CN103007292A - 靶向小胶质细胞的miR-30b复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向小胶质细胞的miR-30b复合物,由K9肽(KKKKKKKKK)和S9肽(VVMKFLTQQ)的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成,该复合物可利用S9肽的导向作用,特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体,在S9肽与CX3CR1受体作用的同时,miR-30b高效转染入小胶质细胞,抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的发生或恶化,可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物,在神经***疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种多肽-基因复合物,还涉及该复合物的制备方法和在制药领域中的应用。
背景技术
小胶质细胞作为中枢神经***免疫防疫的第一道防线,在炎症反应中起重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡,小胶质细胞会迅速被激活并将其清除,同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明,过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经***疾病的进程,而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。因此,适当抑制小胶质细胞的活性可能是治疗中枢神经***疾病的有效途径。
微小RNA(microRNA, miRNA)是一类约21-25个核苷酸的非编码RNA分子,普遍存在于真核生物中,不编码蛋白质或多肽,而是与靶基因的信使RNA(mRNA)3’非翻译区互补结合,导致靶基因mRNA的降解或翻译抑制,从而实现转录后基因调控作用。近年来,miRNA与神经***疾病的发病关系越来越受重视。miRNA已被证实参与了神经细胞的发育与分化、细胞活化及应答调控等过程,并且与神经***有关疾病的发生发展密切相关。例如,在缺血缺氧引发的小胶质细胞介导的炎症反应中,小胶质细胞特定miRNA会发生表达改变,调控宿主细胞的基因表达,应对微环境做出相应的反应,从而参与疾病的发生与发展。因此,miRNA在小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的治疗领域可能具有极为广阔的应用前景。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种miR-30b复合物,该复合物可以特异靶向小胶质细胞,抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的发生或恶化。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物,由K9肽和S9肽的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成,所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys- Lys),所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQ(Val-Val-Met-Lys-Phe-Leu-Thr-Gln-Gln)。
进一步,所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接而成。
2.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法,是在涡旋条件下,向含有miR-30b和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液,滴毕,继续涡旋20~60分钟,再静置20~60分钟,即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。
进一步,所述miR-30b与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2.5:1。
进一步,所述靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法是在涡旋条件下,向含有浓度为500μg/mL的miR-30b和浓度为1mg/mL的氯化钠的水溶液中,滴加等体积浓度为200μg/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液,滴加完毕后,继续涡旋30分钟,再静置30分钟,即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。
3.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果在于:K9肽为带正电荷的短肽,可通过电性中和作用与带负电荷的miRNA聚合形成致密颗粒,提高细胞对miRNA的摄取率,增强转染效率。CX3CR1受体在中枢神经***中主要在小胶质细胞上表达,来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽S9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用,但其本身不引起趋化运动,不影响胞内信号转导和细胞自然活性。本发明所述miR-30b复合物可通过S9肽的导向作用,特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体,在S9肽与CX3CR1受体作用的同时,miR-30b高效转染入小胶质细胞,抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的发生或恶化,可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物,在神经***疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1为透射电镜鉴定miR-30b复合物。
图2为miR-30b复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。
图3为miR-30b复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
一、靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备
1、K9肽和S9肽的融合肽K9-S9的制备
融合肽K9-S9由K9肽的羧基端与S9肽的氨基端直接连接而成,氨基酸序列为KKKKKK- KKKVVMKFLTQQ(SEQ ID No.1)。
融合肽K9-S9的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行,采用标准Fmoc方案。以0.25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂,按照融合肽K9-S9的氨基酸序列,使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸,肽链合成完毕后,将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成)中,室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来,然后用G6玻砂漏斗过滤,收集滤液,室温下低压蒸干,残余物用去离子水溶解后,用?KTA explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化,色谱柱为C18柱,流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液,流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,二元线性梯度洗脱,流动相B的体积分数在0~15分钟内由10%上升至50%,流速为1mL/min,收集融合肽K9-S9的洗脱液,冷冻干燥,即得融合肽K9-S9,用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液,用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌,-70℃冻存备用。
