如"Applications in the Rapid and Facile Synthesis ofOligonucleotides,Analogs,and conjugates",Radhakrishan P.等人,Tetrahedron,Vol.53,No.8,pp.2731-2750,1997,将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。其中描述了使用PNT核苷亚磷酰胺与PNT核苷H-磷酸酯和PNT核苷亚磷酰胺结合来合成作为反义剂的骨架缺失的寡核苷酸（MBO），以及PNT基团在制备生物可逆的寡核苷酸结合物中的用途。
戊-4-烯酰基：新型胺保护基团；参见例如Robert Madsen,CarmichaelRoberts和Bert Fraser-Reid,J Org.Chem.,60,7920-7926,(1995),将其教导的所有内容以引用方式结合于本文。将伯胺和仲胺保护为N-戊-4-烯酰基衍生物可产生N-戊-4-烯酰胺并发现其高度结晶。
发现在温和条件下通过以3当量碘的THF水溶液进行处理，可快速有效地脱保护。显示虽然在脱保护过程中需要氧化介质，但不影响可氧化的官能团包括对甲氧基苄基醚和烷基硫。包括戊-4-烯酰基的本发明的代表性化合物如下所示：
Figure BDA00002280522000412
琥珀酰基作为环外胺保护基。可利用环外胺上的琥珀酰基进一步衍生/连接各用于固相寡核苷酸合成的种支持物。本发明所述的包括琥珀酰基的代表性化合物如下所示：
Figure BDA00002280522000421
 另外，可使用琥珀酰亚胺基对3',5'保护的核苷的环外胺进行衍生化以在5'→3'方向合成，所述琥珀酰亚胺基能够连接于固体支持物，如以下结构3所示。
Figure BDA00002280522000422
（结构3）
通过反向RNA过程掺入锁核酸TM，也称为2'-O，4'-C-亚甲基核糖核苷和亚磷酰胺（LNA）：2'-O，4'-C-亚甲基核糖核苷和亚磷酰胺，一种新型的构象限制性寡核苷酸类似物（结构1-6），已显示具有较高的与互补DNA和RNA序列的结合能力。
目前评价了各种2'-O，4'-C-亚甲基核糖核苷和亚磷酰胺以评价合成DNA、RNA和嵌合体的各种治疗和诊断性应用1-5。最常见的用于合成确定序列的寡核苷酸的亚磷酰胺合成子为LNA-C(n-bz)-5'-DMT-3'-氰乙基亚磷酰胺（1），LNA-C (n-ac)-5'-DMT-3'-氰乙基亚磷酰胺（2），LNA-胸苷-5'-DMT-3'-氰乙基亚磷酰胺（3），LNA-A(n-bz)-5'-DMT-3'-氰乙基亚磷酰胺（4），LNA-G(n-二甲基甲脒)-5'-DMT-3'-氰乙基亚磷酰胺（5；R；二甲基甲脒）。
已显示2'-O,4'-C-亚甲基核糖核苷和亚磷酰胺寡聚物在设计和疗效上对基因调节、基因表达、反义、siRNA、和RNA传送至细胞的寡核苷酸有帮助。已显示它们可提高DNA和RNA稳定性1-5。目前在本领域中所描述的2'-O-4'-C-亚甲基核糖核苷和亚磷酰胺具有5'-DMT和3'亚磷酰胺功能（6）。
Figure BDA00002280522000431
我们的发明中提出的掺入2'-O-4'-C-亚甲基核糖核苷和本领域所描述的具有寡核苷酸中的这些单元和合成子来构成3'-DMT和5′亚磷酰胺（结构7），适合如我们的发明中所述方法的反向RNA合成。
Figure BDA00002280522000432
包括2'-O,4'-C-亚甲基核糖核苷和亚磷酰胺的本发明所述的化合物如下所示：
Figure BDA00002280522000433
2'-O-4'-C-亚甲基核糖核苷-3'-DMT核苷，5'-亚磷酰胺和5'-支持物的合成图示：
Figure BDA00002280522000441
将以下参考文献的教导以引用方式结合于本文：
1.A.A.Koshlin,S.K.Singh,P.Nielsen,V.K.Rajwanshi,R.Kumar,M.Meldgaard,C.E.Olsen and J.Wengel,Tetrahedron,1998m54,3607-3630.
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将糖引入寡核苷酸中
糖
本发明所述化合物可以包括，例如核糖或***糖。可通过与所描述的核糖核苷类似的程序制备***糖核苷。合成实例如以下图示所示：
图示：2’-***糖反向亚酰胺的合成：
3′羟基的保护：
此前研究了作为脱氧核苷的5'-羟基保护基的一系列三芳基甲基并评价了其在寡核苷酸合成过程中三苯甲基的脱除。所获得的不同颜色的阳离子对于比色监测和用于寡核苷酸合成的核苷之间的区分是非常有用的，参见"Color coded triarylmethyl protecting groups useful for deoxypolynucleotidesynthesis";E.F.Fisher和M.H.Caruthers,Nucleic Acids Research,Vol.11,5,1589-1599(1983),将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。用于本发明的三芳基甲基包括二-对甲氧基苯基苯基甲基、对氟苯基-1-萘基苯基甲基、对甲氧基苯基-1-萘基苯基甲基、二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基、二-邻甲氧基苯基苯基甲基、对甲苯基二苯基甲基、二-对甲氧基苯基苯基甲基、二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基、二-对甲氧基苯基苯基甲基、二-邻甲氧基苯基苯基甲基、二-对甲氧基苯基苯基甲基和对甲苯基二苯基甲基。
此外，3'羟基保护基三芳基甲基表示为式：
Figure BDA00002280522000452
其中
Figure BDA00002280522000453
表示与3'氧原子连接，Ra，Rb，和Rc独立地选自以下结构式：
Figure BDA00002280522000454
Figure BDA00002280522000461
四氢吡喃基和甲氧基四氢吡喃基作为3'羟基保护剂和其在酸性条件下的脱除。参见例如"Synthesis of oligonucleotides with sequences identical withor analogous to the 3'-end of 16 S ribosomal RNA of E coli:preparationA-C-C-U-C-C via modified phosphotriester method";J.H.van Boom,P.M.J.Boom,P.M.J.Burgers,G.van der Marel,C.H.M.Verdegaal和Mrs.G.Wille,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。代表性的3'甲氧基四氢吡喃基如下所示：
Figure BDA00002280522000462
磷酸酯保护基团（以R3表示）
如本文所使用的，术语“磷酸酯保护基团”是指当存在于本发明所述分子中时，在形成寡核苷酸后消除的部分。例如，磷酸酯部分可由氰乙基保护基保护。众所周知通过β-消除机理将用于核苷酸之间磷酸酯形成的氰乙基保护基消除，产生丙烯腈和磷酸二酯寡核苷酸。（图式3
图式3.通过碱基:B进行的氰乙基磷酸酯基团消除
Figure BDA00002280522000463
磷酸酯保护基团包括-CH2CH2CN、-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、-CH2CH2-C6H4-NO2、-CH2CH2-NH-C(O)-C6H5、或-CH2CH2-O-C6H4-C(O)CH3，并且R4为-O-Si(R5)3。其它磷酸酯保护基在本领域中是已知的，并且包括(2-乙酰氧基苯氧基)乙基（APOE）（参见Cheruvallath,Z.S.等人，Org.Process Res.Dev.,2006,10(2),pp 251-256,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文），和2-苯甲酰胺基乙基（参见Guzaev AP,J Am.Chem.Soc.2001Feb 7;123(5):783-93,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
2'-封闭基团为以下结构式所表示的2-O-脱水核碱基：
Figure BDA00002280522000471
3'官能团
本发明涉及高纯度RNA的合成，特别是在合成RNA的寡核苷酸3'端引入所选择的基团。这样的RNA分子在治疗、诊断、药物设计中，和在细胞环境中选择性抑制RNA序列、阻断细胞内存在的不同类型的RNA的功能中有应用。
已显示哺乳动物细胞可以很容易地摄取寡核苷酸。据显示摄取可导致细胞核积聚。已显示将亲脂性分子连接于寡核苷酸可大大提高其摄取性能。特别地，详细研究了胆固醇与聚-L-赖氨酸的连接。
其它RNA结合物包括肽-RNA结合物。肽转运RNA分子在核糖体中发生的蛋白生物合成，以及将遗传密码翻译为功能蛋白中是关键分子。它们通常在将RNA固定于区室中以及聚集在脂质体中起着重要作用（参见Lazar,A.等人，International Round Table on Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids,IRT-XVII,Sep 3-7,2006,page 47,Bern,Switzerland,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
这些官能团的肽连接通常发生在3'-端，并且称为“3'官能团”。
如本文所使用的，“3'官能团”是指连接于RNA分子3'端的部分。本文所述的反向合成方法为将部分连接于寡核苷酸链末端提供了方便。所述的3'官能团可以包括脂类如脂肪酸和胆固醇，类固醇，肽，酶和标记物，所述的标记物包括荧光的、化学发光的或放射标记的部分。
可通过如下所示的亚磷酰胺连接子的反应引入所述的3'官能团：
1.将所述的3'官能团连接于RNA可产生两亲性的3'-肽基-RNA结合物。该分子模拟天然肽-转运RNA。以上提及的作者在固体支持物上进行了这样的RNA的合成。通过酰胺连接将RNA连接于各种肽上。例如，可使用本文所公开的反向合成方法将以下结构式表示的化合物连接于3'端：
Figure BDA00002280522000481
2.RNA的3'-端的生物素连接
可以在一个步骤中通过生物素亚酰胺进行3'-生物素连接，并且避免使用生物素CPG。通常，将保护的生物素亚酰胺用于通过固相寡核苷酸合成连接生物素以得到高纯度的寡核苷酸。本领域已知“保护的生物素”，参见例如U.Pieles,B.S.Sproat和G.M.Lamm,Nucleic Acids Research,Vol.18,No.15,4355(1990),将其教导的全部内容以引用方式并入本文。可用于本发明的代表性的保护的生物素如下：
Figure BDA00002280522000482
3.用于3'官能团的二硫化物连接子
可通过二硫化物连接子对我们的发明中的寡核苷酸的3'端进行衍生化，所述的二硫化物连接子可以产生生成-SH基。随后偶联至携带末端SH官能团或活化硫化物酶以产生二硫化物连接的寡聚物-酶结合物。代表性的二硫连接子如下：
Figure BDA00002280522000491
这些二硫化物连接子亚磷酰胺可容易地连接于寡核苷酸的3'-端。通过本领域已知的硫化物偶联或交换反应可使通过3'端的磷酸酯连接的二硫化物与各种肽、酶结合。
