CN103025761A - 人源化抗白介素3受体α链抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了结合白介素-3受体α链的抗体和其用途。

Description

人源化抗白介素3受体α链抗体
相关申请信息
本申请要求2010年8月17日提交的名称为“人源化抗白介素3受体α链抗体(Humanized Anti-Interleukin3Receptor Alpha ChainAntibodies)”的美国专利申请号61/374,489和名称为“靶向1型干扰素产生细胞的组合物和方法(Compositions and Methods for TargetingType1Interferon Producing Cells)”的国际专利申请号PCT/AU2011/000155的优先权。这些申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明领域
本公开涉及抗白介素3受体α链抗体和其用途。
发明背景
功能性白介素3受体是包含特定α链(IL-3Rα；CD123)和与粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)和白介素5(IL-5)共享“共同”IL-3受体β链(βc；CD131)的杂二聚体。
IL-3Rα是含有细胞外结构域(参与IL-3结合)、跨膜结构域和约50个氨基酸的短细胞质尾部的推导分子量为约41kDa的I型跨膜蛋白。细胞外结构域由两个区构成：约100个氨基酸的N端区，其序列显示与GM-CSF和IL-5受体α链的等同区类似；以及接近跨膜结构域的区，其含有四个保守半胱氨酸残基和此细胞因子受体家族的其它成员所共有的WSXWS基元。
IL-3结合结构域包含由两个Ig样折叠结构域构成的约200个氨基酸残基的细胞因子受体基元(CRM)。IL-3Rα的细胞外结构域高度糖基化，具有配体结合和受体信号传导所必需的N-糖基化。
IL-3Rα在整个造血***中广泛表达，包括造血祖细胞、肥大细胞、红细胞、巨核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞和CD5+B淋巴细胞。非造血细胞(如浆细胞样树突状细胞(pDC)、莱氏细胞(Leydig cell)、内皮细胞和基质细胞)也表达IL-3Rα。
IL-3Rα也由某些疾病病况中所涉及的细胞表达，所述疾病病况包括骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))、恶性淋巴增殖性病症(如淋巴瘤)、过敏症和自体免疫性疾病(如狼疮、休格伦氏综合症
Figure BDA00002778180900021
或硬皮病)。因此，需要抗IL-3Rα抗体用于治疗性应用。
发明概述
本公开是基于发明人制造了特异性结合IL-3Rα的人源化抗体。人源化后，发明人发现抗体对IL-3Rα的亲和力降低。因此，发明人进行了亲和力成熟以提高抗体对IL-3Rα的亲和力。未预料到的是，亲和力成熟的抗体在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的框架区(FR)以及轻链的CDR1中包括突变。
发明人还制造了这种抗体的能够诱导增强水平的效应功能的形式。
发明人还发现，诱导效应功能增强的特定修饰产生另一合意特性，即向哺乳动物施用修饰的抗体后，哺乳动物体内NK细胞的数量最初降低，然而接着扩增至高于施用前的水平。发明人还证实，在NK细胞数量与靶细胞(例如白血病细胞)的溶解之间存在相关性。
本公开大体涉及能够特异性结合IL-3Rα链的基于鼠类抗体的免疫球蛋白。
在一个实施例中，本公开提供分离的或重组免疫球蛋白，其特异性结合IL-3Rα链且包含含有SEQ ID NO:8中所示的序列的VL的互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:9中所示的VH的CDR。
本公开另外或替代地提供分离的或重组抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合IL-3Rα链且包含含有SEQID NO:8中所示的序列的VL的CDR和SEQ ID NO:9中所示的VH的CDR。
本公开另外或替代地提供分离的或重组人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合IL-3Rα链且包含含有SEQ ID NO:8中所示的序列的VL的CDR和SEQ ID NO:9中所示的VH的CDR。
在一个实施例中，本公开提供分离的或重组免疫球蛋白，其特异性结合IL-3Rα链且分别包含SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。
本公开另外或替代地提供分离的或重组抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合IL-3Rα链且包含SEQ IDNO:2-7的氨基酸序列。
本公开另外或替代地提供分离的或重组人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合IL-3Rα链且包含SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。
例如，免疫球蛋白或抗体包含：
(i)包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、2和3的轻链可变区(VL)；和
(ii)包含分别如SEQ ID NO:5、6和7中所示的CDR1、2和3的重链可变区(VH)。
例如，免疫球蛋白或抗体包含：
(i)包含以下的VL：
a)包含SEQ ID NO:2中所示的序列(或由SEQ ID NO:14中所示的序列编码)的CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3中所示的序列(或由SEQ ID NO:15中所示的序列编码)的CDR2；和
c)包含SEQ ID NO:4中所示的序列(或由SEQ ID NO:16中所示的序列编码)的CDR3；和
(ii)包含以下的VH：
d)包含SEQ ID NO:5中所示的序列(或由SEQ ID NO:17中所示的序列编码)的CDR1；
e)包含SEQ ID NO:6中所示的序列(或由SEQ ID NO:18中所示的序列编码)的CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:7中所示的序列(或由SEQ ID NO:19中所示的序列编码)的CDR3。
本公开另外或替代地提供分离的或重组人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合IL-3Rα链且包含含有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID NO:20中所示的序列编码)的VL和/或含有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或由SEQID NO:21中所示的序列编码)的VH。
本公开另外或替代地提供分离的或重组人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合IL-3Rα链且包含含有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID NO:20中所示的序列编码)的VL和含有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或由SEQ IDNO:21中所示的序列编码)的VH。
本公开所涵盖的示例性抗原结合片段包括：
(i)结构域抗体(dAb)；
(ii)Fv；
(iii)scFv或其稳定形式(例如二硫键稳定的scFv)；
(iv)二聚scFv或其稳定形式；
(v)双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或更高级多聚体；
(vi)Fab片段；
(vii)Fab’片段；
(viii)F(ab’)片段；
(ix)F(ab’)2片段；
(x)与抗体的Fc区融合的(i)-(ix)中的任一个；
(xi)与结合免疫效应细胞的抗体或其抗原结合片段融合的(i)-(ix)中的任一个。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体去除或至少部分消除其所结合的细胞，例如白血病细胞和/或嗜碱性粒细胞和/或pDC。
如本领域的技术人员根据本文的公开内容将显而易见，示例性免疫球蛋白或抗体能够在不与毒性化合物缀合的情况下去除或至少部分消除其所结合的细胞。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体能够诱导效应功能，例如导致杀死所述免疫球蛋白或抗体所结合的细胞的效应功能。示例性效应功能包括ADCC、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体能够诱导ADCC。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体包含能够诱导效应功能的抗体Fc区。例如，效应功能是Fc介导的效应功能。在一个实施例中，Fc区是IgG1Fc区或IgG3Fc区或杂交的IgG1/IgG2Fc区。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体能够诱导与野生型人IgG1和/或人IgG3Fc区类似(例如没有显著不同或在约10%以内)或相同水平的效应功能。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体能够诱导增强水平的效应功能。
在一个实施例中，由免疫球蛋白或抗体诱导的效应功能的水平相对于包含野生型IgG1Fc区时的免疫球蛋白或抗体的水平得到增强。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是无岩藻糖基化的或包含无岩藻糖基化的Fc区。
在另一实施例中，与人或未改造以降低蛋白质的岩藻糖基化水平的CHO细胞所产生的免疫球蛋白或抗体相比，免疫球蛋白或抗体具有较低水平的岩藻糖基化。根据此实施例，较低水平的岩藻糖基化应理解为意思是在包含免疫球蛋白或抗体的组合物中，岩藻糖基化免疫球蛋白(例如连接至抗体的Asn297的糖基包含岩藻糖)的百分比低于由人或未改造以降低蛋白质的岩藻糖基化水平的CHO细胞所产生的水平。
例如，免疫球蛋白或抗体是包含含有SEQ ID NO:8中所示的序列(或由SEQ ID NO:20中所示的序列编码)的VL和含有SEQ ID NO:9中所示的序列(或由SEQ ID NO:21中所示的序列编码)的VH的无岩藻糖基化人源化抗体。例如，免疫球蛋白或抗体是包含含有SEQ IDNO:13中所示的序列(或由SEQ ID NO:23中所示的序列编码)的轻链和含有SEQ ID NO:10中所示的序列(或由SEQ ID NO:22中所示的序列编码)的重链的无岩藻糖基化人源化抗体。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是由不表达可检测到的水平的(或表达较低水平的)α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)表达的包含含有SEQ ID NO:13中所示的序列(或由SEQ ID NO:23中所示的序列编码)的轻链和含有SEQ ID NO:10中所示的序列(或由SEQ ID NO:22中所示的序列编码)的重链的人源化抗体。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体包含含有一个或多个增强由免疫球蛋白诱导的效应功能的氨基酸序列取代的Fc区。例如，一个或多个氨基酸序列取代使Fc区对Fcγ受体(FcγR)的亲和力相比于不包含所述取代的Fc区增加。例如，一个或多个氨基酸序列取代使Fc区对选自由FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa组成的组的FcγR的亲和力相比于不包含所述取代的Fc区增强增加。在一个实施例中，一个或多个氨基酸序列取代是：
(i)根据Kabat的EU编号***的S239D、A330L和I332E；或
(ii)根据Kabat的EU编号***的S239D和I332E。
例如，免疫球蛋白或抗体是包含含有SEQ ID NO:8中所示的序列(或由SEQ ID NO:20中所示的序列编码)的VL和含有SEQ ID NO:9中所示的序列(或由SEQ ID NO:21中所示的序列编码)的VH的人源化抗体，其中所述抗体包含含有一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸序列取代的Fc区：
(i)根据Kabat的EU编号***的S239D、A330L和I332E；和
(ii)根据Kabat的EU编号***的S239D和I332E。
在一个实施例中，Fc区包含SEQ ID NO:11的残基234-450之间所示的序列(包含根据Kabat的EU编号***的S239D和I332E取代)。
在一个实施例中，Fc区包含SEQ ID NO:12的残基234-450之间所示的序列(包含根据Kabat的EU编号***的S239D、A330L和I332E取代)。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是选自由以下组成的组：
(i)包含含有SEQ ID NO:13中所示的序列的轻链和含有SEQ IDNO:11中所示的序列的重链的抗体；
(ii)包含包含含有SEQ ID NO:13中所示的序列的轻链和含有SEQ ID NO:12中所示的序列的重链的抗体；
如上文所述，发明人已确定，在施用本文所述的抗体后，哺乳动物体内循环中NK细胞的数量与施用前哺乳动物体内循环中NK细胞的数量相比最初降低且接着增加。发明人还证实，使NK细胞相对于靶细胞增加得到增强的功效，即杀死更多数量的靶细胞。此作用是由包含含有根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的恒定区或Fc区的抗体诱导。
因此，在一个实施例中，本公开提供分离的或重组抗体，其能够特异性结合IL-3Rα链且包含：
(i)包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、2和3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含分别如SEQ ID NO:5、6和7中所示的CDR1、2和3的重链可变区(VH)；和
(iii)包含根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的重链恒定区。
在一个实施例中，本公开提供分离的或重组人源化抗体，所述抗体能够特异性结合IL-3Rα链且包含：
(i)包含以下的VL：
a)包含SEQ ID NO:2中所示的序列(或由SEQ ID NO:14中所示的序列编码)的CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3中所示的序列(或由SEQ ID NO:15中所示的序列编码)的CDR2；和
c)包含SEQ ID NO:4中所示的序列(或由SEQ ID NO:16中所示的序列编码)的CDR3；
(ii)包含以下的VH：
d)包含SEQ ID NO:5中所示的序列(或由SEQ ID NO:17中所示的序列编码)的CDR1；
e)包含SEQ ID NO:6中所示的序列(或由SEQ ID NO:18中所示的序列编码)的CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:7中所示的序列(或由SEQ ID NO:19中所示的序列编码)的CDR3；和
(iii)包含根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的重链恒定区。
在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1和人IgG2恒定区的杂交体。
