CN103740614B - 一株高产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株（Actinoplanes）CGMCC NO.8430，属于发酵工程技术领域。该菌是以从海南岛的土壤样品中筛选出的产雷帕霉素的游动放线菌hn?016（Actinoplanes）为出发菌株，经过常压室温等离子体诱变产生的。本发明的诱变菌株BCStr?096，比常规诱变方法获得的菌株遗传稳定性更高，雷帕霉素的生产能力更高，其产量比出发菌株hn?016的产量200mg/L，提高了175%，且在现有雷帕霉素最高的发酵水平上提高了37%左右，大大降低了生产成本。

Description

一株高产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株高产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株BCStr-096。

背景技术

雷帕霉素(rapamycin,RPM)又名西罗莫司，是具独特作用机制的含氮三烯大环内酯类抗生素，具有抗真菌、抗增殖的作用，据报道，Luan FL等人的动物实验发现雷帕霉素还具有抗肿瘤的作用。雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型强效免疫抑制剂，其分子结构类似于FK506，是又一种亲免疫蛋白结合剂，可用于器官移植抗排斥作用，它的免疫抑制作用比环孢菌素强数十倍，是肾毒性最低的免疫抑制剂，还可用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病，目前发展为基因治疗和抗肿瘤药物，具有广阔的应用前景。

最初，RPM作为低毒性抗真菌抗生素，1978年发现它对自身免疫性疾病有免疫抑制作用。受此启发，1989年Mortis正式开始把RPM作为器官移植抗排斥的新型免疫抑制剂进行试用。1999年9月美国FDA正式批准雷帕霉素作为肾移植的抗排斥药物投放市场，同时由Cordis公司研发的以雷帕霉素作为涂层药物的血管支架Cypher已于2002年相继在欧洲、美国和日本上市。2005年6月我国福建省微生物研究所研发的国产雷帕霉素经SFDA批准投放市场，而由美国Wyeth公司开发的雷帕霉素作为抗癌药现已进入临床试验阶段。2006年前，雷帕霉素在美国市场的价格为6千美金1克，目前，雷帕霉素的销量正在迅速增长，其市场售价也略有降低，估计它将和环孢菌素有效地竞争，逐渐地平分抗移植器官排异药的市场，Pharmaprojects（在研新药动态）预测其销售额达5-20亿美元。雷帕霉素在国内属于六类新药，2009年雷帕霉素在国内市场的销售额已超过5亿元人民币，具有广阔的市场前景。

目前，雷帕霉素的工业化生产主要是通过微生物发酵方法生产，但目前该抗生素的发酵水平还相当低，有文献报道的最高发酵水平也仅达到400mg/L左右。因此，雷帕霉素生物发酵生产存在的不足主要在于雷帕霉素的生物发酵单位不高，不利于提取纯化，不能充分满足工业化生产的要求。

本发明利用常压室温等离子体诱变技术，筛选出一株雷帕霉素高产菌株，提高了雷帕霉素的产量，有效降低了生产成本。

发明内容

本发明所要解决的问题是利用常压室温等离子体诱变技术，筛选出一株新型雷帕霉素高产菌株。

本发明所提供的菌株为游动放线菌（Actinoplanes sp.）诱变菌株BCStr-096，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.8430，分类命名：游动放线菌Actinoplanes sp.；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期2013年11月05日。该菌株是以从海南岛的土壤样品中筛选出的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016（Actinoplanes sp.）为出发菌株，经多组复合诱变筛选得到的。

本发明游动放线菌，具体采用以下技术方案进行选育：

1.采用常压室温等离子体诱变技术选育雷帕霉素高产菌株

（1）选择生长良好的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016斜面菌株，用生理盐水洗下孢子，经纱布过滤，制成10⁶个/mL的孢子悬浮液；

（2）将（1）中的孢子悬浮液，用移液枪吸取10μL于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气为工作气体，功率110W，工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变***中，处理距离为2mm，分别处理0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s，将处理的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线；

（3）根据（2）的致死率曲线，选择高、中、低三个不同致死剂量的照射时间，对菌株hn-016的孢子悬液进行等离子体诱变；

（4）将（3）中三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀；

（5）将（4）中的诱变孢子悬液，进行梯度稀释后，分别涂布于含有2mg/L氯霉素，0.8mg/L链霉素，4mg/L红霉素，1mg/L庆大霉素的抗性平板上；

（6）将（5）中各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面后，以1%的接种量，接种于种子培养基中，28℃，220r/min，培养45-50h后，以10%的接种量将种子液接种于发酵培养基，28℃，220r/min培养7-8d；

（7）取（6）中的发酵液于离心管中，5000r/min离心10min，取菌体用甲醇萃取，倒入装有10-15颗玻璃珠的三角瓶中，于180-200r/min的摇床上震荡浸提1h，取抽提液，10000r/min离心10min，过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定雷帕霉素的产量，通过此方法筛选出雷帕霉素高产菌株BCStr-096。

2.游动放线菌BCStr-096的培养方法为：

（1）菌种活化：将游动放线菌BCStr-096转接至保藏分离斜面培养基，28℃恒温培养7-15天；

（2）种子培养：选取生长良好的斜面，用灭菌的生理盐水洗下孢子，制备浓度约10⁶个/mL的孢子悬液，以1%的接种量接种于装有60mL种子培养基的500mL三角瓶中，28℃，220r/min，震荡培养45-50h；

