CN103013927B

CN103013927B - 抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN103013927B
Application number: CN201110284158.2A
Authority: CN
Inventors: 陈佺; 杜蕾; 王珺; 金海京; 王晓慧; 李保伟
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2031-09-22
Also published as: CN103013927A

Abstract

本发明提供一种抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗细胞型朊蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.4972的杂交瘤细胞系AbM-PRIO-3产生，其与细胞型朊蛋白免疫结合，所述细胞型朊蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示；所述单克隆抗体用于制备抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括抗结直肠癌药物、抗结直肠癌转移药物、抗直肠癌细胞转移药物、抗直肠癌细胞扩散药物、抗直肠癌干细胞转移药物和抗直肠癌细胞生长药物。

Description

抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种与人体正常粘膜所分泌的天然蛋白-细胞型朊蛋白(cellular prion protein)，相结合的单克隆抗体的杂交瘤，由该杂交瘤产生的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤。近二十多年来，结直肠癌发病率逐年上升，尤其是亚洲国家结直肠癌发病率上升趋势十分明显，致死率居高不下，位居癌症死因的第二位。目前，世界上***的主要方法是手术、放疗、化疗和生物治疗等四种。从医学角度看，至今肿瘤的治疗没有一种完全有效的手段，尤其是已经发生转移的肿瘤患者，传统的治疗方法无法控制肿瘤的全身扩散。

编码细胞型朊蛋白的基因PRNP定位于20号染色体，基因全长20kb，包含2个外显子。PRNP基因转录的mRNA长度为2.5kb(NM_000311)，编码由253个氨基酸组成的蛋白质，具有高度不稳定的5个串联八肽重复区(5 tandem octapeptide重复区)。细胞型朊蛋白与疯牛病致病性朊病毒蛋白具有相同的氨基酸序列，为同一个基因PRNP所编码。但在三级结构方面，细胞型朊蛋白具有丰富的α螺旋的三级结构，而致病性朊蛋白表现为β折叠。

相对于朊病毒的研究，细胞型朊蛋白的功能尚未得到明确的认识。朊蛋白基因敲除小鼠的研究提示细胞型朊蛋白缺失后小鼠会出现心律失常、昼夜节律改变等症状。目前已经发现细胞型朊蛋白与乳腺癌、***癌、肝癌和结肠癌等多种肿瘤相关(Mehrpour，M.；Codogno，P.，2009.Cancer Lett.，290：1-23)，在胃癌和乳腺癌中细胞型朊蛋白表达与Bcl-2上调相关，参与发挥抑制细胞凋亡功能(Liang，J.；Pan，Y.L.；Ning，X.X.；Sun，L.J.；Lan，M.；Hong，L.；Du，J.P.；Liu，N.；Liu，C.J.；Qiao，T.D.；Fan，D.M.，2006.Tumour.Biol.，27：84-91)(Li，Q.Q.；Cao，X.X.；Xu，J.D.；Chen，Q.；Wang，W.J.；Tang，F.；Chen，Z.Q.；Liu，X.P.；Xu，Z.D.，2009.Cell Mol.Life Sci.，66：504-515)。细胞型朊蛋白能抵抗肿瘤坏死因子RNF-α和TRAIL引起的乳腺癌细胞凋亡(Diarra-Mehrpour，M.；Arrabal，S.；Jalil，A.；Pinson，X.；Gaudin，C.；Pietu，G.；Pitaval，A.；Ripoche，H.；Eloit，M.；Dormont，D.；Chouaib，S.，2004.Cancer Res.，64：719-727)(Meslin，F.；Hamai，A.；Gao，P.；Jalil，A.；Cahuzac，N.；Chouaib，S.；Mehrpour，M.，2007.Cancer Res.，67：10910-10919)，此外还有报道指出细胞型朊蛋白通过增加葡萄糖水平上升来促进结肠癌细胞生存(Li，Q.Q.；Sun，Y.P.；Ruan，C.P.；Xu，X.Y.；Ge，J.H.；He，J.；Xu，Z.D.；Wang，Q.；Gao，W.C.，2011.Cancer Sci.，102：400-406)。Dodelet等人报道细胞型朊蛋白对于CD34+造血干细胞的自我更新是必须的(Dodelet，V.C.；Cashman，N.R.，1998.Blood，91：1556-1561)，Weinberg的研究结果提示细胞型朊蛋白可能与乳腺细胞球状体形成相关(Liao，M.J.；Zhang，C.C.；Zhou，B.；Zimonjic，D.B.；Mani，S.A.；Kaba，M.；Gifford，A.；Reinhardt，F.；Popescu，N.C.；Guo，W.；Eaton，E.N.；Lodish，H.F.；Weinberg，R.A.，2007.Cancer Res.，67：8131-8138)。尽管以上报道提示细胞型朊蛋白可能与多种肿瘤相关，但是细胞型朊蛋白在人类肿瘤中的具体生理功能至今还不清楚，对于肿瘤发生、发展的作用机制未见报道。