在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:11的残基121-450之间(包括残基121-450)所示的序列。
本公开另外或替代地提供分离的或重组人源化抗体，所述抗体能够特异性结合IL-3Rα链且包含：
(i)包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID NO:20中所示的序列编码)的VL和/或包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或由SEQ ID NO:21中所示的序列编码)的VH；和
(ii)包含根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的重链恒定区。
在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1和人IgG2恒定区的杂交体。
在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:11的残基121-450之间(包括残基121-450)所示的序列。
本公开另外或替代地提供分离的或重组人源化抗体，所述抗体能够特异性结合IL-3Rα链且包含含有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列(或由SEQ ID NO:20中所示的序列编码)的VL、含有根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或由SEQ ID NO:21中所示的序列编码)的VH和含有根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的重链恒定区。
在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1和人IgG2恒定区的杂交体。
在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:11的残基121-450之间(包括残基121-450)所示的序列。
在一个实施例中，本公开提供分离的或重组人源化抗体，所述抗体能够特异性结合IL-3Rα链且包含含有SEQ ID NO:13中所示的序列的轻链和含有SEQ ID NO:11中所示的序列的重链。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体或其抗原结合片段中和IL-3信号传导。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体是裸免疫球蛋白或者本公开的抗体或其抗原结合片段是裸抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体是全长抗体。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体结合IL-3Rα链的平衡解离常数(KD)是1×10-8M或更低，如5×10-9M或更低，例如3×10-9M或更低，如2.5×10-9M或更低。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体结合IL-3Rα链的KD为约2.2×10-9M或更低。在一个实施例中，KD在约1×10-9M与约2.5×10-9M之间，例如为约2.2×10-9M。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体结合IL-3Rα链的KD为约9×10-10M或更低，例如约8×10-10M或更低。在一个实施例中，KD在约5×10-10M与约9×10-10M之间，例如为约7.8×10-10M。
本公开还包括本公开的免疫球蛋白或抗体的片段、变体和衍生物。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体在施用至哺乳动物(例如非人灵长类动物，如食蟹猕猴)时能够减少NK细胞的数量。例如，免疫球蛋白或抗体当施用至哺乳动物时能够使NK细胞的数量在施用12小时或10小时或8小时内减少至少约20%，如至少约30%或40%。例如，免疫球蛋白或抗体在施用至哺乳动物时能够使NK细胞的数量在施用6小时内减少至少约50%。在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体在以0.0001mg/kg与50mg/kg之间，如约0.0005mg/kg与约40mg/kg之间，例如约0.001mg/kg与约30mg/kg之间，如约0.005mg/kg和约20mg/kg，如约0.01mg/kg和约10mg/kg的剂量施用时能够减少NK细胞的数量。例如，免疫球蛋白或抗体当施用至哺乳动物时在以约0.01mg/kg或0.1mg/kg或1mg/kg或10mg/kg的剂量施用时能够使NK细胞的数量在施用6小时内减少至少约50%。在一个实施例中，剂量为约0.01mg/kg或0.1mg/kg。
在一个实施例中，哺乳动物体内NK细胞的数量在施用免疫球蛋白或抗体后约7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或22或29或57天与施用免疫球蛋白或抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量相比增加。例如，NK细胞的数量在施用后至少约8或11或17或22或29天增加。例如，哺乳动物体内NK细胞的数量与施用免疫球蛋白或抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量相比增加约10%或20%或30%或50%或60%或70%或80%。例如，哺乳动物体内NK细胞的数量在以约0.001mg/kg与约0.1mg/kg之间的剂量施用抗体或免疫球蛋白后至少8天与施用免疫球蛋白或抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量相比增加约20%。例如，哺乳动物体内NK细胞的数量在以约0.001mg/kg与约0.1mg/kg之间的剂量施用抗体或免疫球蛋白后至少11、17、22或29天与施用免疫球蛋白或抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量相比增加约50%。在一个实施例中，抗体或免疫球蛋白是以0.01mg/kg与0.1mg/kg之间的剂量施用。例如，免疫球蛋白或抗体是以0.01mg/kg或0.1mg/kg的剂量施用。
基于本文的公开内容，本领域的技术人员显而易见，本公开提供当施用至哺乳动物时引起哺乳动物体内NK细胞的数量增加的免疫球蛋白或抗体。例如，免疫球蛋白或抗体当施用至哺乳动物时引起哺乳动物体内NK细胞的数量减少，接着NK细胞的数量增加。在一个实施例中，NK细胞的数量与施用免疫球蛋白或抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量相比增加或减少。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体在以约0.01mg/kg或0.1mg/kg的剂量施用时能够使哺乳动物体内NK细胞的数量在施用6小时内减少至少约50%并且哺乳动物体内NK细胞的数量在以约0.001mg/kg与0.1mg/kg之间的剂量施用抗体或免疫球蛋白后至少8天与施用免疫球蛋白或抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量相比增加约20%。
在一个实施例中，本公开提供包含本公开的免疫球蛋白或抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本公开还提供编码本公开的免疫球蛋白或抗体的分离的核酸。
核酸的示例性序列论述于编码本公开的抗体或免疫球蛋白的上下文中并且应了解为在作了必要的修改的情况下适用于本公开的当前实施例。
本公开还提供能够在高严谨性杂交条件下与本公开的核酸杂交的核酸。
本公开还包括本公开的分离的核酸的片段、同源物和衍生物。
本公开还提供包含本公开的分离的核酸和一个或多个其它核苷酸序列(如可操作地连接于核酸的启动子)的基因构建体。
在一个实施例中，基因构建体是包含表达载体和本公开的分离的核酸的表达构建体，其中所述分离的核酸可操作地连接于所述表达载体中的一个或多个调节性核酸。
在一个实施例中，本公开的基因构建体包含可操作地连接于启动子的编码多肽(例如包含VH)的核酸和可操作地连接于启动子的编码另一多肽(例如包含VL)的核酸。
在另一实施例中，基因构建体是双顺反子基因构建体，例如按5’至3’顺序包含以下可操作地连接的组分：
(i)启动子；
(ii)编码第一多肽的核酸；
(iii)内部核糖体进入位点；和
(iv)编码第二多肽的核酸。
例如，第一多肽包含VH且第二多肽包含VL或第一多肽包含VL且第二多肽包含VH。
本公开还涵盖单独的基因构建体，其中之一编码第一多肽(例如包含VH)且其中另一个编码第二多肽(例如包含VL)。例如，本公开还提供包含以下的组合物：
(i)第一表达构建体，其包含可操作地连接于启动子的编码多肽(例如包含VH)的核酸；和
(ii)第二表达构建体，其包含可操作地连接于启动子的编码多肽(例如包含VL)的核酸。
本公开还提供包含本公开的基因构建体的宿主细胞。
在一个实施例中，本公开提供表达本公开的免疫球蛋白或抗体或抗原结合片段的分离的细胞或经过遗传修饰以表达免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的重组细胞。
在一个实施例中，细胞包含本公开的基因构建体或：
(i)第一基因构建体，其包含可操作地连接于启动子的编码多肽(例如包含VH)的核酸；和
(ii)第二基因构建体，其包含可操作地连接于启动子的编码多肽(例如包含VL)的核酸，
其中第一和第二多肽形成本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。
基因构建体可整合至细胞中或保持游离形式。
本公开细胞的实例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本公开另外提供用于制造本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将本公开的基因构建体维持在足以产生免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的条件下。
在一个实施例中，用于制造本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的方法包括在足以产生和任选地分泌免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的条件下培养本公开的细胞。
在一个实施例中，用于制造本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的方法另外包括分离所述免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。
本公开另外提供用于制造本公开的重组免疫球蛋白或抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)培养含有本公开的表达载体的宿主细胞使得重组免疫球蛋白或抗体在所述宿主细胞中表达；和
(ii)分离所述重组免疫球蛋白。
在一个实施例中，用于制造本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的方法另外包括用药学上可接受的载体配制所述免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。
本公开还提供用于预防性或治疗性治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本公开的免疫球蛋白或抗体，由此治疗或预防所述疾病或病症的步骤。
在一个实施例中，哺乳动物为人。
在一个实施例中，哺乳动物需要治疗或预防。
在一个实施例中，有需要的哺乳动物罹患疾病或病症。
在一个实施例中，有需要的哺乳动物处于发展疾病或病症或复发所述疾病或病症的风险中。
本公开还提供本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段或本公开的组合物在药剂中的用途。
本公开另外或替代地提供本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段用于制造用于治疗哺乳动物的疾病或病症的药剂的用途。
本公开还提供用于治疗哺乳动物的疾病或病症的本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。
在一个实施例中，疾病或病症是IL-3Rα介导的疾病或病症。
在一个实施例中，疾病或病症是骨髓发育不良综合症。
在一个实施例中，疾病或病症是癌症，如血液癌症，例如白血病，如急性白血病(例如急性骨髓性白血病)或慢性白血病(例如慢性髓单核细胞性白血病)。
在一个实施例中，疾病或病症是IL-3Rα相关性癌症，例如白血病，即癌症(或白血病)的特征在于癌症(或白血病)细胞表达IL-3Rα。
在另一实施例中，癌症是恶性淋巴增值性病症，如淋巴瘤。
在一个实施例中，疾病或病症是自体免疫性病症或炎症性病症。例如，病症是狼疮(例如全身性红斑狼疮)、休格伦氏综合症或硬皮病(例如全身性硬皮病)。
在一个实施例中，方法包括施用有效量的免疫球蛋白，如治疗有效量的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。
在一个实施例中，方法包括向哺乳动物施用约0.0001mg/kg与50mg/kg之间的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。例如，方法包括施用约0.0005mg/kg至约40mg/kg之间。例如，方法包括施用约0.0005mg/kg至约30mg/kg之间。例如，方法包括施用约0.001mg/kg至约20mg/kg之间。例如，方法包括施用约0.001mg/kg至约10mg/kg之间。例如，方法包括施用约0.01mg/kg至约5mg/kg之间。例如，方法包括施用约0.001mg/kg至约1mg/kg之间。
在一个实施例中，方法包括施用约0.1mg/kg至约10mg/kg之间的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。例如，方法包括施用约0.1mg/kg至约5mg/kg之间。例如，方法包括施用约0.1mg/kg至约1mg/kg之间。
在一个实施例中，方法包括施用约10mg/kg至约30mg/kg之间的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。例如，方法包括施用约20mg/kg至约30mg/kg之间。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段是以0.01mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段是以0.1mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段是以1mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段是以10mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段是以30mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体向哺乳动物施用多次。在一个实施例中，施用之间的时期为至少约7天，如至少约8天，例如至少约9天或10天。在一个实施例中，施用之间的时期为至少约11天。在另一实施例中，施用之间的时期为至少约15天，如至少约16天，例如至少约18天或20天。在一个实施例中，施用之间的时期为至少约22天。在另一实施例中，施用之间的时期为至少约25天，如至少约30天，例如至少约40天或45天。在一个实施例中，施用之间的时期为至少约57天或60天。