对于3'-巯基修饰的连接，可使用来自易得的亚磷酰胺的3'-二硫化物，即C-3二硫化物、C-6二硫化物。先前已描述了含有游离巯基的寡核苷酸以及巯基特异性探针之后的连接，可调整用于3'端巯基的连接。（参见Connolly,B.A.NAR,13,12,4485,1985,将其教导的全部内容以引用方式并入本文）。已合成了5'-端含有游离巯基的探针并进一步使用巯基特异性探针进行衍生化。可合成S-三苯基-O-氰乙基亚磷酰胺-2-巯基乙醇和其它烷基链并掺入寡核苷酸的3'-端。
4.用于多基团连接的3′-支化连接子
T.Horn等人,Nucleotides and Nucleotides,895&6),875-877(1989)中描述了在核酸分析中作为信号扩增多聚体的分枝寡核苷酸的合成，将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。
“Highly sensitive detection of DNA using enzyme linked DNA-probesusing colorimetric and fluorometric detection”,Akira Murakai等人,NucleicAcids Research,Vol.17,No.14,5587(1989)中描述了酶探针，将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。
分枝的亚磷酰胺可连接到寡核苷酸的末端。可利用所述分枝的亚磷酰胺连接各种报告分子、发色团、酶、配体、聚乙二醇、肽、或本文所述的其它3'官能团。通过将糖的3'-羟基与以下结构式所示的化合物进行反应来制备分枝的寡核苷酸：
可使用本文所述的其它合适的羟基保护基取代DMT保护基。寡核苷酸的3'-端的不对称支化的亚酰胺的连接随后可通过配体修饰。可利用它们连接各种报告分子、发色团、酶、二硫键、配体、聚乙二醇、肽。可连接酶的一个或多个单元以进行量热和荧光检测。
该支化亚磷酰胺具有连接寡核苷酸3'-端的巨大的潜能。代表性化合物包括：支化亚磷酰胺（I）：
Figure BDA00002280522000501
（分枝的亚酰胺I）；（SEQ ID NO 5）。分枝的亚酰胺（I）描绘了取代连接于寡核苷酸的3'端的DMT基团后，聚乙二醇的连接。对该寡核苷酸进行纯化并通过PAGE分析进行分析（图12）。
此外，大量应用可用于寡核苷酸的3'端连接。可通过在RNA的3'端直接偶联来连接大体积分子，如胆固醇、长链脂肪链如C-18、三甘醇、六甘醇。
已获得在RNA3'端有聚乙二醇，如PEG 2000酰胺和PEG 4000亚酰胺。
由于反义SiRNA链引导靶向识别，对SiRNA的有义链（3'端）的突出物的修饰不希望影响靶向mRNA识别。可设计有用的修饰以提高SiRNA的传送。
非放射性同位素杂交测定方法和使用荧光、化学发光和酶标记的寡核苷酸探针的诊断应用在本领域中是已知的。（参见Urdea,M.等人,NAR,16,11,1988,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。此外，放射标记的聚核苷酸探针已广泛用于通过特异性杂交来检测互补核酸。本文所公开的反向合成方法可用于标记长的寡核苷酸（如包括100个碱基的那些）。可以通过本文所公开的反向合成方法连接的标记物的实例包括，例如荧光素；德克萨斯红；罗丹明；化学发光分子如异鲁米诺；酶如辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶标记物；和酶。
2'取代基
对2'-硅醚进行了深入的开发，并且具已知有卓越的稳定性。深入研究了硅醚的溶剂分解，并且已知的是大体积烷基硅醚具有高度的稳定性；（参见Bazani,B.和Chvalowski,V.,Chemistry of Organosilicon Compounds,Vol.1,Academic Press,New York,1965,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。随后Ogilvie和同事对其作为寡核糖核酸合成的2'-羟基保护基进行了深入的研究工作（参见Ogilvie,K.K.等人,Thtrahedron Letters,15:2861-2864,1974;和Ogilvie,K.K.等人.J Carbohydrate Nucleosides Nucleotides,3:197-227,1976;Ogilvie,K.K.Proceedings of the 5th International Round Tableon Nucleosides,Nucleotides and Their Biological Applications,Rideout,J.L.,Henry,D.W.,和Beacham L.M.,III,eds.,Academic,London,pp.209-256,1983,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
核糖核苷的2'-羟基上的叔丁基二甲基硅基保护基在用于制备3'-亚磷酰胺和用于寡核苷酸合成中已经是选用的基团，已显示其可非常容易地迁移至3'-羟基位置。（参见Ogilvie,K.K.,和Entwistle,D.W.Carbohydrate Res.,89;203-210,1981;和Wu,T.,和Ogilvie,K.K.J.Org.Chem.,55:4717-4734,1990,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。该迁移使想要的亚磷酰胺的合成复杂，并且需要有效的纯化方法，所述纯化方法能够清楚地分辨相应异构体并防止最终单体的任何污染。相反地，向3'羟基的迁移不影响反向（5'→3'）合成过程。
代表性的2'氨基保护基团包括以下结构式所表示的化合物：
Figure BDA00002280522000511
2'-氟-3'-DMT-核苷-5'-亚磷酰胺。
可通过以下提出的3'-DMT-2'-氟-N保护的-核苷-5'-亚磷酰胺的合成掺入2'-氟取代基：
Figure BDA00002280522000521
另外，可通过以下提出的2'-氟-3'-DMT-N-（以快速脱保护基团）保护的核苷-5'-亚磷酰胺掺入2'-氟取代基：
Figure BDA00002280522000522
选择性5'-乙酰丙酰基保护，接着结晶产生化合物（ii）；DMT-Cl反应产生化合物（iii），接着与氨水反应4-5min产生化合物（iv）。然后通过标准磷酰化离子化学过程合成5'-亚磷酰胺，产生（v。
标准Jones过程也可用于制备2'-***糖氟核苷（FANA）。该过程包括：将（i）和（ii）的步骤交换；a；以TMS氯暂时保护；接着与苯氧乙酰氯/吡啶反应；b；氨水处理2-4分钟以选择性去除TMS基团；c；结晶苯氧乙酰基保护的-2'-氟核苷。
核苷的糖部分的2'-氟修饰，2'-核糖氟-2'-脱氧或2'-***糖氟-2'-脱氧-核苷（FANA）在各种DNA和RNA如反义、微小RNA、siRNA、适体的设计中具有重要应用。将该单元选择性引入寡核苷酸中需要在固相寡核苷酸合成后小心地进行脱保护。已证明如果进行严格的氨水脱保护，会发生寡核苷酸的脱嘧啶化并且糖部分会失去氟。因此，通常需要开发优化的核苷环外官能团的保护基团以确保寡核苷酸内的所有修饰的核苷单元适合温和的碱性脱保护。
因此，将若干保护基团如FMOC、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰基（t-BPAC）、异丙基苯氧乙酰基（isoPrPAC）和乙酰保护的鸟苷N-2氮（N-乙酰鸟苷）用于使氟核苷单元的氟损失最小化。因此需要使用不稳定的保护基保护反向RNA合成单元，从而将该保护基在寡核苷酸合成后在温和脱保护条件下脱除。类似地，温和磷酸酯保护基团，如氰乙基亚磷酰胺化学目前用于DNA和RNA合成技术领域的现有技术中。
在各种非常温和的碱性反应条件下进行FMOC保护基团的脱保护。（参见Heikkila,J.和Chattopadhyaya,J.,Acta Chem.Scand.B 37,No.3,263-265,1983,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。可利用导致FMOC保护基团亲核置换的氨水条件脱保护，或通过导致FMOC-活性氢基B-消除的非亲核碱如三乙胺脱保护，如下图式所示：
显示FMOC-β-消除的图式
Figure BDA00002280522000531
因此能够调节FMOC保护基从寡核苷酸上的脱除条件，并且可通过与脱除氰乙基的β-消除过程相似的β-消除过程脱除作为碱基保护基的FMOC。其它保护基，例如包括苯氧乙酰基或烷基化苯氧乙酰基，也可用于本文所述的反向合成方法中以产生高纯度的脱保护寡核苷酸。
因此该过程提供了非常引人注目的在不使用氨的情况下进行寡核苷酸合成的可能性。该过程进一步提供了脱氧寡核苷酸的可能性，以在固体支持物上进行寡聚物的完全脱保护。该技术或过程可提供核糖核苷酸，如基于芯片的技术所需的核糖核苷酸，以及用于微小RNA、Si RNA、RNA芯片的高纯度寡核苷酸。
因此，这些碱基保护基团与氰乙基磷酸酯保护基团组合提供了将N-保护基团和氰乙基从所合成的脱氧和核糖寡核苷酸上洁净地，优选地在使用无水碱时，以及在多种诊断应用的支持物上脱除的机会。
在肽合成中已经将FMOC保护基团充分地确立为用于氨基酸的α-氨基的氨基保护的一种优选试剂以进行逐步肽合成（参见Carpino,L.A.,和Han,G.Y.,J Amer.Chem.Soc,92:5748,1970,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。另一种N-保护基为2-硝基苯基氧硫基（NPS），其用于保护胞苷、腺苷、鸟苷和相应的2'-脱氧核糖核苷的氨基（参见J.Heikkila,J.等人，ActaChem.Scand B 37:857-864,1983,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。NPS与环外胺的连接表示为以下结构式：
Figure BDA00002280522000541
亚磷酰胺
Studies on the formation of the internucleotode n bond in RNA Synthesiusing dialkylamino phosphoramidites;G.Gasparutto,D.Molko&R.Teoule,Nucleosides&Nucleotides,9(8),1087-1098(1990),将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。在寡核苷酸合成过程中测试的各种5'-DMT-2'-TBDMS-U-3'-n,n-二烷基氨基氰乙基亚磷酰胺中，上文的作者发现n,n-二乙基和n-乙基,n-甲基氨基保护可得到形成rU均聚物的最好的偶联结果，偶联4分钟后平均为97%。例如，5'二乙基氰乙基可用于本文所公开的发明中。
使用点击化学通过反向RNA合成过程加入2'或3'官能团
铜（I）催化的叠氮化物与末端炔烃的Huisgen 1,3-偶极环加成为充分确立的点击化学中所使用的点击反应的实例（参见Broggl,J.等人,InternationalRound Table Conference on Nucleosides,Nucleotides and Nucleicv acids,Sep3-7,2006,Bern,Switzerland,,p.348,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
本发明所述的3'-DMT-2'-炔烃-5'-亚磷酰胺化合物可进一步提供在RNA的3'-末端修饰和连接各种大分子的优势。反向RNA合成过程可允许在固相寡核苷酸合成的过程中，在寡聚物的3'-端以及内部位置上引入各种修饰。
Figure BDA00002280522000551
