CN103033623A - 人m2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒及制备方法,所述试剂盒包括以下组份:M2型丙酮酸激酶标准品;包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒;辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体;化学发光底物A和B;白色不透明微孔板;洗涤液;本发明试剂盒可以准确定量检测病人血清中M2-PK的含量,对于肺癌等恶性肿瘤的检测具有重要的指导意义,与传统的ELISA方法相比,本发明灵敏度高,特异性好,线性范围宽,且稳定性、可靠性和准确度高,安全环保,操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析及医学检验技术领域,具体的,本发明涉及一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术
癌症是目前威胁人类健康的主要致死疾病之一,癌症已超过心脑血管疾病成为致死原因的第一位的疾病,严重危害着人民健康和生命安全,且有逐年上升的趋势。癌症的最佳治疗时期在癌细胞转移前,此时可通过手术或药物治疗将其彻底清除。因此早期发现早期治疗至关重要。绝大多数癌症早期患者并无任何症状,很难被发现。因此只有建立准确可靠的早期检测方法,通过体检筛查才能发现早期病变,才有可能及时采取有效的治疗措施,免疫分析技术为这种早期筛查提供了可能。近年来研究发现,M2型丙酮酸激酶(M2Pyruvate Kinase,M2-PK)在肺癌等癌症诊断、动态监测、抗癌疗效评价及预后判断中具有广泛的应用价值。
M2型丙酮酸激酶是一种新发现的肿瘤标志物,作为肺癌新的特异性标记物来探讨其在肺癌诊断、动态监测/抗肺癌疗效评价及预后评估等方面的作用,已成为国内外肺癌研究的热点。丙酮酸激酶是糖酵解途径的一个关键酶,在三磷酸核苷的合成过程中也起决定性作用。PK有两种结构基因(L基因、M基因)和四种同工酶分别为L型、R型、M1型、M2型,这4种同工酶的分布具有组织特异性,常以酶的活性四聚体形式存在。当肿瘤发生时往往先表现为PK的组织特异性同工酶(如肌肉及脑中的M1-PK)表达减少,随之发生M2-PK同工酶的表达上调,酶从传统的四聚体型转变成二聚体型,在肿瘤细胞中呈过度表达。所以称这种M2-PK为肿瘤M2-PK或TU M2-PK,M2-PK能在体液中被大量监测到。肿瘤发生时往往伴随二聚体型M2-PK含量的增加,在有足够氧气供应的实体瘤(如肺癌)中,谷氨酸酵解提供大量的丙酮酸,这些谷氨酸酵解和糖酵解中产生的丙酮酸用来合成乳酸、谷氨酸和脂肪酸,从而释放出糖酵解过程中甘油醛3-磷酸脱氢酶作用下产生的氢,以保证肿瘤细胞中能量的供给,可见在肿瘤新陈代谢中发挥着极其重要的作用。Oremek G等用健康对照195例,新确诊的不同病理类型的肺癌患者140例为对象,检测血浆中TU M2-PK的水平。研究显示,肿瘤患者的TU M2-PK水平比对照组明显升高,且特异性为95%,在小细胞肺癌为78%,腺癌和非小细胞肺癌分别为73%和85%。
目前对M2-PK的检测方法主要有ELISA法和胶体金法,如德国SCHEBO BIOTEO公司建立了一种可以检测患者血浆中M2-PK的酶联免疫方法。该方法具有简便快捷和无污染等优点,但与化学发光技术相比具有灵敏度不够高、线性范围窄等缺点。
复旦大学附属肿瘤医院公开了《一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒及其制备方法》,该试剂盒采用胶体金测定技术,在测定区包被抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体,参比区包被抗鼠IgG或抗原液;对肿瘤型M2丙酮酸激酶进行半定量分析测定,10分钟内完成测试。胶体金试剂盒便于携带和保存,操作简便,快速,但是准确性较差,无法进行精确定量测定。深圳市安群生物工程有限公司公开了一种《人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用》的发明专利,该发明主要是制备人肿瘤M2型丙酮酸激酶抗原决定簇多肽和多克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种灵敏度高,检测时间短,特异性好,稳定可靠的人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒。
本发明的技术方案概述如下:
一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,包括以下组份:
①M2型丙酮酸激酶标准品;
②包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒;
③辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体;
④化学发光底物A和B;
⑤白色不透明微孔板;
⑥洗涤液;
其中,所述包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备:
①取2.0ml质量含量为2.5%的磁颗粒悬浮液,磁板分离弃上清,用0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒一次;所述磁颗粒悬浮液中的液体是0.05mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;
②将0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液与步骤①获得的磁颗粒混合,使总体积为2.0~5.0ml;
③加入2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,于摇床上匀化10~20分钟;
④加入4.0~10.0mg碳二亚胺,于摇床上匀化16~20小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次;
⑥加入Tris-EDTA缓冲液,调节总体积至2.0ml,置于2~4℃保存。
所述辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体是用下述方法制备:
①取2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,加入0.5~1.0ml浓度为0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解,2~4℃保存;
②取10.0mg的辣根过氧化物酶,加入2.0ml去离子水溶解,取出0.5~1.0ml,加入0.2ml浓度为0.1mol/L的NaIO4水溶液,室温下避光反应0.5~1.5小时;