（3）发酵培养：将（2）中的种子培养液，以10%的接种量接种于装有60mL发酵培养基的500mL三角瓶中，28℃，220r/min，震荡培养7-8d；

3.游动放线菌BCStr-096诱变及培养过程所用培养基组成为：

（1）保藏分离培养基：燕麦片3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，碳酸钙0.25%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（2）种子培养基：可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1%，碳酸钙0.3%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（3）发酵培养基：玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黄豆饼粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，氯化钠0.5%，甘油1%，碳酸钙0.3%，泡敌0.2%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

有益效果：

本发明的诱变菌株BCStr-096是通过等离子体诱变方法获得的，比常规诱变方法获得的菌株遗传稳定性更高，雷帕霉素的生产能力更高，其产量比出发菌株hn-016的产量200mg/L，提高了175%，且在现有雷帕霉素最高的发酵水平上提高了37%左右，大大降低了生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

从土壤中筛选出的产雷帕霉素的菌株hn-016

1.菌体形态：菌体为革兰氏阳性菌，无气生菌丝，以孢子的方式进行繁殖，孢子浑圆，大部分具极生丛毛，能游动。

2.菌落形态：在平板上，菌落的基丝表面呈颗粒状，橙黄色，随着培养时间的延长，菌落会由橙黄色变成黄褐色。

3.培养特征：此菌为高耗氧菌，最适生长温度为28℃，最适生长pH为7.0-7.2；在摇床转速为210-240r/min，培养7-8d时，雷帕霉素产量最高，发酵过程中溶氧对雷帕霉素的产生具有显著作用。

实施例2

以游动放线菌hn-016为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术筛选菌株BCStr-096

1.诱变菌株的获得

（1）选择生长良好的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016斜面菌株，用生理盐水洗下孢子，经纱布过滤，制成10⁶个/mL的孢子悬浮液；

（2）将（1）中的孢子悬浮液，用移液枪吸取10μL于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体，电源功率为110W，工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变***中，处理距离为2mm，分别处理0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s，将处理的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线；

（3）根据（2）的致死率曲线，选择40s、80s、100s三个不同致死剂量的照射时间，对菌株hn-016的孢子悬液进行等离子体诱变；

（4）将（3）中三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀；

（5）将（4）中的诱变孢子悬液，进行梯度稀释10^-1-10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于含有2mg/L氯霉素，0.8mg/L链霉素，4mg/L红霉素，1mg/L庆大霉素的抗性平板上；

（6）将（5）中各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面后，以1%的接种量，接种于种子培养基中，28℃，220r/min，培养45-50h后，以10%的接种量将种子液接种于发酵培养基，28℃，220r/min培养7-8d；

所述种子培养基组成为：可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1%，碳酸钙0.3%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

所述发酵培养基组成为：玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黄豆饼粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，氯化钠0.5%，甘油1%，碳酸钙0.3%，泡敌0.2%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

（7）取（6）中的发酵液于离心管中，5000r/min离心10min，取菌体用甲醇萃取，倒入装有13颗玻璃珠的三角瓶中，于190r/min的摇床上震荡浸提1h，取抽提液，10000r/min离心10min，过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定雷帕霉素的产量，通过此方法即筛选出高产雷帕霉素的诱变菌株BCStr-096。

2.诱变菌株BCStr-096的特性

（1）菌体形态：菌体为革兰氏阳性菌，无气生菌丝，以孢子的方式进行繁殖，孢子浑圆，大部分具极生丛毛，能游动。

（2）菌落形态：在平板上，菌落的基丝表面呈颗粒状，橙黄色，随着培养时间的延长，菌落会由橙黄色变成黄褐色。

（3）培养特征：此菌为高耗氧菌，最适生长温度为28℃，最适生长pH为7.1；在摇床转速为230r/min，培养7-8d时，雷帕霉素产量最高。

（4）可以在含有0.8mg/L链霉素的培养基中进行生长，并生长良好。

实施例3

游动放线菌BCStr-096的培养

1.培养基的配制

（1）保藏分离培养基：燕麦片3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，碳酸钙0.25%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（2）种子培养基：可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1%，碳酸钙0.3%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（3）发酵培养基：玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黄豆饼粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，氯化钠0.5%，甘油1%，碳酸钙0.3%，泡敌0.2%，不足部分蒸馏水补足，pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2.菌种活化

将甘油保存的菌种BCStr-096转接至保藏分离培养基斜面，于恒温培养箱中，28℃培养7-15d；

3.种子培养

选择生长良好的活化斜面，接种于装有上述1中制得的种子培养基中（500mL三角瓶内装60mL培养基），于28℃，220r/min，培养45-50h。

4.发酵培养

将3中制得的种子液以10%（v/v）接种量接种于发酵培养基中（500mL三角瓶内装60mL培养基），于28℃，220r/min条件下发酵培养8d。

检测结果：游动放线菌（Actinoplanes sp.）BCStr-096在发酵培养基上雷帕霉素的产量为535—565mg/L。

Claims (2)

1.一株产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株，

所述游动放线菌诱变菌株(Actinoplanes)BCStr-096，保藏编号为CGMCC NO.8430。

2.根据权利要求1所述的产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株BCStr-096在发酵生产雷帕霉素中的应用。