CN103003441A - 脂质体的两相制备方法及其在制造诊断试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂质体的两相制备方法，在其过程中，使用技术上简单和廉价的机械混合方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的单独混合物的非极性有机相和与其不混溶的极性水（缓冲液）相，合成具有独特结构的脂质体乳剂。此外，本发明包括关于当不使用任何洗涤剂将蛋白类型活性成分锚定到脂质体膜的表面，并且非蛋白类型活性成分与具有独特结构的脂质体乳剂简单混合时，以这种方式制备的脂质体的体外诊断用途的方法的实施方式。在一个可能的方法的实施方式中，制备凝血酶原时间(PT)试剂。在另一个可能的方法的实施方式中，制备激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)试剂。

Description

脂质体的两相制备方法及其在制造诊断试剂中的应用
技术领域
本发明涉及脂质体的两相制备方法，在其过程中，使用技术上简单的机械方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的单独混合物的非极性有机相和与其不混溶的极性水（缓冲液）相。当活性组分锚定到脂质体膜的表面时，用本方法制备的具有独特结构的脂质体乳剂优选体外应用。
此外，本发明可能的实施方式涉及体外血液凝固诊断试剂的制备。在本发明的一组实施方式中，所述试剂由我们的提供用于活性组分和蛋白类型的活性组分的膜表面的具有独特结构的脂质体乳剂，即天然或重组组织因子，组成。在这个组的可能的实施方式中，在初步制备的脂质体上实现将蛋白锚定到膜表面。在这个组进一步可能的实施方式中，蛋白的锚定与脂质体膜表面的组装同时进行。在另一组实施方式中，所述试剂由我们的具有独特结构的脂质体乳剂和与所述乳剂通过简单的机械混合混合的非蛋白类型的可溶活性组分组成。非蛋白类型的可溶活性组分可为有机酸或无机化合物（例如，鞣花酸、鞣酸、芸香苷、槲皮苷或无机二氧化硅）。
本发明的主题为方法，作为其中可能的实施方式，制备了体外血液凝固诊断试剂。通过我们的方法制备的所述体外血液凝固诊断试剂适于测量凝血酶原时间和激活部分促凝血酶原激酶时间。本说明书的进一步的主题为上述方法可能的商业实现。
背景技术
血液凝固诊断中最常用的进行的测量目的为测定凝血酶原时间(PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。两种诊断方法监控血液凝固***的酶过程，以显示检测的有机体的止血状态。
血液凝固是一个由复杂的增多和减少的生化步骤组成的级联型酶链反应。血液凝固***的酶反应中决定性的多数为包括蛋白和非蛋白类型分子（酶和辅因子）和膜组分的膜结合过程。膜组分的主要构成为起基本结构（锚定）和功能（例如酶活性辅因子）作用的极性和非极性脂质。为在体外***中模拟体内膜结合过程，膜功能可被脂质化的特定过程支持，为体内***提供合适的脂质成分。
根据本发明，体外血液凝固诊断试剂中含脂质的组分为脂质体，即具有小于微米范围的直径的脂囊泡，其与合适组成的水溶液形成稳定的乳剂。所述脂质体提供体外血液凝固诊断反应所必需环境的膜表面，即它们适于锚定有机化合物（例如具有合适氨基酸序列的天然或重组蛋白）并适于与具有合适结构的有机或无机化合物结合。此外，脂质体膜的表面在锚定的活性蛋白或可溶活性无机化合物的表面活性反应中起到辅因子的作用。
PT和APTT测量旨在确定作为血液凝固***的中心步骤的血浆纤维蛋白原的聚合时间，即非活性凝血素变化为活性凝血酶时间。
PT测量利用所谓的促凝血酶原激酶的凝血启动效应，即所谓外在凝血途径的起始[Mackman N.等，(2007)：Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27：1687至1693]。促凝血酶原激酶包括含在磷脂膜中的组织因子（TF，凝血因子III）。组织因子为与膜重叠的跨膜糖蛋白[Bazan J.F.(1990):PNAS 87,6934-6938.]。虽然健康个体的循环血液中的组织因子的可检测水平有争议[Monroe D.M.,Key N.S.(2007):J.Thromb.Haemost.5:1097-1105.]，当血管床损伤时，膜结合的组织因子由沿损伤的细胞（例如内皮细胞和白细胞）释放，从而启动血液凝固级联反应。释放的膜结合组织因子结合并激活凝血因子VII，因此膜结合组织因子起到激活的凝血因子Vila的辅因子和受体的作用。膜结合组织因子和激活的凝血因子VIIa在Ca2+离子存在下促进凝血因子X的激活。由凝血酶原酶复合体触发凝血素转变为凝血酶，凝血酶原酶复合体由激活的凝血因子X（即因子Xa）和激活的凝血因子V（即因子Va）组装，后者起到调节蛋白的作用。凝血酶将纤维蛋白原蛋白链裂解成纤维蛋白单体。凝血酶还激活因子XIII；激活的因子XIIIa形成转谷氨酰胺酶家族的连接酶，起到纤维蛋白的稳定因子的作用。在激活的纤维蛋白稳定因子XIIIa的影响下，通过共价交联由纤维蛋白单体产生纤维蛋白聚合物，即稳定的纤维蛋白网络（Edgington T.S.等，(1991)：组织因子的表达和功能的结构生物学，Thrombosis and Haemostasis，66：67-79）。
如上述，促凝血酶原激酶为包含锚定到合适组成的脂质膜的组织因子的膜复合体。此外，与环绕脂质膜结合的蛋白的存在是在时间和空间上血液凝固级联反应的启动中的关键。通过动物或人富含脂质的内皮组织与水溶液的均匀化，产生绝对多数现有的PT试剂。然而，在一些先进的产品中，应用与人造脂质结构结合的含重组组织因子的促凝血酶原激酶。
在APTT测定中，激活级联反应的启动不需要任何组织因子组分（部分促凝血酶原激酶），但是由具有净负电荷的活性成分（二氧化硅，有机酸）和脂质膜触发。