③将步骤①与②获得的液体混合,室温下避光反应4~6小时;
④向步骤③获得的溶液中加入0.1ml浓度为3mg/ml的NaBH4水溶液,室温下避光反应1~2小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析16~24小时,再用HPLC进行二次纯化,收集蛋白峰,加入等体积甘油后于-20℃下冷冻保存。
所述化学发光底物A是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将5~10mmol鲁米诺加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃避光保存。
所述化学发光底物B是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将0.6~1.0mmol四苯硼钠、1.5mmol铁***、1.0mmol肉桂酸、10.0mmol过氧化氢加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃保存。
所述洗涤液由下述方法制成:
取6.05g三羟甲基氨基甲烷、8.5g NaCl、1.0ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7.5。
M2型丙酮酸激酶标准品的配制
将0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液,用基础缓冲液将M2型丙酮酸激酶抗原稀释成浓度为0、2.5U/mL、6.4U/mL、16U/mL、40U/mL、100U/mL的标准品。
本发明的优点
本发明试剂盒可以准确定量检测病人血清中M2-PK的含量,对于肺癌等恶性肿瘤的检测具有重要的指导意义,与传统的ELISA方法相比,本发明灵敏度高,特异性好,线性范围宽,且稳定性、可靠性和准确度高,安全环保,操作简便。
附图说明
图1M2-PK试剂盒(实施例1)标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,包括以下组份:
①M2型丙酮酸激酶标准品;
②包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒;
③辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体;
④化学发光底物A和B;
⑤白色不透明微孔板;
⑥洗涤液;
其中,所述包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备:
①取2.0ml质量含量为2.5%的磁颗粒悬浮液,磁板分离弃上清,用0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒一次;所述磁颗粒悬浮液中的液体是0.05mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;
②将0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液与步骤①获得的磁颗粒混合使总体积为2.0ml;
③加入2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,于摇床上匀化10分钟;
④加入4.0mg碳二亚胺,于摇床上匀化16小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次;
⑥加入Tris-EDTA缓冲液(Tris0.05mol/L,EDTA0.005mol/L,BSA0.1%,Proclin3001.0mL/L,pH=7.5),调节总体积至2.0ml,置于2~4℃保存。
所述辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体是用下述方法制备:
①取2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,加入0.5ml浓度为0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解,2~4℃保存;
②取10.0mg的辣根过氧化物酶,加入2.0ml去离子水溶解,取出0.5ml,加入0.2ml浓度为0.1mol/L的NaIO4水溶液,室温下避光反应0.5小时;
③将步骤①与②获得的液体混合,室温下避光反应4小时;
④向步骤③获得的溶液中加入0.1ml浓度为3mg/ml的NaBH4水溶液,室温下避光反应1小时;
⑤用0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析16小时,再用HPLC进行二次纯化,收集蛋白峰,加入等体积甘油后于-20℃下冷冻保存;
所述化学发光底物A是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将5mmol鲁米诺加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃避光保存。
所述化学发光底物B是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将0.6mmol四苯硼钠、1.5mmol铁***、1.0mmol肉桂酸、10.0mmol过氧化氢加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃保存。
所述洗涤液由下述方法制成:
取6.05g三羟甲基氨基甲烷、8.5g NaCl、1.0ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7.5。
M2型丙酮酸激酶标准品的配制
将0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液,用基础缓冲液将M2型丙酮酸激酶抗原稀释成浓度为0、2.5U/mL、6.4U/mL、16U/mL、40U/mL、100U/mL的标准品。
实施例2
人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,包括以下组份:
①M2型丙酮酸激酶标准品;
②包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒;
③辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体;
④化学发光底物A和B;
⑤白色不透明微孔板;
⑥洗涤液;
其中,所述包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备:
①取2.0ml质量含量为2.5%的磁颗粒悬浮液,磁板分离弃上清,用0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒一次;所述磁颗粒悬浮液中的液体是0.05mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;
②将0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液与步骤①获得的磁颗粒混合使总体积为3.0ml;
③加入2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,于摇床上匀化15分钟;
④加入7.0mg碳二亚胺,于摇床上匀化18小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次;
⑥加入Tris-EDTA缓冲液(Tris0.05mol/L,EDTA0.005mol/L,BSA0.1%,Proclin3001.0mL/L,pH=7.5),调节总体积至2.0ml,置于2~4℃保存;
所述辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体是用下述方法制备:
①取2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,加入0.8ml浓度为0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解,2~4℃保存;
②取10.0mg的辣根过氧化物酶,加入2.0ml去离子水,溶解后取出0.8ml,加入0.2ml浓度为0.1mol/L的NaIO4溶液,密封后于室温下避光反应1.0小时;
③将步骤①与②获得的液体混合,室温下避光反应5小时;
④向步骤③获得的溶液中加入0.1ml浓度为3mg/ml的NaBH4溶液,室温下避光反应1.5小时;
⑤用0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析20小时,再用HPLC进行二次纯化,收集蛋白峰,加入等体积甘油后于-20℃下冷冻保存;
所述化学发光底物A是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将8mmol鲁米诺加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃避光保存;化学发光底物B工作液的配制:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将0.8mmol四苯硼钠、1.50mmol铁***、1.0mmol肉桂酸、10.0mmol过氧化氢加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃保存。
洗涤液和M2型丙酮酸激酶标准品的配制同实施例1。
实施例3:
人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,包括以下组份:
①M2型丙酮酸激酶标准品;
②包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒;
③辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体;
④化学发光底物A和B;
⑤白色不透明微孔板;
⑥洗涤液;
其中,所述包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备:
①取2.0ml质量含量为2.5%的磁颗粒悬浮液,磁板分离弃上清,用0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒一次;所述磁颗粒悬浮液中的液体是0.05mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;
②用0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液与步骤①获得的磁颗粒混合使总体积为5.0ml;
③加入2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,于摇床上匀化20分钟;
④加入10.0mg碳二亚胺,于摇床上匀化20小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次;
⑥加入Tris-EDTA缓冲液(Tris0.05mol/L,EDTA0.005mol/L,BSA0.1%,Proclin3001.0mL/L,pH=7.5),调节总体积至2.0ml,置于2~4℃保存待用。
所述辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体是用下述方法制备:
①取2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,加入1.0ml浓度为0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解,2~4℃保存;
②取10.0mg的辣根过氧化物酶,加入2.0ml去离子水,溶解后取出1.0ml,加入0.2ml浓度为0.1mol/L的NaIO4溶液,密封后于室温下避光反应1.5小时;
③将步骤①与②获得的液体混合,室温下避光反应6小时;
④向步骤③获得的溶液中加入0.1ml浓度为3mg/ml的NaBH4水溶液,室温下避光反应2小时;
⑤用0.02mol/LpH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时,再用HPLC进行二次纯化,收集蛋白峰,加入等体积甘油后于-20℃下冷冻保存;
化学发光底物A工作液的配制:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将10mmol鲁米诺加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃避光保存;
化学发光底物B工作液的配制:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将1.0mmol四苯硼钠、1.50mmol铁***、1.0mmol肉桂酸、10.0mmol过氧化氢加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃保存。
洗涤液和M2型丙酮酸激酶标准品的配制同实施例1。
实施例4
一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒实验操作程序(以实施例1试剂盒为例)如下:
①将实验所需试剂及人血清样品放置室温,平衡20分钟以上才可进行实验操作;