越来越多的证据表明肿瘤干细胞对于肿瘤的发生起着重要作用。肿瘤干细胞是一类存在与肿瘤组织中具有极高自我更新能力的群体，对于放疗和化疗不敏感，往往成为肿瘤复发和转移的根源。我们已发表的文章表明CD44作为肿瘤干细胞的表面标志物能够促进肿瘤的发生(Du，L.；Wang，H.；He，L.；Zhang，J.；Ni，B.；Wang，X.；Jin，H.；Cahuzac，N.；Mehrpour，M.；Lu，Y.；Chen，Q.2008.Clin.Cancer Res.14：6751-6760)。我们最近的研究结果显示细胞型朊蛋白与结直肠癌细胞的转移有正相关性。研究结果显示细胞型朊蛋白与CD44双阳性的细胞具有更高的肿瘤形成能力和转移能力，细胞型朊蛋白能显著提高结直肠癌干细胞的成瘤性和转移能力。因此，将其应用于肿瘤药物的制备，为肿瘤的治疗提供了新的策略。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高特异性和灵敏度的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体以及这种鼠源抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中的用途。该抗体的亚类为IgG2a，能特异结合细胞型朊蛋白重组抗原和天然抗原，能特异结合表达细胞型朊蛋白的转移型肿瘤干细胞，能显著抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞的转移。

本发明用于实现上述目的的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种保藏号为CGMCC No.4972的杂交瘤细胞系AbM-PRIO-3(分类命名：小鼠杂交瘤细胞，保藏日期：2011年6月21日，保藏号为CGMCC No.4972，保藏地：中国院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)。

另一方面，本发明提供一种抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No 4972的杂交瘤细胞系的产生。

优选地，所述抗细胞型朊蛋白单克隆抗体能够与细胞型朊蛋白特异性结合。

优选地，所述细胞型朊蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述细胞型朊蛋白的编码基因如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

又一方面，本发明提供一种制备重组载体的方法，所述方法包括上述所述的基因***已知载体。

又一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体含有上述所述的基因或由上述所述的方法产生。

优选地，所述已知载体为pET-30a(+)。

再一方面，本发明提供一种制备重组有机体的方法，所述方法包括上述所述的重组载体导入宿主有机体。

优选地，所述宿主有机体为大肠杆菌，所述大肠杆菌优选为BL21菌株，所述BL21菌株优选为BL21-Condon Plus(DE3)。

又一方面，本发明提供一种抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述抗肿瘤药物包括抗结直肠癌药物、抗结直肠癌转移药物、抗直肠癌细胞转移药物、抗直肠癌细胞扩散药物、抗直肠癌干细胞转移药物和抗直肠癌细胞生长药物。

本发明的抗细胞型朊蛋白抗体灵敏度和特异性高，不仅与重组的细胞型朊蛋白抗原具有极强的特异性和敏感性，而且与结直肠肿瘤组织和细胞中的细胞型朊蛋白有极强的特异性和敏感性，从而作为分子标志物应用于结直肠癌肿瘤干细胞的临床诊断和预后疗效的评估。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所述的细胞型朊蛋白的编码基因PCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图，图中1为PCR扩增所得的细胞型朊蛋白的编码基因，2为DNA标记(Marker)；