反向亚酰胺，即3'-DMT-2'-炔烃-5'亚磷酰胺可使用5'-固体支持物进行寡核苷酸合成。可通过点击化学来区域特异性地连接大分子如发色团、配体、生物学上重要的多肽、胆固醇和聚乙二醇：
Figure BDA00002280522000552
固相支持物上的点击化学过程可产生洁净的环加成产物，其中将所有反应物洗脱，接着释放寡核苷酸。修饰包括用于分子传感器并通过“点击化学”连接于寡核苷酸的高效淬灭染料。为可用于点击化学的本发明所述化合物提出的合成如以下图式所描绘：
Figure BDA00002280522000561
已开发了用于组合“点击化学”的构建单元；进行多个循环的点击反应以产生具有一个或多个不同发色团和其它大分子单元的寡核苷酸。我们改进了“点击”反应的1,3-环加成的催化效率，以合成高纯度的基于自动固体支持物的寡核苷酸合成的基于DNA/RNA的探针。我们还开发了用于分子传感器并通过“点击化学”连接于寡核苷酸的新型高效淬灭染料。
将以下引文所教导的全部内容以引用方式并入本文：
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RNA的3′-端的生物素连接
通常，保护的生物素亚酰胺用于通过固相寡核苷酸合成来连接生物素以获得高纯度的寡核苷酸。“保护的生物素”在本领域是已知的，参见例如U.Pieles,B.S.Sproat和G.M.Lamm,Nucleic Acids Research,Vol.18,No.15,4355(1990),将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。
Figure BDA00002280522000571
3′-羟基的保护：
1.其它三芳基甲基保护基：参见例如"Color coded triarylmethylprotecting groups useful for deoxypolynucleotide synthesis";E.F.Fisher和M.H.Caruthers,Nucleic Acids Research,Vol.11,5,1589-1599(1983),将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。所报导的三芳基甲基包括二-对甲氧基苯基苯基甲基，对氟苯基-1-萘基苯基甲基，对甲氧基苯基-1-萘基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，对甲苯基二苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，对甲苯基二苯基甲基。其它三芳基甲基保护基表示为以下结构式：
Figure BDA00002280522000572
其中
Figure BDA00002280522000573
表示与3'氧原子连接，Ra，Rb，和Rc独立地选自以下结构式：
Figure BDA00002280522000574
Figure BDA00002280522000575
2.四氢吡喃基和甲氧基四氢吡喃基用作保护剂和在酸性条件下作为3'保护基的脱除。该保护基可在酸性条件下脱除，参见例如"Synthesis ofoligonucleotides with sequences identical with or analogous to the 3'-end of 16 Sribosomal RNA of E coli:preparation A-C-C-U-C-C via modifiedphosphotriester method";J.H.van Boom,P.M.J.Boom,P.M.J.Burgers,G.vander Marel,C.H.M.Verdegaal和Mrs.G.Wille，将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。包括甲氧基四氢吡喃基的本发明所述代表性化合物如下所示：
Figure BDA00002280522000581
反向RNA方法的优势
我们使用BTT作为活化剂，使用2分钟的偶联时间合成了全长寡聚物。HPLC测得所获得的粗品寡聚物纯度为78.95%。使用ETT作为活化剂，4.0分钟的偶联时间是可以的，所获得的粗品寡聚物纯度为89.09%。通过反向过程制备的粗品寡聚物纯度通常在90%的范围内。我们在大规模合成中（12umol的规模）使用反向RNA方法使用6分钟的偶联时间获得了相似的结果（粗品寡聚物约为92%，纯化的寡聚物约为98%）。我们能够合成硫代磷酸寡核苷酸和混合的硫代磷酸酯/磷酸骨架而不损失偶联效率或寡核苷酸的质量。相反地，传统（3'→5'）方向合成导致粗品寡聚物纯度在80%范围内，需要数次纯化以将纯度提高至约90%。传统RNA合成在所需带的两侧均产生杂质。而在反向RNA合成中，即使偶联时间为2'也未产生任何N+1杂质，并且HPLC跟踪显示峰的右手一侧相当直。此前，反向RNA合成；5'→3'显示出寡核苷酸的HPLC粗品纯度约为80%。目前，反向RNA合成；由于单体合成子的纯度提高和/或使用ETT作为活化剂的偶联时间与10分钟相比降低为4分钟，因此5'→3'粗寡核苷酸的纯度达到90%的程度。
使用反向RNA合成方法将发色团和淬灭染料与寡核苷酸连接的代表性实例：
1.利用2'-炔丙基合成子和叠氮化物连接的淬灭染料（ChemGene的专有淬灭双偶氮染料）的反向RNA合成：
2.利用2'-炔丙基合成子和叠氮化物连接的发色团（6-FAM）的反向RNA合成，具有多个内部掺入：
Figure BDA00002280522000592
2.利用2'-炔丙基合成子和叠氮化物连接的发色团二茂铁的反向RNA合成；3'-端连接
4.利用2'-炔丙基合成子和叠氮化物连接的发色团（6-FAM）的反向RNA合成（单个内部掺入：
Figure BDA00002280522000602
5.连接子（L）可通过两步骤过程连接（a）；3'-端碱基具有保护基团，可容易地脱除而产生游离3'-羟基，（b）通过琥珀酰亚胺碳酸酯活化游离3'-羟基，随后琥珀酰亚胺碳酸酯与胺封端连接子反应产生结构2所示的化合物。结构1来自与具有亚磷酰胺官能团的连接子的最后一次偶联。
Figure BDA00002280522000611
连接子、发色团列表（称为L1和L2）
L来自与核苷连接的连接子、发色团、荧光染料、荧光核苷、荧光分子，并且可作为亚磷酰胺进行偶联，或可来自活化酯如NHS酯。列表包括以下内容：
用于在3'-端或内部位置上进一步衍生化寡核苷酸的官能团；
氨基修饰子C-3，氨基修饰子（C-6），氨基修饰子C-12，氨基修饰子C-5-dU，氨基修饰子C-5-dU，3'-巯基修饰子（C-6间隔子），巯基修饰子（C6-二硫化物），羧基修饰子（具有间隔子），羧基修饰子（C-10间隔子），C-8（氨基修饰子-C6-间隔子）-r-腺苷，FMOC保护的氨基修饰子-5-r-胞苷（间隔子），FMOC保护的氨基修饰子-C-5-尿苷（间隔子），3'-巯基修饰子（C-3间隔子）二硫化物，
寡核苷酸的3'-化学磷酸化
磷酸酯-on-磷酸化试剂（磺酰基二乙醇单DMT，单亚磷酰胺），二氰乙基磷酸化试剂
寡核苷酸的3'-乙醛连接：
3'-乙醛修饰子C-2间隔子，甲酰基吲哚，
寡核苷酸的间隔子连接：
为了在寡核苷酸的3'-端产生间隔和随后连接重要分子，如肽、氨基酸、发色团、聚乙二醇、不对称二倍子、对称二倍子、长三倍子、三倍子，序列上或序列内的3'端发色团、染料连接：
在通过我们的过程合成的寡核苷酸的内部位置或3'-端的发色团、染料和间隔子的连接可容易地实现；具有间隔子的Dabcyl、dabcyl-C-5尿苷或2'-脱氧尿苷、具有间隔子的生物素、具有四甘醇间隔子的生物素、生物素-C-5脱氧胸苷、生物素-C-5尿苷、生物素（四甘醇间隔子）、5-(间隔子)荧光素、6-(间隔子)荧光素(6-FAM)、5-(间隔子)六氯荧光素、5-(间隔子)四氯荧光素、6-(间隔子)六氯荧光素、6-(间隔子)四氯荧光素、荧光素-C-5脱氧胸苷、荧光素-C-5-rU、四甲基罗丹明（TAMRA）、Cy5TM、Cy 5.5TMCy 3TM、Cy 3.5TM（cy染料为General Electric的商标；GE-Amersham）、Epoch RichmondRedTM、Epoch Kokimo YellowTM、Epoch Gig Harbor GreenTM、Epock EclipseQuencherTM、（Eclipse染料为Epoch Biosciences Inc.的商标）、BHQ-0TM、BHQ-1TM、BHQ-2TM、BHQ-3TM（BHQ染料为Biosearch Technologies,Inc.的商标）。
各种其它染料连接如C-5芘-r-尿苷、C-5-r-尿苷、(5,6)-吡咯-r-胞苷、连接于间隔子的吖啶染料、连接于间隔子的二硝基苯基胺、通过3-OH连接于间隔子的胆固醇四甘醇、通过呋喃环连接于间隔子的补骨脂素、通过间隔子连接的乙二胺四乙酸（EDTA）、嘌呤霉素。
其它连接子包括：C-5（rU和rC）丙烯酸酯生物素、C-5（rU和rC）荧光素、6-FAM、5-FAM、Tamra、罗丹明、丙烯酸酯。
活化剂的使用。在方法的偶联步骤中可加入活化剂，以在本发明所述的5'-亚磷酰胺和羟基之间形成寡核苷酸键。选择活化剂以能够活化亚酰胺的氮并随后使其质子化。活化剂可选自四唑、苄基硫代四唑、乙基硫代四唑、二氰基二咪唑。所述的活化剂导致亚酰胺键活化，以进行与羟基的偶联反应，形成磷酸酯。
Figure BDA00002280522000631
反向RNA合成在微小RNA合成中的应用
微小RNA（miRNA）通常为高度保守的非编码RNA，长度为20至25个核苷，其通过与信使RNA的3'非翻译区（UTR）的序列特异性杂交来调节靶基因的表达以及阻断翻译或直接降解其靶信使RNA，并存在于植物以及动物中。1993年Dr.Victor Ambrose的实验室首先在秀丽隐杆线虫中发现了这一类新型RNA（Lee R.C.等人(1993),14.Cell 75:843-854,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。已在几乎每个物种中确定其存在，包括在人体中发现微小RNA（Lim L.P.等人，(2003),Science 299:1540,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。认为每种miRNA可调节复数个基因，并且由于预计高等真核生物中存在数百个miRNA基因，miRNA承担的潜在调节的回路是庞大的。几个研究组提供的证据表明miRNA可充当多种过程的关键调节子，如早期发育（Reinhart 2000）、细胞增殖和细胞死亡（Brennecke2003），凋亡和脂肪代谢（Xu 2003）。已显示微小RNA在许多生物过程中起着不可或缺的作用，包括免疫应答、细胞周期调控、代谢、病毒复制、干细胞分化和人体发育。许多微小RNA在多个物种中是保守的，这表明这些分子作为关键生物途径的调节子的进化重要性。然而，微小RNA的表达或功能在许多疾病状态下会明显改变，包括癌症、心力衰竭和病毒感染。使用基于miRNA的药物靶向人类疾病路径代表潜在的强大的新型治疗方法。
反向RNA合成方法提供了合成这种RNA，包括修饰以改变该RNA在细胞内环境中的稳定性，以及掺入配体或输送剂以开发摄取和治疗的机会。
反向RNA合成在RNAi合成中的应用
