CN103063657A - 基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法 - Google Patents
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Abstract
基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法，涉及生物分析化学技术领域，解决了现有检测酶活性的方法存在的流路设计复杂、操作繁琐、检测灵敏度低和成本高的问题。基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法为：步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；步骤二、向步骤一中的血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。本发明的方法具有简便、快捷、高灵敏、低成本的优点，能够得到更低的检出限，对胰蛋白酶检出限可以达到1ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析化学技术领域，具体涉及一种基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法。
背景技术
流动注射分析技术是自20世纪80年代发展起来的一种新型试样分析技术，它利用蠕动泵驱动试剂和试样，当试剂和试样混合之后流经检测器时信号被检测，基本的流路***如图1所示。流动注射分析技术具有广泛的适用性，可以与多种检测手段联用，可用于进样、在线样品处理、自动监测以及过程分析等；具有效率高的优点，其采样频率可以达到40～300/h；试样消耗量低，一般消耗10～100 μL；设备简单，价廉。
化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，其发光机理是反应体系中的某些物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，从激发态返回基态时将能量以光辐射的形式释放出来，产生发光现象。
化学发光分析法则是依据某一时刻化学发光强度或化学发光总量来确定反应中相应组分含量的一种微量及痕量分析法，具有高灵敏度、线性范围宽、设备简单、操作简便、易于实现自动化和分析快速等特点。近年来，与流动注射、电化学、高效液相色谱和毛细管电泳等方法的联用，使得化学发光分析法已广泛应用于药物分析、临床分析、环境分析和材料分析等领域。
流动注射化学发光法结合了流动注射分析法与化学发光法各自的优点，能够进行快速的测定和高通量的分析，同时又能够高灵敏度的分析。
蛋白酶是一类能够水解蛋白质中肽键的一类酶的总称，这些蛋白酶多数都是蛋白质，在人体内有超过550种蛋白酶，这些蛋白酶大约占人体内所有蛋白种类的2%左右。蛋白酶在生物体内有着十分重要的作用，在蛋白质的消化转移、血液的凝结、生长发育以及细胞信号传导。蛋白酶的功能紊乱与许多人类重大疾病如癌症、阿尔茨海默病、糖尿病等有重要的关系，因此对于蛋白酶活性的检测有着重要的意义，开发新型的灵敏检测蛋白酶活性的方法是势在必行的。
目前，酶活性的检测方法主要有毛细管等电聚焦，凝胶电泳，高效液相色谱法，酶联接免疫吸附剂测定电化学方法等多种方法。基于化学发光法的酶活性检测方法见于报道的很少。1995年，Alan Townshend（Robert Edwards，Alan Townshend，Barry Stoddart. Analyst，1995，120：117-120.）等人通过合成一种三肽-异鲁米诺衍生物，如图2所示，将此衍生物固定于一种固体支持物上，在加入蛋白酶之后，蛋白酶将固定于固体支持物上的三肽-异鲁米诺衍生物中的肽键切断，从而使得异鲁米诺脱离于固体支持物，异鲁米诺随着载流进入流动注射化学发光***，在先后与钴离子和过氧化氢混合之后，钴离子能够极大的催化异鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应，通过化学发光的强度进行蛋白酶的检测。这种方法对胰蛋白酶的检出限达到了40ng/mL，但是此方法需要合成特定的三肽-异鲁米诺衍生物，流路设计复杂，操作较为繁琐，检测灵敏度低，成本高。
发明内容
为了解决现有检测酶活性的方法存在的流路设计复杂、操作繁琐、检测灵敏度低和成本高的问题，本发明提供一种简便、快捷、高灵敏、低成本的基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供的一种基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；
步骤二、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，然后再向血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；
步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。
所述蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原蛋白酶。
所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。
所述反应体系包括以下①～④中的任意一种：
①终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0～200ng/ml的胰蛋白酶、蛋白酶K或胰凝乳蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液；
②终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0～1000ng/ml的木瓜蛋白酶或胶原蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液；
③终浓度为200nM的血红蛋白，浓度为0～40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液；
④终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，浓度为0～40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液。
所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括：pH为9.0浓度为1×10-4 M的鲁米诺溶液，浓度为1×10-3 M的过氧化氢水溶液。
本发明还提供一种基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、 将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；
步骤二、将蛋白酶与不同浓度的蛋白酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；
步骤三、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，然后再将步骤二中的混合溶液中加入到血红素蛋白溶液中，形成反应体系；
步骤四、将步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶抑制剂活性进行检测。
所述蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂、蛋白酶K抑制剂、木瓜蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂或胶原蛋白酶抑制剂。
所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。
所述反应体系包括以下①～⑦中的任意一种：
①浓度为200ng/mL的胰蛋白酶，浓度为0～100ng/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
