CN107261124B - 一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用,所述ES‑2‑AF肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示;所述ES‑2‑AF肽的透明质酸化修饰物是由上述的ES‑2‑AF肽的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合而成,结构式为:HA‑CO‑NH‑(ES‑2‑AF)n。本发明的ES‑2‑AF肽与Anti‑flt1肽、ES2肽相比,保留甚至增强了抑制新生血管生成的能力。本发明的ES‑2‑AF肽的透明质酸化修饰物与ES‑2‑AF肽相比,保留了ES‑2‑AF肽抗新生血管生成与抗肿瘤活性,整合了大分子透明质酸抗新生血管生成等特性,使其具有稳定性更高、亲水性更强、靶向性更强等特性,因此具有更好的使用效果和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别是涉及一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用。
背景技术
内皮抑素(Endostatin,ES)是一种从血管内皮瘤中分离得到的20KDa的多肽,被确认为胶原蛋白XVIII的C端部分。内皮抑素能够直接靶向肿瘤附近的内皮细胞而不会对正常细胞产生明显毒性。它同样能抑制内皮细胞增生、迁移,引起细胞凋亡。其抗血管增殖活性通过调节血管内皮生长因子VEGF的表达而实现。ES-2(IVRRADRAAVP)是ES结构中一个具有明显抗新生血管生成、抗肿瘤活性的短肽段,更容易进入细胞内部,且更容易获得和改造,但是同ES一样,ES-2也存在体内半衰期短和稳定性差等缺点,这些缺点大大的限制了ES-2进一步的应用。
Anti-flt1肽(GGNQWFI)能够特异性地与VEGFR1(fms-like tyrosine kinase-1orFlt1)结合,从而起拮抗作用阻止VEGFR1与VEGFA、VEGFB、胎盘生长因子PIGF等的结合。与其他VEGFR1的单克隆抗体或RNA拮抗剂不同,Anti-flt1肽是一种合成成本较低的非免疫原性的短肽。但是与ES-2等其他多肽相比,Anti-flt1肽的水溶性较差,这很大程度地影响了其作用的发挥。
综上,现有的多肽类新生血管抑制剂多存在体内半衰期短、稳定性差等问题,限制了多肽类药物在制备新生血管抑制剂中的应用。因此,本领域迫切需要开发一种新型的多肽类新生血管抑制剂。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种ES-2-AF肽,该ES-2-AF肽在活性、溶解性、稳定性和半衰期等方面得到了改善,具有明显的抗新生血管生成作用。
本发明的另一目的在于提供一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种ES-2-AF肽,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示,具体如下:
ES-2-AF肽:IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI;(SEQ ID NO.1)。
本发明将Anti-flt1肽与ES-2肽融合在一起,所得到的ES-2-AF肽在活性、溶解性、稳定性和半衰期等方面得到了很好的改善。
本发明的ES-2-AF肽经Fmoc固相合成,由高效液相进行纯化,并质谱、高效液相色谱等手段进行了结构的确证,纯度均可达95%以上。
本发明的第二方面,提供一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物,由ES-2-AF肽上的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合,结构式如下:
HA-CO-NH-(ES-2-AF)n;
式中,n=30~60;ES-2-AF的分子量为2197.5Da,HA的分子量为240000Da。
ES-2-AF的供给量(即上述结构式中n的取值)会影响与透明质酸(HA)的结合度,本发明对ES-2-AF的供给量进行了优化考察,综合考虑了对HA空间构象的影响以及ES-2-AF与透明质酸的结合度,优选n=60。
本发明的第三方面,提供上述ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物的制备方法。
本发明提供的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物的制备方法,步骤如下:
(1)制备HA-TBA结合物,改善HA的溶解性,使HA能够溶于有机溶剂;
(2)将HA-TBA结合物溶于有机溶剂中,加入卡特缩合剂,以活化HA的羧基;然后将活化羧基后的HA-TBA、ES-2-AF肽和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)混合,反应24h后,加入NaOH溶液;再调节反应体系的pH降至3.0以终止反应;然后将反应体系的pH再升至7.0,反应产物经透析、干燥,即得ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物。
步骤(1)中,所述HA-TBA结合物的制备方法为:向Dowex离子交换树脂中加入过量的四丁基氢氧化铵(TBA-OH),混匀,得到Dowex-TBA树脂,过滤除去上清;将透明质酸钠NaHA溶于水中,倒入制备的Dowex-TBA树脂中,混匀,过滤除去Dowex树脂,得到澄清的HA-TBA溶液,冻干,即得HA-TBA结合物。