通过RNA干扰（RNAi）使基因表达沉默已成为研究成熟的方法，所述方法提供了选择性基因抑制和在各种生化和药理学过程的控制和管理中的可能。早期的研究表明在秀丽隐杆线虫中的RNA干扰是由21和22个核苷酸的序列介导的。（参见Fire等人，Nature,391:806-811,1998,将其教导的全部内容以引用方式并入本文）。这进一步证实为21和22个核苷酸RNA所介导的小双链RNA对基因表达的特异性抑制的普遍现象（参见Genes Dev.,15:188-200,2001,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。随后，大量研究确证了上述研究，并将RNAi确立为有选择性以及非常特异的基因抑制和调节的强大工具（参见Nishikura,K.,Cell,107,415-418,2001;和Nykanen,A.等人,Cell,107:309-321,2001;和Tuschl,T.,Nat.Biotechnol,20:446-448,2002;和Mittal,V.,Nature Rev.,5,355-365,2004;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,6047-6052,2002;和Donze,O.&Picard,D.,Nucl.Acids.Res.,30,e46,2002;和Sui,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,5515-5520,2002;和Paddison,P.J.等人,Genes Dev.,16,948-959,2002,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。除了天然双链（ds）RNA序列，在序列中使用2'-脱氧-2'-氟-β-D-***糖核酸（FANA）以改变siRNA活性的化学修饰的RNA已显示可导致哺乳动物细胞中相似的或增强的RNA干扰（参见Dowler,T.等人,Nucl Acids Res.,34,1669-1675,2006,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
改善siRNA特性的各种其它修饰仍在继续进行，包括改变骨架化学，2'-糖基修饰，和核碱基修饰，最近对其中一些进行了综述（参见Nawrot,B,和Sipa,K.,Cur r.Top.Med.Chem.,6:913-925,2006;和Manoharan,M.,Curr.Opin.Chem.Biol,8,570-579,2004,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。虽然一些报告表明毒性提高和疗效有所降低，但siRNA的PS修饰具有良好的耐受性。（参见Harborth,J,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.,13,83-105,2003,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。其中还有2'-O-甲基修饰，但其保持A型（RNA样）螺旋，并显示根据序列中该修饰的数量保留或降低siRNA活性（参见Chiu,Y.L.,Rana,T.M.,RNA,9:1034-1048,2003,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。也显示可在有义链中对序列进行广泛的2'-O-甲基修饰而无siRNA活性损失。（参见Kraynack,B.A.,Baker,B.F.,RNA,12:163-176,200,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文）。
支持和连接基团
支持材料（在本文的结构式中表示为“Q”）为非溶胀性固体支持物。该固体材料可为固态、液态或凝胶形式。“连接基团”为将核苷连接于支持物上的部分如羰基，并且在下面的段落中描述了合适的连接基团。支持材料Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物，其例如琥珀酰基、羟基喹啉基、草酰基；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基。另外，可使用不可逆性连接子。
“连接基团和间隔子”为将核苷连接于支持物上的部分如羰基，并且在下面的段落中描述了合适的连接基团。
两种最常用的固相材料为可控孔度玻璃（CPG）和大孔聚苯乙烯（MPPS）。通常通过孔径来限定CPG。在寡核苷酸化学中，分别使用500、1000、1500、2000和
Figure BDA00002280522000651
的孔径制备约50、80、100、150和200-聚体的寡核苷酸。为了制备适合进一步加工的天然CPG，可使用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷处理该材料表面以得到氨基丙基CPG。氨基丙基臂可进一步延伸产生长链氨基烷基（LCAA）CPG。然后将氨基用作适合寡核苷酸合成的连接子的固定点。适合寡核苷酸合成的MPPS为低溶胀性的、高度交联的聚苯乙烯，其在致孔剂的存在下通过二乙烯苯（最少60%）、苯乙烯和4-氯甲基苯乙烯的聚合而获得。将所获得的大孔氯甲基MPPS转化为氨基甲基MPPS。
为了使支持材料适合寡核苷酸合成，通过常规方法将非核苷性连接子（通用支持物）或核苷琥珀酸盐共价连接于固体支持物中的反应性氨基上。使用乙酸酐将剩余的未反应氨基封端。例如，合成开始于通用支持物，其中在该部位非核苷性连接子连接于支持材料。在寡核苷酸链装配的第一合成循环中使用标准方案将5'-末端核苷残基对应的亚磷酰胺偶联于通用支持物上。然后继续链装配直到完成，之后对支持物结合的寡核苷酸进行脱保护。通用固体支持物的性能特点是通过水解裂解P-O键释放寡核苷酸，所述P-O键将5'-末端核苷酸残基的5'-O连接于通用连接子。该方法的关键优势为使用相同支持物而与所合成的寡核苷酸的序列无关。
另外，5'-末端核苷残基的5'-羟基通常通过5'-O-琥珀酰臂连接于支持物。寡核苷酸链装配起始于来自5'-末端的第二核苷酸残基的各亚磷酰胺构建单元的偶联。与用于通用支持物的条件相比一定程度上更温和的条件下，对在核苷支持物上合成的寡核苷酸中的5'-末端羟基进行脱保护。
另一种连接基团包括Q-支持物，其为氢醌间隔子，与琥珀酰支持物相比可容易地裂解（参见University Technologies International,LP(UTI)&Publication;R.T.Pon和S.Y.Yu,Tetrahedron Lett.,1997,38,3327-3330,将其教导以引用方式结合于本文）。结构式如下：支持物-NH-C(=O)-CH2-C6H4-CH2-C(-O)-O-5'-核苷，并且其由以下结构式表示：
Figure BDA00002280522000661
用于寡核苷酸合成的固体支持物：
目前有多种支持物可用于寡核苷酸合成，所述的支持物可以按照适合不同类型的寡核苷酸选择采用。一些关键支持物技术和说明在以下段落中所述。
参见Richard T.Pon;Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,Unit 31,Feb.2000,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。该手册中描述了支持物的物理和化学性质以及寡核苷酸合成的各种化学品的适用性。
通用支持物在寡核苷酸中有重要应用。与单个DNA或RNA碱基的衍生化相比，由Isis Pharmaceuticals开发的UnyLinker技术允许使用单一分子合成寡核苷酸。Unylinker分子的裂解可平稳发生以使3'-端核苷上包括游离3'-端羟基。我们的发明提出在我们的5'→3'-寡核苷酸合成过程中将该Unylinker分子引入到寡核苷酸的5'-端。在固相寡核苷酸合成后，可容易地脱除通用支持物以产生游离5'-端羟基。Isis Pharmaceutical technology具有知识产权，其涵盖了此分子用于进行3'→5'-寡核苷酸合成，并且涵盖在以下专利中；将其教导的全部内容以引用方式结合于本文：
提交于2003年11月13日的第60/520.179（DVCM0009US.L）号美国专利申请，标题为Supports for oligomer synthesis；提交于2003年12月16日的第60/530.477(DVCM0010US.L)号美国专利申请，标题为Supports foroligomer synthesis。报导了Isis Pharmaceutical科学家针对该通用支持物技术的后续出版物。
AM Chemicals,LLC描述了通用支持物。该公司描述了可转化的固体支持物，其允许在3'-端引入各种配体、官能团。我们的发明提出利用该固体支持物纳入我们的过程中以在5'-位上进行官能化。AM Chemicals,LLC描述的描述通用支持物的出版物详细列出了3'→5'-方向寡核苷酸合成的应用；Aconformationally Preorganized Universal Support for Efficient OligonucleotideSynthesis,Andre P.Guzaev&Muthiah Manoharan,J.Am.Chem.Soc,2003,125,2380-2381,将其教导的全部内容以引用方式结合于本文。
Nitto Phase R（Nitto Denko Technical Corporation的商标）。Nitto phaseR支持物已证明具有用于治疗级DNA和RNA合成的可能性。Nitto PhaseR支持物通过Nitto Denko Corp的全资子公司Kinovate Life Sciences销售。这可在我们的过程和发明中用作核苷5'-位连接的支持物。凭借我们用于反向RNA合成的出色的过程以及结合此支持物，我们预期能够合成高品质的寡核苷酸。
Prime Synthesis Inc.报导了（见Prime Synthesis Inc.的网站）可控孔度玻璃（CPG）的各种连接子/间隔子的在连接到CPG珠表面的用途。
GE（General Electric）的一个部门GE Health Care描述了用于寡核苷酸合成的定制支持物，称为Primer Support 200（apczech.cz/pdf/df-primersupport.pdf）。GE Health Care表明该支持物适合DNA合成、RNA合成、寡核苷酸合成过程中的自定义添加碱基和寡核苷酸链延伸、多种发色团如荧光素、dabsyl、磷酸酯-ON试剂等的标记。Primer support的装载水平为20-250umole/g。然而据我们所知，没有5'→3'方向RNA合成为人所知或被提出过。
以下化合物不是本发明所述的化合物：
示例
图式1中描述了合成图式的详细内容：
Figure BDA00002280522000682
其中B=a)A(N-Bz),b)C(N-Bz),c)C(N-Ac),d)G(N-iBu);e)A(N-tBPac),f)C(N-fBPac),g)G(N-tBPac),h)A(N-Pac),i)C(N-Pac),j)G(N-Pac),k)U。
利用2',3'-亚异丙基官能团来保护n-保护的核糖核苷的核糖的2'、3'羟基。图式（1）中显示了许多优选的n-保护基团。之后优选地使用苯甲酰基保护5'-羟基以获得通式21所示的化合物。然后在本领域熟知的温和酸性条件下选择性脱除亚异丙基。该步骤产生如通式22所示的化合物。随后与TBDM硅烷基氯（叔丁基二甲基硅烷基氯）的反应产生如通式23所示的单硅烷基化合物。本发明人观察到3'-TBDMS基团，也即化合物结构24在该过程中不是优选形成的。在大多数情况下，他们观察到洁净的产物，通过化学分析方法确证其结构为23。
在上述过程中的每个步骤中通过结晶或柱色谱进行纯化。随后在吡啶中与二甲氧基三苯基氯（DMT-氯）反应产生通式为26的3'-DMT-2'-TBDMS-n-保护的核苷。通过柱色谱对各化合物进行充分纯化。
虽然他们利用TBDMS基团制备2'-TBDMS醚，但在该步骤中可利用其它硅醚。小心地用水性/甲醇性NaOH水解产生具有游离5'-羟基的化合物，通式为27。