图2为本发明所述的细胞型朊蛋白的编码基因克隆于的pET-30a(+)载体的图谱及该载体克隆表达区域的图谱；

图3为本发明所述的细胞型朊蛋白的编码基因克隆的琼脂糖电泳结果示意图，图中1为DNA标记(Marker)，2-6分别为1-5号细胞型朊蛋白的基因克隆；

图4为1-5号细胞型朊蛋白的编码基因克隆的测序图谱；

图5为更换宿主BL21-Codon Plus(DE3)后，诱导表达的细胞型朊蛋白的SDS-PAGE电泳结果示意图，图中1为蛋白标记(Marker)，2为未诱导表达的含细胞型朊蛋白的编码基因的菌，3为诱导表达的含细胞型朊蛋白的编码基因的菌的上清，4为诱导表达的含细胞型朊蛋白的编码基因的菌的沉淀；

图6为大量表达的细胞型朊蛋白粗提纯后进行SDS-PAGE电泳结果示意图，图中1为蛋白标记(Marker)，2为大量诱导表达的含细胞型朊蛋白的编码基因的菌的沉淀，3为大量诱导表达的含细胞型朊蛋白的编码基因的菌的上清；

图7为大量表达的细胞型朊蛋白纯化后进行SDS-PAGE电泳结果示意图，图中1为纯化后的细胞型朊蛋白，2为蛋白标记(Marker)；

图8为本发明所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体进行免疫组化实验检测结直肠癌配对组织中的表达的实验结果示意图，图中图8-1为细胞型朊蛋白在转移型结肠癌组织中的表达情况，图8-2为细胞型朊蛋白在非转移型结肠癌组织中的表达情况；

图9为发明所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体的用途验证-免疫印迹实验结果示意图，图中A中的1、2、5、6、7、8为细胞型朊蛋白在6例转移型直肠癌中的表达情况及在3、4例非转移型直肠癌中的表达情况，图中B为作为正对照的肌动蛋白的实验结果示意图；

图10为本发明所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在进行免疫荧光定位外源细胞型朊蛋白的实验结果示意图；

图11为本发明所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体抑制肿瘤肝细胞转移的实验结果示意图，图11-1为LgG抗体抑制肿瘤干细胞转移的试验结果示意图，图11-2为抗细胞型朊蛋白单克隆抗体抑制肿瘤干细胞转移的试验结果示意图。

具体实施方式

以下实施例中所使用的技术，包括基因扩增，基因克隆，细胞融合，以及细胞培养、检测技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、细胞等，除非是说明书中特别说明，均为本领域技术人员可以通过公共途径获得的。

以下试验小鼠均为Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实施例1：细胞型朊蛋白抗原的制备

细胞型朊蛋白抗原是以正常某组织cDNA为模板，根据细胞型朊蛋白的编码基因序列(SEQ ID NO：2)设计特异引物，引物两端连入BamH I和Xho I酶切位点。

上游引物：5′-CGGGATCCGGTGGTGGTATGGCGAACCTTGGCTGCTGGAT-3′(SEQ IDNO：3)

下游引物：5′-CCGCTCGAGTCCCACTATCAGGAAGATGAGGAAAG-3(SEQ ID NO：4)′。

PCR扩增细胞型朊蛋白的编码基因(PCR参数：95℃5min，94℃45S，62℃1min，72℃1min30s，72℃10min，反应循环数为30)后进行琼脂糖电泳，结果如图1所示，表明扩增的为细胞型朊蛋白的编码基因；再将扩增的细胞型朊蛋白的编码基因经BamH I和Xho I双酶切后与pET30a(+)连接，化学转化感受态细胞BL21，挑取1-5号单克隆提取质粒酶切后进行琼脂糖电泳，结果如图2所示，均匀大小正确的片段***，再将其进行测序(图4为测序的实验结果示意图)，验证序列4号克隆正确。更换表达宿主BL21-Codon Plus(DE3)，选择测序正确的阳性菌4号克隆，0.4mmol/L IPTG诱导表达过夜。诱导以后，收集菌体，经超声破碎后离心，以未诱导的表达菌作为负对照，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，如图5所示，结果显示表达的产物为非可溶性蛋白。