步骤(2)中,所述有机溶剂为DMSO。
步骤(2)中,HA-TBA与ES-2-AF摩尔比为1:(4~100)。
步骤(2)中,所述NaOH溶液的浓度为1M。
步骤(2)中,采用1M的HCl调节pH降至3.0;采用1M NaOH将pH升至7.0。
步骤(2)中,反应产物透析的方法为:将反应产物倒入预处理的透析袋(10kDa),分别用NaCl溶液、25%乙醇和水透析。
本发明通过制备HA-TBA结合物,改善了HA的溶解性,使本不溶于有机溶剂的HA能够溶于DMSO。过量的BOP使HA的羧基充分活化,使之与肽链的氨基反应形成酰胺键。卡特缩合剂是蛋白质、肽链反应中常用的方法,但是反应温度、反应体系的pH、反应时间等因素都对反应效率有很大影响。本发明通过优化卡特缩合剂的供给量、反应温度、反应体系的pH、反应时间等条件,成功制备出半衰期增长、活性更强的透明质酸化ES-2-AF肽修饰物。
本发明的第四方面,提供上述ES-2-AF肽和/或ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物在制备抑制新生血管生成的药物中的用途。
进一步的,本发明还提供上述ES-2-AF肽和/或ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物在制备伴随新生血管生成疾病的治疗药物和/或抗肿瘤药物中的用途。
所述伴随新生血管生成疾病包括糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变和关节炎等。
本发明的有益效果:
(1)本发明通过调整ES-2-AF肽的供给量、反应温度、反应体系的pH、反应时间等条件,可以制备得到不同结合度的透明质酸-ES-2-AF肽结合物。
(2)本发明制备的ES-2-AF肽与Anti-flt1、ES-2肽相比,其分子水平与细胞水平抗新生血管生成的作用均优于后两者。
(3)本发明制备的ES-2-AF肽透明质酸化修饰物与ES-2-AF肽相比,其稳定性更高、生物活性更强。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。
图1:ES-2-AF肽透明质酸化修饰物的核磁共振1H图谱;
图2:Anti-flt1、ES-2、ES-2-AF对内皮细胞增殖的抑制作用;
图3:Anti-flt1、ES-2、ES-2-AF可抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合;
图4:ES-2-AF、HA&ES-2-AF、HA-ES-2-AF对内皮细胞增殖抑制作用;
图5:ES-2-AF、HA&ES-2-AF、HA-ES-2-AF可抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合;
图6:ES-2-AF、HA&ES-2-AF、HA-ES-2-AF内皮细胞转移的抑制作用。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,现有的多肽类新生血管抑制剂多存在体内半衰期短、稳定性差和水溶性差等问题。基于此,本发明提出了一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物。
在本申请的一种实施方案中,提供了一种ES-2-AF肽,其等电点为11.54,其氨基酸序列如下:
ES-2-AF肽:IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI。
由于Anti-flt1和ES-2在活性方面既有相似之处,又有诸多不同,将Anti-flt1和ES-2进行融合的难点在于:如何保证将Anti-flt1和ES-2各自的优点融合在同一个肽中,同时克服融合前各条多肽固有的缺点。本申请通过设计linker(GGGG)实现了Anti-flt1和ES-2的融合,融合后的ES-2-AF肽具有更好的生物活性、更明确的作用机制、更好的稳定性和更长的半衰期。
在本申请的另一种实施方式中,还提供了一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物,由ES-2-AF肽上的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合,结构式如下:
HA-CO-NH-(ES-2-AF)n;
式中,n=30~60;ES-2-AF的分子量为2197.5Da,HA的分子量为240000Da。
本发明的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物与ES-2-AF肽相比,保留了ES-2-AF肽抗新生血管生成与抗肿瘤活性,整合了大分子透明质酸抗新生血管生成等特性,使其具有稳定性更高、亲水性更强、靶向性更强等特性,因此具有更好的使用效果和应用价值。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
实施例1:ES-2-AF肽的制备
本发明的ES-2-AF肽的分子量为2197.5Da,采用Fmoc固相合成,由高效液相进行纯化,并质谱、高效液相色谱等手段进行了结构的确证,纯度均可达95%以上。
实施例2:ES-2-AF肽透明质酸化修饰物(HA-ES-2-AF)的制备
制备步骤如下:
(1)将Dowex离子交换树脂用水清洗,加入过量的四丁基氢氧化胺TBA-OH(24.5ml),混匀。得到Dowex-TBA树脂,过滤除去上清。将透明质酸钠NaHA(1g)溶于水中,倒入准备好的Dowex-TBA树脂(10g)中。混匀3h后,用0.45μm针头滤器过滤以除去Dowex树脂得到澄清的HA-TBA溶液,冻干3天。