已知用于生产血液凝固诊断试剂的方法在制备膜组分，即脂质体，的方法方面彼此不同。在所有用于生产PT试剂的方法中，通过混合在表面活性剂物质（洗涤剂）的帮助下保存于溶液中的组织因子和预制的脂质体分散体制备促凝血酶原激酶[该方法在美国专利5625036、美国专利5314695、美国专利6124110、美国专利6733985、美国专利7049087和美国专利7148067中说明]。由于存在的比例大于0.05%的洗涤剂抑制血液凝固反应，通过合适的分离方法即透析[参考例如美国专利5314695；美国专利4622188；美国专利6124110；和美国专利6733985]、超滤[美国专利5625036；和美国专利5314695]或吸附方法[如在美国专利7049087；和美国专利7148067中说明]，从体系中去除表面活性剂。去除洗涤剂的过程，即当洗涤剂的浓度达到其最终值时，应通过进行几个生产中测定检查。除了增加程序的步骤之外，使用洗涤剂一个很大的缺点为洗涤剂自身和/或用于去除其的步骤的高成本。
已知的方法中，用于生产脂质体的方法[例如在美国专利4622188中]基于这样的现象，即在合适极性的溶液中，根据物理化学环境，同时具有极性和非极性分子部分的表面活性物质形成单层或多层囊泡。
“A”―最常使用的用于生产脂质体经典方法为所谓的干膜方法[在美国专利4438052；美国专利5556637；和美国专利7169410中说明]。在这个方法中，第一个步骤为将脂质溶于有机溶剂。然后，用真空或惰性气体流将溶剂从溶液中完全蒸发。最终将在容器壁上形成的干脂质膜分散于合适的水溶液中。通过充分混合[例如在美国专利6296870中说明的方法]和/或超声粉碎[参考美国专利5234634]制备来自该分散体的最终脂质体乳剂。这些已知的方法基本上形成具有相当宽的尺寸分布的多层脂质体。通过在提供窄的粒径分布和单片层或双片层囊泡的高压装置上挤压所述未加工的分散体，可实现合适尺寸分布和优选的迭片结构。挤压方法在九十年代广泛使用[这种方法的实例在美国专利4529561；美国专利5204112；和美国专利6926905中说明]。
根据所含脂质的溶剂的水混溶性，混合溶剂的方法可分成两类。
在使用可与水混溶的溶剂的情况下，所述方法被称为单相方法[一个实例为美国专利6261792]。
“B”―在单相方法中，脂质溶于极性有机溶剂，通常在乙醇中，并将脂质溶液与水溶剂混合。获得的脂质体通常包括两层或更多层，脂质体的内腔包含水溶液和乙醇的混合物。为了减小脂质体的迭片结构并使尺寸分布变窄，使用在干膜技术中列出的方法。
“C”―单相方法的一个特殊实例为，当用加入相对高浓度(1至2%)的洗涤剂分子将脂质混合物溶于水溶液时。通过超滤、透析或在吸收包装的帮助下去除洗涤剂。通过该已知方法可形成单层或多层脂质体，理论上通过洗涤剂去除的速度和水溶液的合适的离子组成可将其产物的比例控制到特定的范围。
在使用不与水混溶的溶剂的情况下，所述方法称为两相方法[例如参考美国专利5723147]。在双相方法的情况下，根据溶剂的体积比，可进行进一步分类。
“D”―传统上，由溶于小量的非极性有机溶剂并在充分较大量的水性（极性）溶剂中混合的脂质生产的脂质体被称为“水包油”乳剂。
“E”―由溶于大量的非极性溶剂并在小量的水中混合的脂质生产的脂质体被称为“油包水”乳剂。
在多数已知的双相方法中，具有较小体积的相注入具有较大量的相，并在整个过程中，使用充分的湍流混合。为了使脂质体尺寸分布变窄，这些方法后还可挤压，或者在相同的装置上在单个步骤中实现注入和挤压。
在“水包油”的乳剂的情况下，假定生产单层，由脂质分子的极性端（头部）形成脂质体的表面，而分子的非极性端（尾部）指向包含在囊泡内的非极性溶剂。在“油包水”的乳剂的情况下，情况相反。根据理论的考虑，在完全去除溶剂的情况下，脂质体以假六方晶格排列，该状态在“水包油”的乳剂的情况下称为六I(HI)排列，在“油包水”的乳剂的情况下称为六II(HII)排列。
本领域技术人员将理解，在基于锚定活性分子到其中活性分子（例如蛋白质）对水相（例如诊断试剂）发挥其作用的脂质膜上的应用中，所组装的单层应只以HI排列。即，“水包油”乳剂可被用作细胞膜模型。此外，在多层脂质体的情况下，只有其中脂质的头部指向水相的最外表面层的囊泡能够具有上述功能。
在对考虑的已知方法的批判性分析中，我们仅处理适用于生产诊断试剂的那些，因此组“E”中的方法不是比较的主题。
通常，属于组“A”、“B”和“C”的方法产生具有宽尺寸范围的多层脂质体乳剂，需要进一步的物理处理。组“D”的方法主要产生较窄的尺寸分布和单层脂质体。
组“A”中包含的干膜方法的进一步的缺点为用相对多的步骤（脂质溶解、干燥、在水溶液中混合、充分混合/超声粉碎）完成脂质体的制备。虽然这些步骤可用可商购和相对简单的装置进行，但是实际的尺寸分布只有可用挤压控制，这需要昂贵的装置。在诊断试剂的市场上，没有专门以这种方法生产的产品。
方法“B”可用最简单的工具在两个主要步骤中完成（脂质溶解，混合入水溶液）但是与组“A”中的方法类似，需要进一步物理加工以这种方式生产的脂质体。即，建议使用挤出机调节尺寸。产品乳剂和脂质体的腔中包含非极性有机溶剂，如果应用需要，可能必须去除该有机溶剂。在诊断试剂的市场上，没有以这种方法生产的产品。
方法“C”也可在两个步骤中完成（脂质溶解于洗涤剂溶液，洗涤剂的去除），但是用任何已知的方法（吸收填充材料、超滤或透析膜）去除洗涤剂都是一个长时间和花费高的过程，并且需要昂贵和独特的装置（透析器、超滤装置、过滤装置/离心机、色谱柱和***）。生产的脂质体为单层或多层囊泡，尽管通过调节所述溶剂的合适的化学组成可控制迭片结构。最终产品的脂质体在它们的腔中可包含一些洗涤剂，如果应用时需要，可能必需进一步的去除步骤。建议应用挤出机调节尺寸分布。在诊断试剂的市场上，没有专门以这种方法生产的产品[Morrissey和Smith，根据美国专利7148067的促凝血酶原激酶试剂]。
