CN103068408A - 用于使液体培养基病毒灭活的装置 - Google Patents

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Abstract

一种能够使液体培养基病毒灭活的装置(100)，包括至少一个由外部圆柱体(120)和内部圆柱体(130)所构建的共轴圆柱体(110)、液体培养基入口(140)、至少一个C型紫外线辐射的发射器(145)、和液体培养基出口(150)。所述内部圆柱体具有适合在所述内部圆柱体的外径和所述外部圆柱体的内径之间形成间隙(160)的外径。所述培养基以基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动。所述至少一个C型紫外线辐射的发射器被置于所述内部圆柱体中。所述出口被连接至所述外部圆柱***于或接近所述外部圆柱体与入口相对的一端。

Description

用于使液体培养基病毒灭活的装置
相关申请
本申请要求2010年6月7日提交的美国临时申请号61/352,276的权益。上述申请的完整教学通过提述并入本文。
背景技术
为了防止用于治疗或非治疗目的的生物制药学应用中的病毒性污染物，贯穿生物医药制造过程所有阶段的病毒减少是由国际或国内监管机构建立的一项越来越严格的要求。已经采用了数种方法将来自生物制药学产品组合物的较大或较小、有包膜或无包膜的病毒颗粒灭活和/或移除。这类方法的例子包括过滤(例如，20nm过滤、Q膜层析、厚度过滤器技术(depth filtertechnology))，加热(例如，高温度短时间(HTST)的巴氏消毒法)，化学法(例如，加入溶剂–去污剂或化学剂)，或辐射(例如，紫外线或γ射线照射)。由于这些方法的低通量和/或高成本，其已经主要被用在生物医药制造过程中的下游。用现有方法对生物医药过程(在每天处理多达20,000L或更多的情况下)中输入的细胞培养基进行病毒灭活，就时间和成本而言会是令人望而却步的。一些方法诸如紫外线C(UVC)照射，在应用到生物医药制造过程中时是有挑战性的，因为不同于例如水处理中的，培养基(特别是含有血清的培养基)的过度暴露可能是有害的，并且因此需要将辐射剂量均一地投送到培养基并在相对窄的范围中进行控制。对培养基特别是含有血清的培养基进行紫外线照射的另外挑战是，培养基UVC范围中(例如，在254nm处)的UV透射率实质性低于例如水在该波长范围中的UV透射率。另外，理想的是在高通量生物医药制造中使用的装置含有能够进行清洁和灭菌处理(例如，实地清洁(CIP)和实地蒸汽(SIP)规程)的组件。因此，需要能够使低透射率液体培养基进行高通量病毒灭活以用于生物制药学和其它应用的方法和装置。
发明内容
本发明概括性涉及能够使液体培养基高通量病毒灭活的方法和装置。
在一个实施方案中，能够使高吸光度液体培养基病毒灭活的装置包括至少一个由外部圆柱体(具有长度、内径和外径的维度)和与该外部圆柱体共轴的内部圆柱体构建的共轴圆柱体。该装置进一步包括培养基入口、至少一个C型紫外线辐射的发射器、和培养基出口。内部圆柱体具有基本上等于外部圆柱体长度的长度和适合在内部圆柱体的外径和外部圆柱体的内径之间形成间隙的外径。细胞培养基以基本上气旋性的流动路径沿间隙流动。培养基入口被连接至外部圆柱体，位于或接近外部圆柱体的一端。该入口被配置为使培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿间隙流动。在内部圆柱体内至少放置一个C型紫外线辐射的发射器，从而向要用C型紫外线辐射处理的培养基发射C型紫外线辐射，并由此使培养基中的病毒灭活。出口被连接至外部圆柱体，位于或接近外部圆柱体与入口相对的一端。在一个进一步的实施方案中，所述要处理的培养基是细胞培养基。在另一个进一步的实施方案中，所述要处理的培养基含有血清。
在另一个实施方案中，一种使高吸光度液体培养基中病毒灭活的方法包括将该液体培养基引入至少一个共轴圆柱体中，所述共轴圆柱体包括沿着圆柱体长度在内部圆柱体的外径和外部圆柱体的内径之间的间隙。所述培养基经由入口引入，该入口被配置为使得液体培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿间隙流动。该方法进一步包括用置于内部圆柱体内的至少一个C型紫外线辐射的发射器照射培养基，从而向该液体培养基发射C型紫外线辐射以由此使得培养基中的病毒灭活。该方法然后包括使培养基流动经过连接至外部圆柱体接近外部圆柱体与入口相对一端的出口。在一个进一步的实施方案中，所述要处理的培养基是细胞培养基。在另一个进一步的实施方案中，所述要处理的培养基含有血清。
本发明具有许多优点，诸如使液体培养基高通量病毒灭活以用于生物制药学过程，以及能够按照清洁规程(例如，实地清洁(CIP)和实地蒸汽(SIP))处理。本发明装置的另一个优点是在配置中的灵活性，这使得它们能够适合于受限制或定制化的空间要求。
附图说明
前述内容从下列本发明实施例实施方案的更具体描述来看将是明显的，如在伴随的附图中例示的，其中相同的附图标记字符在所有不同视图中指示相同的部分。附图不必要按规定比例，因此重点被放在例示本发明的实施方案上。
图1A是依照本发明用于使液体培养基病毒灭活的装置的透视示意图，其包括一个共轴圆柱体。
图1B是图1A中显示的装置的入口和共轴圆柱体的横截面示意图。
图1C是图1A中显示的装置的入口和共轴圆柱体的侧视示意图。
图1D是用于使液体培养基病毒灭活的装置的透视示意图，所述装置具有切向的入口和出口，两者依照本发明都有矩形横截面和圆角。
图1E是依照本发明的气旋性流动路径的示意图。
图1F是依照本发明用于使液体培养基病毒灭活的装置特定实施例的示意图，所述装置包括两个共轴圆柱体和在每个共轴圆柱体周围的壳体(housing)。
图2是有多个C型紫外线辐射的发射器的共轴圆柱体的横截面示意图。
图3是沿着共轴圆柱体间隙内的静态混合元件的示意图。
图4是依照本发明用于使细胞培养基病毒灭活的装置的侧视示意图，其有两个垂直堆叠的共轴圆柱体。
图5A是依照本发明将2排共轴圆柱体堆叠在输入多支管和输出多支管之间的示意图。
图5B是依照本发明将4排共轴圆柱体堆叠在输入多支管和输出多支管之间的示意图。
图6是依照本发明将2排共轴圆柱体水平堆叠在输入多支管和输出多支管之间的示意图。
图7A是依照本发明将4个共轴圆柱体水平和垂直堆叠的示意图。
图7B是液体培养基流动经过图7A中显示的装置的示意图。
图8是依照本发明用于使细胞培养基病毒灭活的装置的平面视图示意图；W=清洗/冲洗阀，F=流动控制阀，D=剂量计。
图9是用于模型开发的工作流程的示意图。
图10是对于水、无血清细胞培养基和含血清(10%体积)细胞培养基，将254nm处的辐射强度作为离石英套管的径向距离的函数的图。
图11是实施例2中描述的装置的示意图。
图12是实施例2中描述的装置中气旋性流动路径的示意图。
图13是在实施例2(5mm间隙，3.8lpm(1gpm))和实施例3(3mm间隙，4.75lpm(1.25gpm)和9.5lpm(2.5gpm))中描述的装置中将频率(暴露的细胞培养基的%)作为无血清细胞培养基UV剂量的函数的图。
图14是在实施例2(5mm间隙，3.8lpm(1gpm))和实施例3(3mm间隙，4.75lpm(1.25gpm)和9.5lpm(2.5gpm))中描述的装置中将%颗粒(累积剂量)作为无血清细胞培养基UV剂量的函数的图。
图15是在实施例2(5mm间隙，1.9lpm(0.5gpm))和实施例3(3mm间隙，2.4lpm(0.631gpm)和3.8lpm(1gpm))中描述的装置中将频率(暴露的细胞培养基的%)作为含血清细胞培养基UV剂量的函数的图。
图16是在实施例2(5mm间隙，1.9lpm(0.5gpm))和实施例3(3mm间隙，2.4lpm(0.631gpm)和3.8lpm(1gpm))中描述的装置中将%颗粒(累积剂量)作为含血清细胞培养基UV剂量的函数的图。
图17是实施例4中描述的UVC处理设置的示意图。
图18A和18B是受控样品在归一化之前(图18A)和之后(图18B)的荧光分布图。
图19是从准直光束(collimated beam)校准实验获得的在各种均一剂量水平上的荧光分布图。
图20A和20B是对各种UV能流从水中的准直光束校准实验获得的荧光分布的均值图。
图21是以三种不同流动速率暴露于UVC反应器中UV光的样品的荧光分布图。
图22A、22B和22C是对βj、Γj,i和αi定义的图解示图。
图23是通过按表2中给定比例数学地混合校准样品获得的两种测试荧光分布图。
图24是对两种测试情况的实际和预测UV剂量分布的比较图。