②浓度为200ng/mL的蛋白酶K，浓度为0～280μg/ml的蛋白酶K抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
③浓度为1μg/ml的木瓜蛋白酶，浓度为0～400ng/ml的木瓜蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
④浓度为200ng/mL的胰凝乳蛋白酶，浓度为0～160ng/ml的胰凝乳蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
⑤浓度为1μg/ml的胶原蛋白酶，浓度为0～54μg/ml的胶原蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
⑥浓度为40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为0～120μg/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为200nM的血红蛋白；
⑦浓度为40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为0～120μg/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为200nM的辣根过氧化物酶。
所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括：pH为9.0浓度为1×10-4 M的鲁米诺溶液，浓度为1×10-3 M的过氧化氢水溶液。
发明原理：本方法采用一种天然的蛋白质即细胞色素C为酶切底物，细胞色素C在天然的状态下几乎不能够催化鲁米诺-过氧化氢的化学发光反应，而在蛋白酶水解后，细胞色素C中的血红素脱离出来，以单体形式存在的血红素能够强烈的催化鲁米诺-过氧化氢的化学发光反应。
在细胞色素C溶液中，随着加入的蛋白酶的量的增加，水解产生的血红素的量增多，从而产生化学发光信号值增强，在一定的反应时间内，发光信号强度值与加入的蛋白酶的量成正比，进而检测蛋白酶活性。
蛋白酶抑制剂的加入能够有效的抑制蛋白酶的活性，随着加入的蛋白酶抑制剂的量的增多，蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的效率增高，蛋白酶水解细胞色素C产生的血红素的量减少，从而产生的化学发光的信号值降低，进而检测蛋白酶抑制剂活性。
本发明的有益效果是：本方法选用天然的蛋白质细胞色素C为酶切底物，细胞色素C价廉易得，不需要通过复杂昂贵的合成以及修饰。
本方法的检测手段为基于化学发光法的检测，仅仅需要简单的化学发光试剂鲁米诺和过氧化氢，不需要合成，能够大大的降低成本。
本方法进行检测时能保证在最短的时间内完成，节省时间，包括工作曲线在内，70分钟就能够测定完成。
本方法操作简单，仅仅需要简单的样品的混合以及注射操作，并且不存在任何的合成反应，无需其他的有毒有害试剂，减少污染和保护环境。
本方法能够得到更低的检出限，对胰蛋白酶检出限可以达到1ng/mL。
附图说明
图1为流动注射分析技术的流动注射流路示意图；
图2为现有的基于化学发光法检测蛋白酶活性的流动注射流路示意图；
图3为本发明的流动注射化学发光流路示意图；
图4为实施例1中检测胰蛋白酶活性的胰蛋白酶浓度与发光强度的关系曲线图；
图5为实施例6中检测胰蛋白酶抑制剂活性的抑制效率曲线图；
图6为蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胶原蛋白酶的发光强度随时间的变化曲线图，随着时间的增加，发光强度逐渐增强，胰凝乳蛋白酶相比其他蛋白酶，其发光强度随时间变化最强；
图7为实施例7中检测蛋白酶K抑制剂活性中的抑制效率曲线图；
图8为实施例8中检测木瓜蛋白酶抑制剂活性中的抑制效率曲线图；
图9为实施例9中检测胰凝乳蛋白酶抑制剂活性中的抑制效率曲线图；
图10为实施例10中检测胶原蛋白酶抑制剂活性中的抑制效率曲线图；
图11为本发明检测蛋白酶活性的原理图；
图12为实施例11中检测胰蛋白酶活性中的胰蛋白酶浓度与发光强度的关系曲线图；
图13为实施例12中检测胰蛋白酶抑制剂活性中的抑制效率曲线图。
具体实施方式
本发明提供的一种基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；
步骤二、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，优选温度为37℃，优选时间为5min，然后再向血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；
步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。
步骤一中的血红素蛋白可以为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。
步骤二中的蛋白酶可以为胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原蛋白酶。
步骤二中的反应体系包括以下①～④中的任意一种：
①终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0～200ng/ml的胰蛋白酶、蛋白酶K或胰凝乳蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）；
②终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0～1000ng/ml的木瓜蛋白酶或胶原蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）；
③终浓度为200nM的血红蛋白，浓度为0～40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）；
④终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，浓度为0～40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）。
步骤三中的对蛋白酶活性进行检测的具体过程为：以10～15min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以0.75～2min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
步骤三中的鲁米诺-过氧化氢检测体系包括：pH为9.0浓度为1×10-4M的鲁米诺溶液，浓度为1×10-3 M的过氧化氢水溶液。
本发明还提供了一种基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、 将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；
步骤二、将蛋白酶与不同浓度的蛋白酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；
步骤三、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，然后再将步骤二中的混合溶液中加入到血红素蛋白溶液中，形成反应体系；
步骤四、将步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶抑制剂活性进行检测。
步骤一中的血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。
步骤二中的蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂、蛋白酶K抑制剂、木瓜蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂或胶原蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶抑制剂是从大豆中提取的抑制剂，名称是trypsin inhibitor from soybean；蛋白酶K抑制剂是Alkaline protease inhibitor, API. （碱性蛋白酶抑制剂）；木瓜蛋白酶抑制剂是TomatoCystatin；胰凝乳蛋白酶抑制剂是chymotrypsin inhibitor ECIfrom Erythrina variegate seeds；胶原蛋白酶抑制剂是 1,10-邻菲咯啉。