例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合结构域是以0.0001mg/kg与5mg/kg之间，如0.0005mg/kg与5mg/kg之间，例如0.001mg/kg与5mg/kg之间的剂量施用，且施用之间的时期为至少约7天或8天或9天或10天或11天或14天或17天或21天或22天或28天或29天或30天或1个历月。例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合结构域是以0.01mg/kg与5mg/kg之间的剂量施用，且施用之间的时期为至少约7天或8天或9天或10天或11天或14天。例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合结构域是以0.01mg/kg与2mg/kg之间的剂量施用，且施用之间的时期为至少约7天或8天或9天或10天或11天或14天。例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合结构域是以0.01mg/kg与1mg/kg之间的剂量施用，且施用之间的时期为至少约7天或8天或9天或10天或11天或14天。在一些实施例中，施用之间的时期为至少约7天且少于约22天，如至少约11天或15天且少于约20天，例如至少约13天且少于约18天。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合结构域是以0.01mg/kg的剂量施用且施用之间的时期为6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合结构域是以0.1mg/kg的剂量施用且施用之间的时期为6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是以1mg/kg的剂量施用且施用之间的时期为6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天或20天或21天或22天。
例如，免疫球蛋白或抗体是以6mg/kg与50mg/kg之间的剂量施用且施用之间的时期为至少约15天。例如，免疫球蛋白或抗体是以10mg/kg与30mg/kg之间的剂量施用且施用之间的时期为至少约14或15天。例如，免疫球蛋白或抗体是以20mg/kg与30mg/kg之间的剂量施用且施用之间的时期为至少约14或15天。在一些实施例中，施用之间的时期为至少约20天且少于约70天，如至少约21或22天且少于约65天，例如至少约25天且少于约57天。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是以10mg/kg的剂量施用且施用之间的时期为14天或15天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是以30mg/kg的剂量施用且施用之间的时期为14天或15天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。
如上所述，发明人发现在施用本公开的免疫球蛋白或抗体后，NK细胞的数量在约8天内增加高于施用前存在的数量。发明人还证实，NK细胞数量增加使得本公开的抗体或免疫球蛋白诱导靶细胞死亡的功效增强。因此，一旦NK细胞的数量增加，即可施用另一剂量的抗体或免疫球蛋白以诱导治疗/预防作用。例如，本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段以约0.001mg/kg与约1mg/kg之间的剂量施用多次，其中施用之间的时期为至少约7天，如至少约8天，例如至少约11天，如至少约14天，例如至少约17天，如至少约21天，例如至少约22天，例如28天或29天或一个历月或56或57或60天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约7天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约8天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约11天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约14天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约17天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约21天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约22天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约28天。在一个实施例中，剂量之间的时期为约29天。剂量在约0.01mg/kg与约0.1mg/kg之间，如剂量为约0.01mg/kg或0.1mg/kg。
附图简要说明
图1A是示出在施用抗体CSL362X2后的不同时间点(如所示)来自非人灵长类动物受试者的样品中NK细胞的数量的图示。细胞数量表示为施用抗体前细胞数量的百分比。指出抗体的剂量。
图1B是示出在施用抗体CSL362B后的不同时间点(如所示)来自非人灵长类动物受试者的样品中NK细胞的数量的图示。细胞数量表示为施用抗体前细胞数量的百分比。指出抗体的剂量。
图1C是示出在施用包含人IgG1恒定结构域和抗体7G3的可变区的嵌合抗体(命名为CSL360)后的不同时间点(如所示)来自非人灵长类动物受试者的样品中NK细胞的数量的图示。细胞数量表示为施用抗体前细胞数量的百分比。指出抗体的剂量。
图2A是示出在指定细胞群体和不同浓度(如X轴上所示)的抗体CSL362X1存在下所溶解的TF-1细胞的百分比的图示。
图2B是示出在不同数量的NK细胞和抗体CSL362X1存在下AML细胞的百分比的图示。效应细胞(NK细胞；E)与靶细胞(白血病细胞；T)的比率在X轴上示出。描绘使用来自两位患者的细胞所产生的结果。
发明详述
序列表关键词
SEQ ID NO:1-IL-3Rα链的氨基酸序列
SEQ ID NO:2-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的LCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO:3-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的LCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO:4-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的LCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO:5-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的HCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO:6-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的HCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO:7-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的HCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO:8-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:9-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:10-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和CSL362B的重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:11-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362X1的重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:12-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362X2的重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:13-人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:14-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的LCDR1的核苷酸序列
SEQ ID NO:15-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的LCDR2的核苷酸序列
SEQ ID NO:16-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的LCDR3的核苷酸序列
SEQ ID NO:17-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的HCDR1的核苷酸序列
SEQ ID NO:18-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的HCDR2的核苷酸序列
SEQ ID NO:19-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的HCDR3的核苷酸序列
SEQ ID NO:20-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:21-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:22-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和CSL362B的重链的核苷酸序列
SEQ ID NO:23-编码人源化抗IL-3Rα链抗体CSL362和其修饰形式的轻链的核苷酸序列
总则
在本说明书中，除非另外明确陈述或上下文另外要求，否则提及单一步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组应理解为涵盖一个和多个(即一个或多个)这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组。
本领域的技术人员将了解，本公开易于进行除明确描述的以外的变化和修改。应了解，本公开包括所有这些变化和修改。本公开还包括本说明书中个别地或总体提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。
本公开的范围不受本文描述的特定实施例限制，所述实施例仅欲出于示例的目的。功能上等同的产物、组合物和方法明显在本公开的范围内。
本文本公开的任何实施例应理解为在作了必要修改的情况下适用于本公开的任何其它实施例，除非另外明确陈述。
除非另外明确定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语应理解为具有与本领域的普通技术人员通常所理解相同的含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。
除非另外说明，否则本公开中所用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域的技术人员所数值的标准程序。所述技术描述和说明于以下业内文献中，如：J.Perbal,A Practical Guide to MolecularCloning,John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编著),Essential Molecular Biology:A PracticalApproach,卷1和卷2,IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编著),DNA Cloning:A Practical Approach,卷1-4,IRL Press(1995和1996)；和F.M.Ausubel等(编著),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新)；编著Harlow和David Lane(编著)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)；和J.E.Coligan等(编著)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括迄今为止的所有更新)。
本文中的可变区和其部分、免疫球蛋白、抗体和其片段的描述和定义可通过Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991中的论述得到进一步澄清。
术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应理解成意思是“X和Y”或“X或Y”，且应理解为提供对两种含义或任一含义的明确支持。
在本说明书中，用语“包含(comprise)”或变体(如“comprises”或“comprising”)应理解为意指包括所述要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，而不排除任何其它要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。
如本文所用，术语“来源于”应理解为表示指定整体可以从特定来源获得，不过不必直接从所述来源获得。
所选定义
如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白基因复合物的任何抗原结合蛋白产物，包括免疫球蛋白同种型IgA、IgD、IgM、IgG和IgE以及其抗原结合片段。示例性免疫球蛋白为抗体。示例性免疫球蛋白为单克隆免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”中包括经过适当去免疫化由此减少或消除哺乳动物对已施用至所述哺乳动物的免疫球蛋白的免疫反应的任何免疫球蛋白。在治疗人的情况下，适合免疫球蛋白包括嵌合、人源化或人免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”中还包括无论是天然存在的或是通过人工介入(例如通过重组DNA技术)产生的，包含经过改造或变异型氨基酸残基、序列或糖基化的修饰、诱变、嵌合和/或人源化免疫球蛋白。示例性蛋白质包括Fc受体结合部分。例如，由术语“免疫球蛋白”涵盖的蛋白质包括结构域抗体、骆驼化抗体和来自软骨鱼的抗体(即，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))。一般来说，骆驼抗体和IgNAR包含VH，然而缺乏VL且通常称为重链免疫球蛋白。其它“免疫球蛋白”包括T细胞受体和能够结合抗原(例如借助于包含可变区的抗原结合位点)的其它含免疫球蛋白样结构域蛋白质。
本领域的技术人员将了解，“抗体”通常视为包含由多个多肽链(例如包含VL的多肽和包含VH的多肽)构成的可变区的蛋白质。抗体通常也包含恒定结构域，其中一些可排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。VH与VL相互作用形成包含能够特异性结合一个或数个密切相关的抗原的抗原结合区的Fv。一般来说，来自哺乳动物的轻链为κ轻链或λ轻链，且来自哺乳动物的重链为α、δ、ε、γ或μ。抗体可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。术语“抗体”涵盖人源化抗体。