图25A、25B和25C是将经过UVC反应器的细胞培养基中的UV剂量分布作为荧光分布的函数的图：对于图25A-1流动速率=2.75lpm，预测均值UV剂量=91mJ/cm2；对于图25A-2实验性均值UV剂量=82mJ/cm2；对于图25B-1流动速率=4.75lpm，预测均值UV剂量=53mJ/cm2；对于图25B-2实验性均值UV剂量=52mJ/cm2；对于图25C-1流动速率=7.6lpm，预测均值UV剂量=35mJ/cm2；对于图25C-2实验性均值UV剂量=50mJ/cm2。
图26A、26B和26C是将经过UVC反应器的有10%DBS的细胞培养基的UV剂量分布作为荧光分布的函数的图：对于图26A-1流动速率=2.2lpm，预测均值UV剂量=89mJ/cm2；图26A-2实验性均值UV剂量=47mJ/cm2；图26B-1流动速率=3.8lpm，预测均值UV剂量=53mJ/cm2；图26B-2实验性均值UV剂量=36mJ/cm2；图26C-1流动速率=6lpm，预测均值UV剂量=34mJ/cm2；图26C-2实验性均值UV剂量=28mJ/cm2。
图27是维生素C水溶液的UVC吸光度测量图。
图28A和28B是将经过UVC反应器的0.1g/L(吸光度为4.7个吸光度单位)维生素C溶液的UV剂量分布作为荧光分布的函数的图：对于图28A-1流动速率=2.2lpm，预测均值UV剂量=104mJ/cm2；对于图28A-2实验性均值UV剂量=81mJ/cm2；对于图28B-1流动速率=3.8lpm，预测均值UV剂量=61mJ/cm2；对于图28B-2实验性均值UV剂量=63mJ/cm2。
图29A、29B和29C是将经过UVC反应器的0.04g/L(吸光度为1.94个吸光度单位)维生素C溶液的UV剂量分布作为荧光分布的函数的图：对于图29A-1流动速率=2.75lpm，预测均值UV剂量=91mJ/cm2；对于图29A-2实验性均值UV剂量=81mJ/cm2；对于图29B-1流动速率=4.75lpm，预测均值UV剂量=53mJ/cm2；对于图29B-2实验性均值UV剂量=60mJ/cm2；对于图29C-1流动速率=7.6lpm，预测均值UV剂量=35mJ/cm2；对于图29C-2实验性均值UV剂量=47mJ/cm2。
发明详述
本发明概括性涉及液体的高通量处理。在一个具体方面，本发明针对能够使所述液体培养基高通量病毒灭活的方法和装置。如本文中使用的，液体培养基包括任何其中期望除去病毒性污染或防止潜在污染的液体或溶液，包括但不限于，缓冲液、可摄取流体、可注射溶液、生物学流体、血清、培养基、生物处理溶液、含有动物组分的溶液和用于人或供兽医学使用的治疗物。在一个实施方案中，生物处理溶液是细胞培养基、条件培养基、层析溶液(诸如冲洗或洗脱缓冲液)、或配制剂溶液。在一个实施方案中，所述液体培养基是细胞培养基(例如，含有血清的细胞培养基或无血清细胞培养基)。在另一个实施方案中，所述液体培养基是含有至少一种治疗性蛋白质诸如单克隆抗体、重组蛋白或酶的液体。
如本文中使用的，液体的“高通量”处理意味着以在下列范围内的流动速率处理：每分钟约0.5升(0.5lpm)和每分钟约50升之间，或每分钟约0.5升和每分钟约5升之间，或每分钟约5升和每分钟约10升之间，或每分钟约10升和每分钟约50升之间。在具体的实施方案中，高流动速率为约每分钟1升、或每分钟2升、或每分钟3升、或每分钟4升、或每分钟5升、或每分钟10升、或每分钟20升、或每分钟30升、或每分钟40升、或每分钟50升。
病毒包括有包膜病毒，诸如例如HIV、BIV、牛白血病、丙肝、乙肝、庚型肝炎、疱疹病毒、卡希谷病毒(Cache valley virus)、痘病毒、流感病毒、副流感病毒、α病毒、波纳病毒(Bornavirus)、水泡性口炎(Vesicular stomatitis)病毒、Voronavirus、PRRSV、LDHEV、BVDV、和黄病毒，以及无包膜病毒，诸如例如甲肝、戊肝、细小病毒(Parvovirus)、杯状病毒(Calicivirus)、Vesivirus、星状病毒、微小核糖核酸病毒、肠道病毒(Enterovirus)、鼻病毒、嵴病毒(Kobuvirus)、捷申病毒(Teschovirus)、环病毒、腺病毒、呼肠病毒(Reovirus)、和轮状病毒。在本发明的一个实施方案中，本发明的装置或方法用于使有包膜的病毒灭活。在本发明的另一个实施方案中，本发明的装置或方法能够使无包膜的病毒灭活。病毒灭活意味着本发明的装置和方法能够实现在病毒浓度上相比于未经处理的对照培养基中的病毒浓度至少2个对数级的降低(2logreduction)，优选地至少3个对数级的降低，更优选地至少4个对数级的降低，最优选地至少5个对数级的降低或更大程度的降低。本领域中的普通技术人员会领会的是，对病毒减少的测量可以基于本领域中的常用操作进行，诸如提供未经处理的对照，其已经掺有经测量量的已知病毒，并将此未经处理的对照与用本发明的装置或方法处理后所达到的水平进行比较。参见Wang,J.,Mauser,A.,Chao,S.-F.,Remington,K.,Treckmann,R.,Kaiser,K.,Pifat,D.和Hotta,J.,Virus inactivation and protein recovery in a novel ultraviolet-C reactor,Vox Sanguinis86:230-238(2004);Chevrefils,G.,Ing,B.,Caron,E.,Wright,H.,Sakamoto,G.,Payment,P.,Benoit,B.和Cairns,W.,UV Dose Required to AchieveIncremental Log Inactivation of Bacteria,Protozoa and Viruses,IUVA News8(1):38-45(2006)。
在一个实施方案中，显示在图1A中的，用于使液体诸如细胞培养基病毒灭活的装置100包括一个由外部圆柱体120(具有长度、内径、和外径的维度)和与该外部圆柱体共轴的内部圆柱体130所构建的共轴圆柱体110。外部圆柱体120和内部圆柱体130的长度可以根据用途而变化。没有限制地，在特定实施方案中，外部圆柱体120的长度的范围可以在约25cm和约100cm之间，或在约35cm和约90cm之间，或在约45cm和约80cm之间，或在约55cm和约70cm之间。所述装置进一步包括液体培养基入口140、至少一个在内部圆柱体130内的C型紫外线辐射的发射器145(在图1B中共轴圆柱体110的横截面中显示)、和液体培养基出口150。内部圆柱体130具有基本上等于外部圆柱体120长度的长度，并且如图1B中显示的，具有适合在内部圆柱体130的外径和外部圆柱体120的内径之间形成间隙160的外径120。间隙160的范围可以在约1mm和约5mm之间。在具体的方面，所述间隙为约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、或约5mm。所述液体培养基以如图1E中显示的基本上气旋性的流动路径沿间隙160的全部或大部分(substantialportion)流动。所述气旋性的流动路径可以包括沿间隙160垂直于共轴圆柱体110的轴的横截面平面中的次级漩涡流动。
所述间隙还可以任选地包括静态混合元件165，诸如挡板或导流片，如图3中显示的。如本文中描述的，液体可以以高通量流动经过间隙160。无限制地，在特定实施方案中，所述液体培养基沿间隙160的流动速率的范围可以在约0.5lpm和约50lpm之间，或在约5lpm和约40lpm之间，或在约10lpm和约30lpm之间。
返回到图1A，液体培养基入口140被连接到外部圆柱体120，优选地位于或接近外部圆柱体120的一端。入口140被配置为使得液体培养基以基本上气旋性的流动路径沿间隙160流动。如图1B中显示的，入口140被定位为使得沿入口140的中线170与外部圆柱体120的半径180(垂直于沿入口140的中线170)在位于或接近外部圆柱体120的外径的位置185处相交。在一个方面，入口140与外部圆柱体120和/或内部圆柱体130相切，如图1B中显示的。
入口140对外部圆柱体120的切向连接创造或增强了沿间隙160的气旋性流动。如本领域中技术人员会领会的，可以使用其它手段来增强或维持沿该间隙的气旋性流动。例如，增强气旋性流动的另一项特征在于使图1C中显示的入口140的连接和外部圆柱体120该端(即入口在外部圆柱体上所定位的那一端)之间的间隔最小化。图1F是装置100的特定实施例的示图，其包括两个共轴圆柱体110和在每个共轴圆柱体110周围的壳体105。壳体105包括在内部圆柱体120和外部圆柱体130之间的O形环状密封115。
沿入口140的中线170和外部圆柱体120的半径180形成径向角r，在图1B中显示为90°。径向角r的范围可以在约90°和约150°之间，或在约100°和约140°之间，或在约110°和约130°之间。
如图1C中显示的，平行于沿入口140的中线170的线和外部圆柱体120的轴190形成轴向角a，在图1C中显示为90°。轴向角a的范围可以在约30°和约90°之间，或在约40°和约80°之间，或在约50°和约70°之间。