大量培养细菌后进行诱导表达，收集诱导表达菌，超声破碎离心后，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，如图6所示，表达的产物为非可溶性蛋白，且大小与细胞型朊蛋白相符；

再将其提取细胞型朊蛋白，将经Ni-NAT亲和层析柱(购自GEHealthcare)进行纯化，50mM咪唑洗脱细胞型朊蛋白，SDS-PAGE电泳，结果如图7所示，切取条带进行MALDI-TOF/TOF鉴定(购自BRUKEROPTICS)，证实表达产物为细胞型朊蛋白。

实施例2：抗细胞型朊蛋白杂交瘤的制备

1)免疫

将经Ni-NAT亲和层析纯化得到的细胞型朊蛋白，腹部皮下免疫(免疫前眼眶取20μL血清做阴性对照)3只4-6周龄雌性Balb/c小鼠，编号为1，2，3；剂量为每只小鼠60μg蛋白+生理盐水至200μL+CFA200μL。每14天皮下加强免疫一次，剂量为每只小鼠30μg蛋白+生理盐水至200μL+IFA200μL。第3次加强免疫后7天眼眶取血测效价，达要求者冲击免疫，50μg蛋白+生理盐水至100μL；尾静脉注射，待3天后融合。

2)融合

将新鲜切下的小鼠脾脏放到细胞筛上碾碎过滤，与sp2/0细胞(购自华大蛋白质中心冻存)按1∶5的比例混合，1500转/分钟离心5分钟。将装有离心好的、且混匀的细胞的离心管放入37℃温水浴中，边搅动细胞边缓慢加入1mL PEG1500。在水浴中静置1分钟。缓慢加入10mL的无血清的IMDM(Sigma，H0262-10VL)1000转/分钟离心5分钟。弃上清，加入10mL的血清小心的将细胞吹打起来，并加入胸腺细胞(小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，腹面朝上。打开胸腔分离出胸腺，放入培养皿中，用镊子夹碎，加入400u/ml III型胶原酶5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到胸腺单细胞悬液)及25mL半固体培养基，充分混匀，均匀倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入5％CO₂孵箱中培养。

3)挑克隆

融合后7-10天，观察克隆细胞团大小密度适中。在解剖镜下，吸取圆、实、大克隆团于预先准备好培养基(含饲养细胞和1％HT次黄嘌呤(hypoxantin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)液体)的96孔板中。放入5％CO₂细胞培养箱。

4)筛选

a.一筛：挑克隆后3天左右，观察细胞量大约占底面积2/3时，取100μL上清ELISA筛选。阳性克隆进行换液，添加200μL完全培养基(含1％HT液体)。

b.二筛：2天后重复步骤a进行二次筛选。阳性株转入预先准备好培养基(含饲养细胞和1％HT液体)的24孔板。

c.三筛：5天后，用含标签His的其它重组蛋白包板，取100μL上清ELISA筛选。符合要求的克隆转入6孔板或细胞培养瓶扩大培养。

5)细胞冻存

对数生长期细胞占满底面积80％左右即可冻存。收集上清且去除死细胞等杂质，上清存于-20℃。直接将冻存细胞放4℃半小时，然后放-20℃两小时，转-80℃冻存过夜，次日放液氮罐。

实施例3：由保藏号为CGMCC No.4972的杂交瘤细胞系制备抗细胞型朊蛋白单克隆抗体

发明人将杂交瘤(命名为：AbM-PRIO-3，分类命名：小鼠杂交瘤细胞，保藏日期：2011年6月21日，保藏号为CGMCC No.4972，保藏地：中国院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，用于制备鼠抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，具体操作步骤如下：