步骤三中的反应体系包括以下①～⑦中的任意一种：
①浓度为200ng/mL的胰蛋白酶，浓度为0～100ng/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
②浓度为200ng/mL的蛋白酶K，浓度为0～280μg/ml的蛋白酶K抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
③浓度为1μg/ml的木瓜蛋白酶，浓度为0～400ng/ml的木瓜蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
④浓度为200ng/mL的胰凝乳蛋白酶，浓度为0～160ng/ml的胰凝乳蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
⑤浓度为1μg/ml的胶原蛋白酶，浓度为0～54μg/ml的胶原蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
⑥浓度为40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为0～120μg/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为200nM的血红蛋白；
⑦浓度为40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为0～120μg/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为200nM的辣根过氧化物酶。
步骤四中的鲁米诺-过氧化氢检测体系包括：pH为9.0浓度为1×10-4M的鲁米诺溶液，浓度为1×10-3 M的过氧化氢水溶液。
步骤四中的对蛋白酶抑制剂活性进行检测的具体过程为：以10～15min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以0.75～2min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
本发明中的所用到的鲁米诺溶液的配制过程如下：称取0.1772g鲁米诺溶解于0.1M氢氧化钠溶液中，得到浓度为0.01M的鲁米诺溶液，避光放置于4℃，使用时，取5mL上述的0.01M的鲁米诺溶液稀释于100mM的硼酸-硼酸钠缓冲溶液中，得到浓度为1×10-4M pH为9.0的鲁米诺溶液。
本发明中的所用到的过氧化氢溶液的配制过程如下：取60μL30%的过氧化氢溶液稀释到600mL，得到浓度为1×10-3M的过氧化氢溶液。
本发明中用到的仪器为IFFM-E型流动注射化学发光分析仪，蠕动泵转速40 r/min，光电倍增管负高压为600V。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1 胰蛋白酶活性的检测
步骤一、取9支3 mL样品管中，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、向步骤一中的9支样品管中依次加入终浓度为0、2、5、10、20、50、100、150、200 ng/mL的胰蛋白酶溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取200μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值，经过60分钟左右的测定停止实验。
实验结果表明：如图4所示，随着胰蛋白酶浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对胰蛋白酶的检出限能够达到1ng/mL。
实施例2 蛋白酶K活性的检测
步骤一、取9支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于35℃水浴中温育10min；
步骤二、向步骤一中的9支样品管中依次加入终浓度为0、2、5、10、20、50、100、150、200 ng/mL的蛋白酶K溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取180μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以15min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以0.75min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：随着蛋白酶K浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对蛋白酶K的检出限为2 ng/mL。
实施例3 木瓜蛋白酶活性的检测
步骤一、取8支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，细胞色素C用50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于40℃水浴中温育3min；
步骤二、向步骤一中的8支样品管中依次加入终浓度为0、5、10、20、50、100、200、1000 ng/mL的木瓜蛋白酶溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取150μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以13min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以0.8min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：随着木瓜蛋白酶浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对木瓜蛋白酶的检出限为3ng/mL。
实施例4 胰凝乳蛋白酶活性的检测
步骤一、取9支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，细胞色素C用50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、向步骤一中的9支样品管中依次加入终浓度为0、2、5、10、20、50、100、150、200 ng/mL的胰凝乳蛋白酶溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取210μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以12min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以2min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：随着胰凝乳蛋白酶浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对胰凝乳蛋白酶的检出限达到1 ng/mL。
实施例5 胶原蛋白酶活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，细胞色素C用50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、向步骤一中的7支样品管中依次加入终浓度为0、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的胶原蛋白酶溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取200μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1.2min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：随着胶原蛋白酶浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对胶原蛋白酶的检出限为20ng/mL。