入口140可以具有多种形状，诸如矩形、正方形、椭圆形或圆形横截面，如图1B中的插图中显示的。在图1D中也显示了具有矩形横截面的入口140。具有矩形或正方形横截面的入口140还可以包括圆角，如在图1D中对于矩形横截面显示的。
如图1B中显示的，在内部圆柱体130内放置至少一个C型紫外线辐射的发射器145，从而向要用C型紫外线辐射处理的液体培养基发射C型紫外线辐射，并由此使该液体培养基诸如细胞培养基中的病毒灭活。所述至少一个发射器145可以具有范围在约1.6cm和约2.54cm之间的直径。在具体的方面，所述至少一个发射器145可以具有1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm、2.0cm、2.1cm、2.2cm、2.3cm、2.4cm、2.5cm、和2.54cm的直径。在内部圆柱体130中可以放置多个放射器145。在具体的方面，在内部圆柱体130内可以放置1个发射器至8个发射器，诸如2个发射器、3个发射器、4个发射器、5个发射器、6个发射器、或7个发射器。如图2中显示的，在内部圆柱体130内均匀地分布着7个发射器145。所述至少一个C型紫外线(UVC)辐射的发射器145可以是，例如，低压UVC灯或中压UVC灯，两者都是商业可获的。参见例如，Heraeus Noblelight LLC,Duluth,GA的UV灯。所述至少一个发射器145发射波长范围在约200nm和约280nm之间(UVC范围或C型)，或在约210nm和约270nm之间，或在约220nm和约260nm之间，或在约220nm和约270nm之间，或在约245nm和约260nm之间的辐射。在一个方面，所述灯是单色(在UVC范围内)的，具有约254nm的波长。所述至少一个发射器145可以具有范围在约80W和约200W之间的灯功率。在具体方面，所述至少一个发射器145可以具有约80W、或约90W、或约100W、或约110W、或约120W、或约130W、或约140W、或约150W、或约160W、或约170W、或约180W、或约190W、或约200W的灯功率。
如本领域中普通技术人员会领会的，依照比尔-朗伯定律(Beer-Lambertlaw)UVC辐射的穿透性随着距离指数性下跌。如图10中显示的，无血清细胞培养基在254nm处的UVC透射率为约0.1%(UVC吸光度为约3个吸光度单位)，而含有10体积%血清的培养基在254nm处的UVC透射率为约0.001%(UVC吸光度为约5个吸光度单位)，如相比于水在254nm处为70%的UVC透射率(UVC吸光度为约0.15个吸光度单位)。无血清细胞培养基的典型UVC吸光度可以在约1.5和约2.5个吸光度单位之间的范围内。含有血清的细胞培养基的典型UVC吸光度根据血清浓度可以在约2.5和约5.5个吸光度单位之间的范围内。如本文中使用的，低透射率(即高吸光度)液体是在约254nm处具有范围在约1%和约1E-38%之间(UVC吸光度范围在约2个和约40个吸光度单位之间)的UVC透射率的液体，诸如在约254nm处的透射率范围在约1%和约1E-5%之间(UVC吸光度范围在约2和约7个吸光度单位之间)，或透射率范围在约1%和约1E-8%之间(UVC吸光度范围在约2和约10个吸光度单位之间)，或透射率范围在约1%和约1E-13%之间(UVC吸光度范围在约2和约15个吸光度单位之间)，或透射率范围在约1%和约1E-18%之间(UVC吸光度范围在约2和约20个吸光度单位之间)，或透射率范围在约1%和约1E-23%之间(UVC吸光度范围在约2和约25个吸光度单位之间)，或透射率范围在约1%和约1E-28%之间(UVC吸光度范围在约2和约30个吸光度单位之间)，或透射率范围在约1%和约1E-33%之间(UVC吸光度范围在约2和约35个吸光度单位之间)。
返回到图1A，出口150被连接到外部圆柱体120，优选地位于或接近外部圆柱体120与入口140相对的一端。出口150可以被配置为与入口140类似的配置来创建或维持液体培养基(诸如细胞培养基)在流出时的气旋性流动。这样的配置在本发明的装置包括多个共轴圆柱体时特别有用，诸如图4-7中显示的。
外部圆柱体120和内部圆柱体130可以由多种材料制成。在一个方面，外部圆柱体120由金属或适合生物制药加工的材料制成，诸如不锈钢，典型地为316L级。在另一个方面，内部圆柱体130由对UVC辐射基本上为透过性的材料制成，诸如含氟聚合物和/或石英。任选地，可以将内部圆柱体130和外部圆柱体120塑造成多种形状来促进液体的气旋性流动。例如，可以将内部圆柱体130(例如，由含氟聚合物制成)塑造成维持或增强液体的气旋性流动，而通过提供沿间隙160的形状或通过提供沿间隙160的静态混合元件、粗糙表面或脊，经由次级湍流漩涡(turbulent vortices)或涡流(eddies)增加径向混合。由含氟聚合物制成的内部圆柱体130还可以是一次性的，以易于装置100的维护。符合VI级规范并因此适合制药学应用的含氟聚合物材料的实例，包括但不限于，聚四氟乙烯(PTFE)、氟乙烯丙烯(FEP)、和全氟烷氧基化物(perfluoralkoxy)(PFA)。Saint-Gobain Performance Plastics,Akron,OH。
在具体的方面，所述装置包含两个或更多个共轴圆柱体。在这些实施方案中，所述装置包含每个共轴圆柱体之间的连接器。例如，参见图4，用于使液体(例如细胞培养基)病毒灭活的装置100包括在第一个共轴圆柱体110和第二共轴圆柱体110之间的连接器195。连接器195可以被配置为与本文中描述的入口140的那种类似的配置来创建或维持液体培养基在从第一个共轴圆柱体110流出时的气旋性流动。
如会被本领域中的普通技术人员领会的，装置100根据特定的用途(例如，要处理的液体的量和类型等)可以包含多个共轴圆柱体。如图5A和5B中显示的，这类实施方案可以进一步包括一个或多个多支管。在一个方面，装置100包含至少一个入口多支管115和至少一个出口多支管125，从而使多个共轴圆柱体110能够得以堆叠。可以将共轴圆柱体110如图4中显示的垂直堆叠，或如图6中显示的水平堆叠，或者如图7A中例示的按照垂直和水平堆叠的混合方式，并且在图7B中显示了相应的流动图。包含多个共轴圆柱体的装置的一个优点在于该装置配合受限空间或定制化空间要求的能力。在图5A、5B和图6中显示的堆叠排列可以包括额外的阀(未显示)以在多支管上关闭特定的共轴圆柱体110。
在一个实施方案中，共轴圆柱体110的堆叠使得该装置占据的空间(footprint)小于或等于约5英尺乘以5英尺乘以5英尺。在另一个实施方案中，共轴圆柱体110的堆叠使得该装置的体积小于或等于约125立方英尺。在另一个实施方案中，共轴圆柱体的堆叠(垂直、水平或混合方式的)使得该装置适合被放在现有制造或其它设备周围，而仍然提供要处理的液体培养基的高通量。调整到更高的流动速率可能牵涉并行连接许多单元。例如，在一个实施方案中，并行连接仅10个单元，其中在该实施例中每个单元包括2个有3mm间隙并以10lpm运行的共轴圆柱体，不考虑另外的入口拐弯损失，能够为无血清细胞培养基处理提供100lpm的流动速率，有每平方英寸2.5磅(psi)的压降。在一个实施方案中，装置100的额定压力小于或等于约50psi，从而能够在采用该装置下游压力的工业生产液流中使用该装置，诸如用于过滤(通常采用达到约30psi)。在另一个实施方案中，装置100的额定压力范围在约25psi和约50psi之间。以小于或等于5psi的来自流动的压降，对在100lpm的含血清细胞培养基的处理可以用并行的25个共轴圆柱体完成，其可以充裕地适应(fit comfortably)于5’x5’x5’的占用空间中，并且仍然具有范围在每小时约2500升和每小时约6000升之间的通量。在具体的实施方案中，通量的范围可以为每小时约2200升、每小时约2400升、每小时约2500升、每小时约2600升、每小时约2800升、每小时约3000升、每小时约3200升、每小时约3400升、每小时约3600升、每小时约3800升、每小时约4000升、每小时约4200升、每小时约4400升、每小时约4600升、每小时约4800升、每小时约5000升、每小时约5200升、每小时约5400升、每小时约5600升、每小时约5800升、或每小时约6000升。
如本领域中普通技术人员会领会的，所述装置可以进一步包含多种可选的组件。参见图8，在另一个实施方案中，用于使液体(例如细胞培养基)病毒灭活的装置200包括装置100以及任选地，用于将液体培养基(例如细胞培养基)泵送经过装置100的泵210。或者，可以使用来自液体容纳池215的初压来使液体培养基(例如细胞培养基)流动经过装置100。装置200可以进一步任选地包括监测器220(在图9中用D标记)，其指示液体培养基(例如细胞培养基)已经暴露于的辐射剂量，并且进一步任选地包括一个或多个关闭阀240。