术语“人源化抗体”应理解为表示包含人样可变区的抗体，包括来自非人物种(例如小鼠)的抗体的CDR移植到来自人抗体的FR上或***所述FR中(这种类型的抗体也称为“CDR移植抗体”)。人源化抗体还包括人抗体的一个或多个残基通过一个或多个氨基酸取代而被修饰和/或人蛋白质的一个或多个FR残基被置换为相应非人残基的抗体。如本文所例示，人源化抗体也可包含在人抗体或非人抗体中都没有发现的残基。抗体的任何其它区(例如Fc区)通常为人的。人源化可以使用本领域中已知的方法进行，例如US5225539、US6054297、US7566771或US5585089。术语“人源化抗体”还涵盖超人源化蛋白质，例如像US7732578中所述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换使用，表示呈大致上完整形式的抗体，与抗体的抗原结合片段不同。具体地说，完全抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体能够诱导一种或多种效应功能。
术语“裸抗体”是指未缀合任何化合物(例如毒性化合物或放射性标记)的抗体。
抗体的“抗原结合片段”包含完整抗体的抗原结合结构域和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在本公开的上下文中，“效应功能”是指由结合于导致杀死细胞的抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的细胞或蛋白质介导的那些生物活性。由抗体或免疫球蛋白诱导的效应功能的实例包括：补体依赖性细胞毒性；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；和B细胞活化。在本公开的上下文中，术语或“由抗体诱导的效应功能”或类似术语可与“免疫球蛋白的效应功能”或“抗体的效应功能”或类似术语互换使用且各自提供对彼此的文献支持。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种形式的细胞毒性，其中结合于存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀手(“NK”)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(“FcR”)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合带有抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC分析。适用于所述分析的效应细胞包括周边血液单核细胞(“PBMC”)和NK细胞。
如本文所用，“可变区”是指如本文所定义的轻链和/或重链中能够特异性结合抗原的部分，且例如包括CDR的氨基酸序列；即CDR1、CDR2和CDR3，和框架区(FR)。例如，可变区包含三个或四个FR(例如FR1、FR2、FR3和任选地FR4)以及三个CDR。VH是指重链的可变区。VL是指轻链的可变区。
如本文所用，术语“互补决定区”(同义词CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的氨基酸残基，其存在是特异性抗原结合的主要贡献因素。各可变区通常具有三个CDR区，标识为CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置是根据以下进行定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991(在本文中也称为“Kabat编号***”。根据Kabat编号***，VH FR和CDR如下定位：残基1-30(FR1)、31-35(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)和103-113(FR4)。根据Kabat编号***，VLFR和CDR如下定位：残基1-23(FR1)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)和98-107(FR4)。
“框架区”(下文FR)是除CDR残基以外的那些可变结构域残基。
如本文所用的术语“恒定区”是指抗体的重链和轻链中除可变区以外的部分。在重链中，恒定区通常包含多个恒定结构域和铰链区，例如IgG恒定区包含以下连接的组分：恒定重链(CH)1、连接子、CH2和CH3。在重链中，恒定区包含Fc。在轻链中，恒定区通常包含一个恒定结构域(a CL1)。
术语“可结晶的片段”或“Fc”或“Fc区”或“Fc部分”(它们在本文中可互换使用)是指抗体中包含至少一个恒定结构域且一般(但不一定)糖基化且能够结合一种或多种Fc受体和/或补体级联的组分的区。重链恒定区可选自以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，各种子类(如重链的IgG子类)的重链负责不同效应功能，且因此通过选择所需重链恒定区，可制造具有所需效应功能的蛋白质。示例性重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)和γ3(IgG3)，或其杂交体。
“恒定结构域”是抗体中序列与抗体/相同类型抗体(例如IgG或IgM或IgE)中的序列高度类似的结构域。抗体的恒定区通常包含多个恒定结构域，例如γ、α或δ重链的恒定区包含两个恒定结构域。
如本文所用，术语“特异性结合”应理解成意思是免疫球蛋白或抗体，其意思是免疫球蛋白或抗体与IL-3Rα链之间的结合相互作用依赖于由免疫球蛋白或抗体所结合的IL-3Rα链的抗原决定子或表位的存在。因此，免疫球蛋白或抗体优先结合或识别IL-3Rα链抗原决定子或表位，甚至在存在于其它分子或生物体的混合物中。在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体与其与替代抗原或细胞的反应或缔合相比，更经常地、更快速地、以更长持续时间和/或以更高亲和力与IL-3Rα或表达IL-3Rα的细胞反应或缔合。通过阅读此定义还应了解，特异性结合IL-3Rα的免疫球蛋白或抗体可能或可能不特异性结合第二抗原。因此，“特异性结合”不必要求排他性结合或与另一抗原的结合不可检测。术语“特异性结合”与“选择性结合”在本文中可互换使用。一般来说，本文中提及的结合意思是特异性结合，且各术语应理解为提供对其它术语的明确支持。“.在一个实施例中，与IL-3Rα或表达IL-3Rα的细胞“特异性结合”意思是免疫球蛋白或抗体结合IL-3Rα或表达IL-3Rα的细胞的平衡常数(KD)为100nM或更低，如50nM或更低，例如20nM或更低，如1nM或更低，例如0.8nM或更低。
术语“Kabat的EU编号***”应理解成意思是抗体重链的编号是根据Kabat等,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda中所教导的EU索引。EU索引是基于人IgG1EU抗体的残基编号。
如本文所用，术语“IL-3Rα介导的病症”应理解成意思是与过度IL-3Rα表达和/或哺乳动物体内表达IL-3Rα的细胞(如癌细胞(例如白血病细胞)和/或免疫细胞(例如浆细胞样树突状细胞))数量过高相关或由其引起的病症。
如本文所用，术语“骨髓发育不良综合症”或“MDS”应理解为表示涉及骨髓类血液细胞的产生低效(或发育不良)的血液医学病症的不同集合。患有MDS的受试者通常发生严重贫血且可能需要频繁输血。在许多情况下，随着MDS发展，受试者因进行性骨髓衰竭而发生血细胞减少症(低血球计数)。在约三分之一的MDS患者中，疾病转化为急性骨髓性白血病(AML)。MDS可以诊断或归类为各种***，包括French-American-British分类***(Bennett等,Br.J.Haematol.33:451–458,1976)、国际预后评分***(International Prognostic ScoringSystem)(Greenberg等,Blood89:2079-88,1997)或世界卫生组织所公布的***。
如本文所用，术语“治疗”是指设计用来在临床病理学过程中改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床介入。治疗的合意效果包括降低疾病发展速率、改善或缓解疾病病况和缓和或预后改良。例如当与疾病相关的一种或多种症状得到减轻或消除时，个体得到成功“治疗”。
如本文所用，术语“预防”包括关于个体的疾病的发生或复发提供预防。个体可能容易发生疾病或疾病复发或具有发生疾病或疾病复发的风险，但尚未诊断出疾病或复发。
如本文所用，具有发生疾病或病症或复发疾病或病症或复发的“风险”的哺乳动物在根据本公开治疗之前可能具有或可能不具有可检测到的疾病或疾病症状，并且可能已显示或可能未显示可检测到的疾病或疾病症状。“具有风险”表示哺乳动物具有一个或多个风险因素，其是如本领域中所已知和/或本文所述与疾病或病症的发展有关的可测量的参数。
“有效量”是指在必需剂量下且持续必需的时期，至少有效实现所需治疗或预防结果的量。有效量可以在一次或多次施用中提供。在本公开的一些实施例中，术语“有效量”意思是实现如前文所述的疾病或病症的治疗所必需的量。有效量可以根据所欲治疗的疾病或病症并且也可以根据与所治疗的哺乳动物有关的体重、年龄、种族背景、性别、健康状况和/或身体状况和其它因素而变化。通常，有效量将处于可以通过医学从业者的常规试验和实验来确定的相对广泛的范围(例如“剂量”范围)内。有效量可以在单次剂量或在治疗期内在重复一次或若干次的剂量中施用。
“治疗有效量”是实现特定病症(例如SLE)的可测量的改良所需要的至少最低浓度。本文中的治疗有效量可以根据以下因素而变化，如患者的疾病病况、年龄、性别和体重以及免疫球蛋白或抗体在个体体内引发所需反应的能力。治疗有效量还是治疗有益效果胜过免疫球蛋白或抗体的任何毒性或有害作用的量。
“预防有效量”是指在必需剂量下且持续必需的时期，有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病前或疾病在早期阶段用于哺乳动物，所以预防有效量可以小于治疗有效量。
本文提及“哺乳动物体内NK细胞的数量”应理解为包括来自哺乳动物的样品中NK细胞的数量并且不需要测定哺乳动物体内NK细胞的总数。此数量可表示为例如每mL或dL的细胞数或在一定时间内的不同点从哺乳动物所取的样品中细胞数的百分比。
仅出于***命名的目的且不加限制，IL-3Rα链的氨基酸序列教导于基因ID保藏编号3563和/或SEQ ID NO:1中。
根据本公开治疗的“哺乳动物”可以是如非人灵长类动物或人等哺乳动物。在一个实施例中，哺乳动物为人。
术语“序列同一性”在本文中以其最广泛意义使用，包括使用标准算法考虑到适当比对、考虑到在比较窗口上序列相同的程度时确切核苷酸或氨基酸匹配的数目。序列同一性可以通过使用算法的计算机实施来比对比较序列(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group,575Science Drive Madison,WI,USA,incorporatedherein by reference)或通过各种所选方法中任一个所产生的检验和最佳比对(即，在比较窗口上产生最高同源性百分比)来确定。也可参考BLAST程序族，例如像Altschul等,1997,Nucl.Acids Res.253389所公开。序列分析的详细论述可见于Ausubel等编著的CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley&Sons IncNY，1995-1999)的第19.3单元中。
本公开还提供本公开的抗IL-3Rα免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的衍生物。如本文所用，“衍生物”蛋白质例如已通过本领域中所了解的翻译后修饰(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化修饰(例如添加、除去或改变糖基化)和/或纳入其它氨基酸序列得到改变。
如本文所用的术语“核酸”表示能够编码本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段或其多肽组分的单链或双链DNA和RNA。DNA包括基因组DNA和cDNA。RNA包括mRNA和cRNA。核酸还可以是DNA-RNA杂交体。核酸包含通常包括包含A、G、C、T或U碱基的核苷酸的核苷酸序列。然而，核苷酸序列可以包括其它碱基，如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿核苷，不过不限于此。
“杂交”在本文中用于表示至少部分互补的核苷酸序列配对以产生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA杂交体。包含互补核苷酸序列的杂交序列通过互补嘌呤与嘧啶之间的碱基配对而发生，如本领域中所熟知。
在此方面，应了解，经过修饰的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和经过修饰的嘧啶(例如硫尿核苷和甲基胞嘧啶)也可以在碱基配对中接合。
如本文所用的“严谨性”是指杂交期间的温度和离子强度以及某些有机溶剂和/或清洁剂的存在或不存在。严谨性越高，则杂交的核苷酸序列之间所需的互补性程度也越高。
“高严谨性条件”表示仅具有高互补碱基频率的核酸可以杂交的那些条件。
本文提及高严谨性条件包括且涵盖：-
(i)至少约31%v/v至至少约50%v/v甲酰胺和至少约0.01M至至少约0.15M盐用于在42℃下杂交，以及至少约0.01M至至少约0.15M盐用于在42℃下洗涤；
(ii)1%BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7%SDS用于在65℃下杂交，且(a)0.1×SSC、0.1%SDS；或(b)0.5%BSA、1mMEDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、1%SDS用于在超过65℃的温度下洗涤约一小时；和
(iii)0.2×SSC、0.1%SDS用于在68℃或超过68℃下洗涤约20分钟。
一般来说，洗涤在Tm=69.3+0.41(G+C)％-12℃下进行。通常，失配碱基数量每增加1％，双链体DNA的Tm降低约1℃。
尽管如上所述，但严谨条件在本领域中是已知的，如Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY John Wiley&Sons,Inc.1995-2009的第2.9和2.10章中所述。
“表达载体”可以是自我复制型的染色体外载体(如质粒)或整合至宿主基因组中的载体。
免疫球蛋白
适当地，本公开的免疫球蛋白或抗体选择性结合IL-3Rα链，这意思是免疫球蛋白或抗体与IL-3Rα链之间的结合相互作用是依赖于免疫球蛋白所结合的IL-3Rα链的抗原决定子或表位的存在。因此，免疫球蛋白或抗体优先结合或识别IL-3Rα链抗原决定子或表位，甚至在存在于其它分子或生物体的混合物中。
抗体
在一个实施例中，根据任何实施例的本文所述的免疫球蛋白是抗体，例如包含本文所述的CDR和/或一个或多个可变区的抗体。
适当地，免疫球蛋白是包含分别根据SEQ ID NO:2-7的轻链和重链CDR1、2和3氨基酸序列的人源化、嵌合或人抗体。在一个实施例中，抗体包含SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO:8的轻链可变区氨基酸序列。在一个实施例中，抗体包含SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列和SEQID NO:13的轻链氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体是重组抗体。制造包含本文所述的CDR和/或可变区的抗体的方法基于本文的公开内容和/或本文提及的文献对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。