使用碱的水溶液或甲醇溶液选择性脱除5'-苯甲酰基在本领域是公知的。将化合物3'-DMT-2'-TBDMS-n-保护的核苷（结构27）通过硅胶柱色谱纯化。随后使用磷酸化试剂将纯化的化合物（结构27）磷酸化以产生相应的亚磷酰胺（结构16），所述的磷酸化试剂如n,n-二异丙基氨基氰乙基磷酰胺氯或2-氰乙基,n,n,n,n-四异丙基磷烷。两种磷酸化试剂，n,n-二异丙基氨基氰乙基磷酰胺氯或2-氰乙基,n,n,n,n-四异丙基磷烷，都可以在市场上可购买到由ChemGenes Corp.所生产的，并且磷酸化来产生相应亚磷酰胺在本领域是熟知的。
大规模合成高纯度3'-DMT-2'-TBDMS-核苷-5′-亚磷酰胺以用于反向RNA合成。在以下实施例中描述了70-100g量的亚磷酰胺的典型合成。通过31PNMR证明每个亚磷酰胺合成过程具有100%的纯度，通过高压液相色谱（HPLC）分析证明纯度高于98%。在独立的表中给出了质量控制数据。
3'-ODMT-2'OTBDMS-7-脱氮rG (n-ibu)-5'-OP的合成
步骤（a）：通过文献中公布的已知步骤制备5'OPMT-2'TBDMS-7-脱 氮rG(n-ibu)
步骤（b）：5'OH-2'-TBDMS-7-脱氮rG-(n-ibu)：
5'-O-DMT-2'-TBDMS-7-脱氮rG(n-ibu)；取30gm置于二氯甲烷中的三氯乙酸中（3%溶液，w/v；2eq）以选择性将DMT基团从5'-位脱除。将混合物剧烈振摇得到澄清溶液，其随反应进行而变成深紫色。在室温下进一步搅拌此溶液10分钟。然后在零摄氏度下以10%碳酸氢钠水溶液（预冷至05℃)淬灭反应混合物，以中和反应至pH为7-8。将有机层以饱和盐水洗涤一次，接着通过无水硫酸钠并在真空下浓缩。通过柱色谱在硅胶上（70-230目；Merck级别）纯化残留物以得到纯的5',3'-二羟基-2'-TBDMS-7脱氮rG(n-ibu)；产量15gm(85%)；tlc rf.0.2(溶剂***(5:3:2):Chl:Hex:丙酮。
步骤（c ）：5'-OBz-2'TBDMS-7-脱氮rG-(n-ibu)：
将5'OH-2'-TBDMS-7-脱氮rG-(n-ibu)选择性地在5'-位苯甲酰化。将5'OH-2'-TBDMS-7-脱氮rG-(n-ibu)(15gm)置于干燥吡啶(10倍w/v；150ml)中，在无水条件下降至-10℃至0。将苯甲酰氯(1.1当量，4.10ml)一批次加入，并将此混合物在相同温度下搅拌1.5小时。以冷甲醇淬灭混合物，接着在真空下除去溶剂。将此混合物在氯仿中萃取，以饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，接着以饱和盐水洗涤一次。有机层通过无水硫酸钠，接着在低真空下除去溶剂。将残留物在***和乙酸乙酯中结晶来纯化，得到17gm纯化合物。HPLC纯度99%.rf.0.5.(溶剂***(5:3:2):Chl:Hex:丙酮。
步骤（d）：5'-QBz-3'-ODMT-2'-TBDMS-7-脱氮rG (n-ibu)
上一步的化合物；5'-OBz-2'TBDMS-7-脱氮rG-(n-ibu(17g)以无水吡啶干燥两次，接着置于吡啶中w/v；1:10，170ml)，并且对溶液进行防潮保护并降至0-5℃。将DMT-氯(25.2g；2.5当量)加入溶液中并将反应混合物在室温下搅拌24小时，接着以冷却的甲醇淬灭反应。将溶液真空蒸发溶剂，并通过在乙酸乙酯中萃取进行后处理。将有机层依次以饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，接着通过无水硫酸钠。将此溶液浓缩并通过柱色谱纯化残留物（硅胶70-230目，E.Merck），产量为为9gm纯品，HPLC纯度为98%，也回收了未反应的起始原料(8gm)。
步骤（e）：5'-OH-3'-ODMT-2'-TBDM S-7-脱氮rG (n-ibu)：
将在此前的步骤中所得到的化合物（6.0g）在5-10℃下在可控的水解条件下即2N NaOH的吡啶溶液：MeoH 60ml (80:20)，选择性水解30分钟，接着使用Dowex-吡啶阳离子交换树脂中和反应混合物，接着过滤除去Dowex树脂以得到粗产物。以泵抽去溶剂，随后通过柱色谱纯化残留物得到纯化合物，产量为4.0g。HPLC纯度为98.5%。质谱和1H NMR
步骤（f）：3'-ODMT-2'-TBDMS-7-脱氮rCK(n-ibu)-5'-氰乙基亚磷酰胺：
将在此前的步骤中所得到的化合物使用无水乙腈彻底干两次。将干燥产物置于无水蒸馏的四氢呋喃中。随后将二异丙基乙胺(2.0当量)加入反应混合物中，同时在无水条件下搅拌。将二异丙基-2氰基乙基氯试剂（1.1当量）加入反应混合物中。室温下搅拌此混合物2.0小时。将粗品反应混合物以饱和碳酸氢钠（冷却至0℃)淬灭，接着使用过量乙酸乙酯稀释。以饱和盐溶液洗涤有机层一次。使有机层通过无水硫酸钠。真空下除去溶剂，并通过柱色谱纯化粗品反应混合物（硅胶230-400目，E.Merck级别）；用于纯化的溶剂***；45:45:10氯仿:乙酸乙酯:三乙胺)以得到纯亚磷酰胺。HPLC纯度>98%。31P NMR，1H NMR，MASShnmr mass HPLC。偶联效率测试显示偶联>98%。
3'-Q-DMT-2'-TBDMS-L-rU亚磷酰胺的合成。
步骤（a）1-O Ac-2,3,5-三-O-bz-L-核糖（使用硅烷基化的尿嘧啶）
以类似于本领域熟知的1-乙酰基-三-O-苯甲酰基-D-核糖的合成方法来合成1-O-乙酰基-三-O-苯甲酰基-L-核糖（i）。
步骤（b）：235'-三-O-苯甲酰基-L-尿苷
通过使用六甲基二硅氮烷处理来制备硅烷基化的尿嘧啶（六甲基二硅氮烷；HMDS；20当量）。然后在氯化锡（IV）存在下（SnCl4作为催化剂）将硅烷基化的尿嘧啶与1-O-乙酰基-三-O-苯甲酰基-L-核糖融合。将粗产物以固体碳酸氢钠中和来进行后处理，接着使用乙腈过滤。将固体丢弃。真空下将滤液抽出。在硅胶柱上通过柱色谱纯化该粗化合物（E.Merck；70-230目）。将纯馏分抽干，通过HPLC、UV和ESI/MS鉴定产物。
步骤（c）：2,3,5-三-羟基-L-尿苷（L-尿苷）：
随后将步骤（b）中获得的纯的完全保护的中间体化合物然后在37度下使用吡啶中的氨水（29%）（50:50；v/w）水解36小时以产生粗产物。将此粗品化合物以***洗涤，接着以乙酸乙酯洗涤以除去溶剂和苯甲酸。随后在乙醇中结晶此化合物。纯的干燥化合物产率为80%。通过HPLC、UV和ESI/MS分析产物。
步骤（d）2',3'-亚异丙基-L-rU
将干燥化合物溶于经蒸馏的丙酮中（6倍于前体的干燥重量）。加入催化量的H2SO4后在室温下搅拌此混合物，接着加入2,2-二甲氧基丙烷（相对于L-rU为4当量），进一步以丙酮稀释并搅拌1hr。该阶段之后在反应混合物中加入碳酸钠以将pH调节至中和。过滤混合物除去固体，并在真空下浓缩滤液。通过柱色谱（硅胶70-230目）纯化粗品（2',3'异亚丙基-LrU），溶剂***；CHCl3:MeOH (90:10)，产生纯度化合物，产率为85%。通过UV、JPLC和ESI/MS表征产物。Tlc;CHCl3:MeOH(9:1);rf.0.45)；干燥化合物的纯度>98%。
步骤（e ）5'-O-Bz-2'，3′-异亚丙基-L-rU：
将步骤（d）后所获得的产物溶于干燥吡啶（10倍）中，在0-5摄氏度下加入苯甲酰氯（1.1当量），并在0-5℃下搅拌反应混合物1.5小时。以冷甲醇淬灭反应混合物后对粗反应混合物进行后处理，接着除去溶剂。随后通过柱色谱在溶剂***中（Chl:己烷:丙酮：50:30:20）纯化粗反应产物。将纯的干燥产物用UV、HPLC、ESI/MS表征。产率；80%。
步骤（f）5'-Q-Bz-L-rU
将前面步骤中的到的产物置于二氧六环中（相对于纯的干燥固体为5倍）并加入2N HCl（5倍V;V）。室温下搅拌混合物过夜。0℃下以固体碳酸氢钠淬灭混合物直到pH为中性。过滤溶剂并将滤液抽干。在乙腈中结晶残留物，干燥产物并通过UV、HPLC、ESI/MS表征，产率为75%。
步骤（g）5'-O-Bz-2'-TBDMS-L-rU：
将之前的产物置于干燥四氢呋喃中（10倍w/v），在搅拌下和干燥条件下加入到硝酸银/吡啶复合物中，接着加入TBDMS-氯（1.1当量）。室温下搅拌反应混合物8小时。粗略的tlc表明形成两个主斑点。通过以100倍过量的乙酸乙酯稀释来对反应混合物进行后处理。将有机层依次以饱和碳酸氢盐和饱和饱和盐溶液洗涤。将有机层通过无水硫酸钠过滤。然后将有机层抽干并通过柱色谱纯化残留物。通过UV、HPLC、1H NMR和ESI/MS表征纯条带。想要的2'-异构体的产率约为55%。
步骤（h）5'-O-Bz-2'-TBDMS-3'-O-DMT-L-rU
将前面步骤中充分干燥的化合物置于干燥吡啶中（10倍；w/v），并在此溶液中加入DMT-氯（DMT氯；2.5当量）。搅拌反应混合物24小时以产生粗产物。使用冷甲醇（相对于反应中使用的DMT-氯为2当量）淬灭反应。然后在真空下浓缩粗混合物，并通过柱色谱（硅胶；230-400目Merck级别）纯化残留物。合并纯馏分，浓缩并通过UV、HPLC、1H NMR和ESI/MS表征所获得的产物。产率；85%。
步骤（i）5'-OH-2'-TBDMS-S'-O-DMT-L-rU
将前面的步骤获得的纯产物置于吡啶/甲醇（50:50V;V）中，并且在5度下使用2N NaOH处理30分钟，同时将pH保持在12.5-13。30分钟后加入Dowex-吡啶嗡阳离子交换树脂来中和反应混合物，产生粗产物。通过硅胶柱色谱（硅胶230-400目，E.Merck grade）纯化粗化合物。合并纯馏分并除去溶剂。分析干燥产物并通过HPLC、UV、1-H NMR和ESI/MS表征。产率;90%。
步骤（j）：3'-Q-DMT-2'-TBDMS-L-rU-5'-氰乙基亚磷酰胺
室温下在二异丙基乙胺（2当量）的THF溶液中以n,n-二异丙基-2-氰乙基氯试剂（1.1当量）对纯的干燥产物进行磷酰化1.5小时。将粗反应物按照通常方式处理，随后通过柱色谱处理来得到纯产物。通过UV、HPLC、1HNMR、ESI/MS和31P NMR分析并表征产物。
寡核苷酸1的合成：使用5'→3'定向的REV-RNA亚磷酰胺化学以1μmol的规模合成寡核苷酸1。在Expedite 8900合成器中进行合成，此合成使用标准RNA 1μmol循环，并且单体和固体支持物的偶联时间为4.0分钟。
所使用的亚酰胺（参见所使用的活化剂的表）：
（1）N6-苯甲酰基-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-腺苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(A-N-Bz).LOT#AL300-2
（2）N4-Acetyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-胞苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(C-N-Ac).LOT#NS143-19
（3）N2-异丁酰基-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-鸟苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(G-N-Ibu).LOT#NS42-19
（4）2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-尿苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺.LOT#NS147-19
所使用的产品：
（5）2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-尿苷-5'-琥珀酰基CPG 1000A.三苯甲基值;28.4um/gm LOT#NS24-19
