CN103013850B - 一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法，该菌株为杆状革兰氏阴性菌，耐盐耐碱，对铬污染物耐受浓度高，能在好氧条件下将高毒性Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)；当pH为8.5，NaCl浓度为20 g L^-1时，菌株经114h培养后，可将Cr(VI)浓度从130 mg L^-1降至9.1 mg L^-1，还原率高达95.2%；本发明所提供的菌株具有高的Cr(VI)还原效率，可作为铬污染水体与土壤的生物修复材料，用于去除水中和土壤中的Cr(VI)污染物。

Description

一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种用于环境污染修复的微生物，尤其涉及一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原菌株及其筛选方法。

背景技术

据初步调查，目前我国铬渣总堆存量超过600万吨，分散于20多个省市的80余处。经过几十年的雨水冲淋、渗透，铬渣堆存场地已被严重污染，据有关专家估算，已被铬渣严重污染、必须治理的土壤数量估计在400万吨至1000万吨之间，由此导致的水体污染亦不容忽视。《中华人民共和国国民经济和社会发展第十一个五年规划纲要》已将铬渣污染治理列为环境治理重点工程，明确要求对堆存铬渣及受污染土壤进行综合治理，实现所有堆存铬渣无害化处置。因此，开展铬污染水体与土壤的修复治理工作已刻不容缓。

铬在环境中主要以Cr(VI)和Cr(III)的形式存在。与Cr(III)相比，Cr(VI)具有致畸、致癌、致突变等高毒性。而Cr(III)则易与环境中的有机、无机化合物相结合，形成复杂稳定的难溶化合物，因而迁移性小，生物有效性低，其毒性仅为Cr(VI)的千分之一。因此，将高毒性的Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)是Cr(VI)污染物修复的基本思路。

与物理隔离法、化学还原沉淀法、离子交换法、反渗透法等传统的物理化学方法相比，生物修复因其具有低成本、操作简单、无二次污染等优势而受到广泛的关注与重视。近年来，已有不同种属的铬还原微生物得以分离和报道，如无色杆菌Achromobacter sp.Ch-1、微杆菌Microbacterium sp.MP30、苍白杆菌Ochrobactrum sp.、金黄节杆菌Arthrobater aurescens sp.、芽孢杆菌Bacillus sp.等。但迄今尚未有关于解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum还原Cr(VI)的报道。同时，已报道的微生物中，大多数菌株的Cr(VI)还原过程在厌氧条件下进行，且耐盐能力低、耐碱能力有限，因而难以满足实际污染土壤和水体中高盐分含量、碱性环境的实际修复要求。

因此，本领域迫切需要筛选获得新的、能够满足实际污染水体与土壤修复要求的微生物资源，从而为铬污染生物修复的实施提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法。该菌株对铬污染物具有高耐受能力，且能够在高盐度的碱性环境中将高毒性的Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)。本发明为铬污染的生物修复提供了新的微生物资源。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物，它的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所示的基因序列；该耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.5873。

上述耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物通过以下步骤筛选获得：

（1）富集：称取5g铬污染土壤于50mL已灭菌的液体LB培养基中（氯化钠5g L^-1，酵母提取物5g L^-1，胰蛋白胨10g L^-1，pH=7.0～7.5），28℃，160rpm振荡培养；

（2）驯化：当土悬液由原来的黄色变成灰绿色时，取上悬液接种至含Cr(VI)的液体LB培养基中，28℃，160rpm振荡培养，当培养液再次由黄色变成灰绿色时，将其接种至另一含有更高Cr(VI)浓度的液体培养基中，以此逐步提高培养基中的Cr(VI)浓度，从而驯化目的菌株；驯化过程中所用的Cr(VI)以过滤灭菌后的K₂Cr₂O₇母液形式进行添加；驯化所用的Cr(VI)浓度梯度依次为5mM、8mM、10mM、12mM、15mM；