在一个实施例中，本公开的抗体包含含有本文所示的CDR和来自人抗体的FR的VH和/或VL。任选地，FR包含一个或多个氨基酸取代，例如2个或更多个，或3个或更多个，或4个或更多个，或5个或更多个，或10个或更多个，或15个或更多个。在一个实施例中，FR包含与人FR相比不超过30个氨基酸取代，例如不超过20个氨基酸取代。
在一个实施例中，本公开的抗体包含含有本文所示的CDR和来自非人灵长类动物抗体的FR的VH和/或VL，即抗体是共人源化抗体，例如像WO2007/019620中所述。
在一个实施例中，本公开的抗体是复合抗体，例如像WO2006/082406中所述。
本公开的一种示例性抗体是人源化抗体，例如像本文所定义。示例性人源化抗体在本文中描述。在一个实施例中，人源化抗体已经过亲和力成熟。在一个实施例中，人源化抗体包含：
(i)包含以下的VL：
a)包含SEQ ID NO:2中所示的序列(或由SEQ ID NO:14中所示的序列编码)的CDR1；
b)包含SEQ ID NO:3中所示的序列(或由SEQ ID NO:15中所示的序列编码)的CDR2；和
c)包含SEQ ID NO:4中所示的序列(或由SEQ ID NO:16中所示的序列编码)的CDR3；和
(ii)包含以下的VH：
d)包含SEQ ID NO:5中所示的序列(或由SEQ ID NO:17中所示的序列编码)的CDR1；
e)包含SEQ ID NO:6中所示的序列(或由SEQ ID NO:18中所示的序列编码)的CDR2；和
f)包含SEQ ID NO:7中所示的序列(或由SEQ ID NO:19中所示的序列编码)的CDR3。
本领域的技术人员应了解，本公开的免疫球蛋白或抗体可以包括引入人体内未天然发现的序列例如以增强亲和力或效应功能的修饰。
本公开还提供本公开的免疫球蛋白或抗体的变体。适当地，变体与SEQ ID NO:2-13中所示的任何氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
例如，在本领域中了解，一些氨基酸可以取代或缺失而不会不利地或显著地影响免疫球蛋白或抗体的IL-3Rα特异性和/或效应功能(例如保守性取代)。
本公开所涵盖的抗体或免疫球蛋白的衍生物包括但不限于氨基酸侧链的修饰、在肽或多肽合成期间并入非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交联剂。
本公开的示例性抗体和其抗原结合片段描述于表1中。
表1：示例性抗体和其抗原结合片段
名称 重链SEQ ID NO: 轻链SEQ ID NO:
CSL362Fv 91 81
CSL362 10 13
CSL362B 102 13
CSL362X1 11 13
CSL362X2 12 13
1仅可变区序列。
2重链恒定区为无岩藻糖基化的。
抗体片段
单结构域抗体
在一些实施例中，本公开的抗体的抗原结合片段是单结构域抗体或包含单结构域抗体(其与术语“结构域抗体”或“dAb”可互换使用)。单结构域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或一部分的单一多肽链。
双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体
在一些实施例中，本公开的抗原结合片段是双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或更高级蛋白质复合物或包含双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或更高级蛋白质复合物，如WO98/044001和/或WO94/007921中所述的那些。
例如，双功能抗体是包含两个缔合多肽链的蛋白质，各多肽链包含结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中X是包含不足以允许单一多肽链中的VH和VL缔合(或形成Fv)的残基的连接子或不存在，且其中一个多肽链的VH结合另一多肽链的VL以形成抗原结合位点，即形成能够特异性结合一个或多个抗原的Fv分子。各多肽链中的VL和VH可以相同或者各多肽链中的VL和VH可以不同以便形成双特异性双功能抗体(即，包含两个具有不同特异性的Fv)。
能够诱导效应活性的双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体等可以使用能够结合IL-3Rα的抗原结合结构域和能够结合免疫细胞(例如T细胞，例如CD3)上的细胞表面分子的抗原结合结构域来制造。
单链Fv(scFv)片段
本领域的技术人员将了解，scFv在单一多肽链中包含VH和VL区并且在VH与VL之间包含多肽连接子，所述连接子使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构(即，使得单一多肽链的VH与VL能够彼此缔合以形成Fv)。例如，连接子包含超过12个氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3为一个用于scFv的更有利连接子。
本公开还涵盖经过二硫键稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中在VH的FR和VL的FR中引入单个半胱氨酸残基并且所述半胱氨酸残基由二硫键连接以产生稳定Fv。
或者或另外，本公开涵盖二聚scFv，即包含两个由非共价或共价键联(例如，通过亮氨酸拉链结构域(例如来源于Fos或Jun))连接的scFv分子的蛋白质。或者，两个scFv由长度足以允许这两个scFv形成并且结合抗原的肽连接子连接，例如像US20060263367中所述。
本公开还涵盖能够诱导效应活性的二聚scFv。例如，一个scFv结合IL-3Rα且包含本文所述的CDR和/或可变区并且另一scFv结合免疫细胞(例如T细胞，例如CD3或CD19)上的细胞表面分子。在一个实施例中，二聚蛋白质是dAb与scFv的组合。能够诱导效应功能的双特异性抗体片段的实施例描述于例如US7235641中。
其它抗体和抗体片段
本公开还涵盖其它抗体和抗体片段，如：
(i)“钥孔(key and hole)”双特异性蛋白质，如US5,731,168中所述；
(ii)杂缀合蛋白质，例如像US4,676,980中所述；
(iii)使用化学交联剂制造的杂缀合蛋白质，例如像US4,676,980中所述；和
(iv)Fab3(例如像EP19930302894中所述)。
恒定区
本公开涵盖包含抗体的恒定区和/或抗体的Fc区的免疫球蛋白和抗体和抗原结合片段。
适用于制造本公开的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的恒定区和/或Fc区的序列可以获自多种不同来源。在一些实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的恒定区、Fc或其部分是来源于人抗体。恒定区、Fc或其部分可以来源于任何抗体类别，包括IgA、IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何抗体同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施例中，恒定区或Fc是人同种型IgG1或人同种型IgG2或人同种型IgG3或任何上述同种型的杂交体。
在一个实施例中，恒定区或Fc区能够诱导效应功能。例如，恒定区或Fc区是人IgG1或IgG3Fc区。在另一实施例中，恒定区或Fc区是IgG1与IgG2恒定区或Fc区的杂交体或者IgG1与IgG3恒定区或Fc区的杂交体或者IgG2与IgG3恒定区或Fc区的杂交体。人IgG1与IgG2恒定区或Fc区的示例性杂交体描述于Chappel等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,88:9036-9040,1991中。
确定Fc区可以抑或不可以诱导效应功能的方法对于本领域的技术人员将显而易见和/或在本文中描述。
效应功能
适当地，本公开的抗IL-3Rα免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段具有或显示有助于IL-3Rα+细胞或使得IL-3Rα+细胞能够至少部分去除、大致上去除或消除的效应功能。这种效应功能可以是增强的与Fc受体的结合亲和力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本领域的技术人员基于本文的描述将显而易见，本公开的一些实施例包括能够诱导效应功能的免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段。
对于IgG类抗体，这些效应功能受制于Fc区与表达于多种免疫细胞上的称为Fcγ受体(FcγR)的受体家族和/或与补体(例如C1q)的接合。Fc/FcγR复合物的形成将这些细胞募集至所结合抗原的位点，通常引起信号传导和后续免疫反应。优化FcγR对抗体Fc区的结合亲和力以便增强效应功能，特别是相对于“亲本”Fc区改变ADCC和/或CDC活性的方法对于本领域的技术人员来说是已知的。这些方法可以包括修饰抗体的Fc区以增强其与相关Fc受体的相互作用和增加其促进ADCC和ADCP的潜力。也已描述在修饰与IgG1抗体的Fc区中的保守Asn297连接的寡糖后ADCC活性得到增强。
就这点来说，应了解，在一些非限制性实施例中，增强效应功能(如ADCC)可以通过修饰具有正常糖基化的野生型恒定结构域的免疫球蛋白或抗体(包括改变或除去糖基化(参见例如WO00/61739)和/或氨基酸序列突变(参见例如WO2008036688))来实现。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段以使得其能够诱导效应功能(如ADCC)的方式结合IL-3Rα。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段结合IL-3Rα内允许其诱导效应功能(如ADCC)的表位。
在另一实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段能够结合哺乳动物体内细胞上的IL-3Rα，由此诱导效应功能，如ADCC。
例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段保持与细胞表面上的IL-3Rα结合维持足以诱导效应功能(如ADCC)的时间。例如，免疫球蛋白或抗体不会内化得太快，从而允许诱导ADCC。
或者或另外，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段以允许免疫效应细胞结合免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段中的恒定区或Fc区且诱导效应功能(如ADCC)的方式与细胞表面上的IL-3Rα结合。例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的Fc区以使得当免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段与IL-3Rα结合时能够与免疫效应细胞上的Fc受体(例如FcγR)相互作用的方式暴露。在本公开的上下文中，术语“免疫效应细胞”应理解为意思是表达Fc受体且能够通过ADCC或ADCP杀死其所结合的细胞的任何细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞是NK细胞。
上述涉及免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段的各段落应理解为在作了必要修改的情况下适用于诱导CDC。例如，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段以允许补体组分C1q结合免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段中的恒定区或Fc区且诱导CDC的方式与细胞表面上的IL-3Rα结合。
在一个实施例中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段能够诱导增强水平的效应功能。
在一个实施例中，由恒定区或Fc区诱导的效应功能的水平相对于野生型IgG1抗体恒定区或Fc区或野生型IgG3抗体恒定区或Fc区得到增强。
在另一实施例中，恒定区或Fc区经过修饰以与没有修饰的恒定区或Fc区相比增强其所能够诱导的效应功能的水平。所述修饰可以位于氨基酸层面和/或二级结构层面和/或三级结构层面和/或恒定区或Fc区的糖基化。
本领域的技术人员将了解，较高效应功能可以多种方式中的任一种表现，例如表现为较高作用水平、更持续作用或较快作用速率。
例如，抗IL-3Rα免疫球蛋白、抗体或抗原结合片段具有或显示包括抗议依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在内的效应功能。
在一个实施例中，恒定区或Fc区包含一个或多个增强其诱导增强的效应功能的能力的氨基酸修饰。在一个实施例中，恒定区或Fc区以较高的亲和力结合一个或多个FcγR。在一个实施例中，恒定区或Fc区对FcγR的亲和力是野生型恒定区或Fc区亲和力的1倍以上或野生型恒定区或Fc区亲和力的5倍以上或在野生型恒定区或Fc区亲和力的5倍与300倍之间。在一个实施例中，恒定区或Fc区在选自由以下组成的组的位置包含至少一个氨基酸取代：230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332和335，根据Kabat的EU索引编号。在一个实施例中，恒定区或Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R和T335Y，根据Kabat的EU索引编号。在一个实施例中，恒定区或Fc区包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A330I、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、K326I、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V266I、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I、S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326E和S239D/A330Y/I332E/K326T，根据Kabat的EU索引编号。
在另一实施例中，恒定区或Fc区结合FcγRIIIa的效率高于FcγRIIb。例如，恒定区或Fc区在选自由以下组成的组的位置包含至少一个氨基酸取代：234、235、239、240、264、296、330和I332，根据Kabat的EU索引编号。在一个实施例中，恒定区或Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：L234Y、L234I、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、V240M、V264I、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A330I、I332D和I332E，根据Kabat的EU索引编号。例如，恒定区或Fc区包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：I332E、V264I/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、Y296Q、A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L234I、L235I、V240A、V240M、V264Y、A330I、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和S239D/V264I/A330L/I332E，根据Kabat的EU索引编号。