方法“D”可在两个步骤中实现（脂质溶解，混合入水溶液）。然而，为混合相，应用特别设计的注入和混合装置，使得该方法昂贵。制造的脂质体通常为单层囊泡，它们的大小在相对窄的范围，但是在脂质体的腔中有有机溶剂，如果应用时需要，可能必需进一步的去除步骤。建议使用挤出机以调节尺寸分布。在诊断试剂市场上，没有以这种方式生产的产品。
在得到了很好的证明并被专门用于制造诊断试剂的脂质体的方法“C”中，所用的添加剂（洗涤剂）自身昂贵，其去除需要一些长时间和复杂的过程，使这个方法更加昂贵。由于任何残留的洗涤剂可干扰诊断反应，在去除洗涤剂的过程中，洗涤剂浓度必须通过进行几个生产中测定检查。虽然在某种程度上可控制制造的产品的尺寸分布，使用挤出机（均化器）来生产最终的产品，这使该方法更昂贵。
已知的方法中，组“A”、“B”和“D”不需要昂贵的添加剂，但是方法“A”、和“B”产生具有宽尺寸分布的多层脂质体，使后续的均匀化不可避免，因此它们使最终制造的产品昂贵。
发明内容
我们开发的方法的目的为去除已知方法的缺点，并设计一种技术上简化脂质体乳剂的生产并使它们的制造更便宜的方法。
应用方法“D”不需要昂贵的注入/混合装置，甚至不需要任何进一步的加工操作，可获得优选组成的脂质乳剂。由于脂质体的内容物很少进入诊断应用中的反应空间，囊泡中包装的有机溶剂不会引起问题，因而不必去除溶剂。本发明的普通方案适合方法“D”。
已知的方法根据它们的物理实施方式产生具有宽的尺寸分布和迭片结构的脂质体。具有50至100nm的外径和由一层或两层膜（单层或双层）组装的适用于诊断试剂的脂质体通过完成具有高设备需求（超声粉碎、过滤、挤出、离心）和/或需要表面活性物质的后续昂贵的加工步骤而生产。在这种情况下，由于伴随这个附加步骤的所有缺点也必须去除洗涤剂。
我们的方法基于这样的现象，即彼此不混溶的相的边界在单分子层（单层），如在我们的情况下的磷脂层，中起到布置表面活性物质的表面的作用。由于我们的目的为生产脂质体的水性乳剂，本领域技术人员可以理解溶于非极性有机溶剂的脂质将其极性头端指向水相，而其非极性尾端指向有机相。通过混合相，至此以具有零曲率为特征的分子层，闭合形成球（囊泡）。在大体积的水溶液中，脂质的极性头部指向水相，并且脂质分子的非极性尾部指向被包在囊泡内的非极性溶剂。在合适的溶剂比例和脂质合适的组成和浓度的情况下，在脂质体内部可获得全部量的有机溶剂的包埋。考虑到当进行诊断测量时，脂质体的内容物很少进入反应空间，在实现诊断测量时，包在囊泡内的有机溶剂不会引起任何问题，因此不必去除溶剂。如果应用时需要，包在脂质体中的有机溶剂可通过真空蒸发或脂质体乳剂的冻干被完全去除，并且被干燥的乳剂可再次溶于水溶液[参考根据美国专利4880635；美国专利5578320；和美国专利5922350的Janoff等的方法]。
基于我们的经验，我们认识到通过简单混合（通过振荡器、涡流混合器和搅拌器）相，发生脂质体的组装，即较小体积的具有合适脂质组分的非极性有机相在较大体积的上层极性水（缓冲液）相下分层，因此不需要特定的注入混合器。
我们认识到为了生产具有优化尺寸分布的单层脂质体，呈现正或零曲率的脂质分子的特定混合物是必需的。此外，通过改变呈现正或零曲率的脂质分子的比例，在特定的限制内可选地调节脂质体直径，因而，确保合适的脂质组成，以可再生产的方式产生具有必需的尺寸分布的稳定的乳剂。
我们观察到用上述方法生产的具有独特结构的脂质体乳剂的膜表面，适于通过使活性成分锚定或简单地通过在溶液中与活性分子结合来监测表面活性过程（例如血液凝固反应）。
我们的经验显示锚定活性分子到具有独特结构的脂质体乳剂的膜表面不需要任何的添加剂分子（例如洗涤剂）或物理处理。因此，通过上述方法生产的我们的具有独特结构的脂质体乳剂提供了合适的用于体外血液凝固诊断试剂的膜组分，而我们的方法通过包含其它可选择活性组分还可延伸到其它专业领域。
我们还认识到在合成PT试剂的过程中，具有合适非极性膜锚定分子部分的组织因子分子整合进我们的具有独特结构的脂质体乳剂的膜中，因此在与脂质体制备相同的过程中，可在单一步骤中生产最终试剂产品。本领域技术人员将理解用于单步骤生产首要条件是在生成具有零曲率的脂质单层时，具有非极性膜锚定分子部分的活性分子在过程开始时被包含于水相中。这样，适合期望定位（即其锚定端指向膜，并且其活性头部指向水相）的活性分子在相的边界整合进生成的脂质单层。如果活性分子溶于有机相，在脂质体组装时，所述活性头部将大部分位于所述脂质体内部，因此所述活性成分将不能发挥其效果。
根据我们的观测，不需要洗涤剂以提供将组织因子锚定到脂质体膜的表面所需的组织因子的合适的浓度。根据我们经验，通过将合适组成的组织因子溶液混合到预先制备的脂质体或到同时组装的脂质体的膜表面上，而实现锚定。此外，我们认识到在需要激活的膜表面的诊断检测***中，可通过将具有合适的组成的活性成分[例如有机酸、无机酸]的水溶液混合到我们的具有独特结构的脂质体乳剂来简单地制造诊断试剂。
本发明涉及制备脂质体的双相方法。我们的发明中描述的双相方法包含技术上简单和廉价的机械混合方法混合包含天然和合成磷脂的单独混合物的非极性有机相和与前者不混溶的极性水（缓冲液）相，从而合成具有独特结构的脂质体乳剂。为将被锚定的活性成分提供膜表面的我们的具有独特结构的脂质体乳剂，可优选用于体外应用，以检测表面活性反应。
在本发明可能的实施方式中，强调了体外血液凝固诊断试剂的制备。在本发明的一组的实施方式中，提到的试剂由我们的具有独特结构的脂质体乳剂和蛋白型的活性成分，即天然或重组组织因子，组成。在初步制备的具有独特结构的脂质体上，或与脂质体膜表面的组装同时进行，实现将蛋白锚定到膜的表面。在本发明的另一组的实施方式中，所述试剂由我们的具有独特结构的脂质体乳剂和非蛋白类型可溶活性成分组成；通过简单的机械混合使它们结合。上述非蛋白类型可溶活性成分可为，例如鞣花酸、鞣酸、芸香苷、槲皮苷或无机二氧化硅。