辐射剂量可以在约5mJ/cm2和约100mJ/cm2之间的范围内，或约10mJ/cm2和约90mJ/cm2之间的范围内，或约20mJ/cm2和约80mJ/cm2之间的范围内，或约30mJ/cm2和约70mJ/cm2之间的范围内，或约40mJ/cm2和约60mJ/cm2之间的范围内。在一个方面，在无包膜病毒浓度上实现期望的至少4个对数级降低的最小辐射剂量是约20mJ/cm2。在另一个方面，在病毒浓度上实现期望的至少6个对数级降低的最小辐射剂量是约30mJ/cm2。在再一个方面，在病毒浓度上实现期望的至少15个对数级降低的最小辐射剂量(理论基础)是约50mJ/cm2。装置200可以进一步任选地包括液体培养基流动速率控制阀230(在图9中用F标记)，其可以调节和任选地在需要时关闭液体培养基的流动，如下文描述的。培养基流动速率可以在每分钟约0.5升和每分钟约50升之间的范围内。装置200还可以任选地在装置100上游包括关闭阀240以关闭培养基的流动，以及冲洗***250(在图9中用W标记)来冲洗掉已经过度暴露于辐射或于辐射暴露不足的液体培养基(例如细胞培养基)。当冲洗***250正在运行时，流动控制阀230被关闭，并且培养基经由装置100下游的关闭阀240被送到处置池或另一个容纳池。本领域中的技术人员会领会的是，装置200的可选元件可以以多种方式进行配置。
依据要处理的液体，本领域中的普通技术人员会领会的是，可以对间隙尺寸、共轴圆柱体长度、和液体流动速率进行调整来得到期望的病毒灭活处理。在一个特定的实施方案中，用3mm的间隙和与外部圆柱体相切的入口和连接器，以及两个串联的共轴圆柱体，无血清或含有血清的细胞培养基可以暴露于范围在约20和约30mJ/cm2之间的最小辐射剂量，细胞培养基有约90%暴露于小于约80至约100mJ/cm2的辐射剂量，辐射平均剂量的范围在约50和约60mJ/cm2之间，对于范围在每分钟约3升和约5升之间的流动速率，且对于具有范围在约2个和约5个吸光度单位之间的紫外线吸光度的细胞培养基，有1至2个共轴圆柱体，每个圆柱体包括一个灯。
该装置可以被用于多种目的，诸如用于任何高通量的液体处理，例如，在水或食品工业(例如对饮料的处理)中。在一个实施方案中，细胞培养基可以用本发明的方法和装置处理。
细胞培养基以及对其的补充物，是本领域中公知的。非常多种类的细胞培养基是可以从多家供应商商业可获的，诸如例如，Life Technologies,Inc.(Carlsbad,CA),Sigma-Aldrich(St.Louis,MO),Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA),Becton Dickinson&Co.(Franklin Lakes,NJ)。可获得用于原核生物细胞、真核生物细胞和古细菌细胞培养的细胞培养基。例如，可获得用于细菌、昆虫细胞、古细菌细胞、植物细胞、酵母、哺乳动物细胞、干细胞、神经元细胞和其它细胞类型的细胞培养基。细胞培养基可以包含每种都被化学限定的组分(诸如在化学限定的培养基中)，或者可以包括一种或多种被较少限定的组分，诸如来自植物、动物或无机物来源的提取物。如本领域中公知的，可以用一种或多种营养物补充细胞培养基，所述营养物诸如糖、盐、维生素、缓冲物、提取物、化学物或其它帮助细胞生长、培养物的产生或稳定的营养物。如本领域中还公知的，可以用血清补充细胞培养基。例如，在细胞培养中使用动物血清是公知的。例如，通常用于哺乳动物细胞培养的动物血清包括但不限于，供体牛血清(DBS)、胎牛血清(FBS)、或小牛血清。
在特定实施方案中，本发明的方法和装置被设计为向细胞培养基(有或无补充)投送能够杀死病毒的剂量的UVC剂量。在特定实施方案中，本发明的方法和装置被设计为向细胞培养基(有或无补充)投送能够减小传染剂(诸如病毒)存在风险的剂量的UVC剂量。
在一个具体方面，使细胞培养基中病毒灭活的方法包括将细胞培养基引入至少一个共轴圆柱体中，该共轴圆柱体包括沿着圆柱体长度在内部圆柱体的外径和外部圆柱体的内径之间的间隙。在另一个实施方案中，所述装置包括多个共轴圆柱体。在再一个实施方案中，所述装置包括共轴圆柱体的多支管。所述培养基经由入口引入，该入口被配置为使细胞培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿该间隙流动。该方法进一步包括用置于内部圆柱体内的至少一个C型紫外线辐射的发射器照射细胞培养基，从而向细胞培养基发射C型紫外线辐射以由此使细胞培养基中的病毒灭活。该方法然后包括使细胞培养基经由连接至外部圆柱***于或接近外部圆柱体与入口相对一端的细胞培养基出口流动。在一个实施方案中，所述细胞培养基含有范围在约2体积%和约12体积%之间的血清。在具体的方面，所述细胞培养基含有4体积%血清、6体积%血清、8体积%血清、或10体积%血清。在另一个实施方案中，所述细胞培养基是无血清的。在另外的其它实施方案中，所述细胞培养基是无动物衍生组分(无ADC)的，或在化学上是限定的。在另一个实施方案中，所述细胞培养基是意图用于分批补料的细胞培养基。
在另一个方面，所述使病毒灭活的方法可以在生物制药学工艺中的下游应用到包含至少一种治疗性蛋白质的液体培养基，所述治疗性蛋白质诸如单克隆抗体、酶、融合蛋白或重组蛋白。在特定实施方案中，所述液体培养基是层析液体，诸如含有清洗物、洗脱物或树脂的溶液。在其它实施方案中，所述液体培养基是治疗性蛋白质的配制或重建溶液。
实施例
实施例1–有5mm间隙的装置
图4中显示的装置100的设计采用了基于流体动力学和辐射建模基本原理的计算机模拟。在图9中显示了模型开发的工作流程。首先，构建该装置的详细3D几何学模型。装置100由两个UV处理室110组成，所述处理室在其核心含有被石英管包围的UV灯(管灯)，石英管将灯从液体侧分开。液体培养基沿着石英管和外部圆柱体壁之间的间隙流动。
使用计算流体动力学(CFD)作为解决这个用于使液体培养基病毒灭活的装置模型中的流动分布的工具。Fluent,Inc.,(Lebanon,NH)。CFD牵涉使用有限体积法在每个对照体积上(反应器几何学被离散到数百万个对照体积中)数值地求解基于基本原理的流动方程。S.V.Patankar,Numerical Heat Transferand Fluid Flow,Hemisphere,Washington,DC,1980。
该流动解法提供了关于预测流动模式的信息并且允许所预测的速度、压降、和湍流量的可视化。在该流动解法后，使用称为离散纵坐标(DO)模型的辐射模型来预测用计算机建模的装置中的辐射分布。在计算机模型中的每个对照体积上，DO模型说明入射辐射，并且在要处理的可能液体的吸光度基础上考虑吸收、内散射和外散射来计算离开该液体元件或对照体积的所得辐射。正如流动解法，在贯穿用计算机建模的装置的每个对照体积上进行该计算机分析，由此提供该装置中预测UV照射的分布。对于辐射模型的边界条件，壁表面被假定为是“发散的”，即将辐射向所有方向反射。
基于UV灯的瓦数和该灯的效率及表面积来计算入射辐射。典型的灯效率在约30%和约40%之间的范围内。此外，假定从灯表面到石英外部表面有10%的辐射损失，并且由此计算入射强度(Io)且在下列所有计算中将其假定为跨越石英管的全长均一分布的。
作为最终一步，从入口表面释放虚拟示踪颗粒(模拟的病毒颗粒、蛋白质颗粒、流体包(fluid packet))。基于流体对其施加的流体力学的力，对多达4000个颗粒经由共轴圆柱体110进行追踪。该颗粒足够小(假定大小为1μm)到使其随流动前行，并且提供了沿路混合和暴露于UV剂量的优良指示。
对每个颗粒，随着该颗粒继续其经由共轴圆柱体110到装置100的出口150的前行，累积记录UV剂量。UV剂量被计算为：
UVC剂量(J/m2)=入射辐射(W/m2)*暴露时间(秒)(1)
等式1的结果是基于被追踪颗粒数量的UV剂量分布，其被用作统计学方法来测定对于指定的流动速率、培养基吸光度和共轴圆柱体110几何学设计的平均剂量、方差和最小剂量。
所有计算机模拟都使用HP xw8600-Intel Xeon x5450工作站(运行Windows XP x64)上的商业CFD软件–ANSYS FLUENTTM版本6.3.26实施。该分析使用了确立的建模实践诸如高分辨率有限体积网格(超过1x106个对照体积)、二阶数值离散来达到增高的准确度，并且实现了残差的深度收敛(1x10-4)。