②取白色不透明微孔板(96孔)进行编号,所有M2型丙酮酸激酶标准品及人血清样品均做双孔重复;
③取各个浓度的标准品和样品50μl分别加入相应编号的孔中;
④将辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体用标记物缓冲液(0.05mol/L磷酸盐缓冲液,pH=7.4,NaCl8.5g/L,BSA0.5%,Proclin3001.0mL/L,Tween-200.5mL/L)按1:5000稀释,再将其取50μl分别加入到各孔;
⑤将包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒用磷酸盐-BSA缓冲液(0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH=7.4,BSA0.2%,Proclin3001.0mL/L)按1:150稀释得磁颗粒悬浮液;每孔各加入50μl磁颗粒悬浮液,充分混匀,室温振荡40分钟;
⑥将其放在磁板上吸附磁颗粒,吸去上清液;
⑦去除磁板,每孔均各加入300μl洗涤液;
⑧振荡10秒后,将其放在磁板上吸附磁颗粒,吸去上清液;
⑨重复一遍步骤⑦、⑧;
⑩将化学发光底物A与B工作液等体积混合后,每孔各加入100μl混合液;
用化学发光仪测定每孔的相对发光值(RLU),检测时间0.2秒/孔;
实施例5
本发明试剂盒的方法学鉴定
根据本领域中常规的检定程序对实施例1~3中的三种试剂盒进行鉴定,经过多次实验证明,本发明的试剂盒在M2-PK浓度的测定中,检测的方法学指标如下:
①检测范围:0~100U/ml;
②灵敏度:最小检出限为0.15U/ml;
③精密度:批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%;
④准确性:回收率测定在90~110%之间;
⑤特异性:与类似物M1-PK的交叉反应率小于1.0%;
⑥稳定性:各试剂组分于37℃放置6天后,各组分仍稳定。
实施例6
使用本发明的试剂盒对人血清样本进行检测的实验数据
按照实施例4的操作步骤,使用实施例1的试剂盒,对83例人血样进行测定,由24例非小细胞肺癌样本,以及59例健康人样本组成,测定结果如下表所示:
表1.对83例血液样本的检测结果
使用本发明试剂盒对83例人血清样本进行检测,结果显示,24例非小细胞肺癌病人血液样本中,有21例M2-PK浓度值大于临界值15U/mL;59例健康人血清样本中,M2-PK浓度值均在15U/mL以下,说明本试剂盒的测定特异性良好。
本发明试剂盒具有操作方法快速简便、灵敏度及稳定性高、检测范围广等优点。
Claims (5)
1.一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,其特征包括以下组份:
①M2型丙酮酸激酶标准品;
②包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒;
③辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体;
④化学发光底物A和B;
⑤白色不透明微孔板;
⑥洗涤液;
其中,所述包被有M2型丙酮酸激酶单克隆抗体的磁颗粒经过以下步骤制备:
①取2.0ml质量含量为2.5%的磁颗粒悬浮液,磁板分离弃上清,用0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液洗磁颗粒一次;所述磁颗粒悬浮液中的液体是0.05mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;
②将0.02mol/L pH值为7.0的磷酸盐缓冲液与步骤①获得的磁颗粒混合使总体积为2.0~5.0ml;
③加入2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,于摇床上匀化10~20分钟;
④加入4.0~10.0mg碳二亚胺,于摇床上匀化16~20小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次;
⑥加入Tris-EDTA缓冲液,调节总体积至2.0ml,置于2~4℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于所述辣根过氧化物酶标记的M2型丙酮酸激酶单克隆抗体是用下述方法制备:
①取2.0mg M2型丙酮酸激酶单克隆抗体,加入0.5~1.0ml浓度为0.02mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解,2~4℃保存;
②取10.0mg的辣根过氧化物酶,加入2.0ml去离子水溶解,取出0.5~1.0ml,加入0.2ml浓度为0.1mol/L的NaIO4水溶液,室温下避光反应0.5~1.5小时;
③将步骤①与②获得的液体混合,室温下避光反应4~6小时;
④向步骤③获得的溶液中加入0.1ml浓度为3mg/ml的NaBH4水溶液,室温下避光反应1~2小时;
⑤用0.02mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析16~24小时,再用HPLC进行二次纯化,收集蛋白峰,加入等体积甘油后于-20℃下冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于所述化学发光底物A是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将5~10mmol鲁米诺加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃避光保存。
4.根据权利要求1所述的一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于所述化学发光底物B是用下述方法制成:
①配制0.02mol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液;
②将0.6~1.0mmol四苯硼钠、1.5mmol铁***、1.0mmol肉桂酸、10.0mmol过氧化氢加入到1000ml步骤①所述的缓冲液中,混匀,2~4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种人M2型丙酮酸激酶化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于所述洗涤液由下述方法制成:
取6.05g三羟甲基氨基甲烷、8.5g NaCl、1.0ml Tween-20,加去离子水至1L,溶解后用HCl调pH至7.5。
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