（6）DDTT((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-l,2,4-二噻唑啉-3-硫酮),lot#AG015
（7）乙基硫代四唑(ETT);(0.25M),lot#DP 152-4
1.0umol磷酸二酯和硫代膦酸酯的一般步骤：
将上述亚酰胺（固体）分别加入20mL加速瓶（expedite bottle）中并溶于一定量的干燥乙腈中，使溶液为0.075M。以氩气吹扫瓶，迅速密封螺帽然后振摇以完全溶解固体。由于G-N-Ibu在干燥乙腈中的溶解度有限，将G-N-Ibu溶于50%无水二氯甲烷中，接着加入干燥乙腈以制备50:50二氯甲烷:乙腈溶液。按如下顺序将单体溶液瓶旋入合成器：1号亚酰胺在#6接口上；2号亚酰胺在#7接口上；3号亚酰胺在#8接口上；4号亚酰胺在#9接口上。此外，准备具有No.5产品的1.0um快速柱（expedite column）并连接于合成器。
根据表中列出的所总结的关键特征完成合成后，将可控孔度玻璃（CPG）固体支持物以3.0ml***洗涤并将其转移至2ml微量离心管中。将寡核苷酸1通过在65°C下在1ml 40%甲胺水溶液中孵化30min从CPG上裂解并脱保护。除去上清液并以1ml水洗涤CPG；合并上清液并干燥。45℃下通过以500ul新鲜的12.0%四乙基氯化铵的DMSO溶液在超声浴中处理1小时，将叔丁基二甲基硅烷基保护基从RNA残基上脱除。以1.5ml正丁醇沉淀寡核苷酸1；在-20°C下冷却样品1小时然后在10,000g下离心10分钟。倒出上清液，将沉淀物以正丁醇再次洗涤并最后以500ul乙醇洗涤，然后在10000rpm下离心5分钟，倒出上清液。将沉淀物溶于1000ul M.Q水并检查OD（粗脱盐）。然后通过离子交换HPLC纯化寡核苷酸1，使用线性梯度缓冲液A=(10.0%,0.5M TRIS和10.0%ACN)pH 7.5和缓冲液B=缓冲液A中1.0M氯化锂。
将整个样品装载于Sourcel5Q柱（1.0cm x 25cm）上并在40分钟内以5%至75%的乙腈线性梯度洗脱。在260nm下监测样品并收集与所需寡核苷酸相应的峰，通过加入5.0体积的（2%LiCLO4，在丙酮中）进行沉淀，接着在10,000g下离心10分钟。倒出上清液，以乙醇洗涤沉淀物。
寡核苷酸2：使用5'→3'定向的REV-RNA亚磷酰胺化学以1μmol的规模合成寡核苷酸2。在Expedite 8900合成器中进行合成，使用标准RNA 1μmol循环，并且单体和固体支持物的偶联时间为4.0分钟。
所使用的亚酰胺（参见所使用的活化剂的表）：
（1）N6-苯甲酰基-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-腺苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(rA).LOT#AL300-2
（2）N4-乙酰基-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-胞苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(rC).LOT#NS143-19
（3）N2-异丁酰基-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-鸟苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(rG).LOT#NS42-19
（4）2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-尿苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺(rU).LOT#NS147-19
（5）N6-苯甲酰基-2'-O-Me-3'-O-DMT-腺苷-5'-氰乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺.LOT#133-8SS
（6）2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-尿苷-5'-琥珀酰基CPG 1000A(rU).TV-8.4um/gm,LOT#NS24-19
（7）乙基硫代四唑(ETT);(0.25M),lot#DP 152-4
将上述亚酰胺（固体）分别加入20mL加速瓶中并溶于一定量的干燥乙腈中，使溶液为0.075M。由于G-N-Ibu在干燥乙腈中的溶解度有限，将G-N-Ibu溶于50%无水二氯甲烷中，接着加入干燥乙腈以制备50:50二氯甲烷:乙腈溶液。按如下顺序将单体溶液瓶旋入合成器：1号亚酰胺在#6接口上；2号亚酰胺在#7接口上；3号亚酰胺在#8接口上；4号亚酰胺在#9接口上。此外，准备具有No.6产品的1.0um快速柱并连接于合成器。对于寡核苷酸2，将硫化试剂(二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮（DDTT）溶于吡啶:乙腈（90:10）以制备0.1M溶液。将该试剂置于合成器的辅助接口上。
合成后，将可控孔度玻璃（CPG）固体支持物以3.0ml***洗涤并转移至2ml微量离心管中。将寡核苷酸通过在65°C下在1ml 40%甲胺水溶液中孵化30min从CPG上裂解并脱保护。除去上清液并以1ml水洗涤CPG；合并上清液并干燥。45℃下通过以500ul新鲜的12.0%四乙基氯化铵的DMSO溶液在超声浴中处理1小时将叔丁基二甲基硅烷基保护基从RNA残基上脱除。以1.5ml正丁醇沉淀寡核苷酸1；在-20°C下冷却样品1小时然后在10,000g下离心10分钟。倒出上清液，将沉淀物以正丁醇再次洗涤并以500ul乙醇洗涤，在10000rpm下离心5分钟。离心后倒出上清液。将沉淀物溶于1000ul M.Q水中并检查OD（粗脱盐）。
然后通过离子交换HPLC纯化寡核苷酸，使用线性梯度A=(10.0%,0.5MTRIS和10.0%ACN)pH 7.5和缓冲液B=缓冲液A中1.0M氯化锂。将整个样品装载于Sourcel5Q柱（1.0cm x 25cm）上并在40分钟内以15%至95%的乙腈线性梯度洗脱。在260nm下监测样品并收集与所需寡核苷酸相应的峰，通过加入5.0体积的（2%LiClO4，在丙酮中）进行沉淀，接着在10,000g下离心10分钟。倒出上清液，以乙醇洗涤沉淀物。
由反向合成方法合成的寡核苷酸序列
Figure BDA00002280522000761
由反向RNA方法合成的76聚体磷酸二酯REV-磷酸二酯：
76聚体磷酸二酯REV-磷酸二酯-OLIGO——76聚体
rGrCrCrCrGrGrArUrArGrCrUrCrArGrUrCrGrGrUrArGrArGrCrArUrCrArGrArCrUrUrUrUrUrArUrCrUrGrArGrGrGrUrCrCrArGrGrGrUrUrCrArArGrUrCrCrCrUrGrUrUrCrGrGrGrCrGrCrCrA（SEQ ID NO:4）以6分钟的偶合时间合成。进行Page分析以比较由传统方法（3'→5'）和反向RNA合成方法（5'→3'）合成的76聚体。所产生的凝胶显示与通过传统方法合成的76聚体相比，由反向RNA方法制备的76聚体中存在更少的缺失序列（例如，75聚体，74聚体等）。
大规模的寡核苷酸合成：
进行了12umol规模的具有末端2'-O-甲基碱基的硫代磷酸酯核苷酸(seq#2)的合成。获得了以下数据(a)三苯甲基直方图；(b)所合成粗寡核苷酸的CE(毛细管凝胶电泳)；(c)纯化的寡核苷酸CE和HPLC(d)用于分子重量测定的ESI-MS分析。
一般程序
12.0umol硫代磷酸酯寡核苷酸：
制备了亚酰胺和产品，并在如上所述的用于寡核苷酸1和2的Expedite8900合成器上进行合成。规模、单体偶联时间、活化剂和DDTT/碘试剂如下表所述。
4min和6min偶联时间的寡核苷酸合成条件的表
Figure BDA00002280522000771
根据表中列出的所总结的关键特征完成合成后，将可控孔度玻璃（CPG）固体支持物以15ml***洗涤并转移至8X2ml微量离心管中。通过在65°C下在1ml 40%甲胺水溶液中孵化30min来将寡核苷酸从CPG上裂解并脱保护。除去上清液并以1ml水洗涤CPG；合并上清液并干燥。45℃下通过以500ul新鲜的12.0%四乙基氯化铵的DMSO溶液在超声浴中处理1小时，将叔丁基二甲基硅烷基保护基从RNA残基上脱除。以1.5ml正丁醇沉淀寡核苷酸；在-20°C下冷却样品1小时然后在10,000g下离心10分钟。倒出上清液，以正丁醇再次洗涤沉淀物并最后以500ul乙醇洗涤，然后在10000rpm下离心5分钟，倒出上清液。将沉淀物溶于l000ul M.Q水并检查OD（粗脱盐）。
通过HPLC或CE分析测得以上获得的粗品RNA纯度为90-92%。通过离子交换或反相HPLC进行后续纯化。纯化使得纯化的RNA纯度为92%至98%。
纯化的详细内容：
使用线性梯度纯化寡核苷酸，其中缓冲液A=(10.0%,0.5M TRIS和10.0%ACN)pH 7.5。缓冲液B=缓冲液A中1.0M氯化锂。
将整个样品装载于Source15Q柱（1.0cm x 25cm）上并在40分钟内以60%至100%的缓冲液B梯度洗脱。在260nm下监测样品并收集与所需寡核苷酸相应的峰，通过加入5.0体积的（2%LiClO4，在丙酮中）进行沉淀，接着在10,000g下离心10分钟。倒出上清液，以乙醇洗涤沉淀物。得到;343.0OD(260nm)；纯度(通过CE分析);98.01%。
序列列表：
缩写：
mA;(2'-O甲基-r-腺苷);rC;(r-胞苷);rG(r-鸟苷);rU(r-尿苷)
REV-RNA-Me-SEQ(具有甲氧基)
SEQ：rUmrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrAmrA(SEQ ID NO 1)
REV-RNA-Me-THIO-4Min偶联时间
SEQ：rU-p(s)mrA-p(s)rC-p(s)rC-p(s)rA-p(s)rG-p(s)rC-p(s)rU-p(s)rC-p(s)rU-p(s)rA-p(s)rC-p(s)rA-p(s)rU-p(s)rA-p(s)rC-p(s)rG-p(s)rA-p(s)rC-p(s)rA-p(s)mrA-p(s)(SEQ ID NO 2)
REV-RNA-4Min偶联时间（无甲氧基）
SEQ：rUrArCrCrArGrCrUrCrUrArCrArUrArCrGrArCrArC(SEQ ID NO 3)
76聚体
SEQ：rGrCrCrCrGrG rArUrA rGrCrU rCrArG rUrCrG rGrUrA rGrArGrCrArUrCrArG rArCrU rUrUrU rUrArU rCrUrG rArGrG rGrUrC rCrArGrGrGrUrUrCrA rArGrU rCrCrC rUrGrU rUrCrG rGrGrC rGrCrC rA(SEQ ID NO4)
尽管本发明具体地结合其实例的实施方案进行显示和描述，本领域技术人员应当理解的是，在不背离所附权利要求所包括的发明范围的前提下，可在形式和详细内容上进行各种变化。

Claims (39)

1.如式Ia，Ib，Ic或Id所示的化合物：
Figure FDA00002280521900011
Figure FDA00002280521900012
其中
J为H，
Figure FDA00002280521900013
其中
Figure FDA00002280521900014
表示J连接到O原子的位置；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
或R1与R2与其所连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当结构式Ia或Ib为：