在实施例2和3中，描述了来自实施例1的计算机建模预测结果。如本领域中技术人员会领会的，拉格朗日光能测定学(Lagrangian actinometry)是一种使用荧光微球来确认由计算机建模预测的UV剂量分布的方法。Anderson,W.A.,Zhang,L.,Andrews,S.A.,Bolton,J.R.A technique for directmeasurement of UV fluence distribution,Proceedings of the Water QualityTechnology Conference;American Water Works Association:Philadelphia,PA,2003。在这个方法中，从装置上游释放荧光颗粒，并且该颗粒在被UV光照射时经历化学反应。在装置流出处，用流式细胞术分析这些颗粒对应于UV剂量暴露分布的荧光程度，由此对本文中描述的数学模型提供确认。
实施例2–有切向入口和连接器的5mm间隙
在图11中显示的设计重复采用5mm的间隙、切向入口140、和切向连接器195来消除静点(dead spot)并增强混合。切向的入口和连接器创建了产生更好混合的气旋性流动路径，由此潜在地缩窄UV剂量分布。图12中显示的预测流动分布显示了气旋性流动路径，尽管鉴于管的长度，流动中最初较紧的漩涡最终试图拉直。在图13中显示了该设计的预测UV剂量分布，标记为“5mm”。在图14中显示的预测累积分布结果提供了方差的直接指示，因为累积分布斜率中的变化是方差的直接指示。该设计的方差为31.7%左右。
实施例3–有切向入口和连接器的3mm间隙
该设计除了切向的入口140和切向的连接器195外，还牵涉3mm而非5mm的流体间隙160。在图13和14中显示了来自该设计的预测结果，标记为“3mm”。对无血清培养基的预测方差显示预测基本上降到了21.26%，这提供了非常窄的UV剂量分布。在图14中显示的有较陡斜率的预测累积分布预测了对该设计改进特征的强指示。例如，对于无血清细胞培养基每分钟2.5加仑(2.5gpm或9.5lpm)的流动速率，平均剂量为57.8mJ/cm2(毫焦每平方厘米)，伴随着30mJ/cm2的最小剂量。如图14中显示的，90%的无血清细胞培养基会暴露于75mJ/cm2的最大剂量，且100%的无血清细胞培养基会暴露于小于100mJ/cm2的剂量。
对于含有血清的(10体积%)细胞培养基，在图15和16中显示的，预测是类似的，有着更窄的UV剂量分布。具体而言，对于含有血清的细胞培养基，分布预测了长拖尾，同时最小剂量通常保持在20mJ/cm2以下。凭借用于3mm流体间隙和切向入口的设计，剂量分布被预测为基本上缩窄的，最小剂量为30mJ/cm2，并且如图16中显示的，90%的含血清细胞培养基对于1gpm(3.8lpm)的流动速率得到小于85mJ/cm2的照射量，平均剂量为58mJ/cm2。
据预测，有3mm液体间隙和切向入口和连接器的装置会对无血清细胞培养基和含血清细胞培养基两者都提供充分窄的UVC剂量分布。在具有并行配置的该单元中的压降被预测为即使对于高流动速率也完全在5psi的限制内。
在100lpm的较高流动速率预测的压降为2.5psi，而对较低流动速率的预测压降提供了小于2.5psi的预测压降。通过按需要减少串联共轴圆柱体的数量(例如从2个到1个)，可以调整该设计规模以如期望的实现较低的压降。在另一个方面，通过将间隙减少到1mm并采用以每分钟0.5升运行的多个单元，还可以调整该设计规模来实现对有低得多的透射率(吸光度为约40个吸光度单位)的浓缩分批补料培养基的处理。
实施例4–有3mm间隙和切向的入口、连接器以及出口的UVC处理装置
建立并测试了UVC反应器的一种实验室规模原型，其能够处理在高流动速率的高吸光度流体诸如细胞培养基以确保病毒灭活但又不超过可能导致培养基降解的高剂量。该测试方法基于由Bohrerova等开发的用于通过荧光微球的使用来进行的UV反应器证实的方法。参见Bohrerova,Z.,Bohrer,G.,Mohanraj,S.M,Ducoste,J.和Linden,K.G.,Experimental measurements ofFluence distribution in a UV reactor using Fluorescent microspheres,Environ.Sci.Technol.39:第8925页–第8930页(2005)。在该方法中，经由微球的荧光与UV能流值的相关性获得了UV剂量暴露的分布。
材料和方法
对UVC暴露(254nm)敏感的荧光微球自PolyMicrospheres,Division ofVasmo,Inc.,Indianapolis,IN获得，其处在固体占1%重量(等于约4.44x109个颗粒/mL)的10mL溶液中。它们具有的均值直径为约1.6μm。这些微球在暴露于和UV能流成比例的UVC辐射时经历光漂白。这种依赖性使得这些微球能够在UV剂量分布的测量中被利用。
对培养基中荧光微球的UVC处理
培养基准备
实验前两天，从冷室中取出细胞培养基(UVC吸光度为约1.95个吸光度单位)和含有10%供体牛血清(DBS)的细胞培养基(UVC吸光度为约5.3个吸光度单位)并允许在室温平衡。为了准备掺加微球的溶液，将500mL细胞培养基溶液和2mL微球溶液混合，达到约1.8x107微球/mL的浓度。将该掺混溶液的瓶用铝箔覆盖以防止实验前的暴露。
UVC原型测试
基于图4中显示的设计，用3mm的液体间隙和长度为约30”(76cm)的内部和外部圆柱体建立了UVC原型。该设计由两个处理室(每个室1个灯)组成，有切向的入口和出口以及切向的连接器来维持和重建进入该室的漩涡气旋性流动。所述灯为254nm处的低压单色灯，具有85W的额定瓦数。但是，额定UVC效率仅为约32.9%。灯长为约29”(73.5cm)。基于石英表面积并考虑损失，估计石英表面的辐射通量为约400W/m2。
如按照图17中显示的示意图设置UVC反应器。在连接培养基袋前，用去离子水冲洗该***。
为了达到40、58和100mJ/cm2的靶均值UV能流，基于前面CFD预测的外推估计必需流动速率，如表1中显示的。在培养基进入UVC反应器前，将稀释微球溶液掺入流以达到约1x105微球/mL的浓度。这些流动速率也汇总在表1中。
UVC反应器具有约650mL的体积。为了实现连贯的微球出口浓度，一旦开始掺加微球，就靶向99%的冲失(washout)。表1包括对每个流动速率所计算的冲失次数。假定充分混合的反应器来计算冲失次数。
表1：为实现靶UV能流所计算的体积性流动速率、掺加微球的流动速率和用于浓度平衡的冲失次数
Figure BDA00002831430400181
对于所有细胞培养基的运行，将流动指向废液池直到已经达到适当的冲失次数，如按表1的。然后将流动重新指向被照射的培养基瓶达3分钟，每分钟都换瓶。在每次运行之间用去离子水冲洗***。
将两个UV灯都关闭来进行用于每种培养基类型的对照运行，其使用和用于100mJ/cm2的靶能流相同的泵设置。
对于细胞培养基的处理，将两个UV灯中的一个断开。对于处理含DBS的培养基，两个灯都被使用来实现靶剂量。在用去离子水流经UVC单元进行处理以防止过热前，将灯打开达10分钟。按表1运行流动速率。
采样
在每次处理运行后，从每个流出物瓶倒出1L到一个1L圆瓶中，并将剩余物丢弃。将圆瓶用铝箔覆盖以防止微球进一步暴露，并存储在冷室中。
在采样日1，从每个细胞培养基流出物瓶取3份200μL样品到96孔板中用于流式细胞术(FC)分析。还纳入每种未经处理的培养基(无微球)的一个样品以用于比较目的。
采样日2发生在第1天的4天后且包括两张96孔板。还纳入来自每种掺混溶液的样品，以及来自第1天测试的每个流出物瓶的单一样品。板2包括来自每个细胞培养基流出物瓶的单一样品。
桌面规模校准
为了测定UV能流和荧光之间的函数关系，桌面规模校准实验使用了近准直光束装置和微球水溶液以用于范围从10–120mJ/cm2的均一剂量。样品以随机化次序一式三份地运行，并从储备溶液中取出。
在样品照射前测定储备微球溶液的Petri因子和UV透射率。参见Bolton,J.R.和Linden,K.G.,Standardization of Methods for Fluence(UV Dose)Determination in Bench-Scale UV Experiments,J.Environ.Eng.,129(3),209(2003)。在样品暴露之前和之后立即进行辐照度测量。使用微磁性搅拌棒在60x15mm培养皿中混合样品，总体积为0.32mL。
流式细胞术
使用装备有4个激光器的BDTM Biosciences特殊定制流式细胞器LSR II来检测微球中的荧光变化。BD Biosciences,San Jose,CA。将488nm的蓝激光器和351nm的UV激光器用于激发微球。用蓝激光器检测散射光，并使用带通滤光器407/30nm用UV激光器收集微球的发射荧光的光。使用BDTMBiosciences DiVaTM软件和/或FlowJoTM(Tree Star,Inc.,Ashland OR)数据分析软件对数据进行处理和分析并且还输出到MATLAB用于进一步的处理和分析。
UVC剂量的CFD预测