(2)将步骤(1)中制得的HA-TBA与ES-2-AF肽分别溶于DMSO。HA-TBA充分溶解后,加入过量的卡特缩合剂BOP以活化HA羧基,混匀30min。然后将HA-TBA溶液与肽溶液、等摩尔量的DIPEA混合溶于DMSO,反应24h后,加入等体积1M NaOH水溶液。用1M HCl将pH降至3.0以终止反应,然后用1M NaOH将pH升至7.0。反应产物倒入预处理的透析袋(10kDa),用大量的NaCl溶液、25%乙醇、水透析。冻干3天。
采用1H核磁共振鉴定结构,结果如图1所示,结果表明透明质酸成功地修饰了ES-2-AF肽,平均连结率为93.75%。
试验例1:ES-2-AF肽抗细胞增殖作用与Anti-flt1、ES-2肽的比较
实验过程如下:
(1)试验药物:Anti-flt1肽、ES-2肽与实施例1制备的ES-2-AF肽,三组药物中肽浓度一致。
(2)试验方法:
收集对数期人脐静脉内皮细胞EAhy926,调整细胞悬液浓度为7000/孔,分于96孔板,每孔200μL(含10%FBS的DMEM培养基),置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养使细胞贴壁;加入不同浓度梯度的试验药物,每种药物5个复孔,继续培养48h;每孔加入MTT溶液20μL,37℃继续培养4h后终止培养,酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度(OD)值,并计算其抑制率:抑制率=1-[(实验组-空白组)/(对照-空白组)。重复实验三次,取平均值。
抗内皮细胞增殖试验的结果见图2,由图2可以看出,不同浓度梯度的Anti-flt1肽、ES-2肽和ES-2-AF肽在作用48h后,ES-2-AF肽的抗细胞增殖作用效果总体高于Anti-flt1肽和ES-2肽。
试验例2:体外Anti-flt1、ES-2、ES-2-AF肽抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合能力的测试(ELISA法)
(1)试验药物:Anti-flt1肽、ES-2肽与实施例1制备的ES-2-AF肽,三组药物中肽浓度一致。
(2)试验方法:
VEGF165溶于PBS配成0.5μg/mL,敷于96孔板中每孔50μL,4℃过夜。磷酸盐缓冲液PBS洗板,300μL*3次,每次5分钟。3wt%BSA in PBS 250μL/孔,37℃封闭2小时。磷酸盐缓冲液PBS洗板,300μL*3次,每次5分钟。加入待测样品。每浓度3个重复。室温孵育1小时。阳性对照:500ng/mL Flt-Fc in BSA 1wt%in PBS。实验组:500ng/mL Flt-Fc+Anti-flt1组、ES-2组、ES-2-AF组,三组中肽浓度均为5,25,50,100,200μg/mL。含0.05wt%Tween20的PBS洗板300μL*3次,每次5分钟。加入二抗anti-human IgG-HRP-Fc in 0.3wt%BSA in PBS(1:1000,50μL),室温孵育1小时。含0.05wt%Tween 20的PBS洗板300μL*2次,每次5分钟,然后PBS洗板300μL*1次,5分钟。吸水布上轻敲吸干水分。TMB显色液每孔200μL,避光孵育,10分钟后酶免仪450nm测试。
实验结果见图3,当浓度大于25μg/mL时,ES-2-AF抑制VEGF及其受体结合的能力均优于Anti-flt1、ES-2肽。
试验例3:ES-2-AF肽透明质酸化修饰物抗细胞增殖作用与ES-2-AF肽的比较实验过程如下:
(1)试验药物:实施例2制备的ES-2-AF肽透明质酸化修饰物(HA-ES-2-AF)、实施例1制备的ES-2-AF肽以及ES-2-AF肽与透明质酸按连结比混合的混合物(HA&ES-2-AF),三组药物中肽浓度一致。
(2)试验方法:
收集对数期人脐静脉内皮细胞EAhy926,调整细胞悬液浓度为7000/孔,分于96孔板,每孔200μL(含10%FBS的DMEM培养基),置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养使细胞贴壁;加入不同浓度梯度的试验药物,每种药物5个复孔,继续培养48h;每孔加入MTT溶液20μL,37℃继续培养4h后终止培养,酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度(OD)值,并计算其抑制率:抑制率=1-[(实验组-空白组)/(对照-空白组)。重复实验三次,取平均值。
抗内皮细胞增殖试验的结果见图4,由图4可以看出,不同浓度梯度的ES-2-AF肽透明质酸化修饰物和ES-2-AF肽在作用48h后,ES-2-AF肽透明质酸化修饰物的抗细胞增殖作用效果明显比相同肽浓度的ES-2-AF肽以及两者混合物要强很多。
试验例4:体外HA-ES-2-AF结合物抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合能力的测试(ELISA法)
(1)试验药物:实施例2制备的ES-2-AF肽透明质酸化修饰物(HA-ES-2-AF)、实施例1制备的ES-2-AF肽以及ES-2-AF肽与透明质酸按连结比混合的混合物(HA&ES-2-AF),三组药物中肽浓度一致。
(2)试验方法:
VEGF165溶于PBS配成0.5μg/mL,敷于96孔板中每孔50μL,4℃过夜。磷酸盐缓冲液PBS洗板,300μL*3次,每次5分钟。3wt%BSA in PBS 250μL/孔,37℃封闭2小时。磷酸盐缓冲液PBS洗板,300μL*3次,每次5分钟。加入待测样品。每浓度3个重复。室温孵育1小时。阳性对照:500ng/mL Flt-Fc in BSA 1wt%in PBS。实验组:500ng/mL Flt-Fc+ES-2-AF组、HA&ES-2-AF组、HA-ES-2-AF组,三组中肽浓度均为5,25,50,100,200μg/mL。含0.05wt%Tween 20的PBS洗板300μL*3次,每次5分钟。加入二抗anti-human IgG-HRP-Fc in 0.3wt%BSA in PBS(1:1000,50μL),室温孵育1小时。含0.05wt%Tween 20的PBS洗板300μL*2次,每次5分钟,然后PBS洗板300μL*1次,5分钟。吸水布上轻敲吸干水分。TMB显色液每孔200μL,避光孵育,10分钟后酶免仪450nm测试。
实验结果见图5,ES-2-AF肽、HA&ES-2-AF混合物、HA-ES-2-AF结合物的抑制作用均呈浓度依赖性增加。且当肽浓度高于25μg/mL时混合物组抑制作用优于ES-2-AF肽,HA-ES-2-AF结合物组的抑制作用为三者中最明显。
试验例5:Transwell小室法测定对于细胞转移的抑制作用
(1)试验药物:实施例2制备的ES-2-AF肽透明质酸化修饰物、实施例1制备的ES-2-AF肽以及ES-2-AF肽与透明质酸按连结比混合的混合物,三组药物中肽浓度一致。
(2)试验方法:
将无菌黄枪头放入4℃冰箱中冷藏过夜。将Matrigel胶移至4℃冰箱中融化约40min。Matrigel胶用无FBS无抗生素的DMEM稀释1:6,于Transwell小室上层每孔加50μl,放入孵箱孵育1h,取出Transwell小室,吸出上室中未凝固的液体,用双无得培养基DMEM冲洗小室一次。小室倒置,半透膜下层均匀涂抹FN(纤粘蛋白)10μl,置于超净台中风干。24孔板每孔加600μl(含DMEM完全培养基),将小室放入其中;收集对数生长期的内皮细胞EAhy926,调整细胞悬液浓度为5×104/孔,取细胞100μl接种于Transwell小室的上层小室内,并加入药物处理细胞,于培养箱中孵育24h,取出小室,吸去上层培养基,用棉棒拭去Matrigel胶和未穿过膜的细胞,PBS浸洗一遍。小室于固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)中固定25min,PBS洗一遍,用0.1%结晶紫染液染色25min,PBS洗两遍,晾干,置于倒置荧光显微镜下拍照,计数穿过Matrigel胶至小室下层被染色的细胞,并作统计图。实验重复5次,取平均值。
实验结果见图6,各加药组与对照组比较均有明显抑制内皮细胞迁移的作用。与ES-2-AF肽、HA&ES-2-AF混合物相比HA-ES-2-AF结合物组发生迁移的细胞数量最少,说明HA-ES-2-AF抑制细胞迁移的作用最强。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asn Gln Trp Phe Ile
20
Claims (10)
1.一种ES-2-AF肽,其特征在于,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物,其特征在于,由权利要求1所述的ES-2-AF肽的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合而成,结构式如下:
HA-CO-NH-(ES-2-AF)n;
式中,n=30~60。
3.根据权利要求2所述的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物,其特征在于,结构式中n=60。
4.根据权利要求2所述的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)制备HA-TBA结合物,改善HA的溶解性,使HA能够溶于有机溶剂;
(2)将HA-TBA结合物溶于有机溶剂中,加入卡特缩合剂,以活化HA的羧基;然后将活化羧基后的HA-TBA、ES-2-AF肽和DIPEA混合,反应24h后,加入NaOH溶液;再调节反应体系的pH降至3.0以终止反应;然后将反应体系的pH再升至7.0,反应产物经透析、干燥,即得ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述HA-TBA结合物的制备方法为:向Dowex离子交换树脂中加入过量的四丁基氢氧化铵,混匀,得到Dowex-TBA树脂,过滤除去上清;将透明质酸钠NaHA溶于水中,倒入制备的Dowex-TBA树脂中,混匀,过滤除去Dowex树脂,得到澄清的HA-TBA溶液,冻干,即得HA-TBA结合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,HA-TBA与ES-2-AF摩尔比为1:(4~100)。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,采用1M的HCl调节pH降至3.0;采用1M NaOH将pH升至7.0。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,反应产物透析的方法为:将反应产物倒入预处理的透析袋,分别用NaCl溶液、25%乙醇和水透析。
9.权利要求1所述的ES-2-AF肽和/或权利要求2所述的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物在制备抑制新生血管生成的药物中的用途。