Figure FDA00002280521900021
时；其中R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当结构式Ia或Ib为：
Figure FDA00002280521900022
时；R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基、烯基、炔基和苯基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；并且任选地可以-NR7R8、(C1-C4)烷基氨基、二(C1-C4)烷基氨基、-OR9、(C1-C6)烷氧基、苄基或取代苄基、-SR10；或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选取代的核碱基，任选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化，其中所述核碱基选自：
N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，由-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺取代的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；
其中在核碱基或环外胺中任意可取代的氮原子任选地由芴基甲氧基羰基；-C(=O)OPh；-C(=O)(C1-C16)烷基；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)OH；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)O(C1-C6)烷基；=CR8N(C1-C6)烷基)2；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；和
Figure FDA00002280521900031
所取代；
其中在核碱基内的任意可取代的氧原子任选地由-C(-O)N(C1-C6烷基)2-C(=O)N(苯基)2所取代。
2.如式Ia，Ib，Ic或Id所示的化合物：
Figure FDA00002280521900041
Figure FDA00002280521900042
其中
J为H，
Figure FDA00002280521900043
其中
Figure FDA00002280521900044
表示J连接到O原子的位置；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
或R1与R2与其所连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基可以任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当结构式Ia或Ib为：
时；其中R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当结构式Ia或Ib为：
Figure FDA00002280521900051
时；R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基可以任选地包括独立地选自NH，NR5，O和S的***的杂原子；并且任选地可以-NR7R8、(C1-C4)烷基氨基、二(C1-C4)烷基氨基、-OR9、(C1-C6)烷氧基、苄基或取代苄基、-SR10；或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；假如R4为-O-Si(R11)3，并且两个R11基团均为甲基，那么另一个不能为t-丁基，或如果R4为-O-CH2-Si(R11)3，那么三个R11基团不能均为异丙基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选地取代的核碱基，可选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中J为
Figure FDA00002280521900052
其中
Figure FDA00002280521900061
表示J连接到O原子的位置。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中化合物由式Ia或Ib表示：
Figure FDA00002280521900062
或其盐。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中Z为非取代或取代芳基，非取代或取代三芳基甲基，非取代或取代三苯甲基，非取代或取代四氢吡喃基，或非取代或取代9-苯基氧杂蒽基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中Z为二-对甲氧基苯基苯基甲基，对氟苯基-1-萘基苯基甲基，对甲氧基苯基-1-萘基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，对甲苯基二苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基-1-萘基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基，二-邻甲氧基苯基苯基甲基，二-对甲氧基苯基苯基甲基或对甲苯基二苯基甲基。
7.根据权利要求5所述的化合物，其中Z表示为以下结构式：
Figure FDA00002280521900063
其中
Figure FDA00002280521900064
表示与3'氧原子连接，Ra，Rb，和Rc独立地选自以下结构式：
Figure FDA00002280521900065
Figure FDA00002280521900066
8.根据权利要求5所述的化合物，其中Z为4-甲氧基三苯甲基，4,4'-二甲氧基三苯甲基，或4,4',4"-三甲氧基三苯甲基。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中在核碱基或环外胺上的可取代的氮原子任选地由=CHN(CH3)2；C(=O)CH(CH3)2；-C(=O)CH3；=C(CH3)N(CH3)2；-C(=O)OPh；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)CH2CH2-C(=O)O(C1-C6)烷基；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺和
Figure FDA00002280521900071
所取代。
10.根据权利要求4所述的化合物，其中R3为-CH2CH2CN，-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5，-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3，-CH2CH2-C6H4-NO2，-CH2CH2-NH-C(O)-C6H5，或-CH2CH2-O-C6H4-C(O)CH3并且R4为-O-Si(R11)3。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中R4为-O-Si(CH3)2(C(CH3)3)或-O-CH2-S i(CH(CH3)2)3)。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
Figure FDA00002280521900072
或其盐。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
或其盐。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中R3为-CH2CH2CN。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
或其盐。
16.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
或其盐。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
Figure FDA00002280521900083
或其盐。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中R3为CH2CH2CN。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
Figure FDA00002280521900084
或其盐。
20.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
Figure FDA00002280521900091
或其盐。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
或其盐。
22.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
Figure FDA00002280521900093
或其盐。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中所述化合物如以下结构式之一所示：
Figure FDA00002280521900094
或其盐。
24.由以下结构式表示的化合物：
Figure FDA00002280521900095
其中
每个Y独立地为氧或硫；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
或R1与R2与其连接的氮原子一起形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基可以任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当R4为核糖构象时，R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当R4为***糖构象时，R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；并且任选地可以-NR7R8、(C1-C4)烷基氨基、二(C1-C4)烷基氨基、-OR9，(C1-C6)烷氧基、苄基或取代苄基、-SR10或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选地取代的核碱基，任选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化，其中所述核碱基选自：
N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，由-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺取代的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；
其中在核碱基或环外胺中任意可取代的氮原子任选地由芴基甲氧基羰基；-C(=O)OPh；-C(=O)(C1-C16)烷基；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)OH；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)O(C1-C6)烷基；=CR8N(C1-C6)烷基)2；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；和