在另一实施例中，恒定区或Fc区诱导的ADCC的水平高于野生型恒定区或Fc区介导的ADCC的水平。例如，恒定区或Fc区诱导的ADCC的水平是野生型恒定区或Fc区诱导的ADCC的水平的5倍以上或在5倍与1000倍之间。在一个实施例中，恒定区或Fc区在选自由以下组成的组的位置包含至少一个氨基酸取代：230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332和335，根据Kabat的EU索引编号。在一个实施例中，恒定区或Fc区包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R和T335Y，根据Kabat的EU索引编号。在一个实施例中，恒定区或Fc区包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A330I、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、K326I、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V266I、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I、S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326E和S239D/A330Y/I332E/K326T，根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施例中，恒定区或Fc区包含以下氨基酸取代S239D/I332E，根据Kabat的EU索引编号。此恒定区或Fc区对FcγRIIIa的亲和力相比于野生型恒定区或Fc区增加约14倍且诱导ADCC的能力相比于野生型恒定区或Fc区增加约3.3倍。在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:11的残基121-450之间(包括残基121-450)所示的序列。在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:11的残基234-450之间所示的序列。
在一个实施例中，恒定区或Fc区包含以下氨基酸取代S239D/A330L/I332E，根据Kabat的EU索引编号。此恒定区或Fc区对FcγRIIIa的亲和力相比于野生型恒定区或Fc区增加约138倍且诱导ADCC的能力相比于野生型恒定区或Fc区增加约323倍。在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:12的残基121-450之间(包括残基121-450)所示的序列。在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO:12的残基234-450之间所示的序列。
增强Fc区诱导效应功能的能力的其它氨基酸取代在本领域中是已知的和/或描述于例如US6737056或US7317091中。
在一个实施例中，改变恒定区或Fc区的糖基化以增强其诱导增强的效应功能的能力。就这点来说，由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，所述寡糖通常由N型键联连接至恒定区或Fc区的CH2结构域的Asn297。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至双触角寡糖结构的“茎干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，本公开的恒定区或Fc区包含缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构，即Fc区是“无岩藻糖基化”的。所述变体可以具有提高的诱导ADCC的能力。制造无岩藻糖基化抗体的方法包括在不能表达α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的细胞系中表达免疫球蛋白或抗体(例如像Yumane-Ohnuki等,Biotechnol.Bioengineer.,87:614-622,2004中所述)、在表达针对FUT8的小干扰RNA的细胞中表达免疫球蛋白或抗体(例如像Mori等,Biotechnol.Bioengineer.,88:901-908,2004中所述)、在不能表达鸟苷二磷酸(GDP)-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)的细胞中表达免疫球蛋白或抗体(例如像Kanda等,J.Biotechnol.,130:300-310,2007中所述)。本公开还涵盖使用岩藻糖基化水平降低的免疫球蛋白，例如使用经过修饰以表达β-(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnT-III)的细胞所产生的免疫球蛋白(例如像Umāna等,Nat.Biotechnol.,17:176-180,1999中所述)。
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体是无岩藻糖基化的。例如，免疫球蛋白或抗体是在不表达FUT8的细胞(例如哺乳动物细胞，如CHO细胞)中产生。
其它方法包括使用固有地产生能够诱导增强的Fc介导的效应功能的抗体的细胞系(例如用于制造病毒疫苗的鸭胚来源的干细胞，WO2008/129058；在禽类
Figure BDA00002778180900381
细胞中制造重组蛋白，WO2008/142124)。
适用于本公开方法中的免疫球蛋白还包括具有等分寡糖者，例如其中连接于恒定区或Fc区的双触角寡糖由GlcNAc等分。所述免疫球蛋白可以具有减少的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。所述免疫球蛋白的实例描述于例如US6602684和US20050123546中。
还涵盖在连接至恒定区或Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以具有提高的CDC功能。所述免疫球蛋白描述于例如WO1997/30087和WO1999/22764中。
诱导增强水平的ADCC活性的免疫球蛋白的非限制性实例包括
(i)包含含有SEQ ID NO:11中所示的序列的重链和含有SEQ IDNO:13中所示的序列的轻链的抗体；
(ii)包含含有SEQ ID NO:12中所示的序列的重链和含有SEQ IDNO:13中所示的序列的轻链的抗体；和
(iii)包含含有SEQ ID NO:10中所示的序列的重链和含有SEQ IDNO:13中所示的序列的轻链的抗体，其中重链恒定区是无岩藻糖基化的。
本公开的诱导增强水平的ADCC活性的有利抗体包含含有SEQID NO:11中所示的序列的重链和含有SEQ ID NO:13中所示的序列的轻链。如本文所论述，在将此抗体施用至哺乳动物后(例如施用后至少7或8或11或17或22或29天)，哺乳动物体内NK细胞的数量相比于以下的一个或多个增加：
(i)施用抗体前哺乳动物体内NK细胞的数量；
(ii)施用包含含有SEQ ID NO:10中所示的序列的重链和含有SEQ ID NO:13中所示的序列的轻链的抗体的哺乳动物体内NK细胞的数量，其中重链恒定区是无岩藻糖基化的(例如，如在施用后的同一天所评估)；和
(iii)施用特异性结合IL-3Rα链且具有人IgG1恒定区的抗体的哺乳动物体内NK细胞的数量(例如，如在施用后的同一天所评估)。
用于测定免疫球蛋白或抗体诱导效应功能的能力的方法在本领域中是已知的和/或在本文中更详细描述。
其它修饰
本公开还涵盖对免疫球蛋白的其它修饰。
例如，免疫球蛋白或抗体包含一个或多个增加免疫球蛋白的半衰期的氨基酸修饰。例如，免疫球蛋白或抗体包含含有一个或多个增强恒定区或Fc区对新生儿Fc区(FcRn)的亲和力的氨基酸取代的恒定区或Fc区。例如，恒定区或Fc区在较低pH(例如约pH6.0)下对FcRn的亲和力增强，从而有助于内体中的Fc/FcRn结合。在一个实施例中，恒定区或Fc区在约pH6下对FcRn的亲和力与其在约pH7.4下的亲和力相比增强，这有助于恒定区或Fc在细胞再循环后再释放至血液中。这些氨基酸取代适用于通过降低血液清除率而延长免疫球蛋白的半衰期。
示例性氨基酸取代包括T250Q和/或M428L，根据Kabat的EU编号***。其它或替代氨基酸取代描述于例如US20070135620中。
核酸
本公开的另一实施例提供编码本公开的免疫球蛋白或抗体(包括免疫球蛋白或抗体的片段、变体和衍生物)的分离的核酸。
核酸的某些实例包含SEQ ID NO:14-19中的一个或多个中所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:14-19分别编码本公开的免疫球蛋白或抗体的CDR1-6。
核酸的其它实例包含SEQ ID NO:20-23中的一个或多个中所示的核苷酸序列。
本公开还涵盖编码如上文所述的本公开的免疫球蛋白或抗体的变体的核酸同源物。
示例性核酸同源物与编码SEQ ID NO:2-13中任一个的分离的核酸共享至少80%或85%，如至少90%或95%或99%的核苷酸序列同一性。适当地，核酸同源物不编码包含能够特异性结合IL-3Rα的鼠类可变区的蛋白质。
核酸同源物可以在高严谨性条件下与本公开的分离的核酸杂交。
蛋白质制造
重组表达
在一个实施例中，本文根据任何实施例描述的免疫球蛋白或抗体是重组的。
仅举例来说，本公开的重组免疫球蛋白或抗体可以通过包括以下步骤的方法来制造：
(i)制备包含可操作地连接于一个或多个调节性核苷酸序列(例如启动子)的本公开的分离的核酸的表达构建体；
(ii)用所述表达构建体转染或转化适合宿主细胞；
(iii)在所述宿主细胞中表达重组免疫球蛋白或抗体；和
(iv)从所述宿主细胞分离所述重组免疫球蛋白或抗体。
在重组免疫球蛋白的情况下，可将编码其的核酸克隆至表达载体中，所述表达载体接着转染至宿主细胞中，如大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或本来不产生免疫球蛋白或抗体蛋白质的骨髓瘤细胞。
用于表达免疫球蛋白或抗体的示例性细胞为CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。细胞可进一步包含一个或多个有利于表达修饰的免疫球蛋白或抗体的突变和/或缺失。一个非限制性实例是编码所表达免疫球蛋白或抗体的岩藻糖基化所需的酶的基因缺失。例如，所缺失的基因编码FUT8。FUT8缺失CHO细胞的一个可商购获得的来源是Biowa(PotelligentTM细胞)。例如，用于表达无岩藻糖基化免疫球蛋白或抗体细胞是FUT8缺失CHO细胞，如Biowa的PotelligentTM细胞。
用于实现这些目的的分子克隆技术在本领域中是已知的且描述于以下文献中，例如Ausubel等(编著),Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新)或Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。多种克隆和体外扩增方法适用于构建重组核酸。制造重组抗体的方法在本领域中也是已知的。参见US4816567或US5530101。
分离后，将核酸***可操作地连接于基因构建体或表达载体中的启动子以供进一步克隆(扩增DNA)或在无细胞***或细胞中表达。因此，本公开的另一实施例提供包含本公开的分离的核酸和一个或多个其它核苷酸序列的基因构建体。适当地，基因构建体是呈质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的形式或包含这些形式的遗传组分，如本领域中所熟知。基因构建体可以适用于在细菌或其它宿主细胞中维持和增殖分离的核酸，以供通过重组DNA技术进行操作和/或表达本公开的核酸或所编码的免疫球蛋白或抗体。出于宿主细胞表达的目的，基因构建体是表达构建体。适当地，表达构建体包含可操作地连接于表达载体中的一个或多个其它序列(如启动子或调节性序列)的本公开核酸。
通常，调节性核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。
如本文所用，术语“启动子”应以其最广泛情形理解且包括基因组基因的转录调节序列，包括精确转录起始所需的TATA盒或起始因子元件，有或没有改变核酸表达(例如回应于发育和/或外部刺激物，或以组织特异性方式)的其它调节元件(例如上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)。在本公开的上下文中，术语“启动子”也用于描述重组、合成或融合核酸，或赋予、活化或增强其所可操作地连接的核酸的表达的衍生物。示例性启动子可以含有一个或多个特定调节元件的额外拷贝以进一步增强表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
如本文所用，术语“可操作地连接于”意思是相对于核酸定位启动子以使所述核酸的表达受所述启动子控制。
多种用于在细胞中表达的载体可获得。载体组分通常包括但不限于以下一个或多个：信号序列、编码免疫球蛋白或抗体的序列(例如由本文提供的信息得到)、增强子元件、启动子和转录终止序列。本领域的技术人员将了解适用于表达免疫球蛋白的序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II)、酵母分泌信号(例如转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如单纯疱疹gD信号)。
在哺乳动物中具有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒极早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α肌球蛋白重链启动子、猿病毒40启动子(SV40)、劳斯肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β肌动蛋白启动子或免疫球蛋白或抗体启动子或其活性片段的杂交调节元件。适用宿主细胞系的实例为用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
适合在酵母细胞(如选自包含巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe))中表达的典型启动子包括但不限于ADHl启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
用于将分离的核酸或包含所述核酸的表达构建体引入细胞中以供表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定细胞的技术取决于已知成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(如使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))介导的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(如使用涂有DNA的钨粒子或金粒子(Agracetus Inc.,WI,USA)以及其它方式。
用于产生免疫球蛋白或抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养，取决于所用细胞类型。可商购获得的培养基(如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMl-1640(Sigma)和杜尔贝科氏改良依格培养基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)，Sigma)适于培养哺乳动物细胞。用于培养本文所述的其它细胞类型的培养基在本领域中是已知的。
蛋白质的分离
用于纯化免疫球蛋白或抗体的方法在本领域中是已知的和/或在本文中描述。