实施例6 胰蛋白酶抑制剂活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，将细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、将终浓度为200ng/mL的胰蛋白酶与不同浓度的胰蛋白酶抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，胰蛋白酶抑制剂的终浓度分别为0、2、5、10、20、50、100 ng/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的7支样品管中分别加入步骤二中的七组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取200μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：如图5所示，随着胰蛋白酶抑制剂浓度的增加，在浓度为0～20ng/mL范围内抑制效率逐渐增加，在浓度为30～100ng/mL范围内抑制效率趋于平衡达到最大IC50为4.4ng/mL。
实施例7 蛋白酶K抑制剂活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，将细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于40℃水浴中温育3min；
步骤二、将终浓度为200ng/mL的蛋白酶K与不同浓度的蛋白酶K抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，蛋白酶K抑制剂的终浓度分别为0、25、50、100、140、200、280μg/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的7支样品管中分别加入步骤二中的七组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取180μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以15min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以0.75min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：如图7所示，随着蛋白酶K抑制剂浓度的增加，在浓度为0～150μg/mL范围内抑制效率逐渐增加，在浓度为150～280μg/mL范围内抑制效率趋于平衡达到最大，IC50为115μg/mL。
实施例8木瓜蛋白酶抑制剂活性的检测
步骤一、取6支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，将细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于35℃水浴中温育10min；
步骤二、将终浓度为1μg/mL的木瓜蛋白酶与不同浓度的木瓜蛋白酶抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，木瓜蛋白酶抑制剂的终浓度分别为0、100、150、200、300、400 ng/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的6支样品管中分别加入步骤二中的六组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取150μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以13min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以0.8min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：如图8所示，随着木瓜蛋白酶抑制剂浓度的增加，抑制效率随之增加，IC50为210ng/mL。
实施例9 胰凝乳蛋白酶抑制剂活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，将细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、将终浓度为200ng/mL的胰凝乳蛋白酶与不同浓度的胰凝乳蛋白酶抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，胰凝乳蛋白酶抑制剂的终浓度分别为0、16、48、80、112、144、160ng/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的7支样品管中分别加入步骤二中的七组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取210μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以12min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以2min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：如图9所示，随着胰凝乳蛋白酶抑制剂浓度的增加，抑制效率随之增加，IC50为58μg/mL。
实施例10 胶原蛋白酶抑制剂活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为50nM的细胞色素C，将细胞色素C用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、将终浓度为1μg/mL的胶原蛋白酶与不同浓度的胶原蛋白酶抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，胶原蛋白酶抑制剂的终浓度分别为0、3.5、9、18、27、36、54 μg/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的7支样品管中分别加入步骤二中的七组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取200μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1.2min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：如图10所示，随着胶原蛋白酶抑制剂浓度的增加，抑制效率随之增加，IC50为21μg/mL。
实施例11 胰蛋白酶活性的检测
步骤一、取10支3 mL样品管中，分别加入终浓度为200nM的血红蛋白，血红蛋白用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、向步骤一中的10支样品管中依次加入终浓度为0、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、4、8、20、40 μg/mL的胰蛋白酶溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取200μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值，经过60分钟左右的测定停止实验。
实验结果表明：如图12所示，随着胰蛋白酶浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对胰蛋白酶的检出限能够达到20ng/mL。