本发明中说明的方法制备的体外诊断试剂的共同特征为：具有独特结构的稳定脂质体乳剂的颗粒（囊泡）大小为50至100nm。在我们的方法中的非极性有机相为呈现正曲率或零曲率的脂质分子的单独混合物，例如卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱和更少量的天然来源的其它磷脂，所述脂质分子溶解在有机相中，浓度为0.5至1.5g/ml，包括55℃的温度和pH=2的反应条件。
在我们的方法中的上述极性水（缓冲液）相包含适当低浓度的无机离子和优选缓冲在6.0和7.4之间的pH，最优选pH=6.6，具有有机化合物，例如0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸，并补充抗细菌防腐剂，例如0.05M NaN3。用5M NaOH溶液调节水相的最终pH。
通过上述两相的简单的机械混合产生具有独特结构的脂质体乳剂，其中，将较小体积的非极性有机相添加到较大体积的极性水（缓冲液）相。相的体积比为5至50，最优选20。
可在室温(25℃)通过简单共同振荡简单机械混合极性水（缓冲液）相和非极性有机相，后者在前者下面分层。其还可这样进行，由于搅动器件的旋转运动或混合容器的偏离心旋转，较大体积的相被带入涡旋运动，然后在室温将较小体积的相注入、喷射或最优选地滴入漩涡。
在我们的凝血酶原时间(PT)试剂的脂质体组分的双相生产过程中，如上述机械地混合包含磷脂的单独混合物的非极性有机相和极性水（缓冲液）相，然后，将PT试剂的活性成分、天然或重组的组织因子锚定到生产的脂质体膜的表面。例如，可将优选0.5至1.0μΜ浓度，最优选0.8μΜ的活性组分（天然或重组组织因子)混合到通过简单和廉价的机械混合获得的脂质体膜表面上，然后让包含锚定的组织因子的脂质体体系静置。
在不同的实施方式中，将合适浓度的组织因子溶液加到在脂质体组装时使用的极性水（缓冲液）相，其结果是在脂质体膜的组装的同时进行了蛋白的锚定。
在双相生产我们的激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)试剂的脂质体成分时，如上述机械地混合包含磷脂的单独混合物的非极性有机相和极性水（缓冲液）相。通过简单和廉价的机械混合，将合适浓度的APTT试剂的活性组分-有机酸、无机化合物-的水溶液混合到我们的具有独特结构的脂质体乳剂中，然后让包含活性化合物的脂质体体系静置。在本方法中，所述活性组分可为，例如优选的浓度（例如鞣花酸：0.5至1mM，鞣酸：1至2%，SiO2：2至4g/1)下的鞣花酸、鞣酸、芸香苷、槲皮苷、SiO2。
为了最终配制PT和APTT试剂，将上述生产并让其静置的产品用适合各个血液凝固检测的组成和浓度的具有优选pH值的缓冲液以3∶1的比例稀释。在PT试剂的情况下，一种可能的用于稀释的溶液为包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的缓冲液，所述缓冲液优选7.0至7.8的pH值，在本实施例中pH=7.4。在APTT试剂的情况下，一个可能的实例为包含0.25M甘氨酸、0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.001M NiSO4和0.2mM硫汞撒的缓冲液，所述缓冲液优选6.8至7.8的pH值，在本实施例中pH=7.0。
我们的两个方法的特征为可以通过冷冻-干燥（冻干）进一步稳定试剂。在冻干前，使用基质形成添加剂，例如以下面的浓度：甘露醇1至3%、蔗糖1至3%、牛血清0.1mM。在使用前，冻干试剂必须用水重建。
具体实施方式
下面详细说明根据本发明的方法。
1.生产具有在预制阶段中制备的脂质体的试剂
脂质体制备
脂质溶液的组成和浓度
脂质组成：本领域技术人员将理解可通过改变根据它们分子形状呈现负的、零或正的表面曲率的磷脂的比例影响脂质体的性状和迭片结构。显而易见的是，占大部分的呈现零或负的表面曲率的磷脂支持大的平的表面的形成，其中，在水溶液中，通过折叠成层，实现了表面能的最小化，因而，这样组合物的磷脂混合物导致大的多层脂质体或没有被包含的内部空间的分层片状脂质聚集体。易于理解这样的脂质体的有用的表面，即能使活性分子根据需要包埋的表面（指向水溶液），与集合的脂质的量相比较小。因此，具有正的或零的表面曲率的磷脂最适于制备用作诊断试剂目的的脂质体，因为它们使脂质体囊泡的大小和形状（球形）在期望的范围内。因此，脂质混合物的决定部分优选应由呈现零表面曲率的卵磷脂和呈现小的正的曲率的磷脂酰丝氨酸构成。可优选加入小量的溶解形式的分子影响脂质体的大小，即仅包含具有甘油骨架的单个脂肪酸酯的分子，优选呈现正曲率的溶血磷脂酰胆碱和/或溶血磷脂酸。避免高浓度的呈现负的表面曲率的胆固醇或磷脂酰乙醇胺。由合成或天然来源分离的磷脂可用于制备脂质体。本领域技术人员将理解细胞膜分离物的磷脂组合物确保期望的比例，但是植物和动物来源的磷脂组合物可在非常宽的范围内变化。虽然可将兔脑膜脂质分离物用于制备重组诊断试剂而无需改变或添加，但只有在以合适的质量和数量加入溶血脂质之后，来自大豆的提取物才可被用于制备这样的脂质体。
有机溶剂组成和浓度：在两相方法中，关于用于制备脂质体的有机溶剂的基本的要求为其必须与水不混溶，并且其必须溶解期望的组合物的脂质。实践中，可使用合适比例的氯仿和甲醇的混合物，将溶剂的相对量在5∶1至1∶1的比例内改变，优选地选择比例为2∶1的氯仿-甲醇。溶解度以及配置包含不可分离头基（例如磷脂酰丝氨酸）的磷脂的特定的表面曲率的特性很大程度上依赖于头基的质子化，因此在过程中，保持脂质溶液合适的pH水平很重要。优选地，用有机酸将所述脂质溶液的pH值调节到合适的值。蚁酸、乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸可用于此目的。由于其挥发性，特别优选使用三氟乙酸。在脂质的溶解期间，优选调节pH值在2和4之间，最合适的值为2.5。三氟乙酸的浓度为0.5%。