（3）分离：当驯化浓度为15mM Cr(VI)时，经过5d的培养，培养液变成灰绿色，以该菌液作为分离母液，取1mL按梯度稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；分别从10^-5、10^-6、10^-7的稀释液中吸取50uL涂布于含7mM Cr(VI)的固体培养基中，28℃倒置培养2～3d；

（4）纯化：分别挑取不同形态的单菌落，于含有7mM Cr(VI)的固体培养基中进行划线接种；28℃倒置培养2～3d后，再次挑取单菌落划线于含铬培养基中；如此纯化3～4代，获得耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物。

本发明的有益效果是：本发明筛选获得一种新的耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10，该菌株为革兰氏阴性菌，杆状0.5～1.0μm×1.0～2.5μm，在好氧条件下可将重铬酸钾和铬酸钾中的高毒性Cr(VI)还原为低毒性的Cr(III)；该菌具有一定的耐盐性和耐碱性；在培养基氯化钠浓度为2～20g L^-1，pH 7.0～10.7的范围内均可以很好地进行生长和Cr(VI)还原。该菌株的Cr(VI)还原效率高，可用于制备水体或土壤中铬污染的生物修复材料，应用于去除水中和土壤中的Cr(VI)污染物。

Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10菌种已于2012年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCCNo.5873；分类命名为解糖假苍白杆菌LY10，拉丁文学名为：Pseudochrobactrumsaccharolyticum LY10。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。

附图说明

图1是本发明菌株的***发育树；

图2是本发明菌株在不同pH条件下的生长情况图；

图3是本发明菌株在不同pH条件下的Cr(VI)还原情况柱状图；

图4是本发明菌株在不同盐度下的Cr(VI)还原情况柱状图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

实施例1：本发明菌株的筛选与分离

1、富集：采集杭州原红星化工厂铬渣堆场污染土壤，称取5g土壤于50mL已灭菌的液体LB培养基中（氯化钠5g L^-1，酵母提取物5g L^-1，胰蛋白胨10gL^-1，pH=7.0～7.5），28℃，160rpm振荡培养。

2、驯化：当土悬液由原来的黄色（Cr(VI)呈黄色）变成灰绿色（Cr(III)呈绿色）时，取上悬液接种至新配置的含Cr(VI)的液体LB培养基中，28℃，160rpm振荡培养，当培养液再次由黄色变成灰绿色时，将其接种至含有更高Cr(VI)浓度的液体培养基中，以此逐步提高培养基中的Cr(VI)浓度，从而驯化目的菌株。驯化过程中所用的Cr(VI)以过滤灭菌后的K₂Cr₂O₇母液形式进行添加。驯化所用的Cr(VI)浓度梯度依次为5mM、8mM、10mM、12mM、15mM。

3、分离：当驯化浓度为15mM Cr(VI)时，经过5d的培养，培养液变成灰绿色，以该菌液作为分离母液，取1mL按梯度稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。分别从10^-5、10^-6、10^-7的稀释液中吸取50uL涂布于含7mM Cr(VI)的固体培养基中，28℃倒置培养2～3d。

4、纯化：分别挑取不同形态的单菌落，于含有7mM Cr(VI)的固体培养基中进行划线接种。28℃倒置培养2～3d后，再次挑取单菌落划线于含铬培养基中。如此纯化3～4代，获得具有高浓度Cr(VI)耐受能力的菌株，命名为LY10。

实施例2：菌株的生理生化及16S分子鉴定

1、生理生化特征

菌株LY10在不含铬的LB固体平板上生长24h后，菌落呈不透明的圆形，表面光滑湿润，呈乳白色。将菌株LY10划线至含7mM Cr(VI)的固体培养基中，培养72h后，菌落因富集了一定量的铬而呈淡黄色。该菌株为革兰氏阴性菌，杆状，无鞭毛，大小为0.5～1.0×1.0～2.5um。该菌株的检测鉴定委托中国科学院微生物研究所进行（2011微检字第243号）。细菌的氧化酶试验结果为阳性，接触酶试验结果为阳性。其BIOLOG鉴定结果如表1。