实施例12 胰蛋白酶抑制剂活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为200nM的血红蛋白，将血红蛋白用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、将终浓度为40 μg/mL的胰蛋白酶与不同浓度的胰蛋白酶抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，胰蛋白酶抑制剂的终浓度分别为0、5、10、20、40、80、120 μg/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的7支样品管中分别加入步骤二中的七组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取200μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：如图13所示，随着胰蛋白酶抑制剂浓度的增加，在浓度为0～20μg/mL范围内抑制效率逐渐增加，在浓度为20～120μg/mL范围内抑制效率趋于平衡达到最大，IC50为11μg/mL。
实施例13 胰蛋白酶活性的检测
步骤一、取10支3 mL样品管中，分别加入终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、向步骤一中的10支样品管中依次加入终浓度为0、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、4、8、20、40 μg/mL的胰蛋白酶溶液，立即混合均匀，样品的总体积为3mL，得到水解溶液；
步骤三、取200μL步骤二中的水解溶液注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值，经过60分钟左右的测定停止实验。
实验结果表明：随着胰蛋白酶浓度的增加，化学发光体系的发光强度逐渐增强，对胰蛋白酶的检出限能够达到20ng/mL。
实施例14 胰蛋白酶抑制剂活性的检测
步骤一、取7支3 mL样品管，分别加入终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，将辣根过氧化物酶用浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液（1mM CaCl2）稀释，预先于37℃水浴中温育5min；
步骤二、将终浓度为40 μg/mL的胰蛋白酶与不同浓度的胰蛋白酶抑制剂混合，得到七组不同的混合溶液，胰蛋白酶抑制剂的终浓度分别为0、5、10、20、40、80、120 μg/mL，反应总体积为3mL；
步骤三、向步骤一中的7支样品管中分别加入步骤二中的七组混合溶液，形成反应体系；
步骤四、取200μL步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，随着样品和检测体系流过检测器，产生的化学发光被检测器检测，并被数据采集***采集显示于显示器，以10min的时间间隔测定任意一个样品的化学发光强度值，以1min的时间间隔依次测定每个样品的化学发光强度值。
实验结果表明：随着胰蛋白酶抑制剂浓度的增加，在浓度为0～20μg/mL范围内抑制效率逐渐增加，在浓度为20～120μg/mL范围内抑制效率趋于平衡达到最大，IC50为11μg/mL。
Claims (10)
1.基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；
步骤二、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，然后再向血红素蛋白溶液中加入不同浓度的蛋白酶，形成反应体系；
步骤三、将步骤二中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶活性进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述反应体系包括以下①～④中的任意一种：
①终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0～200ng/ml的胰蛋白酶、蛋白酶K或胰凝乳蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液；
②终浓度为50nM的细胞色素C，浓度为0～1000ng/ml的木瓜蛋白酶或胶原蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液；
③终浓度为200nM的血红蛋白，浓度为0～40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液；
④终浓度为200nM的辣根过氧化物酶，浓度为0～40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的基于化学发光法检测蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括：pH为9.0浓度为1×10-4M的鲁米诺溶液，浓度为1×10-3 M的过氧化氢水溶液。
6.基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、 将血红素蛋白溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到血红素蛋白溶液；
步骤二、将蛋白酶与不同浓度的蛋白酶抑制剂混合均匀，得到混合溶液；
步骤三、将步骤一中的血红素蛋白溶液预先于35～40℃水浴中温育3～10min，然后再将步骤二中的混合溶液中加入到血红素蛋白溶液中，形成反应体系；
步骤四、将步骤三中的反应体系注入到流动注射化学发光流路中，与鲁米诺-过氧化氢检测体系发生化学发光反应，对蛋白酶抑制剂活性进行检测。
7.根据权利要求6所述的基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂、蛋白酶K抑制剂、木瓜蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂或胶原蛋白酶抑制剂。
8.根据权利要求6所述的基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述血红素蛋白为细胞色素C、血红蛋白或辣根过氧化物酶。
9.根据权利要求6所述的基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述反应体系包括以下①～⑦中的任意一种：
①浓度为200ng/mL的胰蛋白酶，浓度为0～100ng/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
②浓度为200ng/mL的蛋白酶K，浓度为0～280μg/ml的蛋白酶K抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
③浓度为1μg/ml的木瓜蛋白酶，浓度为0～400ng/ml的木瓜蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
④浓度为200ng/mL的胰凝乳蛋白酶，浓度为0～160ng/ml的胰凝乳蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
⑤浓度为1μg/ml的胶原蛋白酶，浓度为0～54μg/ml的胶原蛋白酶抑制剂，终浓度为50nM的细胞色素C；
⑥浓度为40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为0～120μg/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为200nM的血红蛋白；
⑦浓度为40μg/ml的胰蛋白酶，浓度为0～120μg/ml的胰蛋白酶抑制剂，终浓度为200nM的辣根过氧化物酶。
10.根据权利要求6所述的基于化学发光法检测蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述鲁米诺-过氧化氢检测体系包括：pH为9.0浓度为1×10-4 M的鲁米诺溶液，浓度为1×10-3 M的过氧化氢水溶液。
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