1)细胞复苏

从-80℃冰箱或液氮罐中迅速取出冻存管；迅速放入37℃水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。往15mL离心管中加入3mL血清培养基，将冻存液吸入离心管，1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板(3mL)或瓶(5mL)中。

2)腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5×10⁵，1mL。悬浮的细胞腹腔注射小鼠。7-10天后便收集腹水。第一次收集3mL左右，每隔2、3天重复取，最终可收集8mL/只。每次取出的腹水4000转/分钟，离心10分钟；中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中，4℃保存。

3)单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE Healthcare，17-5079-01)亲和层析柱纯化单克隆抗体。

将腹水在4℃条件下，10000转/分钟离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用耦联缓冲液以1∶3(腹水∶耦连液)稀释，用0.45μm膜过滤。滤液上样到耦联缓冲液平衡过的层析柱。用耦联缓冲液洗过柱子后，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于事先装有中和液的收集管中。

实施例4：单克隆抗体的鉴定

1)单克隆抗体特异性的测定

a.用本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体和商品化鼠抗朊蛋白单克隆抗体(Cayman)分别以1∶100，1∶200，1∶500，1∶1000，1∶2000稀释后与结肠癌细胞共同孵育10分钟，然后与苯肾上腺素(phenylephrine，PE)荧光标记的二抗孵育10分钟，在荧光显微镜下观察定位和荧光强度，检测抗体的特异性和灵敏度。本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体更为特异地定位在细胞膜上。

b.用本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体和商品化鼠抗朊蛋白单克隆抗体分别以1∶200，1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶5000稀释后与结肠癌石蜡切片共同孵育60分钟，然后与二抗孵育30分钟，3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色，封片。在显微镜下观察阳性细胞的定位和信号，检测抗体的特异性和灵敏度。本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体更为特异地定位在细胞膜上，并且灵敏度是商品化鼠抗朊蛋白单克隆抗体的10倍。

2)单克隆抗体效价的测定

用本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体和商品化鼠抗朊蛋白单克隆抗体分别以1∶200，1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶5000，1∶10000稀释后与结肠癌细胞裂解液电泳转膜孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2小时，与ECL发光底物孵育曝光显影，检测抗体的灵敏度。结果显示本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体效价是商品化鼠抗朊蛋白单克隆抗体的20倍(本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体效价为1000，商品化鼠抗朊蛋白单克隆抗体的效价为500，即10000/500＝20)。

3)ELISA法鉴定单克隆抗体亚类

a.实验操作

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG至0.5μg/mL，每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBST)洗3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1小时。倾空液体，用PBST清洗3次。每孔加入0.1mL杂交瘤上清，37℃孵育1小时。倾空液体用PBST清洗3次。用封闭液1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体(购自SouthernBiotech)或1∶2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(购自Southern Biotech)0.1mL每孔，分别加入适当的孔中，37℃用孵育1小时。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL底物溶液，10-20分钟内测405nm波长下的OD值。

b.实验结果

实验结果显示，本发明所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。

实施例5：ELISA法测定单克隆抗体亲和常数

1)实验步骤：

包被免疫用重组细胞型朊蛋白，包被浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜，1×PBST(磷酸盐缓冲液，加吐温20)洗3次。每孔加200μL封闭液37℃封闭2小时，1×PBST洗3次。抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，从1∶200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1小时，1×PBST洗3次。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗1∶20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1小时，1×PBST洗3次。显色液100μL/孔显色10分钟，50μL/孔终止液终止反应。用酶标仪(购自北京天石医疗用品制作所，型号SM-3)，测定波长450/630吸光值。

2)数据分析：找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。

亲和常数

单个IgG抗体平均分子量值为150000，抗体原始浓度单位为4.98mg/mL。

3)结果：本发明单克隆抗体的亲和常数为1.08×10⁹。

实施例6：本发明的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体的用途验证-免疫组化(IHC)