当免疫球蛋白或抗体是分泌至培养基中时，可首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自所述表达***的上清液。可在任何前述步骤中纳入蛋白酶抑制剂(如PMSF)以抑制蛋白水解并且可纳入抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如离子交换、羟磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱(例如蛋白质A亲和色谱或蛋白质G色谱)或前述方法的任何组合来纯化从细胞中制备的免疫球蛋白或抗体。这些方法在本领域中是已知的并且例如描述于WO99/57134或EdHarlow和David Lane(编著)Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbour Laboratory,(1988)中。
本领域的技术人员还将了解，可对免疫球蛋白或抗体进行修饰以包括标签，以便促进纯化或检测，例如聚组氨酸标签，例如六聚组氨酸标签，或流感病毒血球凝集素(HA)标签，或猿病毒5(V5)标签，或FLAG标签，或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。接着使用本领域中已知的方法(如亲和纯化)对所得免疫球蛋白或抗体进行纯化。例如，包含六聚组氨酸标签的免疫球蛋白或抗体可通过使包含免疫球蛋白或抗体的样品与固定在固体或半固体支持物上的特异性结合六聚组氨酸标签的镍-氮基三乙酸(Ni-NTA)接触，洗涤样品以除去未结合的免疫球蛋白并随后洗脱结合的免疫球蛋白来纯化。或者或另外，在亲和纯化方法中使用结合标签的配体或抗体。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体还具有蛋白酶裂解位点，如因子Xa或凝血酶的蛋白酶裂解位点，其允许相关蛋白酶部分消化免疫球蛋白或抗体并由此使免疫球蛋白或抗体从标签释放。接着可通过后续色谱分离使所释放的抗体或免疫球蛋白与融合配偶体分离。
分析免疫球蛋白的活性
本公开的免疫球蛋白或抗体可以容易地针对生物活性进行筛选，例如像下文所述。
结合分析
一种形式的所述分析是抗原结合分析，例如像Scopes(Proteinpurification:principles and practice,第三版,Springer Verlag,1994)中所述。这种方法通常涉及标记免疫球蛋白或抗体和使其与固定的抗原接触。洗涤以除去非特异性结合的蛋白质后，检测标记的量并由此检测到所结合蛋白质的量。当然，可以固定免疫球蛋白或抗体并标记抗原。也可以使用例如像本文所述或例示的淘选型分析。
测定中和作用
在本公开的一些实施例中，免疫球蛋白或抗体能够中和IL-3信号传导。
用于评估免疫球蛋白中和配体通过受体进行信号传导的能力的各种分析在本领域中是已知的。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体减少或阻止IL-3与3Rα链和/或IL-3Rα链与IL-3Rβ链的杂二聚体的结合。这些分析可以使用标记的IL-3和/或标记的免疫球蛋白作为竞争性结合分析来进行。例如，接着使与抗体的Fc区融合的标记IL-3Rα或其细胞外区或固定的表达IL-3R的细胞和标记IL-3与固定的受体或细胞在测试免疫球蛋白或抗体存在或不存在下接触并检测结合标记的量。在抗体或免疫球蛋白存在下结合的标记的量与不存在蛋白质下相比减少表明免疫球蛋白或抗体减少或阻止IL-3与IL-3R结合。通过测试免疫球蛋白或抗体的多种浓度来测定IC50，即减少结合IL-3R的IL-3的量的蛋白质浓度，或者可测定EC50，即实现由免疫球蛋白或抗体实现的对IL-3与IL-3R结合的最大抑制作用的50%的蛋白质浓度。
在另一实施例中，免疫球蛋白或抗体减少或阻止IL-3介导的组胺从嗜碱性粒细胞的释放。例如，将包含嗜碱性粒细胞的低密度白细胞与IgE、IL-3和各种浓度的免疫球蛋白或抗体一起孵育。对照细胞不包含免疫球蛋白(阳性对照)或IL-3(阴性对照)。接着使用标准技术(例如RIA)评估所释放组胺的水平。减少组胺释放水平至低于阳性对照的水平的免疫球蛋白或抗体视为中和IL-3信号传导。在一个实施例中，减少水平与免疫球蛋白或抗体浓度相关。一种用于评估IL-3介导的组胺释放的示例性方法描述于例如Lopez等,J.Cell.Physiol.,145:69,1990中。
在另一实施例中，免疫球蛋白或抗体减少或阻止IL-3介导的白血病细胞系TF-1的增殖。例如，将TF-1细胞在没有IL-3或GM-CSF的情况下培养足以使其增殖停止的时间(例如24-48小时)。接着在IL-3和各种浓度的免疫球蛋白或抗体存在下培养细胞。对照细胞不与免疫球蛋白或抗体(阳性对照)或IL-3(阴性对照)接触。接着使用标准技术(例如3H-胸苷并入)评估细胞增殖。在IL-3存在下减少或阻止细胞增殖至低于阳性对照的水平的免疫球蛋白或抗体视为中和IL-3信号传导。
用于评估IL-3信号传导中和作用的另一分析包括确定免疫球蛋白或抗体是否减少或阻止IL-3介导的对内皮细胞的影响。例如，在IL-3(任选地，含IFN-γ)和各种浓度的免疫球蛋白或抗体存在下培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。接着使用例如酶联免疫吸附剂分析(ELISA)评估所分泌IL-6的量。对照培养物不包含免疫球蛋白或抗体(阳性对照)或IL-3(阴性对照)。在IL-3存在下减少或阻止IL-6产生至低于阳性对照的水平的免疫球蛋白或抗体视为中和IL-3信号传导。
用于评估对IL-3的信号传导的中和作用的其它方法由本公开所涵盖。
测定效应功能
用于评估ADCC活性的方法在本领域中是已知的。
在一个实施例中，使用51Cr释放分析、铕释放分析或35S释放分析来评估ADCC活性的水平。在这些分析中的每一个中，将表达IL-3Rα的细胞与一种或多种所述化合物在足以使化合物被细胞吸收的条件下培养足以使化合物被细胞吸收的时间。在35S释放分析的情况下，可以将表达IL-3Rα的细胞与35S标记甲硫氨酸和/或半胱氨酸一起培养足以使标记氨基酸并入新合成的蛋白质中的时间。接着在免疫球蛋白或抗体存在或不存在下且在免疫效应细胞(例如周边血液单核细胞(PBMC)和/或NK细胞)存在下培养细胞。接着检测细胞培养基中51Cr、铕和/或35S的量，且与不存在免疫球蛋白下相比存在免疫球蛋白或抗体下的增加表明免疫球蛋白具有效应功能。公开用于评估由免疫球蛋白诱导的ADCC的水平的示例性出版物包括Hellstrom等,Proc.Natl Acad.Sci.USA83:7059-7063,1986和Bruggemann等,J.Exp.Med.166:1351-1361,1987。
用于评估由免疫球蛋白或抗体诱导的ADCC的水平的其它分析包括用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.CA,USA)或CytoTox
Figure BDA00002778180900471
非放射性细胞毒性分析(Promega,WI,USA)。
或者或另外，通过测定免疫球蛋白或抗体对一种或多种FcγR的亲和力来评估免疫球蛋白或抗体的效应功能，例如像US7317091中所述。
还可以进行C1q结合分析来证实免疫球蛋白或抗体能够结合C1q并且可以诱导CDC。为评估补体活化，可以进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163,1996。
测定NK细胞数量
如本文所述，本公开的免疫球蛋白和/或抗体可以影响哺乳动物体内NK细胞的数量。用于评估哺乳动物体内NK细胞的数量的方法对于本领域的技术人员将显而易见。
在一个实施例中，在向哺乳动物(例如非人哺乳动物，如非人灵长类动物，例如食蟹猕猴)施用本公开的免疫球蛋白或抗体后，获得血液(或血清)的样品并使用荧光活化细胞分选(FACS)评估NK细胞的数量。可以基于CD16和/或CD56的表达和/或CD20和/或CD3表达的缺乏(或低水平表达)来检测NK细胞。可以通过与较早(例如施用抗体或免疫球蛋白之前)获得的样品中NK细胞的数量进行比较来测定NK细胞数量的变化百分比。
测定亲和力
任选地，测定蛋白质对于IL-3Rα或其表位的解离常数(Kd)或缔合常数(Ka)或平衡常数(KD)。在一个实施例中，通过放射标记或荧光标记的IL-3Rα结合分析来测量免疫球蛋白或抗体的这些常数。此分析在一系列滴定未标记IL-3Rα存在下用最低浓度的标记IL-3Rα(或其可溶性形式，例如包含融合于Fc区的IL-3Rα的细胞外区)平衡蛋白质。在洗涤以除去未结合IL-3Rα后，测定标记的量。
可以通过用于抗体反应的标准方法来测定亲和力测量值，所述方法为例如免疫分析、表面等离子体激元共振(SPR)(Rich和MyszkaCurr.Opin.Biotechnol11::54,2000；Englebienne Analyst.123:1599,1998)、等温滴定热量测定(ITC)或本领域中已知的其它动力学相互反应分析。
在一个实施例中，通过使用表面等离子体激元共振分析，例如使用BIAcore表面等离子体激元共振(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)与固定的IL-3Rα或其区来测量常数。示例性SPR方法描述于US7229619中。
评估治疗功效
体外分析
多种体外分析可用于评估免疫球蛋白或抗体治疗本文所述的疾病或病症的能力。
例如，使用本文所述的方法评估免疫球蛋白或抗体杀死细胞(例如癌细胞，如白血病细胞)的能力。
在另一实施例中，将免疫细胞(例如pDC和/或嗜碱性粒细胞)或包含其的细胞群体(例如PBMC)在存在或不存在免疫球蛋白或抗体和疾病或病症中存在的那些细胞的诱导物(例如CpG寡核苷酸和/或免疫复合物)下培养。接着通过例如使用ELISA测定分泌至细胞培养基中的IFNα的水平来评估免疫球蛋白或抗体在治疗疾病或病症中的功效。或者或另外，评估组胺分泌或IL-4、IL-6和/或IL-13分泌的水平。任何这些细胞因子的水平与在免疫球蛋白或抗体不存在下(或在同种型对照免疫球蛋白或抗体存在下)相比降低都表明免疫球蛋白或抗体适于治疗疾病或病症。或者或另外，评估细胞死亡的水平。细胞死亡增加指示免疫球蛋白或抗体适于治疗疾病或病症。
体内分析
在一个实施例中，使用体内分析来评估免疫球蛋白治疗疾病或病症的功效。
在一个实施例中，使用癌症的异种移植模型来评估治疗功效。例如，用辐射照射NOD/SCID小鼠并且任选地用抗CD122抗体处理以去除NK细胞。向小鼠施用人白血病细胞(例如急性髓细胞性白血病细胞)和小鼠或人骨髓干细胞。细胞移植后，向小鼠施用测试免疫球蛋白或抗体并且评估循环和/或骨髓和/或***中白血病细胞的水平。在抗体或免疫球蛋白存在下与抗体或免疫球蛋白不存在下相比循环和/或骨髓和/或***中白血病细胞的数量降低表明治疗功效。
在另一实施例中，向非人动物(例如非人灵长类动物)施用免疫球蛋白或抗体并且评估循环中免疫细胞(例如pDC和/或嗜碱性粒细胞)的数量/水平。使免疫细胞(例如pDC和/或嗜碱性粒细胞)的数量/水平与施用前和/或尚未施用免疫球蛋白或抗体的对照哺乳动物体内相比减少的免疫球蛋白或抗体视为适于治疗疾病或病症。
在另一实施例中，例如使用ELISA检测哺乳动物循环中细胞因子(如IFNα)的水平。使细胞因子的水平与施用前和/或尚未施用免疫球蛋白或抗体的对照哺乳动物体内的水平相比降低的免疫球蛋白或抗体视为适于治疗疾病或病症。因为考虑细胞因子(如IFNα)在一些疾病/病症(例如狼疮)中起作用，因此减少IFNα产生的免疫球蛋白或抗体视为适于治疗所述病症。
组合物
适当地，在用于向哺乳动物施用抗IL-3Rα免疫球蛋白或抗体的组合物或方法中，免疫球蛋白是与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合，如本领域中所理解。因此，本公开的一个实施例提供包含本公开的免疫球蛋白或抗体与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合的药物组合物。在另一实施例中，本公开提供包含适于在施用至哺乳动物之前与免疫球蛋白或抗体组合或混合的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的试剂盒。在此实施例中，试剂盒可进一步包含使用说明书。
一般来说，“载体、稀释剂或赋形剂”意思是可以安全地施用至任何哺乳动物(例如人)的固体或液体填充剂、粘合剂、稀释剂、囊封物质、乳化剂、湿润剂、溶剂、悬浮剂、包衣或润滑剂。根据特定施用途径，可以使用本领域中已知的多种可接受的载体、稀释剂或赋形剂，例如像Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)中所述。
仅举例来说，载体、稀释剂或赋形剂可以选自包括以下的组：糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)、淀粉、纤维素和其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、油类(包括植物油、合成油和合成单甘油酯或二甘油酯)、低级醇、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、润滑剂(如硬脂酸钠或硬脂酸镁)、等渗盐水和无热原质水。例如，载体、稀释剂或赋形剂与肠胃外施用相容或适于肠胃外施用。肠胃外施用包括不经过消化道的任何施用途径。肠胃外施用的非限制性实例包括注射、输注等。举例来说，注射施用包括静脉内、动脉内、肌肉内和皮下注射。还涵盖通过可以例如皮内、肌肉内和皮下方式递送的储库或缓慢释放制剂进行递送。
组合疗法
在一个实施例中，本公开的免疫球蛋白或抗体是与适用于治疗疾病或病症的另一化合物或治疗性处理。
在一个实施例中，免疫球蛋白或抗体是在之前，例如辐射疗法(例如用于治疗癌症，如血液癌症，如白血病)之前一个月或两周或一周施用。
在一个实施例中，其它化合物是化学疗法化合物，如卡铂(caboplatin)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、多西紫杉醇(docetaxal)、阿霉素(doxorubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、伊立替康(irinotecan)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、拓扑替康(topotecan)、长春新碱(vincristine)或长春碱(vinblastine)。在一个实施例中，化学疗法化合物是选自由以下组成的组：甲氨蝶呤、l-天冬酰胺酶、长春新碱、阿霉素、道诺霉素、阿糖胞苷、伊达比星、米托蒽醌、环磷酰胺、氟达拉滨、苯丁酸氮芥和其组合。
在一个实施例中，其它化合物是用于治疗急性白血病的化学疗法化合物，如选自由以下组成的组的化合物：甲氨蝶呤、l-天冬酰胺酶、长春新碱、阿霉素、道诺霉素、阿糖胞苷、伊达比星、米托蒽醌和其组合。
在一个实施例中，其它化合物是用于治疗急性成淋巴细胞性白血病的化学疗法化合物，如选自由以下组成的组的化合物：甲氨蝶呤、l-天冬酰胺酶、长春新碱、阿霉素、道诺霉素和其组合。
在另一实施例中，其它化合物是化学疗法化合物，如阿扎胞苷。
在一个实施例中，其它化合物是适用于治疗癌症的生物剂，例如利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿来组单抗(alemtuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)或西妥昔单抗(cetuximab)。
在一个实施例中，其它化合物是抗炎化合物。或者或另外，其它化合物是免疫抑制剂。或者或另外，其它化合物是皮质类固醇，如***和/或***龙。或者或另外，其它化合物是抗疟化合物，如羟基氯喹或氯喹宁。或者或另外，其它化合物是甲氨蝶呤。或者或另外，其它化合物是硫唑嘌呤。或者或另外，其它化合物是环磷酰胺。或者或另外，其它化合物是麦考酚酸酯。或者或另外，其它化合物是抗CD20抗体(例如利妥昔单抗或奥伐单抗(ofatumumab))。或者或另外，其它化合物是抗CD22抗体(例如依帕珠单抗(epratuzumab))。或者或另外，其它化合物是抗TNF抗体(例如英夫利昔单抗或阿达木单抗或戈利木单抗)。或者或另外，其它化合物是CTLA-4拮抗剂(例如阿巴西普(abatacept)、CTLA4-Ig)。或者或另外，其它化合物是抗IL-6抗体。或者或另外，其它化合物是BLys拮抗剂，如抗BLys抗体(例如贝利木单抗(belimumab))。
施用的剂量和时程