Figure FDA00002280521900121
所取代；
其中在核碱基内任意可取代的氧原子任选地由-C(-O)N(C1-C6烷基)2-C(=O)N(苯基)2所取代；
R20为H，-O-Z，或R21；
R21为3'官能团；
Z为对酸不稳定的保护基团；和
n为0至150；
或其盐。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中R为
a）氰乙基磷酸酯-聚乙二醇v，其中v为2-100，并且是乙二醇单元数；
b）氰乙基磷酸酯-连接子，其连有胆固醇、生物素、荧光素、花青染料、补骨脂素、四甲基罗丹明染料、dabcyl染料、C-3二硫化物、C-6二硫化物、对称和不对称烃链（C2-C50）、末端氨基被CF3C(=O)或邻苯二甲酰胺基或FMOC保护的对称和不对称烃链（C2-C50）、以胺保护基团保护的(C1-C16)亚烷基胺、以叠氮基保护的(C1-C5)亚烷基胺；以乙炔基（C三键CH）保护的(C1-C5)亚烷基胺；
c）以DMT基或其它对酸不稳定的基团保护的氰乙基磷酸酯-2-乙醇，以DMT基或其它酸不稳定基团保护的氰乙基磷酸酯-3-丙醇；
d）具有末端羟基的(C1-C50)亚烷基；
e）脂类，羧基，或肽；或
f）分枝的亚磷酰胺。
26.根据权利要求24所述的化合物，其中n为5-75。
27.一种合成的RNA分子，其纯度超过97%并由5'亚磷酰胺核苷合成。
28.通过在5'-至3'-方向形成键以制备用于合成RNA寡聚物及其对映异构体的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤
a）从连接到支持物的化合物上裂解Z保护基团，所述的连接到支持物的化合物由以下结构式表示：
Figure FDA00002280521900131
从而形成由结构式（XX）表示的化合物：
Figure FDA00002280521900132
b）将由结构式XX表示的化合物与结构式为XXI的化合物进行反应：
Figure FDA00002280521900133
从而形成由以下结构式表示的2-聚体化合物：
c）将该2-聚体与封端剂反应；
d）氧化或硫化该2-聚体化合物的三价磷基团，以形成由结构式XXII表示的化合物：
Figure FDA00002280521900135
e）从由结构式XXII表示的化合物将Z保护基团裂解，从而形成由结构式XXIII表示的化合物：
Figure FDA00002280521900141
f）将由结构式XXIII表示的化合物与由以下结构式表示的化合物进行反应：
从而形成由结构式XXIV表示的3-聚体：
e）从由结构式XXIV表示的化合物将Z保护基团裂解；
g）重复步骤a）至e）n次，从而形成由以下结构式表示的寡核苷酸：
Figure FDA00002280521900151
或其盐，其中
J为
Figure FDA00002280521900152
其中
Figure FDA00002280521900153
表示J连接到O原子的位置；
Q为a）由连接基团和间隔子组成的能够裂解而形成羟基的支持物；或b）脂肪链，芳香基，取代或非取代芳香基，取代或非取代苯氧基，或乙酰丙酰基；
R1为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R2为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C3-C20)环烷基，或取代或非取代(C3-C20)环烷基(C1-C12)烷基，其中烷基或环烷基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
或R1与R2相连并与其共同连接的氮原子形成4-7元非芳香性杂环基，其中所形成的杂环基任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；
R3为磷酸酯保护基团；
R4为-卤素，-R5，-NR7R8，-OR9，-SR10，或2'-封闭基团；或当结构式Ia或Ib为：
时；其中R4进一步选自O-Si(R11)3或O-CH2-Si(R11)3；或当结构式Ia或Ib为：
Figure FDA00002280521900161
时；R4进一步选自-OC(=O)R12；
每个R5独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代苯基，其中所述烷基，烯基，炔基和苯基可以任选地包括***的杂原子，所述杂原子独立地选自NH，NR7，O和S；并且任选地可以-NR7R8、(C1-C4)烷基氨基、二(C1-C4)烷基氨基、-OR9、(C1-C6)烷氧基、苄基或取代苄基、-SR10或-S-(C1-C6)烷基封端；
R6为-H或-O-Z；
每个R7独立地为芴基甲氧基羰基；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R8为H或取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R9独立地为-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R10独立地为-S(C1-C6)烷基，-C(=O)-(CH2)1-16CH3；取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R11独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基；
每个R12独立地为取代或非取代(C1-C12)烷基，取代或非取代(C2-C12)烯基，或取代或非取代(C2-C12)炔基，或取代或非取代芳基；
Z为对酸不稳定的保护基团；
Bn为氢或任选地取代的核碱基，可选地使用胺保护基团对各环外胺进行官能化，其中所述核碱基选自：
N6，N6-二甲基腺嘌呤，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N-1-甲基腺嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，亚乙烯基腺嘌呤，异鸟嘌呤，N1-甲基鸟嘌呤，7-碘-7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-7-碘腺嘌呤，7-脱氮-7-碘-6-氧嘌呤，5-碘-5-甲基-7-脱氮鸟嘌呤，由-C≡C(CH2)1-8-邻苯二甲酰亚胺取代的7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，次黄嘌呤，6-甲氧基嘌呤，7-脱氮-6-氧嘌呤，6-氧嘌呤，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，8-溴嘌呤，8-氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，8-烷氨基嘌呤，胸腺嘧啶，N-3甲基胸腺嘧啶，5-乙酰氧甲基胞嘧啶，5-氮杂胞嘧啶，异胞嘧啶，N-4(C1-C6)烷基胞嘧啶，N-3(C1-C6)烷基胞苷，5-丙炔基胞嘧啶，5-碘-胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-三氟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，亚乙烯基胞嘧啶，由-CH=CH-C(=O)NH(C1-C6)烷基取代的胞嘧啶和尿嘧啶，由-C≡C-CH2-邻苯二甲酰亚胺取代的胞嘧啶和尿嘧啶，NH(C1-C6)烷基，4-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，N3-硫苯甲酰基乙基尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-乙酰氧基甲基尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，N-3-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-芳基(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-三氟甲基尿嘧啶，4-***基-5-甲基尿嘧啶，2-吡啶酮，2-氧-5-甲基嘧啶，2-氧-4-甲硫基-5-甲基嘧啶，2-硫代羰基-4-氧-5-甲基嘧啶，和4-氧-5-甲基嘧啶；
其中在核碱基或环外胺中任意可取代的氮原子任选地由芴基甲氧基羰基；-C(=O)OPh；-C(=O)(C1-C16)烷基；-C(=O)CH2CH2CH=CH2；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)OH；-C(=O)(C1-C16)亚烷基-C(=O)O(C1-C6)烷基；=CR8N(C1-C6)烷基)2；-C(=O)-NR8-(CH2)1-16NR8(=O)CF3；-C(=O)-(CH2)1-16NR8C(=O)CF3；-C(=O)-NR8(CH2)1-16NR8C(=O)-邻苯二甲酰亚胺；-C(=O)-(CH2)1-16-邻苯二甲酰亚胺；和
Figure FDA00002280521900171
所取代；
其中在核碱基内任意可取代的氧原子任选地由-C(=O)N(C1-C6烷基)2-C(=O)N(苯基)2所取代；和
n为1至150；
或其盐。
29.根据权利要求28所述的方法，其中通过硫化独立地引入每个Y基团以形成硫代磷酸酯键，或通过氧化独立地引入每个Y基团以形成磷酸酯键。
30.根据权利要求29所述的方法，其中在氧化后消除R3基团以形成磷酸酯连接。
31.根据权利要求29所述的方法，其中在硫化后消除R3基团以形成硫代磷酸酯连接。
32.根据权利要求31所述的方法，其中使用碱将核碱基保护基团脱保护。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述碱选自氨水，氨的甲醇溶液或氨的乙醇溶液。
34.根据权利要求32所述的方法，其中R4为-OSi(R11)3。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法进一步包括使用氟化物盐裂解-OSi(R11)3的步骤。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述氟化物盐为氟化四乙基铵。
37.根据权利要求28所述的方法，进一步包括将由以下结构式表示的化合物与3'官能团反应的步骤：
从而形成由以下结构式表示的化合物；
Figure FDA00002280521900182
其中R21为3'官能团或其盐。
38.根据权利要求37所述的化合物，其中R21为
a）氰乙基磷酸酯-聚乙二醇v，其中v为2-100，是乙二醇单元数；
b）氰乙基磷酸酯-连接子，其连有胆固醇、生物素、荧光素、花青染料、补骨脂素、四甲基罗丹明染料、dabcyl染料、C-3二硫化物、C-6二硫化物、对称和不对称烃链（C2-C50）、末端氨基被CF3C(=O)或邻苯二甲酰胺基或FMOC保护的对称和不对称烃链（C2-C50）、以胺保护基团保护的(C1-C16)亚烷基胺、以叠氮基保护的(C1-C5)亚烷基胺；以乙炔基（C三键CH）保护的(C1-C5)亚烷基胺；
c）以DMT基或其它对酸不稳定基团保护的氰乙基磷酸酯-2-乙醇，以DMT基或其它酸不稳定基团保护的氰乙基磷酸酯-3-丙醇；
d）具有末端羟基的(C1-C50)亚烷基；
e）脂类，羧基，或肽；或
f）分枝的亚磷酰胺。
39.根据权利要求28所述方法制备的RNA分子，所述的RNA分子在HPLC，离子交换，或反相色谱纯化之后，纯度为97%或更高。
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