表1.LY10对BIOLOG GN板上95种碳底物的利用能力

试验项目	结果	试验项目	结果	试验项目	结果
						水	-	D-蜜二糖	-	奎尼酸	-
环糊精	-	β-甲基-D-葡萄糖苷	-	D-葡糖二酸	-
						糊精	-	D-阿洛酮糖	-	癸二酸	-
糖原	-	D-棉子糖	-	琥珀酸	＋
						吐温40	-	L-鼠李糖	-	溴丁二酸	＋
吐温80	＋	D-山梨醇	-	琥珀酰胺酸	-
						N-乙酰基-D半乳糖胺	-	蔗糖	-	葡糖醛酰胺	-
N-乙酰基-D-葡萄糖胺	＋	D-海藻糖	-	L-丙氨酸胺	＋
						核糖醇	-	松二糖	-	D-丙氨酸	＋
L-***糖	＋	木糖醇	-	L-丙氨酸	＋
						D-***糖	-	甲基丙酮酸	＋	L-丙氨酰甘氨酸	＋
D-纤维二糖	-	单甲基琥珀酸	＋	L-天冬酰胺酸	＋
						赤藻糖醇	-	乙酸	＋	L-天门冬氨酸	＋
D-果糖	＋	顺-乌头酸	-	L-谷氨酸	＋
						L-果糖	-	柠檬酸	-	甘氨酰-L-天门冬氨酸	＋
D-半乳糖	-	甲酸	-	甘氨酰-L-谷氨酸	＋
						龙胆二糖	-	D-乳糖酸内酯	-	L-丝氨酸	＋
α-D-葡萄糖	＋	D-半乳糖醛酸	-	L-苏氨酸	＋
						m-肌醇	-	D-葡萄糖酸	-	D,L-肉碱	-
α-D-乳糖	-	D-葡萄糖胺酸	-	γ-氨基丁酸	＋
						乳果糖	-	D-葡萄糖醛酸	-	尿刊酸	＋
麦芽糖	-	α-羟基丁酸	＋	肌苷	＋
						D-甘露醇	-	β-羟基丁酸	-	尿苷	＋
D-甘露糖	-	γ-羟基丁酸	-	胸腺嘧啶核苷	-
						p-羟基苯乙酸	-	L-组氨酸	＋	苯乙胺	-
衣康酸	-	羟基-L-脯氨酸	＋	丁二胺	-
						α-酮丁酸	＋	L-亮氨酸	-	2-氨基乙醇	-
α-酮戊二酸	＋	L-鸟氨酸	＋	2,3-丁二醇	-

α-酮戊酸	-	L-苯丙氨酸	-	丙三醇	-
						D,L-乳酸	＋	L-脯氨酸	＋	D,L-α-磷酸甘油	-
丙二酸	-	L-焦谷氨酸	-	1-磷酸葡萄糖	-
						丙酸	＋	D-丝氨酸	-	6-磷酸葡萄糖	-

2、16S rRNA基因及***发育树分析

采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌总DNA。所用PCR引物为通用引物：正向引物BSF8／20序列如SEQ ID NO.2所示：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3’；反向引物BSR1541／20序列如SEQ IDNO.3所示：5’一AAGGAGGTGATCCAGCCGCA一3’。PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成，所得16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。将该序列在NCBI数据库中进行比对分析，构建***发育树如图1所示。比对结果显示，该菌株属于Pseudochrobactrum saccharolyticum种，故命名为Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10。菌株已于2012年3月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）递交专利程序微生物保存，保藏号为CGMCC No.5873。

实施例3.：菌株LY10的耐碱性和耐盐性检测

1、pH对菌株LY10的Cr(VI)还原能力的影响

将菌株P.saccharolyticum LY10培养至对数增长期，按照体积比1%的接种量接种至含130mg L^-1 Cr(VI)，pH分别为5.5、7.0、8.3、9.2、10.7的液体LB培养基中，28℃，160rpm条件下振荡培养。分别于不同时间段取样测定微生物量OD600和培养液中Cr(VI)浓度。