取融合肽K9-S9的洗脱液,用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定,色谱柱为Symmetry C18柱,流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液,流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,二元线性梯度洗脱,流动相B的体积分数在0~15分钟内由10%上升至60%,流速为1mL/min。结果经峰面积归一化法计算,融合肽K9-S9的纯度为98%。另取融合肽K9-S9的洗脱液,用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定,结果显示,融合肽K9-S9的分子量实测值与理论值相符。
2、miR-30b复合物的制备
miR-30b的核苷酸序列为:5’-AUGUAGACCUUGUGAUUAG-3’(SEQ ID No.2)。于室温、涡旋条件下,向100μL含有浓度为500μg/mL的miR-30b和浓度为1mg/mL的NaCl的水溶液中,滴加100μL浓度为200μg/mL的融合肽K9-S9溶液,滴加速度为5μL/min,滴加完毕后,于室温下继续涡旋30分钟,再静置30分钟,即得miR-30b复合物。
将新鲜制备的miR-30b复合物滴于200目铜网上,吸附3分钟,用吸水纸吸干,晾干30秒,以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒,用吸水纸吸干,晾干30秒,80kV透射电镜观察。结果如图1所示,所得miR-30b复合物呈大小均一的近圆形颗粒,绝大多数颗粒长径小于25nm。
同时,按照上述相同方法,以无关序列5’-CUUUAGUAUGAACGAUUGG-3’(SEQ ID No.3)替代miR-30b,制得阴性对照复合物。
二、靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的活性测试
1、miR-30b复合物转染小胶质细胞
将小胶质细胞BV-2于6孔板内单层培养至覆盖面积约30%,换入无血清DMEM培养基2mL,并加入miR-30b复合物100μL,培养4小时,再换入完全DMEM培养基2mL,培养48小时,收集细胞,用PBS洗涤并重悬,获得miR-30b复合物转染的小胶质细胞。
同时,按照上述相同方法,采用阴性对照复合物,获得阴性对照复合物转染的小胶质细胞。
另外,分别将miR-30b复合物和阴性对照复合物转染少突胶质细胞HO,作为无关细胞对照。
2、ELISA检测miR-30b复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平
设置空白组(正常小胶质细胞BV-2)、对照组(阴性对照复合物转染的小胶质细胞)和实验组(miR-30b复合物转染的小胶质细胞)。取各组细胞,以4×105/孔种植于24孔板中,向细胞培养液中加入脂多糖(LPS)至终浓度为10μg/mL,刺激0.5小时,之后弃去含LPS的细胞培养液并洗涤细胞2次,再加入DMEM培养基1mL,继续培养24小时,吸取细胞培养液,用ELISA试剂盒测定白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。结果如图2所示,miR-30b复合物可以明显降低活化的小胶质细胞分泌细胞因子IL-1β和TNF-α的水平。
3、检测miR-30b复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平
将少突胶质细胞HO用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养,收集细胞,离心洗涤2次,再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×106/mL,取1mL细胞悬液置10mL血清瓶中,加入100μCi的Na51CrO4,37℃孵育90分钟,充分洗涤细胞除去未结合的51Cr,再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为1×105/mL,作为靶细胞。在96孔U型板中,设置空白组(以正常小胶质细胞BV-2作为效应细胞)、对照组(以阴性对照复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞)、实验组(以miR-30b复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞)、最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞),每组设3个复孔,各孔按效靶比(E/T)为1∶1加入效应细胞与靶细胞,500r/min离心30秒后,37℃孵育4小时,再1000r/min离心10分钟,各孔取上清100μL,用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值),再按下述公式计算杀伤率:杀伤率(%)=[(相应组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100%,杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果如图3所示,miR-30b复合物可以明显降低活化的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
<120> 靶向小胶质细胞的miR-30b复合物及其制备方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合肽K9-S9
<400> 1
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Val Met Lys Phe Leu
1 5 10 15
Thr Gln Gln
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> miR-30b
<400> 2
auguagaccu ugugauuag 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于阴性对照的无关序列
<400> 3
cuuuaguaug aacgauugg 19
Claims (6)
1.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物,其特征在于,由K9肽和S9肽的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成,所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK,所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQ。
2.根据权利要求1所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物,其特征在于,所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接而成。
3.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法,其特征在于,在涡旋条件下,向含有miR-30b和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液,滴毕,继续涡旋20~60分钟,再静置20~60分钟,即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。
4.根据权利要求3所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法,其特征在于,所述miR-30b与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2.5:1。
5.根据权利要求4所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法,其特征在于,在涡旋条件下,向含有浓度为500μg/mL的miR-30b和浓度为1mg/mL的氯化钠的水溶液中,滴加等体积浓度为200μg/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液,滴加完毕后,继续涡旋30分钟,再静置30分钟,即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。
6.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经***疾病的药物中的应用。
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