脂质溶液的浓度：由于在水溶液中，磷脂非常易于在HⅡ取向中联合,而这从活性产物的低收率的观点看是不利的，所以优选使用高脂质浓度。根据机械混合的方法，优选脂质浓度为0.2g/ml至2g/ml，最优选浓度为1g/ml。在这个浓度范围中，所述氯仿-甲醇-磷脂溶液在凝胶状态而非液态。
脂质溶液的温度：为达到合适的脂质浓度，当溶解脂质时，必须确保高于室温(25℃)的温度。可应用的温度范围由溶剂的沸点（氯仿：61.2℃，甲醇：64.5℃）和磷脂的热稳定性决定。合适的温度范围为30℃至55℃，优选使用较高的温度。
水性缓冲液的组成和浓度
溶液的组成：本领域技术人员易于理解磷脂的头基的净电荷显著地影响它们的表面曲率特性，因此溶液的离子组成和离子强度决定了脂质体组装的质量。离子强度，即粗略地为水相的盐浓度应优选保持在最低水平，大约为零。溶液的pH必须用有机盐而不是无机盐调节至期望的值，优选在pH=6.0和pH=7.4之间，最优选pH=6.6，用5M的NaOH溶液调节。适用的具有缓冲效果的有机物优选为MOPS、CHAPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸、甘氨酸。由于脂质体乳剂易受细菌感染，优选地所述溶液应包含抗菌剂。这样的试剂可为硫汞撒或NaN3，并且由于其Na+含量后者的浓度必须保持在最低水平。
浓度：使用的水溶液的缓冲液组分的浓度必须足以达到必需的pH和缓冲容量，即在三(羟甲基)甲基甘氨酸的情况下，优选浓度范围在0.05至0.1M，最佳浓度为0.07M。在使用NaN3作为抗菌试剂的情况下，浓度不可高于0.1M，优选应为0.05M。可能的水溶液组合物示于下面说明的实施例。
根据混合方法，有机相和水相的比例优选为在1∶5和1∶100之间。
凝血酶原时间试剂制备
水溶液组成和浓度
组织因子(TF)溶液：水性缓冲溶液的组成和浓度与在描述在脂质体制备中使用的水性缓冲溶液时确定的组成与浓度相同。在三(羟甲基)甲基甘氨酸的情况下，优选的浓度范围为0.05至0.1M，最佳浓度为0.07M，并且所述溶液包含0.5至1.0μΜ、最优选0.8μΜ的组织因子。在抗菌剂NaN3的情况下，浓度可不超过0.1M，优选应为0.05M。可能的水溶液组合物可见于下面说明的实施例。
包含活性分子的脂质体乳剂的稀释缓冲液：本领域技术人员易于理解对于血液凝固试剂，血液凝固反应和产生的凝结物的质量，以及产品的最终质量和保质期受离子环境、添加剂数量和质量的关系的很大的影响。优选最终组合物通过稀释包含脂质体和活性分子的溶液来调节。从稀释溶液中的离子环境的方面看，Na+和Ca2+离子的浓度，阳离子的反离子的质量，即Cl-和/或OH-离子的存在具有显著的重要性。在影响凝固反应和凝结物质量的添加剂中，Ni2+离子的浓度及添加剂聚乙二醇的质量和数量具有显著的作用。从离子环境的方面看，负责保持优选的pH范围，即pH=7.0至7.8的有机缓冲液组分的质量和浓度非常重要。为将Na浓度保持在合适的水平，优选用5M NaOH溶液调节最终pH值。此外，添加剂聚乙二醇的质量和数量也影响试剂的凝固能力。由于最终产品包含易受氧化和微生物降解影响的脂质组分，所述产品还应包含抗氧化剂和抗微生物剂。优选地，抗微生物剂应为NaN3，因而当调节离子环境时，应考虑其Na+离子含量。如果脂质体制备期间使用的水溶液不包含凝固添加剂聚凝胺，那么优选地应将其加入稀释缓冲液中。可能的溶液组合物可见于下面说明的实施例。
在稀释具有包含活性分子的独特结构的脂质体乳剂时的混合比例
由最终产品期望的特性确定稀释溶液的混合比例。优选地稀释范围应在2倍至6倍之间，4倍稀释最合适。
激活部分促凝血酶原激酶时间试剂制备
水溶液组成和浓度
激活溶液：本领域技术人员了解在制备APTT试剂期间，可考虑几种不同的活性分子（例如鞣花酸、鞣酸、芸香苷、槲皮苷、SiO2），且溶液实际的组成和浓度比例由它们物理和化学特性确定。对于鞣酸，优选地用根据“水性缓冲溶液的组成和浓度”部分中所述而确定的组成和浓度的溶液稀释2%的水溶液1至2倍，最合适地1.2倍。可能的水溶液组成见下面的实施例。
包含活性分子的脂质体乳剂的稀释缓冲液：本领域技术人员易于理解对于血液凝固试剂，血液凝固反应和产生的凝结物的质量，以及产品的最终质量和保质期都受离子环境、添加剂的数量和质量关系的高度影响。优选通过稀释包含脂质体和活性分子的溶液实现最终的组合物。对于APTT试剂，重要的是稀释溶液不可包含Ca2+离子。从该稀释溶液的离子环境的方面看，Na+离子的浓度、阳离子的反离子的质量，即Cl-和/或OH-离子的存在，具有显著的重要性。从离子环境的方面看，负责保持优选的pH范围，即pH=6.8至7.8的有机缓冲液组分的质量和浓度非常重要。为将Na浓度保持在合适的水平，优选地用5M NaOH溶液调整最终pH值。在影响凝固反应和凝结物质量的添加剂中，Ni2+离子的浓度具有显著的作用。由于最终产品包含易受氧化和微生物降解影响的脂质组分，所述产品还应包含抗氧化剂和抗微生物剂。优选地，抗微生物剂应为硫汞撒。可能的溶液组合物可见于下面说明的实施例。
在稀释具有包含活性分子的独特结构的脂质体乳剂时的混合比例
通过最终产品的期望特性确定稀释溶液的混合比例。优选的稀释范围应在2至6倍之间，最合适的为4倍稀释。
2．在相同过程中脂质体和凝血酶原时间试剂的制备
脂质溶液的组成和浓度与对脂质体制备中使用的脂质溶液的脂质组成的说明中确定的相同。
水性缓冲溶液的组成和浓度与对脂质体制剂中使用的水性缓冲溶液的组成的说明中确定的相同，补充为在这个过程中，应优选地添加凝固添加剂聚凝胺到该溶液中，优选以0.024M的浓度。
有机相和水相的比例与对脂质体制备的说明中确定的相同。
脂质体乳剂稀释缓冲液的组分和浓度与对凝血酶原时间试剂的脂质体乳剂稀释缓冲液中确定的相同。
包含活性分子的脂质体乳剂的稀释溶液的混合比例与对凝血酶原时间试剂的说明中确定的相同。
实现所述试剂的详细的实施例.