实验结果表明，P.saccharolyticum LY10具有一定的耐碱能力和较宽的适宜pH生长范围，在中性-碱性环境下（pH7.0至10.7）均能较好地生长和进行Cr(VI)还原，结果图2、图3所示。当pH为8.3时，该菌具有最大生长量和最高Cr(VI)还原能力，培养84h后，Cr(VI)还原率为60.57%。该菌对pH的广适性为其在不同pH，特别是碱性环境中的应用提供了保证。

2、盐度对菌株LY10的Cr(VI)还原能力的影响

将培养至对数增长期的菌株按照体积比1%的接种量接种至不同盐度（NaCl浓度分别为0、1、2、5、10、20、40、60g L^-1），初始Cr(VI)浓度为130mg L^-1的LB培养基中，28℃，160rpm条件下培养114h后取样，经10000rpm离心10min后取上清测定Cr(VI)的含量。

实验结果表明菌株P.saccharolyticum LY10具有较高的耐盐能力，在NaCl浓度为1～20g L^-1的条件下均能很好地生长并进行Cr(VI)还原，且随着NaCl浓度的增加，Cr(VI)还原率逐渐增加。当NaCl浓度为20g L^-1时，菌株经培养114h后，可将Cr(VI)浓度从130mg L^-1降至9.1mg L^-1，还原率高达95.2%，结果如图4所示。该菌的耐盐特性为其在高盐分含量的铬渣污染土壤中的应用创造了条件。

<110>  杭州高博环保科技有限公司

<120>  一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物及其筛选方法

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1361

<212>  DNA

<213>  Pseudochrobactrum saccharolyticum

<400>  1

tggtcgcctg cctccttgcg gttagcacag cgccttcggg taaaaccaac tcccatggtg     60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcattctg atccgcgatt    120

actagcgatt ccaacttcat gcactcgagt tgcagagtgc aatccgaact gagatggctt    180

ttggagatta gctcgacctc gcggtctcgc tgcccactgt caccaccatt gtagcacgtg    240

tgtagcccag cccgtaaggg ccatgaggac ttgacgtcat ccccaccttc ctccagctta    300

tcactggcag tccctttaga gtgcccaact aaatgatggc aactaaaggc gagggttgcg    360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc    420

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gctggtaagg ttctgcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc    540

ccccgtcaat tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg aatgtttaat    600

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atggaccagt aagccgcctt cgccactggt gttcctgcga atatctacga atttcacctc    780

tacactcgca attccactta cctcttccat actcaagact tccagtatca aaggcagttc    840

cggggttgag ccccgggatt tcacccctga cttaaaagtc cgcctacgtg cgctttacgc    900

ccagtaaatc cgaacaacgc tagccccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta    960

gccggggctt cttctccggt taccgtcatt atcttcaccg gtgaaagagc tttacaaccc   1020

tagggccttc atcactcacg cggcatggct ggatcaggct tgcgcccatt gtccaatatt   1080

ccccactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcat   1140

cctctcagac cagctatgga tcgtcgcctt ggtaggcctt taccctacca actagctaat   1200

ccaacatggg ctcatcattc tccgataaat ctttccccaa aagggcgtat acggtattag   1260

cacaagtttc cctgagttat tccgtagaga acggtagatt cccatgcatt actcacccgt   1320

ctgccactgc ctccgaagag accgttcgac ttgcatgtgt a                       1361

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工设计

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<212>  DNA

<213>  人工设计

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aaggaggtga tccagccgca                                                 20

Claims (1)

1.一株耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物，其特征在于，它的16S rRNA基因具有SEQ ID No.1所示的基因序列；该耐盐耐碱的Cr(VI)还原微生物保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.5873。