10.权利要求1所述的ES-2-AF肽和/或权利要求2所述的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物在制备伴随新生血管生成疾病的治疗药物和/或抗肿瘤药物中的用途。
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CN110302389B (zh) * | 2019-06-18 | 2020-05-05 | 西南医科大学附属医院 | 一种抗血管生成的水凝胶缓释制剂及其应用 |
CN110358799B (zh) * | 2019-07-26 | 2021-02-26 | 山东大学 | 一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法 |
CN115417914A (zh) * | 2019-10-11 | 2022-12-02 | 润辉生物技术(威海)有限公司 | 一种乙酰透明质酸寡肽及其制备与应用方法 |
CN112618714B (zh) * | 2020-11-30 | 2022-02-22 | 四川大学 | 一种Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇及其制备方法和用途 |
CN113648427B (zh) * | 2021-08-20 | 2023-07-28 | 山东大学 | 透明质酸-es2-af肽偶联物及其制备方法和应用 |
CN118063557A (zh) * | 2023-10-11 | 2024-05-24 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 美容肽的透明质酸修饰物及其应用 |
CN117050146A (zh) * | 2023-10-11 | 2023-11-14 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 透明质酸修饰的美容肽、制备方法及其用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120294945A1 (en) * | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Postech Academy-Industry Foundation | Drug delivery system using hyaluronic acid-peptide conjugate micelle |
CN105669857A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-06-15 | 山东大学 | 一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用 |
WO2017062407A1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Genentech, Inc. | Systems and methods for predicting vitreal half-life of therapeutic agent-polymer conjugates |
-
2017
- 2017-06-09 CN CN201710432512.9A patent/CN107261124B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120294945A1 (en) * | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Postech Academy-Industry Foundation | Drug delivery system using hyaluronic acid-peptide conjugate micelle |
WO2017062407A1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Genentech, Inc. | Systems and methods for predicting vitreal half-life of therapeutic agent-polymer conjugates |
CN105669857A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-06-15 | 山东大学 | 一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Anti- Flt1 peptide- hyaluronate conjugate for the treatment of retinal neovascularization and diabetic retinopathy;OH EJ等;《Biomaterials》;20111231;第32卷(第11期);3115-3123 * |
人内皮抑素部分序列—ES-2的生物活性研究;徐寒梅;《中国药科大学学报》;20060430;346-348 * |
透明质酸修饰药物的研究进展;孙政伟等;《中国新药与临床杂志》;20160131;第35卷(第1期);12-18 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107261124A (zh) | 2017-10-20 |
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