为预防或治疗疾病或病症或其复发，活性剂(即本公开的免疫球蛋白或抗体)的适当剂量将取决于所欲治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、所施用的免疫球蛋白或抗体是用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对免疫球蛋白的反应以及主治医师的判断。特定给药方案(即剂量、时程和重复)将取决于特定个体和所述个体的医学病史，如医师所评估。通常，临床医师将施用免疫球蛋白，直至达到实现所需结果的剂量。
本公开的方法适用于治疗、改善或预防哺乳动物的疾病或病症的症状，或用于改善哺乳动物的预后。本公开的方法还适用于延迟具有发生狼疮或其复发的风险的个体的狼疮发生或预防所述个体的狼疮。
为施用本文所述的免疫球蛋白或抗体，正常剂量可在每天每公斤个体体重约10ng至约100mg或更高范围内变化。示例性剂量和其范围在本文中描述。为在若干天或更长时间内重复施用，根据所欲治疗的疾病或病症的严重性，可以持续治疗直至实现所需症状抑制。
在一些实施例中，免疫球蛋白或抗体是以约1mg/kg至约30mg/kg之间，如约1m/gkg至约10mg/kg，或约2mg/kg或约3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg的初始(或负载)剂量施用。免疫球蛋白或抗体可接着以约0.0001mg/kg至约1mg/kg之间，如约0.0005mg/kg至约1mg/kg，例如约0.001mg/kg至约1mg/kg，如约0.01mg/kg至约1mg/kg，例如约0.01mg/kg至约0.1mg/kg，如约0.02mg/kg或0.03mg/kg或0.04mg/kg或0.05mg/kg的维持剂量施用。维持剂量可施用每7-30天一次，如每10-15天一次，例如每10天或11天或12天或13天或14天或15天一次。
在一些实施例中，免疫球蛋白或抗体是以约0.0001mg/kg至约50mg/kg之间，如约0.0005mg/kg至约50mg/kg之间，例如约0.001mg/kg至约40mg/kg之间，例如约0.005mg/kg至约30mg/kg之间，如约0.01mg/kg至约20mg/kg之间的剂量施用。例如，免疫球蛋白是以约0.01mg/kg至约10mg/kg之间，如约0.01mg/kg至约1mg/kg，如约0.02mg/kg或0.03mg/kg或0.04mg/kg或0.05mg/kg或0.06mg/kg或0.07mg/kg或0.08mg/kg或0.09mg/kg或0.1mg/kg或0.2mg/kg或0.3mg/kg或0.4mg/kg或0.5mg/kg或0.6mg/kg或0.7mg/kg或0.8mg/kg或0.9mg/kg的剂量(例如没有更高负载体量)施用。在一些实施例中，多个剂量施用例如每7-30天一次，如每10-22天一次，例如每10-15天一次，例如每10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22天一次。例如，免疫球蛋白或抗体施用每7天一次或每14天一次或每21天一次。
在一些实施例中，免疫球蛋白或抗体是以约1mg/kg至约30mg/kg之间，如约1mg/kg至约10mg/kg，或约2mg/kg或约3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg，或如约10mg/kg至30mg/kg，如约10mg/kg或15mg/kg或20mg/kg或25mg/kg的剂量(例如没有更低维持剂量)施用。在一些实施例中，多个剂量施用例如每10-70天一次，如每14-70天一次，如每14-60天一次，例如每14-50天一次，如每14-40天一次，或每14-30天一次。例如，剂量施用每14或21或25或28或35或40或42或49或50或55或57或63或70天一次。例如，免疫球蛋白或抗体施用每21天或每28天或每35天或每42天或每49天或每56天一次。
在一些实施例中，免疫球蛋白或抗体引起施用后例如施用约6小时内哺乳动物体内的NK细胞减少，或与所述减少相关。在一些实施例中，当哺乳动物体内NK细胞的数量返回至施用前哺乳动物体内NK细胞的数量的20%或10%或5%或1%以内时，施用另一剂量的免疫球蛋白或抗体。在一些实施例中，当哺乳动物体内NK细胞的数量超过施用前哺乳动物体内NK细胞的数量至少约5%或10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%时，施用另一剂量的免疫球蛋白或抗体。可评估哺乳动物体内NK细胞的数量以确定何时施用另一剂量的免疫球蛋白或抗体。或者，通过预先分析群体或模型生物体(例如非人灵长类动物，如食蟹猕猴)来确定施用另一剂量免疫球蛋白或抗体的时间。例如，另一剂量的免疫球蛋白在前一剂量后约7天或8天或14天或17天或21天或22天或28天或29天施用。
在一些实施例中，在开始疗法时，向哺乳动物施用免疫球蛋白或抗体不超过连续7天或连续6天或连续5天或连续4天。
在对治疗的反应不充分的哺乳动物的情况下，可在一周内施用多次剂量。或者或另外，可以施用增加的剂量。
在另一实施例中，对于经历不良反应的哺乳动物，初始(或负载)剂量可以分成一周内的多天或连续多天。
用于特定免疫球蛋白或抗体的剂量可以在已给予一次或多次免疫球蛋白施用的哺乳动物体内凭经验确定。为评估免疫球蛋白的功效，可以监测疾病或病症的临床症状。
根据例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的和熟练从业人员已知的其它因素，根据本公开的方法施用免疫球蛋白可以是连续的或间断的。免疫球蛋白或抗体的施用可以在预先选择的一段时期内为基本上连续的，或者可以为一系列隔开的剂量，例如在病症发展期间或之后。
本公开包括以下非限制性实施例。
非限制性实施例
实施例1：人源化抗体
制造充当IL-3活性拮抗剂的特异性结合人IL-3Rα链的人源化抗体。根据Tan等(J Immunol.169,1119-1125,2002)的程序通过将拮抗性鼠类抗体(7G3)的CDR序列移植到基于供体和接受体CDR的经典结构选择的人可变框架生殖系序列上来制造人源化抗体；有时称为“超人源化”。这一工作是使用呈scFv格式的抗体来进行。这一方法接着比较供体抗体的CDR残基与可变框架生殖系接受体序列的CDR残基，并选择CDR残基具有最高相关性的序列作为接受体序列。然而，在本公开的情况下，选择具有较低CDR相关性水平的重链接受体序列。所得人源化抗体由于人源化过程而具有完全人的可变框架序列，然而对IL-3Rα的亲和力与亲本鼠类抗体相比降低。
使用利用呈scFv格式的抗体进行的基于核糖体展示的诱变过程(Kopsidas等,BMCBiotechnol.7,18,2007)来进行亲和力优化，以试图增加人源化抗体的结合亲和力。产生了当转化成IgG1格式时显示与亲本鼠类单克隆抗体的亲和力相比稍有提高的IL-3Rα结合亲和力的亲和力优化scFv。未预料到的是，亲和力优化过程在VH和VL的框架中以及在轻链的CDR1中产生突变。因此，人源化亲和力优化抗体的CDR序列集合不同于亲本鼠类单克隆抗体的CDR序列集合。此处，亲和力优化抗体在本文中被称为CSL362。
通过在CHO-S细胞中表达适当载体来制造人源化亲和力优化抗体的Fc工程改造衍生物，其包含所述抗体的轻链和重链可变区以及具有三个氨基酸取代S239D/A330L/I332E(在本文中称为CSL362X2)或具有两个氨基酸取代S239D/I332E(在本文中称为CSL362X1)的杂交IgG1/IgG2恒定结构域；鉴定出的突变的位置是基于EU编号***。
通过在来自Biowa的敲除了FUT8的CHO细胞(
Figure BDA00002778180900551
细胞)中表达适当载体来产生人源化亲和力优化抗体的具有人IgG1恒定结构域的无岩藻糖基化型式(在本文称为CSL362B)。
实施例2：结合亲和力测定
全长mAb动力学：
为分析全长抗体，以捕捉格式进行表面等离子体激元共振(Biacore)分析，其中化学固定的抗人或抗小鼠Fc特异性抗体(吸附的抗人山羊抗人IgG(γ)小鼠(Invitrogen，目录号H10500)或抗小鼠Fc特异性抗体(Jackson Immuno Research Labs inc.目录号515-005-071)是使用标准胺偶合化学以化学方式固定于CM-5感应器表面上)并且用于从溶液中捕捉mAb。接着在捕捉的抗体上注射各种浓度的可溶性人IL-3Rα。从来自不捕捉抗体，但其它处理相同的参考流动池的反应中减去反应。接着从来自空白注射的反应减去参考消减反应。
使用非线性回归将最终校正的反应拟合至描述1:1动力学(包括质量转运限制方面)的模型中。局部拟合Rmax值以考虑所捕捉抗体水平的轻微偏差。测定缔合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)。
抗体是在0.3μg/ml下捕捉180秒。
可溶性IL-3Rα注射10分钟，并且监测解离30分钟。
注射0、0.62、1.25、2.5、5、10、20和40nM的可溶性IL-3Rα，其中2.5和5nM有两份重复。
每次循环后通过注射100mM H3PO4持续90秒来进行再生。
所述分析在25℃下进行。
scFv动力学：
为分析scFv，使用标准胺偶合化学将可溶性人IL-3Rα化学固定于CM-5感应器表面上，并且注射各种浓度的scFv。从来自未固定IL-3Rα，但其它处理相同的参考流动池的反应中减去反应。接着从来自空白注射的反应减去参考消减反应。
使用非线性回归将最终校正的反应拟合至描述1:1动力学(包括质量转运限制方面)的模型中。全面拟合Rmax值，并且测定缔合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)。
scFv注射10分钟，并且监测解离20分钟。
注射0、0.62、1.25、2.5、5、10、20和40nM的scFv，其中10nM有两份重复。
在每次循环后通过注射100mM H3PO4、1M NaCl持续30秒和注射50mM NaOH持续15秒来进行再生。
所述分析在25℃下进行。
抗体和scFv亲和力在下表2中列出：
表2：抗体和scFv的亲和力解离常数
抗体 KD(M)
亲本鼠类mAb(7G3) 约9.2×10-10
亲本鼠类mAb的嵌合形式)(人IgG1) 约1.0×10-9
超人源化mAb(IgG1) 约1×10-8
超人源化mAb scFv 约1.4×10-8
CSL362scFv 约2.2×10-9
CSL362(IgG1) 约7.8×10-10
抗体 KD(M)
CSL362B 约4.3×10-10
实施例3：施用人源化或嵌合抗体后的NK细胞水平
通过静脉内输注向未处理的猴(非人灵长类动物；NHP)施用单次剂量的CSL362B或CSL362X1。在另一研究，向未处理的猴施用重复剂量(每周一次×4)的包含用于制造人源化抗体的鼠类抗体(7G3)的可变区和人IgG1恒定区的嵌合抗体。在不同时间点收集周边血液并且通过流式细胞术对NHP NK细胞进行分析。
如图1A中所示，施用CSL362X1导致NK细胞最初去除，例如施用后约6小时。在0.01mg/kg和0.1mg/kg的剂量下，在施用后约第8天，此水平超过了施用前观察到的水平，并且直至施用后至少22或29天仍保持较高。也在1mg/kg剂量下观察到NK细胞数量的增加。
与前述段落中所述的结果不同，施用CSL362B导致NK细胞去除，然而NK细胞数量后来未超过施用前的数量(图1B)。
重复施用嵌合抗体未使循环中检测到的NK细胞的数量产生实质性变化(图1C)。
实施例4：在NK细胞存在下人源化抗体的ADCC增强
分离人PBMC或NK细胞并在各种浓度的CSL362X1存在下与TF-1细胞一起孵育。组合效应细胞(E;PBMC)与靶细胞(T;TF-1细胞)以实现50:1的比率(E:T比率)，或在使用纯化NK细胞作为效应细胞的情况下比率为20:1。使用LDH CytoTox96非放射性细胞毒性试剂盒(Promega)测量细胞溶解。
通过以下计算测定特异性溶解：
特异性溶解=[样品溶解-自发性溶解]/[最大溶解-自发性溶解]×100%。
通过添加ExtranTM至最终浓度为0.75%(v/v)来评估最大溶解。自发性溶解是发生在仅具有细胞(无Ab)的孔中的溶解。
如图2A中所示，TF-1细胞的溶解在PBMC存在下和在NK细胞存在下发生，然而在除去了NK细胞的PBMC中实质性减少。
在另一实验中，施用来自两位不同AML患者的白血病细胞作为靶细胞。在此分析中，使用单一浓度的抗体(10μg/mL)并且添加纯化NK细胞以产生各种E:T比率。图2B示出NK细胞比靶细胞(来自两位不同AML患者的周边血液胚细胞)(即E:T比率)越高，那么由人源化抗体造成的靶细胞特异性溶解也就越多。
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Claims (16)

1.分离的或重组的抗体，其能够特异性结合白介素(IL)-3Rα链，其中所述抗体包含：
(i)包含分别如SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、2和3的轻链可变区(VL)；
(ii)包含分别如SEQ ID NO:5、6和7所示的CDR1、2和3的重链可变区(VH)；和
(iii)包含根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的重链恒定区。
2.分离的或重组的人源化抗体，所述抗体能够特异性结合白介素(IL)-3Rα链且包含：
(i)包含根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区(VL)和包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和
(ii)包含根据Kabat的EU编号***的氨基酸取代S239D和I332E的重链恒定区。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述重链恒定区恒定区包含SEQ ID NO:11的残基121-450之间(包括残基121和450)所示的序列。
4.分离的或重组的人源化抗体，所述抗体能够特异性结合IL-3Rα链且包含：含有SEQ ID NO:13所示的序列的轻链和含有SEQID NO:11所示的序列的重链。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其为裸抗体。
6.药物组合物，其包含如权利要求1至5中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
7.核酸，其编码如权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体或者其重链或轻链。
8.基因构建体，其包含可操作地连接于启动子的编码权利要求1至5中任一项所述抗体的重链的核酸和可操作地连接于启动子的编码权利要求1至5中任一项所述抗体的轻链的核酸。
9.表达权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体的分离的细胞，或经遗传修饰以表达权利要求1至5中任一项所述的人源化抗体的细胞。
10.如权利要求9所述的细胞，其包含权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的基因构建体。
11.用于治疗哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括给予有需要的哺乳动物权利要求1至5中任一项所述的抗体或权利要求6所述的组合物。
12.权利要求1至5中任一项所述的抗体或权利要求6所述的组合物在医药中的用途。
13.权利要求1至5中任一项所述的抗体在制备用于治疗哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途。
14.用于治疗哺乳动物的疾病或病症的权利要求1至5中任一项所述的抗体或权利要求6所述的组合物。
15.权利要求11所述的方法或权利要求12或13所述的用途或权利要求14所述的抗体或组合物，其中所述疾病或病症是IL-3Rα介导的疾病或病症。
16.如权利要求15所述的方法、用途、抗体或组合物，其中所述疾病或病症是癌症或者自体免疫性或炎症性病症。
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