1)材料来源：

本发明具体实施方式所用结直肠癌组织标本来源于北京肿瘤医院组织标本库，共包括结直肠癌及对应的癌旁正常组织样本。样本取材是经手术切除的新鲜结结直肠癌组织与其对应的癌旁组织经生理盐水洗涤后，放入***固定，石蜡包埋保存。标本均经病理证实，并有患者知情同意书。

2)实验步骤：

烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。0.3％H₂O₂甲醇室温10分钟，然后用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)洗3次×5分钟；5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时；抗细胞型朊蛋白单克隆抗体(1∶2000稀释)，湿盒孵育4℃过夜；滴加羊抗鼠二抗(中杉金桥，PV-6002)，室温孵育30分钟；DAB-H₂O₂(中杉金桥，ZLI-9031)显色，镜下控制3-5分钟，PBS漂洗，终止显色；苏木素(中杉金桥，ZLI-9040)复染45秒，然后1％盐酸酒精分化；自来水冲洗反蓝；95％和100％乙醇脱水各5分钟，二甲苯透明，中性树胶封片。

3)实验结果：

如图8所示，对免疫组化实验结果进行统计分析表明，细胞型朊蛋白在190例无转移结直肠癌组织中不表达(-)或者弱阳性表达(+)；在53例转移型结直肠癌组织中为阳性结果(+++)，18例转移型结直肠癌中弱阳性表达(+)。p值小于0.01。因此，组织芯片的实验结果也完全支持蛋白质组分析的结论，即细胞型朊蛋白在无转移的结直肠癌中低表达或不表达，但在转移型结直肠癌组织中高表达。

实施例7：本发明的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体的用途验证-免疫印迹法(WB)

本发明人进一步应用免疫印迹法WB测定细胞型朊蛋白在结直肠癌组织和6种结直肠癌细胞系中的蛋白表达。

1)实验步骤：

2种结直肠癌组织和6种结直肠癌细胞系中的蛋白30μg样本上样于12％SDS PAGE胶；电泳结束后，将胶在1×转移液中浸泡10分钟；PVDF膜甲醇处理后350mA，转膜70分钟；将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中37℃封闭1小时；抗细胞型朊蛋白单克隆抗体(1∶1000稀释)37℃孵育1小时或者4℃孵育过夜；相应羊抗鼠二抗(中杉金桥，1∶2500稀释)室温孵育1小时；用皮尔斯发光试剂(购自Pierce)孵育后用X光胶片曝光。

2)实验结果：

如图9所示，在所有的八对结直肠癌和癌旁组织中，细胞型朊蛋白在正常组织中基本不表达，在低分化肿瘤组织中高表达。当以结直肠癌组织中细胞型朊蛋白的表达作为阳性对照时，6种结直肠癌细胞系中成瘤能力高的细胞系表达细胞型朊蛋白。

实施例8：本发明的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体的用途的验证-免疫荧光(IF)

为了模拟细胞型朊蛋白的分泌后状态，本发明人构建了大肠杆菌表达***，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了去除信号肽的细胞型朊蛋白质--t-细胞型朊蛋白。本发明人采用免疫荧光技术来检测t-细胞型朊蛋白的细胞定位。

1)实验步骤：

将t-细胞型朊蛋白与结肠癌细胞SW480(购自ATCC)共培养；3.7％甲醛固定15分钟；0.2％TritonX-100打孔5分钟；含1％BSA的PBS溶液封闭1小时；加特异抗细胞型朊蛋白单克隆抗体(1∶100稀释)暗盒中孵育2小时；FITC标记的羊抗鼠二抗(中杉金桥，1∶200稀释)暗盒中孵育1小时；0.25μg/μL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液染细胞4分钟；将盖玻片取出盖在滴有10μL抗荧光衰减封片剂的载玻片上，指甲油封片后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