1．通过分层和振荡相组装脂质体
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地1ml的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液的下面分层。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.高速将所述相振荡到一起。
d.去除沉淀的脂质颗粒。
e.所述清澈的脂质体乳剂与0.5ml的0.8M溶于水的重组组织因子混合。静置10分钟后，用0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液稀释4倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.9s，病理对照血浆为17.2s。
2．当通过用磁力搅拌器和旋转搅拌元件产生涡流时，通过将脂质溶液滴到涡旋运动中的液相来组装脂质体。
a.将从兔脑粉中分离的0.5g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.用注射器将100μl的磷脂溶液滴入10ml的在室温(25℃)下快速涡旋运动中的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液中。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.去除沉淀的脂质颗粒。
d.将所述清澈的脂质体乳剂与0.5ml的0.8M重组组织因子混合。静置10分钟后，用0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液稀释4倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.7s，病理对照血浆为16.9s。
3．当通过混合容器的离心旋转产生涡流时，通过将脂质溶液滴到涡旋运动中的液相而组装脂质体。
a.将从兔脑粉中分离的0.5g的磷脂混合物溶于1m1的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.用注射器将100μl的磷脂溶液滴入10ml的在室温(25℃)下快速涡旋运动中的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液中。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.去除沉淀的脂质颗粒。
d.将所述清澈的脂质体乳剂与0.5ml的0.8M重组组织因子混合。静置10分钟后，用0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液稀释4倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.7s，病理对照血浆为16.9s。
4．使用通过分层和振荡相预先生产的脂质体制备凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地在1ml的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液的下面分层。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.高速将所述相振荡到一起。
d.去除沉淀的脂质颗粒。
e.制备0.8M的重组组织因子的水溶液。
f.由所述脂质体乳剂和如e阶段中所述获得的溶液制备2∶1比例的混合物，并让混合物静置10分钟。
g.用包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02MCaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液将包含加入组织因子的脂质体乳剂稀释3倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.9s，病理对照血浆为17.2s。
5．当通过用磁力搅拌器和旋转搅拌元件产生涡流时，用通过将脂质溶液滴到涡旋运动中的液相而预先生产的脂质体制备凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.用注射器将100μl的磷脂溶液滴入10ml的在室温(25℃)下快速涡旋运动中的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.去除沉淀的脂质颗粒。
d.制备0.8M的重组组织因子的水溶液。
e.由所述脂质体乳剂和如d阶段中所述获得的溶液制备2∶1比例的混合物，并让混合物静置10分钟。
f.用包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02MCaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液将包含加入组织因子的脂质体乳剂稀释3倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.7s，病理对照血浆为16.9s。
6．当通过混合容器的离心旋转产生涡流时，用通过将脂质溶液滴到涡旋运动中的液相而预先生产的脂质体制备凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.用注射器将100μl的磷脂溶液滴入10ml的在室温(25℃)下快速涡旋运动中的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.去除沉淀的脂质颗粒。
d.制备0.8M的重组组织因子的水溶液。
e.由所述脂质体乳剂和如d阶段中所述获得的溶液制备2∶1比例的混合物，并让混合物静置10分钟。
f.用包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02MCaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液将包含加入组织因子的脂质体乳剂稀释3倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.7s，病理对照血浆为16.9s。
7．通过原位脂质体组装和活性成分（组织因子）整合，在单个步骤中制备凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得凝胶混合物在55℃保持液态。
b.制备比例为1∶1的用5M NaOH将pH调节为6.6的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3溶液与0.8M的重组组织因子水溶液的混合物。
c.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地在1ml的b阶段中所述的溶液的下面分层。
d.高速将所述相振荡到一起。
e.去除沉淀的脂质颗粒。
f.用包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02MCaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液将包含加入组织因子的脂质体乳剂稀释，其中所述溶液体积为所述脂质体乳剂的3倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是11.7s，病理对照血浆为17.0s。
8．当形成基质的添加剂为牛血清时，通过冻干进一步稳定通过原位脂质体组装和活性成分（组织因子）整合生产的凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.制备比例为1∶1的用5M NaOH将pH调节为6.6的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3溶液和0.8M的重组组织因子水溶液的混合物。
c.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地在1ml的阶段b中所述的溶液的下面分层。
d.高速将所述相振荡到一起。
e.去除沉淀的脂质颗粒。
f.作为形成基质的添加剂，优选以0.1mM的浓度将牛血清（BSA）加入所述产物。
g.将阶段f中获得的乳剂填入冻干小瓶。
h.冻干上述小瓶的内容物。
i.使用前，将冻干的物质溶于4ml的0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M的聚凝胺的溶液中。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是12.4s，病理对照血浆为19.8s。
9．当形成基质的添加剂为甘露醇时，通过冻干进一步稳定通过原位脂质体组装和活性成分（组织因子）整合生产的凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.制备比例为1∶1的用5M NaOH将pH调节为6.6的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3溶液和0.8M的重组组织因子水溶液的混合物。
c.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地在1ml的阶段b中所述的溶液的下面分层。