利用上述CFD技术以实际实验性流动速率实施新的计算，并假定来自石英表面的入射辐射通量为约400W/m2以获得预测的UVC剂量。还对吸光度为约4.7个吸光度单位的维生素C模型溶液进行CFD计算(如下文进一步描述的)以与实验性数据比较。
数据分析
预处理
将从流式细胞术获得的原始数据归一化以说明荧光测量日与日间的变异。选择各对照样品(0mJ/cm2UV剂量)的荧光分布均值作为归一化因子。图18A和18B显示了水和细胞培养基在归一化之前(图18A)和之后(图18B)的荧光分布。
将荧光分布转换为UV剂量分布
从校准实验获得的样品荧光测量显示了以单一UV剂量照射的微球群的荧光分布。图19显示了以各种UV剂量水平照射的样品的荧光分布。不希望受任何具体理论束缚的，荧光水平中这种变化可能归因于微球群中的内在异质性以及流式细胞术设备的属性。
如图20A和20B中显示的，基于文献和科学预测，将每个UV剂量的水校准数据的均值荧光用线性拟合进行关联。拟合中的曲度(curvature)主要位于0–20mJ/cm2之间的低剂量。用图20A和20B中显示的预测拟合，以约12mJ/cm2的RMSE，较低剂量的结果会是被过度预测的而较高剂量的结果会是预测不足的。
校准数据在水中获得，因为准直光束实验需要对颗粒的均一剂量。在将校准曲线应用到细胞培养基或模型溶液诸如维生素C溶液中时，基于细胞培养基对照(UV剂量=0)中的微球荧光读数相对于来自水对照(UV剂量=0)的相应荧光读数，将荧光数据规模进行调整，来说明用水收集但应用到细胞培养基的校准数据。
在图21中显示了从UVC反应器对各种流动速率的细胞培养基获得的样品的典型荧光测量。该数据分析方法的目的是，在给定来自流式细胞术测量的荧光分布的情况下，估算由UVC反应器递送的剂量分布。使用由Blatchley等,Dyed microspheres for quantification of UV dose distributions:photochemicalreactor characterization by Lagrangian actinometry,J.Env.Eng.132:1390-1403.(2006)开发的方法实施该估算。这些作者在第1396页提出了一项假设：
含有已经经过剂量分布的微球的样品中[荧光]分布可归因于：
1.UV剂量分布;
2.与流式细胞术有关的测量错误；和
3.染色微球中的群体异质性。
另外，假定这些错误来源是独立的，而且因此它们的影响是加合性的。
以数学术语地，假设从连续流动UV反应器收集的样品中测量的[荧光]分布可以被描述为可归因于每一种单独的剂量和剂量分布的[荧光]分布的卷积(convolution)。
遵循Blatchley等的数学方程
在对来自实施例4的数据进行分析的过程中使用了下列定义，并且在图22A、22B、和22C中进行了图解例示。
i=用于计算剂量(D)增量的指数(箱宽=5mJ/cm2；i=1,2,..m)
j=用于建立荧光(Fl)增量的指数(箱宽=0.02；j=1,2,..n)
αi=样品中接受剂量Di的颗粒的分数
βj=样品中发射荧光Flj的颗粒的分数
Γj,i=接受发射荧光Flj的剂量Di的颗粒的分数
数学上地，该假设可以由下列方程代表
β j = α 0 Γ j , 0 + α 1 Γ j , 1 + . . . + α m Γ j , m = Σ i = 0 m α i Γ j , i - - - ( 2 )
该方程规定βj(发射Flj的颗粒的分数)由于暴露于从α0到αm的各种UV剂量，是发射Flj的分数的线性组合。方程2当代入j的各种值时，形成一组可以以如下矢量形式代表的线性方程-
β 0 β 1 . . . . β n = Γ 0,0 Γ 0,1 . . . . Γ 0 , m Γ 1,0 Γ 1,1 . . . . Γ 1 , m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Γ n , 0 Γ n , 1 . . . . Γ n , m × α 0 α 1 . . . . α m - - - ( 3 )
[β]=[Γ]×[α]    (4)
去卷积的目的是获得对由矢量[α]代表的剂量分布的估计。对于每种运行条件，矢量[β]是对来自UVC反应器样品进行流式细胞术分析的荧光分布(直方图)。
求解Blatchley等方程的办法
通过将使用Weibull分布的内插算法应用到在校准实验过程中暴露于均一UV剂量的样品的流式细胞术分析数据来计算矩阵[Γ]。
为了求解该方程***，还基于UVC剂量分布的期望形状，假定UV剂量分布(αi值)遵循log正态分布。
以迭代方式如下求解方程4：
1)假定log正态分布的两个参数，均值μ和标准差σ，生成对UV剂量分布[α]g的起始推测。
2)使用方程4对给定[α]g计算荧光分布[β]g。
3)将计算的[β]g值和实验获得的[β]值进行比较。总误差被计算为 Σ j = 0 n ( β jg - β j ) 2 . 4)将[α]g的均值和标准差值优化以使总误差最小化。重复步骤1-3直到误差小于限差标准(tolerance criteria)。
使用MATLAB代码(MathWorks,Natick,MA)执行步骤1-4。
数据分析技术的验证
使用数学卷积实验来验证在前面部分中描述的数据分析技术。从对校准样品的荧光测量数学地构建测试UV分布。将对校准样品的荧光分布测量以预先确定的比例数学地混合来生成新卷积的荧光分布。通过以表2中显示的比例混合校准样品而生成两种测试分布。在图23中显示了所得荧光分布。
表2.用于两种测试分布的混合比例
UV剂量 测试分布1 测试分布2
mJ/cm2 乘数 乘数
0 0 0
10 0 0
20 0 1
30 1 3
40 4 4
60 10 6
80 4 3
100 1 2
120 0 1
在前面部分中描述的数学技术被用于从图23中显示的荧光分布计算UV剂量分布。结果显示在图24中。将对应于表2中所列混合比例的实际UV剂量分布和预测UV剂量分布绘在同一张图上。在实际值和预测值之间观察到非常好的一致性。图24确认了在该项工作中使用的数学技术能够从荧光分布数据预测UV剂量分布。
结果
在图25A、25B和25C中显示了从F1分布数据估算的经过该装置的细胞培养基的UV剂量分布。对于每种流动速率的图显示了从三个不同瓶中收集的样品获得的三种不同曲线，其代表了该过程中不同的时间点。瓶与瓶之间的最小变化指示对UVC反应器的稳定运行。还在同一张图上绘出了由CFD模拟预测的UV剂量分布。使用对准确实验性条件的CFD计算来与实验结果进行比较。
在每分钟7.6升(LPM)的高流动速率，据信在实验过程中对于维持均一的流动存在泵送问题，并且因此第三份样品未接受足够的微球用于流式细胞术分析，如图25C-1中显示的。该结果在高流动速率也是被过度预测的，这与图20A和20B中显示的拟合质量是一致的。
从Fl分布数据估算经过该装置的含10%DBS细胞培养基的UV剂量分布，并与模型(CFD)进行比较，如图26A、26B和26C中显示的。在期望UV剂量分布的预测下，对含血清培养基的观察包括均值数值在内是一致的。
由于不期望流动和UVC辐射的物理性质在研究的流动速率和吸光度范围内变化，所有的实验性UV均值剂量一致低于预测的观察结果可能是由于微球和10%DBS培养基中血清组分的相互作用，其导致屏蔽效应并使结果混杂。使用具有类似于10%DBS细胞培养基吸光度的模型溶液来解决这种结果中的可能偏差。维生素C水溶液被鉴定为这类模型溶液的一种可能候选物。使用UV分光光度计(Agilent8453)测量254nm处的吸光度来对三个不同浓度的维生素C(抗坏血酸)溶液进行测试。如图27中显示的结果确认了维生素C溶液可以被用作模型流体来模拟10%DBS细胞培养基的吸光度，而维持着类水的粘度和密度。
使用10g/L维生素C溶液的储备溶液制备0.1g/L维生素C溶液，其具有约4.7个吸光度单位的吸光度。在用UV照射实验之前和之后测量吸光度值以确认溶液的吸光度并没有由于UV暴露而改变。对模型溶液采用的实验性规程等同于进行细胞培养物照射实验所采用的。
将0.1g/L维生素C溶液的结果和对4.7的吸光度值得到的CFD预测进行比较，并显示在图28A和28B中。对于维生素C模型溶液，模型结果和实验结果很好地吻合，从而确认了该装置即使对高吸光度液体诸如含有血清的细胞培养基也很好地发挥功能。
还用维生素C溶液重复实验来模拟无血清细胞培养基(吸光度为1.95个吸光度单位)。浓度为0.04g/L的维生素C溶液提供了1.94个吸光度单位的UVC吸光度，并且这通过在UV处理前对溶液采样得到确认。还取得经照射溶液的样品用于UVC吸光度测量，以确认溶液的吸光度不因照射而改变。对模型溶液采用的实验性规程等同于进行细胞培养物照射实验所采用的。将0.04g/L维生素C溶液的结果和CFD预测进行比较，并显示在图29A、29B和29C中。