2)实验结果：

如图10所示，t-细胞型朊蛋白结合于细胞膜上，部分细胞型朊蛋白存在于高尔基体中。

运用获得结论，细胞型朊蛋白能够与肿瘤干细胞相结合，是该细胞的一个特异表达膜蛋白质。细胞型朊蛋白在成熟过程中胞外区发生切割，产生一个14KD的N端从细胞膜上脱落，这就意味着细胞型朊蛋白作为肿瘤干细胞的标志物，可以在血清中检测到细胞型朊蛋白的存在，这为细胞型朊蛋白的检测提供了方便。具体地说，由于细胞型朊蛋白是一个很好的肿瘤干细胞标志物，它具有其他肿瘤干细胞标志物没有的优点，临床上可用ELISA的方法检测血清中细胞型朊蛋白的含量。

实施例9：本发明的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体的用途的验证-抑制肿瘤干细胞转移

本发明人用Transwell技术检测了抗细胞型朊蛋白单克隆抗体抑制肿瘤干细胞转移的功能。

1)实验步骤：

将Transwell浸泡在无菌的DMEM中平衡过夜；将结直肠癌干细胞从球状克隆中用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用PBS洗2次，计数。将3×10⁵个细胞重悬在100μL DMEM中，接种到Transwell小室的上层，同时往Transwell下层中加入600μL含有10％FBS的DMEM。上下层培养液中均加入中浓度1μg/mL的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，1μg/mL IgG作为阴性对照，细胞培养24小时。用3.7％多聚甲醛固定细胞，然后用结晶紫染色。用棉签小心擦去没有转移的细胞，PBS洗3次，显微镜下照相，统计转移的细胞数目。

2)实验结果

如图11所示，本发明的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体显著抑制肿瘤干细胞转移。

3)将本发明制备的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体和小鼠IgG分别按照1μg/mL的浓度与结肠癌肿瘤干细胞共孵育2小时，手术方法抑制该细胞到小鼠脾脏包膜下。30天以后处死小鼠检测癌细胞转移，发现抗细胞型朊蛋白单克隆抗体能显著抑制肿瘤干细胞在小鼠体内转移。

实施例10：本发明的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体的其他用途的验证

1)用本发明方法制得的鼠抗朊蛋白单克隆抗体与结直肠癌细胞共同孵育10分钟，然后与PE荧光标记的二抗孵育10分钟，用流式细胞仪分选朊蛋白阳性和阴性的CD44+结直肠癌细胞，取向同数目的分选细胞注射到裸鼠皮下，检测肿瘤形成。结果发现表达细胞型朊蛋白结直肠癌细胞的肿瘤形成能力是不表达朊蛋白细胞的4倍。

2)将分选的细胞手术移植到脾脏包膜下，缝合伤口，35天后处死小鼠检查结直肠癌细胞是否发生肝转移，并取肝脏固定，用石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色的方法确认转移灶。结果显示表达细胞型朊蛋白的结肠癌细胞的转移能力是不表达朊蛋白的结直肠癌细胞的20倍以上。

3)取200个分选细胞接种到0.35％的琼脂糖中，20天后染色发现细胞型朊蛋白阳性的结直肠癌细胞的克隆形成能力显著高于朊蛋白阴性细胞。

以上实验结果表明本发明制备的抗细胞型朊蛋白抗体能专一识别结直肠癌中的转移型肿瘤干细胞。

因此，本发明提供的单克隆抗体用于制备临床上检测血清中细胞型朊蛋白肿瘤干细胞药物有极高的应用前景。

Claims

1.一种保藏号为CGMCC No.4972的杂交瘤细胞系PrPC Ab-3。

2.一种抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.4972的杂交瘤细胞系产生。

3.根据权利要求2所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗细胞型朊蛋白单克隆抗体与细胞型朊蛋白特异性结合。

4.根据权利要求3所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述细胞型朊蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求2至4任一项所述的抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，其中，所述抗肿瘤药物选自抗结直肠癌药物、抗结直肠癌转移药物、抗直肠癌细胞转移药物、抗直肠癌细胞扩散药物、抗直肠癌干细胞转移药物和抗直肠癌细胞生长药物。