d.高速将所述相振荡到一起。
e.去除沉淀的脂质颗粒。
f.作为形成基质的添加剂，优选以1至3%的浓度将甘露醇加入所述产物。
g.将f中获得的乳剂填入冻干小瓶。
h.冻干上述小瓶的内容物。
i.使用前，将冻干的物质溶于4ml的0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M的聚凝胺的溶液中。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是12.7s，病理对照血浆为17.7s。
10．当形成基质的添加剂为蔗糖时，通过冻干进一步稳定通过原位脂质体组装和活性成分（组织因子）整合生产的凝血酶原时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.制备比例为1∶1的用5M NaOH将pH调节为6.6的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3溶液和0.8M的重组组织因子水溶液的混合物。
c.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地在1ml的阶段b中所述的溶液的下面分层。
d.高速将所述相振荡到一起。
e.去除沉淀的脂质颗粒。
f.作为形成基质的添加剂，优选以1至3%的浓度将蔗糖加入所述产物中。
g.将f中获得的乳剂填入冻干小瓶。
h.冻干上述小瓶的内容物。
i.使用前，将冻干的物质溶于4ml的0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M的聚凝胺的溶液。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至7.4。
通过进行凝血酶原时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是12.7s，病理对照血浆为17.7s。
11．使用通过分层和振荡相预先生产的脂质体制备激活部分促凝血酶原激酶时间试剂
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.制备比例为1∶1的用5M NaOH将pH调节为6.6的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3溶液和0.8M的重组组织因子水溶液的混合物。
c.在室温(25℃)，在玻璃注射器的帮助下，将50μl的磷脂溶液小心地在1ml的阶段b中所述的溶液的下面分层。
d.高速将所述相振荡到一起。
e.去除沉淀的脂质颗粒。
f.制备2%的鞣酸水性储备溶液。
g.用0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液将2%的鞣酸储备溶液稀释1.2倍。
h.由e阶段获得的脂质体乳剂和在g中获得的溶液制备1∶1比例的混合物，并让混合物静置10分钟。
i.用包含0.07M甘露醇,0.25M甘氨酸、0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.001MNiSO4,0.2mM硫汞撒的溶液将包含鞣酸的脂质体乳剂稀释3倍。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至7.0。
通过进行激活部分促凝血酶原激酶时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是40.1s，病理对照血浆为76.9s。
12．使用通过当用磁力搅拌器和旋转搅拌元件产生涡流时，将脂质溶液滴入涡旋运动中的水相而预先生产的脂质体制备激活部分促凝血酶原激酶时间试剂。
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.用注射器将100μl的磷脂溶液滴入10ml的在室温(25℃)下快速涡旋运动中的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.去除沉淀的脂质颗粒。
d.制备2%的鞣酸水性储备溶液。
e.用0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液将2%的鞣酸储备溶液稀释1.2倍。
f.由所述脂质体乳剂和如e阶段中所述获得的溶液制备1∶1比例的混合物，并让混合物静置10分钟。
g.用包含0.07M甘露醇、0.25M甘氨酸、0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.001MNiSO4、0.2mM硫汞撒的溶液将包含鞣酸的脂质体乳剂稀释3倍。用5M NaOH调节所述稀释溶液的pH至7.0。
通过进行激活部分促凝血酶原激酶时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是36.2s，病理对照血浆为60.5s。
13．使用通过当由混合容器的偏离心旋转产生涡流时，将脂质溶液滴入涡旋运动中的水相而预先生产的脂质体制备激活部分促凝血酶原激酶时间试剂
a.将从兔脑粉中分离的1g的磷脂混合物溶于1ml的包含0.5%的三氟乙酸的2∶1比例的氯仿-甲醇混合物中。获得的凝胶混合物在55℃保持液态。
b.用注射器将100μl的磷脂溶液滴入10ml的在室温(25℃)下快速涡旋运动中的0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH调节所述水溶液的pH至6.6。
c.去除沉淀的脂质颗粒。
d.制备2%的鞣酸水性储备溶液。
e.用0.07M三(羟甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液将2%的鞣酸储备溶液稀释1.2倍。
f.由所述脂质体乳剂和e阶段中获得的溶液制备1∶1比例的混合物，并让混合物静置10分钟。
g.用包含0.07M甘露醇、0.25M甘氨酸、0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.001MNiSO4、0.2mM硫汞撒的溶液将包含鞣酸的脂质体乳剂稀释3倍。用5MNaOH调节所述稀释溶液的pH至7.0。
通过进行激活部分促凝血酶原激酶时间测试检验产品的质量。测得的正常对照血浆的凝固时间是36.2s，病理对照血浆为60.5s。
上面说明的用于制造血液凝固试剂的方法的最重要的技术优势为它们可通过使用简单和廉价的装置（混合器）和试剂实现。不使用洗涤剂，因而不需要去除洗涤剂，并且不需要对生产的脂质体的任何进一步加工（例如挤出）。
本发明最重要的经济优势为其不需要用于脂质体制备的昂贵的试剂和方法，其不需要使用洗涤剂以溶解组织因子，并且获得的脂质体直接适于生产血液凝固试剂，而不需要任何后续步骤。另一个经济优势为本发明可以在单一的步骤中发生脂质体组装和试剂生产这样的方式实现，因此节省了进一步的费用。使用本发明中所述的方法制造的PT试剂呈现与从天然来源分离的促凝血酶原激酶相同的生化性质。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种脂质体的两相制备方法，在所述方法的过程中，混合包含天然和合成磷脂混合物的非极性有机相和与所述非极性有机相不混溶的极性水（缓冲液）相，并产生具有50至100nm粒径的脂质体乳剂，其特征在于：用简单的机械混合方法生产所述脂质体乳剂，其中，用溶于所述非极性有机相中并呈现正曲率或零曲率的0.5至1.5g/ml浓度的脂质分子的单独混合物产生完全包围所述有机相的单层或双层脂质体膜的结构，所述脂质分子为例如卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱和更少量的天然来源的其它磷脂，且这种方式制备的具有独特结构的所述脂质体乳剂的所述膜表面适于锚定活性成分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将2∶1比例的氯仿-甲醇混合物用作非极性有机相。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述非极性有机相中，为生产呈现正曲率或零曲率的脂质分子的所述单独混合物，优选提供55℃的温度和pH=2的环境。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述极性水相中，用有机化合物，优选0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸，提供所述缓冲效果。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：用5M NaOH将所述极性水（缓冲液）相的pH值调节在pH=6和pH=7之间、优选pH=6.6，并以0.05M的浓度补充抗菌NaN3防腐剂。
6.如权利要求1至5的任一项所述的方法，其特征在于：在制备所述具有独特结构的脂质体乳剂的过程中，将较小体积的所述非极性有机相加入到较大体积的所述极性水（缓冲液）相中，所述较大体积为所述较小体积的5至50倍大，最优选20倍。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：在室温(25℃)下将相简单摇动到一起，所述相为在所述极性水（缓冲液）相下分层的所述非极性有机相。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：由于搅拌元件的旋转运动，较大体积的所述相在室温被带入涡旋运动，然后将较小体积的所述相注入、喷射或最优选滴入所述涡旋中。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：通过离心旋转所述混合容器将较大体积的所述相在室温带入涡旋运动，然后将较小体积的所述相注入、喷射或最优选滴入所述涡旋。
