CN103013863A - 一种鞘氨醇单胞菌及其在制备鼠李糖胶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种鞘氨醇单胞菌，其分类命名为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）PG-8，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册的编号是CGMCC NO.6833，保藏日期是2012年11月15日。本发明还公开鞘氨醇单胞菌在制备鼠李糖胶（Rhamsan Gum）中的应用。利用该菌株在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中培养，在优化条件下能积累鼠李糖胶5～50g/L。该菌株能利用多种碳源和氮源，培养条件粗放，操作方便简单，鼠李糖胶产量高，生产成本低，能广泛应用于食品添加、石油钻井等领域。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种高产鼠李糖胶的微生物菌株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）及其应用。
背景技术
鼠李糖胶（Rhamsan Gum）是由鞘氨醇单胞菌产生的一种胞外多糖，是结冷胶类多糖的一种。结冷胶类多糖具有相同的四糖重复单元主链结构：D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖，只是侧链或其它结构有些细微的区别。鼠李糖胶结构如（1）所示。鼠李糖胶以其独特的物理学和流变学特性以及使用安全性，可作为悬浮剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂、成膜剂等广泛用于食品、石油、水泥、涂料行业，也用于油墨、食品、纺织印染、农药、化妆品、医药等行业。
目前，鼠李糖胶尚未被大规模开发，仅美国Kelco公司对其进行了小范围研究，我国在该领域的研究尚属空白，未见其产业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株能够高产鼠李糖胶的鞘氨醇单胞菌。
本发明还要解决的技术问题，是提供上述鞘氨醇单胞菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
发明人于江苏省南京市老山国家森林国家公园选取的土样中选育的微生物鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）PG-8，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编：100101。登记入册的编号是CGMCCNO：6833，保藏日期是：2012年11月15日。以此菌作为生产菌株。
CGMCCNO：6833菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征：
在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.5~1.2×0.5~3μm大小的杆菌，30°C培养2~3天。在上述培养基中30°C培养12h菌体可以大量生长。菌落呈淡黄色，圆形，表面光滑，粘状，中间凸起，不透明。
2、生理与生化特性：
（1）培养温度：25~38°C，最适温度为30-32°C；
（2）在pH5.0~9.0范围内生长；
（3）革兰氏染色：阴性；
（4）甲基红实验：阴性；
（5）吲哚生产：阴性；
（6）H2S生产：阴性；
（7）耐NaCl浓度：7%浓度以上可以生长。
3、16S rDNA序列分析：
测得16S rDNA大部分序列1443bp，如SEQ ID No：1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的***发育树。结果表明：菌株与鞘氨醇单胞菌达到99.9%同源。所以认定本发明使用的是鞘氨醇单胞菌，具体为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）PG-8。
4、营养特征：
鞘氨醇单胞菌的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量为：碳源10~100g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~50g/L，其余为水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种或多种；氮源可采用酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或多种；培养基中还包括钾盐、钠盐、镁盐、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐等一种或多种常用的无机盐类。
上述鞘氨醇单胞菌在制备鼠李糖胶中的应用。
具体的方法是：将菌株CGMCC NO.6833接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可得到鼠李糖胶。
其中，所述的发酵培养基包含如下组分：碳源10~100g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~50g/L，其余为水，pH5.0~9.0。
其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的一种或多种。
其中，所述的合适生长的条件是：初始pH为5.0~9.0、培养温度为25~38°C、培养时间为24~72h。
其中，发酵结束后，除去菌体的发酵液可提取鼠李糖胶。
具体地说：
本发明提供的制备鼠李糖胶的方法，是将菌株CGMCC No.6833接种到斜面1~4天后（斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基），在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养24~72h，可以生成5~50g/L鼠李糖胶，通常发酵条件优选：培养基为：葡萄糖10~100g/L，酵母膏1~10g/L，(NH4)2SO41~20g/L，K2HPO41~30g/L，MgSO4·7H2O0.2~3g/L。发酵温度25~38°C，较佳的为30~32°C；培养基的初始pH范围为5.0~9.0，较佳的为6.5~8.0；好氧培养。
有益效果：本发明具有如下优势：
（1）本发明筛选到一株鼠李糖胶生产菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产鼠李糖胶，操作方便简单，培养条件十分粗放。
（2）本发明筛选到一株鼠李糖胶生产菌，能够获得较高浓度的鼠李糖胶，鼠李糖胶含量最高可至约50g/L，远高于目前报道的约15g/L[JerryA.Peik，San Diego；SuzannaM.Steenbergen，Lakeside；Harold R.Hayden，Escondido，all of Calif.HETEROPOLYSACCHARIDE S-194，美国专利申请号：313,440，已于1983年8月30日公开]。
（2）可以使用纤维素水解糖液（替代葡萄糖或蔗糖）、豆饼粉（替代酵母膏或蛋白胨）作为鼠李糖胶发酵培养基的碳源、氮源，使发酵原料成本大幅下降。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：500mL摇瓶发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。
发酵培养基：葡萄糖40g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用NaOH溶液调pH6.8。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，30°C、200r/min的摇床条件下培养15h，将种子液按5%（v/v）的种子量接种于预装有500mL灭菌后的发酵培养基的摇瓶中进行培养，培养条件：30°C，200r/min，发酵72h，鼠李糖胶含量达到20.6g/L。