如通过图25A、25B和25C与图29A、29B和29C的比较所证明的，维生素C模型溶液产生了类似于无血清细胞培养基的结果，从而提供了对用维生素C作为模型溶液的办法的确认。观察到的变异性在实验变异性和用水校准数据拟合质量，以及用于将水校准数据集延伸到高吸光度流体(诸如细胞培养基)所使用的近似值的范围之内。
结论
对基于图4中显示的设计建立的实验室规模原型，使用荧光微球进行了测试来测量对细胞培养基的UVC剂量分布。该单元具有有切向入口、出口还有切向连接器的3mm流动间隙用于2个处理室。结果显示，实验测量的UV剂量分布和CFD模型预测密切匹配。含血清细胞培养基的结果对剂量预测不足，这可能是由于血清组分和荧光微球的相互作用使结果变得混杂。用维生素C水溶液作为模型流体重复实验用于含有血清的细胞培养基，因为这提供了类似高的吸光度值。该结果显示和CFD预测的很好的一致性，证明该原型能够投送使高吸光度液体病毒灭活的UV剂量。通过创建维生素C溶液用于无血清细胞培养基，验证了用维生素C的模型流体为有效的办法，并且确认了结果和预测有很好的一致性。
总之，证明了本发明的装置，如由UVC原型单元例示的，对于高吸光度流体诸如有或无血清的细胞培养基能够产生如预测的窄UVC剂量分布。因此，本发明的装置投送杀死多种病毒所需要的UVC剂量。
本文中引用的所有专利、公开申请和引用的相关教学通过提述完整并入。
尽管本发明已经具体示出，并且参考本发明的实施例实施方案进行了描述，但是本领域技术人员会理解在不背离所附权利要求所涵盖的发明范围的情况下，可以对本发明进行形式和细节上的各种变化。

Claims (86)

1.一种能够使细胞培养基病毒灭活的装置，其包含：
a)至少一个共轴圆柱体，其包含：
i)具有长度、内径和外径的外部圆柱体；
ii)与所述外部圆柱体共轴的内部圆柱体，其具有与所述外部圆柱体的所述长度基本上相等的长度，并且具有适合在所述内部圆柱体的外径和所述外部圆柱体的所述内径之间形成间隙的外径，所述细胞培养基经由所述间隙以基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
b)连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体的一端，且被配置为使所述细胞培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动的细胞培养基入口；
c)至少一个置于所述内部圆柱体内的C型紫外线辐射的发射器，从而向要用C型紫外线辐射处理的所述细胞培养基发射C型紫外线辐射，并由此使所述细胞培养基中的病毒灭活；和
d)连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体与所述入口相对一端的细胞培养基出口。
2.权利要求1的装置，其中所述细胞培养基沿着所述间隙以范围在每分钟约0.5升和每分钟约50升之间的流动速率流动。
3.权利要求1的装置，其中所述病毒是有包膜病毒、无包膜病毒、或其组合。
4.权利要求1的装置，其中所述装置能够在病毒浓度上相比于未经处理的对照培养基中的病毒浓度实现至少4个对数级的降低。
5.权利要求4的装置，其中所述装置能够在病毒浓度上相比于未经处理的对照培养基中的病毒浓度实现至少5个对数级的降低。
6.权利要求1的装置，其中所述入口具有矩形横截面。
7.权利要求1的装置，其中所述入口被定位为使得沿所述入口的中线和垂直于所述沿入口的中线的所述外部圆柱体的半径相交于接近所述外部圆柱体外径的位置，并且平行于所述沿入口中线的线与所述外部圆柱体的轴形成轴向角并与所述外部圆柱体的半径形成径向角。
8.权利要求7的装置，其中所述入口和所述外部圆柱体相切。
9.权利要求7的装置，其中所述轴向角的范围在约30度和约90度之间。
10.权利要求9的装置，其中所述轴向角为约90度。
11.权利要求7的装置，其中所述径向角的范围在约90度和约150度之间。
12.权利要求11的装置，其中所述径向角为约90度。
13.权利要求1的装置，其中所述辐射剂量的范围在约5mJ/cm2和约100mJ/cm2之间。
14.权利要求1的装置，其中所述至少一个C型紫外线辐射的发射器发射波长范围在约240nm和约260nm之间的辐射。
15.权利要求14的装置，其中所述至少一个C型紫外线辐射的发射器发射波长为约254nm的辐射。
16.权利要求1的装置，其中所述细胞培养基包含无血清的细胞培养基。
17.权利要求1的装置，其中所述细胞培养基包含含有血清的细胞培养基。
18.权利要求1的装置，其中所述内部圆柱体由选自下组的材料制成：含氟聚合物和石英。
19.权利要求1的装置，其中所述间隙包括静态混合元件。
20.权利要求1的装置，其中所述间隙的范围在约1mm和约5mm之间。
21.权利要求20的装置，其中所述间隙为约3mm。
22.权利要求21的装置，其中所述入口与所述外部圆柱体相切。
23.权利要求1的装置，其中所述细胞培养基出口被配置为在流出时创造或维持所述细胞培养基的气旋性流动。
24.权利要求1的装置，进一步包括输入多支管和输出多支管，和至少两个共轴圆柱体。
25.权利要求1的装置，进一步包括至少一个连接器，所述连接器连接至至少第二共轴圆柱体，所述连接器被配置为创造或维持所述细胞培养基沿着所述第二共轴圆柱体的基本上气旋性的流动路径的气旋性流动。
26.权利要求25的装置，其中所述连接器包括静态混合器元件。
27.权利要求1的装置，其中所述外部圆柱体和所述内部圆柱体的长度的范围在约25cm和约100cm之间。
28.权利要求1的装置，其中所述C型紫外线辐射的发射器的数量范围在1个发射器和8个发射器之间。
29.权利要求1的装置，其中所述间隙包括导流片。
30.权利要求1的装置，进一步包括指示所述细胞培养基已经暴露于的辐射剂量的监测器。
31.权利要求30的装置，进一步包括关闭阀以关闭所述细胞培养基的流动。
32.权利要求31的装置，进一步包括冲洗***以冲洗掉已经过度暴露于辐射或于辐射暴露不足的细胞培养基。
33.权利要求1的装置，进一步包括泵。
34.权利要求1的装置，其中所述细胞培养基的流动速率的范围在每分钟约0.5升和每分钟约50升之间。
35.权利要求1的装置，其中所述装置额定压力小于或等于约50psi。
36.权利要求1的装置，其中所述装置的占用空间(footprint)为小于或等于约5英尺乘以5英尺乘以5英尺。
37.权利要求1的装置，其中所述装置的体积为小于或等于约125立方英尺。
38.一种能够使细胞培养基病毒灭活的装置，其包含：
a)至少一个共轴圆柱体，其包含：
i)具有长度、内径和外径的外部圆柱体；
ii)与所述外部圆柱体共轴的内部圆柱体，其具有和所述外部圆柱体的所述长度基本上相等的长度，并且具有适合在所述内部圆柱体的外径和所述外部圆柱体的所述内径之间形成约3mm间隙的外径，所述细胞培养基经由所述间隙以基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
b)连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体一端并且与所述外部圆柱体相切，从而使所述细胞培养基沿着所述基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动的细胞培养基入口；
c)至少一个置于所述内部圆柱体内的C型紫外线辐射的发射器，从而向要用C型紫外线辐射处理的所述细胞培养基发射C型紫外线辐射，并由此使所述细胞培养基中的病毒灭活；和
d)连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体与所述入口相对一端的细胞培养基出口，
所述细胞培养基暴露于范围在约20和约30mJ/cm2之间的最小辐射剂量，有约90%的细胞培养基暴露于小于约80至约100mJ/cm2的辐射剂量，辐射平均剂量的范围在约50和约60mJ/cm2之间，对于范围在每分钟约3升和约5升之间的流动速率，且对于具有范围在约2个和约5个吸光度单位之间的紫外线吸光度的细胞培养基，有1至2个共轴圆柱体，每个圆柱体包括1个灯。
39.一种能够使高吸光度液体培养基病毒灭活的装置，其包含：
a)至少一个共轴圆柱体，其包含：
i)具有长度、内径和外径的外部圆柱体；
ii)和所述外部圆柱体共轴的内部圆柱体，其具有和所述外部圆柱体的所述长度基本上相等的长度，并且具有适合在所述内部圆柱体的所述外径和所述外部圆柱体的所述内径之间形成间隙的外径，所述液体培养基经由所述间隙以基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
b)连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体的一端，与所述外部圆柱体呈一定角度，且被配置为使所述液体培养基沿着所述基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动的液体培养基入口；
