CN103007292A - 靶向小胶质细胞的miR-30b复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，由K9肽（KKKKKKKKK）和S9肽（VVMKFLTQQ）的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成，该复合物可利用S9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在S9肽与CX3CR1受体作用的同时，miR-30b高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物，在神经***疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

靶向小胶质细胞的miR-30b复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽-基因复合物，还涉及该复合物的制备方法和在制药领域中的应用。

背景技术

小胶质细胞作为中枢神经***免疫防疫的第一道防线，在炎症反应中起重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡，小胶质细胞会迅速被激活并将其清除，同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明，过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经***疾病的进程，而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。因此，适当抑制小胶质细胞的活性可能是治疗中枢神经***疾病的有效途径。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一类约21-25个核苷酸的非编码RNA分子，普遍存在于真核生物中，不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA（mRNA）3’非翻译区互补结合，导致靶基因mRNA的降解或翻译抑制，从而实现转录后基因调控作用。近年来，miRNA与神经***疾病的发病关系越来越受重视。miRNA已被证实参与了神经细胞的发育与分化、细胞活化及应答调控等过程，并且与神经***有关疾病的发生发展密切相关。例如，在缺血缺氧引发的小胶质细胞介导的炎症反应中，小胶质细胞特定miRNA会发生表达改变，调控宿主细胞的基因表达，应对微环境做出相应的反应，从而参与疾病的发生与发展。因此，miRNA在小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的治疗领域可能具有极为广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种miR-30b复合物，该复合物可以特异靶向小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的发生或恶化。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1．靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，由K9肽和S9肽的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK（Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- Lys），所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQ（Val-Val-Met-Lys-Phe-Leu-Thr-Gln-Gln）。

进一步，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接而成。

2．靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法，是在涡旋条件下，向含有miR-30b和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋20~60分钟，再静置20~60分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。

进一步，所述miR-30b与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2.5:1。

进一步，所述靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法是在涡旋条件下，向含有浓度为500μg/mL的miR-30b和浓度为1mg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200μg/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。

3．靶向小胶质细胞的miR-30b复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：K9肽为带正电荷的短肽，可通过电性中和作用与带负电荷的miRNA聚合形成致密颗粒，提高细胞对miRNA的摄取率，增强转染效率。CX3CR1受体在中枢神经***中主要在小胶质细胞上表达，来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽S9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然活性。本发明所述miR-30b复合物可通过S9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在S9肽与CX3CR1受体作用的同时，miR-30b高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物，在神经***疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

图1为透射电镜鉴定miR-30b复合物。

图2为miR-30b复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。

图3为miR-30b复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备

1、K9肽和S9肽的融合肽K9-S9的制备

融合肽K9-S9由K9肽的羧基端与S9肽的氨基端直接连接而成，氨基酸序列为KKKKKK- KKKVVMKFLTQQ（SEQ ID No.1）。

融合肽K9-S9的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行，采用标准Fmoc方案。以0.25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP）树脂为起始树脂，按照融合肽K9-S9的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液（由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成）中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，然后用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用?KTA explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0~15分钟内由10%上升至50%，流速为1mL/min，收集融合肽K9-S9的洗脱液，冷冻干燥，即得融合肽K9-S9，用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液，用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌，-70℃冻存备用。

取融合肽K9-S9的洗脱液，用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0~15分钟内由10%上升至60%，流速为1mL/min。结果经峰面积归一化法计算，融合肽K9-S9的纯度为98%。另取融合肽K9-S9的洗脱液，用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，结果显示，融合肽K9-S9的分子量实测值与理论值相符。

2、miR-30b复合物的制备

miR-30b的核苷酸序列为：5’-AUGUAGACCUUGUGAUUAG-3’（SEQ ID No.2）。于室温、涡旋条件下，向100μL含有浓度为500μg/mL的miR-30b和浓度为1mg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100μL浓度为200μg/mL的融合肽K9-S9溶液，滴加速度为5μL/min，滴加完毕后，于室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得miR-30b复合物。

将新鲜制备的miR-30b复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。结果如图1所示，所得miR-30b复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。

同时，按照上述相同方法，以无关序列5’-CUUUAGUAUGAACGAUUGG-3’（SEQ ID No.3）替代miR-30b，制得阴性对照复合物。

二、靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的活性测试

1、miR-30b复合物转染小胶质细胞

将小胶质细胞BV-2于6孔板内单层培养至覆盖面积约30%，换入无血清DMEM培养基2mL，并加入miR-30b复合物100μL，培养4小时，再换入完全DMEM培养基2mL，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得miR-30b复合物转染的小胶质细胞。

同时，按照上述相同方法，采用阴性对照复合物，获得阴性对照复合物转染的小胶质细胞。

另外，分别将miR-30b复合物和阴性对照复合物转染少突胶质细胞HO，作为无关细胞对照。

2、ELISA检测miR-30b复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平　

设置空白组（正常小胶质细胞BV-2）、对照组（阴性对照复合物转染的小胶质细胞）和实验组（miR-30b复合物转染的小胶质细胞）。取各组细胞，以4×10⁵/孔种植于24孔板中，向细胞培养液中加入脂多糖（LPS）至终浓度为10μg/mL，刺激0.5小时，之后弃去含LPS的细胞培养液并洗涤细胞2次，再加入DMEM培养基1mL，继续培养24小时，吸取细胞培养液，用ELISA试剂盒测定白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果如图2所示，miR-30b复合物可以明显降低活化的小胶质细胞分泌细胞因子IL-1β和TNF-α的水平。 

3、检测miR-30b复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平　

将少突胶质细胞HO用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次，再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10⁶/mL，取1mL细胞悬液置10mL血清瓶中，加入100μCi的Na⁵¹CrO₄，37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的⁵¹Cr，再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为1×10⁵/mL，作为靶细胞。在96孔U型板中，设置空白组（以正常小胶质细胞BV-2作为效应细胞）、对照组（以阴性对照复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞）、实验组（以miR-30b复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞）、最大释放组（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放组（用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞），每组设3个复孔，各孔按效靶比（E/T）为1∶1加入效应细胞与靶细胞，500r/min离心30秒后，37℃孵育4小时，再1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性（cpm值），再按下述公式计算杀伤率：杀伤率(%)=[(相应组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100%，杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果如图3所示，miR-30b复合物可以明显降低活化的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  中国人民解放军第三军医大学第二附属医院

<120>  靶向小胶质细胞的miR-30b复合物及其制备方法和应用

<160>  3

 

<210>  1

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  融合肽K9-S9

<400>  1

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Val Met Lys Phe Leu

  1                      5                            10                             15

Thr Gln Gln

 

<210>  2

<211>  19

<212>  RNA

<213>  智人（Homo sapiens）

<220>

<223>  miR-30b

<400>  2

auguagaccu ugugauuag    19

 

<210>  3

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  用于阴性对照的无关序列

<400>  3

cuuuaguaug aacgauugg    19

 

Claims (6)

1.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，其特征在于，由K9肽和S9肽的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK，所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQ。

2.根据权利要求1所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，其特征在于，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接而成。

3.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向含有miR-30b和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋20~60分钟，再静置20~60分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。

4.根据权利要求3所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法，其特征在于，所述miR-30b与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2.5:1。

5.根据权利要求4所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向含有浓度为500μg/mL的miR-30b和浓度为1mg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200μg/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。

6.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物中的应用。

Images