实施例2：3L发酵罐分批发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基及发酵培养基同实施例1。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，30°C、200r/min的摇床条件下培养15h，将种子液按8%（v/v）的种子量接种于预装有2.1L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：30°C，400r/min，通气量3.0L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用3mol/L HCl或10%氨水（v/v）控制发酵液pH值在6.5-7.5之间。发酵48h，鼠李糖胶含量达到23.5g/L。
实施例3：3L发酵罐分批发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基及发酵培养基同实施例1。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，32°C、200r/min的摇床条件下培养15h，将种子液按5%（v/v）的种子量接种于预装有2.1L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：30°C，600r/min，通气量2.3L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用3mol/L HCl或3mol/L NaOH溶液控制发酵液pH值在7.0-7.5之间。发酵48h，鼠李糖胶含量达到28.9g/L。
实施例4：3L发酵罐间隙补料分批发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基及发酵培养基同实施例1。补料培养基为葡萄糖500g/L，葡萄糖总量为80g/L。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，30°C、200r/min的摇床条件下培养16h，将种子液按10%（v/v）的种子量接种于预装有2.1L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：30°C，400r/min，通气量3.0L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用3mol/L HCl或3mol/L NaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间。当发酵液中残留总糖在10g/L时，打开补料装置，分两次（每次20g/L）将总量为40g/L的葡萄糖补入发酵液中，发酵72h，鼠李糖胶含量达到38.9g/L。
实施例5：100L发酵罐恒流补料发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基及发酵培养基同实施例1。补料培养基为葡萄糖500g/L，葡萄糖总量为80g/L。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，31°C、200r/min的摇床条件下培养16h，将种子液按10%（v/v）的种子量接种于预装有6.3L灭菌后的种子培养基的10L种子罐中，31°C、400r/min条件下培养8h，将其移种至100L发酵罐中，该发酵罐中预装有63L灭菌后的发酵培养基。100L发酵罐发酵条件如下：31°C，300r/min，通气量84L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用3mol/LHCl或3mol/LNaOH控制发酵液pH值在6.8-7.2之间，当发酵液中葡萄糖浓度低至5g/L时，利用补料泵将补料培养基泵入发酵液中，维持发酵罐中糖浓度5-10g/L之间，发酵72h，葡萄糖总量达80g/L，发酵液中鼠李糖胶含量达到50.0g/L。
实施例6：500mL摇瓶发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基同实施例1。发酵培养基：葡萄糖50g/L，玉米浆50g/L，NH4Cl3g/L，K2HPO4·3H2O4g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，利用NaOH溶液调pH7.0。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，35°C、220r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按8%（v/v）的种子量接种于预装有500mL灭菌后的发酵培养基的摇瓶中进行培养，培养条件：35°C，220r/min，发酵68h，鼠李糖胶含量达到29.7g/L。
实施例7：3L发酵罐分批发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基同实施例1。发酵培养基：蔗糖50g/L，棉籽饼粉25g/L，NH4NO38g/L，K2HPO4·3H2O4g/L，MgSO4·7H2O5g/L，利用NaOH溶液调pH8.5。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，38°C、220r/min的摇床条件下培养12h。将种子液按10%（v/v）的种子量接种于预装有2.1L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：38°C，800r/min，通气量3.0L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用3mol/LHCl或3mol/LNaOH控制发酵液pH值在7.5-7.8之间。当发酵液中残留总糖在10g/L时，打开补料装置，分两次（每次15g/L）将总量为30g/L的蔗糖补入发酵液中，发酵72h，鼠李糖胶含量达到42.5g/L。
实施例8：100L发酵罐分批发酵Sphingomonas sp.PG-8生产鼠李糖胶。
种子培养基同实施例1。发酵培养基：葡萄糖50g/L，豆饼粉20g/L，NH4NO38g/L，K2HPO4·3H2O4g/L，MgSO4·7H2O5g/L，利用NaOH溶液调pH8.5。
将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.PG-8(CGMCC NO:6833)接种于种子培养基中，34°C、220r/min的摇床条件下培养10h，将种子液按12%（v/v）的种子量接种于预装有6.3L灭菌后的种子培养基的10L种子罐中，34°C、220r/min条件下培养10h，将其移种至100L发酵罐中，该发酵罐中预装有63L灭菌后的发酵培养基。100L发酵罐发酵条件如下：34°C，220r/min，通气量84L/min，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用3mol/LHCl或3mol/L NaOH控制发酵液pH值在7.5-7.8之间，当发酵液中葡萄糖浓度低至5g/L时，利用补料泵将补料培养基泵入发酵液中，维持发酵罐中糖浓度5-10g/L之间，发酵72h，葡萄糖总量达80g/L，发酵液中鼠李糖胶含量达到48.5g/L。
Claims (6)
1.一种鞘氨醇单胞菌其分类命名为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）PG-8，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册的编号是CGMCC NO.6833，保藏日期是2012年11月15日。
2.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌在制备鼠李糖胶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将菌株CGMCC NO.6833接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可得到鼠李糖胶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下组分：碳源10~100g/L，氮源1~40g/L，无机盐0.01~50g/L，其余为水，pH5.0~9.0。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的合适生长的条件是：初始pH为5.0~9.0、培养温度为25~38°C、培养时间为24~72h。
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