c)至少一个置于所述内部圆柱体内的C型紫外线辐射的发射器，从而向要用C型紫外线辐射处理的所述液体培养基发射C型紫外线辐射，并由此使所述液体培养基中的病毒灭活；和
d)连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体与所述入口相对一端的液体培养基出口。
40.权利要求39的装置，其中所述液体培养基包含治疗性蛋白质。
41.权利要求40的装置，其中所述治疗性蛋白质是单克隆抗体。
42.权利要求40的装置，其中所述治疗性蛋白质是重组蛋白。
43.权利要求40的装置，其中所述治疗性蛋白质是酶。
44.一种使细胞培养基中病毒灭活的方法，包括：
a)将所述细胞培养基经由入口引入至少一个共轴圆柱体中，所述共轴圆柱体包含外部圆柱体和内部圆柱体，所述外部圆柱体具有长度、内径和外径，所述内部圆柱体具有被配置为在所述内部圆柱体的外径和所述外部圆柱体的内径之间形成间隙的外径和基本上等于所述外部圆柱体所述长度的长度，所述入口被连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体的一端并且被配置为使得所述细胞培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
b)使得所述细胞培养基经由所述间隙以所述基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
c)用至少一个置于所述内部圆柱体内的C型紫外线辐射的发射器照射所述细胞培养基，从而向所述细胞培养基发射C型紫外线辐射以由此使所述细胞培养基中的病毒灭活；并
d)使所述细胞培养基流动通过连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体与入口相对一端的细胞培养基出口。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞培养基以范围在每分钟约0.5升和每分钟约50升之间的流动速率流动。
46.权利要求44的方法，其中所述病毒为有包膜病毒、无包膜病毒、或其组合。
47.权利要求44的方法，其中所述灭活致使在病毒浓度上相比于未经处理的对照培养基中的病毒浓度至少4个对数级的降低。
48.权利要求47的方法，其中所述灭活致使在病毒浓度上相比于未经处理的对照培养基中的病毒浓度至少5个对数级的降低。
49.权利要求44的方法，其中所述入口具有矩形横截面。
50.权利要求44的方法，其中所述入口被定位为使得沿所述入口的中线和垂直于所述沿入口的中线的所述外部圆柱体的半径相交于接近所述外部圆柱体的外径的位置，并且平行于所述沿入口中线的线与所述外部圆柱体的轴形成轴向角并与所述外部圆柱体的半径形成径向角。
51.权利要求50的方法，其中所述入口与所述外部圆柱体相切。
52.权利要求50的方法，其中所述轴向角的范围在约30度和约90度之间。
53.权利要求52的方法，其中所述轴向角为约90度。
54.权利要求50的方法，其中所述径向角的范围在约90度和约150度之间。
55.权利要求54的方法，其中所述径向角为约90度。
56.权利要求44的方法，其中所述辐射剂量的范围在约5mJ/cm2和约100mJ/cm2之间。
57.权利要求44的方法，其中所述至少一个C型紫外线辐射的发射器发射波长范围在约240nm和约260nm之间的辐射。
58.权利要求57的方法，其中所述至少一个C型紫外线辐射的发射器发射波长为约254nm的辐射。
59.权利要求44的方法，其中所述细胞培养基包含无血清细胞培养基。
60.权利要求44的方法，其中所述细胞培养基包含含有血清的细胞培养基。
61.权利要求44的方法，其中所述内部圆柱体由选自下组的材料制成：含氟聚合物和石英。
62.权利要求44的方法，其中所述间隙包括静态混合元件。
63.权利要求44的方法，其中所述间隙的范围在约1mm和约5mm之间。
64.权利要求63的方法，其中所述间隙为约3mm。
65.权利要求64的方法，其中所述入口与所述外部圆柱体相切。
66.权利要求44的方法，其中所述细胞培养基出口被配置为在流出时创建或维持所述细胞培养基的所述气旋性流动。
67.权利要求44的方法，进一步包括输入多支管和输出多支管，和至少两个共轴圆柱体。
68.权利要求44的方法，进一步包括至少一个连接器，所述连机器连接至至少第二共轴圆柱体，所述连接器被配置为创建或维持所述细胞培养基沿着所述第二共轴圆柱体的基本上气旋性的流动路径的气旋性流动。
69.权利要求68的方法，其中所述连接器包括静态混合器元件。
70.权利要求44的方法，其中所述外部圆柱体和所述内部圆柱体的长度的范围在约25cm和约100cm之间。
71.权利要求44的方法，其中所述C型紫外线辐射的发射器的数量范围在1个发射器和8个发射器之间。
72.权利要求44的方法，其中所述间隙包括导流片。
73.权利要求44的方法，进一步包括指示所述细胞培养基已经暴露于的辐射剂量的监测器。
74.权利要求73的方法，进一步包括关闭阀以关闭所述细胞培养基的流动。
75.权利要求74的方法，进一步包括冲洗***以冲洗掉已经过度暴露于辐射或于辐射暴露不足的细胞培养基。
76.权利要求44的方法，进一步包括泵。
77.权利要求44的方法，其中所述细胞培养基的流动速率的范围在每分钟约0.5升和每分钟约50升之间。
78.权利要求44的方法，其中所述共轴圆柱体、所述入口和所述出口的额定压力小于或等于约50psi。
79.权利要求44的方法，其中所述共轴圆柱体、所述入口和所述出口的占据空间小于或等于约5英尺乘以5英尺乘以5英尺。
80.权利要求44的方法，其中所述共轴圆柱体、入口和出口的体积为小于或等于约125立方英尺。
81.一种使细胞培养基中的病毒灭活的方法，包括：
a)将所述细胞培养基经由入口引入至少一个共轴圆柱体中，所述共轴圆柱体包含外部圆柱体和内部圆柱体，所述外部圆柱体具有长度、内径和外径，所述内部圆柱体具有被配置为在所述内部圆柱体的外径和所述外部圆柱体的内径之间形成约3mm间隙的外径和基本上等于所述外部圆柱体所述长度的长度，所述入口被连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体的一端并且与所述外部圆柱体相切从而使所述细胞培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
b)使得所述细胞培养基经由所述间隙以所述基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
c)用至少一个置于所述内部圆柱体内的C型紫外线辐射的发射器照射所述细胞培养基，从而向所述细胞培养基发射C型紫外线辐射以由此使所述细胞培养基中的病毒灭活；并
d)使所述细胞培养基流动通过连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体与入口相对一端的细胞培养基出口，
所述细胞培养基暴露于小于约80至约100mJ/cm2的辐射剂量，平均辐射剂量的范围在约50和约60mJ/cm2之间，对于范围在每分钟约3升和约5升之间的流动速率，且对于具有范围在约2个和约5个吸光度单位之间的紫外线吸光度的细胞培养基，有1至2个共轴圆柱体，每个圆柱体包括1个灯。
82.一种使高吸光度液体培养基中的病毒灭活的方法，包括：
a)将所述液体培养基经由入口引入至少一个共轴圆柱体中，所述共轴圆柱体包含外部圆柱体以及内部圆柱体，所述外部圆柱体具有长度、内径和外径，所述内部圆柱体具有被配置为在所述内部圆柱体的外径和所述外部圆柱体的所述内径之间形成间隙的外径和基本上等于所述外部圆柱体所述长度的长度，所述入口被连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体的一端并且被配置为使得所述液体培养基沿着基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
b)使所述液体培养基经由所述间隙以所述基本上气旋性的流动路径沿所述间隙流动；
c)用至少一个置于所述内部圆柱体内的C型紫外线辐射的发射器照射所述液体培养基，从而向所述液体培养基发射C型紫外线辐射以由此使所述液体培养基中的病毒灭活；和
d)使所述液体培养基流动通过连接至所述外部圆柱体接近所述外部圆柱体与所述入口相对一端的液体培养基出口。
83.权利要求82的方法，其中所述液体培养基包含治疗性蛋白质。
84.权利要求83的方法，其中所述治疗性蛋白质是单克隆抗体。
85.权利要求83的方法，其中所述治疗性蛋白质是重组蛋白。
86.权利要求83的方法，其中所述治疗性蛋白质是酶。
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