10.如权利要求7至9的任一项所述的方法，其特征在于：通过沉降、过滤或离心去除与不与水混溶的所述制造的成品的组分。
11.制备体外凝固诊断凝血酶原时间(PT)的试剂的方法，所述试剂的一种成分为用根据权利要求1至10的任一项所述的方法制造的脂质体，其特征在于：在制备所述PT试剂的过程中，不使用任何洗涤剂，将蛋白类型的活性组分组织因子锚定到所述具有独特结构的脂质体的所述膜表面。
12.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其特征在于：所述具有独特结构的脂质体组分在预备生产步骤中生产。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述活性成分为从天然来源分离的组织因子。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述活性成分为通过发酵生产的重组组织因子。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于：所述天然或重组组织因子（活性成分）优选使用0.5至1.0μΜ的浓度。
16.如权利要求1至15的任一项所述的方法，其特征在于：包含所述具有独特结构的脂质体乳剂的所述溶液与所述天然或重组组织因子（活性成分）混合到一起，并静置优选10分钟。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于：所述脂质体乳剂与所述组织因子以2∶1的比例混合。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：通过用合适组成的缓冲液稀释来调节通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和组织因子并静置而生产的产品的最终血液凝固特性。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于：具有合适组成的缓冲液优选使用包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG4000和0.0024M聚凝胺的溶液。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：用5M NaOH将所述具有合适组成的缓冲液pH值调节在pH=7.0和pH=7.8之间、优选pH=7.4。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和组织因子并静置而生产的产品与具有7.4的pH值的所述合适组成的缓冲液的混合比例为3∶1。
22.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其特征在于：在同一生产步骤中，在制备所述具有独特结构的脂质体组分的同时生产所述PT试剂，以使所述极性水相包含优选0.5至1.0μΜ浓度的所述活性组分（组织因子）。
23.如权利要求1至22的任一项所述的方法，其特征在于：在所述进一步稳定（冻干）的步骤前，将基质形成添加剂加入到所述体外诊断试剂产品中。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于：优选0.1mM浓度的牛血清白蛋白（BSA）用作基质形成添加剂。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于：将甘露醇用作基质形成添加剂，优选浓度为1至3%。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于：将蔗糖用作基质形成添加剂，优选浓度为1至3%。
27.如权利要求1至26的任一项所述的方法，其特征在于：通过冷冻干燥（冻干）稳定生产的所述诊断试剂。
28.制备体外凝固诊断激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的试剂的方法，其中，一种组分为优选用根据权利要求1至10的任一项所述的方法制造的脂质体，其特征在于：在制备所述激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的试剂的过程中，添加非蛋白类型的活性成分[例如有机酸和无机酸]到所述具有独特结构的脂质体乳剂中。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述具有独特结构的脂质体组分在预先生产步骤中生产。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为鞣酸。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于：鞣酸组分优选以1.66%的浓度使用。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于：所述具有独特结构的脂质体乳剂与所述鞣酸溶液以1∶1的比例混合。
33.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为鞣花酸。
34.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为芸香苷。
35.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为槲皮苷。
36.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为SiO2。
37.如权利要求28至36的任一项所述的方法，其特征在于：将所述具有独特结构的脂质体乳剂的和包含所述活性组分的溶液混合到一起，并静置优选10分钟。
38.如权利要求28至36的任一项所述的方法，其特征在于：通过用合适组成的缓冲液稀释来调节由混合包含所述具有独特结构的脂质体乳剂的溶液和所述活性组分并静置而生产的所述产品的所述最终血液凝固特性。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于：具有合适组成的缓冲液优选使用包含0.25M甘氨酸、0.01M4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.001M NiSO4和0.2mM硫汞撒的溶液。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于：用5M NaOH将具有合适组成的所述缓冲液pH值调节在pH=6.8和pH=7.8之间、优选pH=7.0。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于：通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和活性成分并静置而生产的所述产品与具有7.0的pH值的合适组成的所述缓冲液的混合比例为3∶1。

Claims (41)

1.一种脂质体的两相制备方法，在所述方法的过程中，混合包含天然和合成磷脂混合物的非极性有机相和与所述非极性有机相不混溶的极性水（缓冲液）相，并产生具有50至100nm粒径的脂质体乳剂，其特征在于：用一种简单的机械方法生产所述脂质体乳剂，其中，用溶于所述非极性有机相中并呈现正曲率或零曲率的0.5至1.5g/ml浓度的脂质分子的单独混合物产生完全包围所述有机相的单层或双层脂质体膜的结构，所述脂质分子为例如卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱和更少量的天然来源的其它磷脂，这样，以这种方式制备的具有独特结构的所述脂质体乳剂的所述膜表面优选适于锚定活性成分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将2∶1比例的氯仿-甲醇混合物用作非极性有机相。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述非极性有机相中，为生产呈现正曲率或零曲率的脂质分子的所述单独混合物，优选提供55℃的温度和pH=2的环境。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述极性水相中，用有机化合物，优选0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸，提供所述缓冲效果。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：用5M NaOH将所述极性水（缓冲液）相的pH值调节在pH=6和pH=7之间、优选pH=6.6，并以0.05M的浓度补充抗菌NaN3防腐剂。
6.如权利要求1至5的任一项所述的方法，其特征在于：在制备所述具有独特结构的脂质体乳剂的过程中，将较小体积的所述非极性有机相加入到较大体积的所述极性水（缓冲液）相中，所述较大体积为所述较小体积的5至50倍大，最优选20倍。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：在室温(25℃)下将相简单摇动到一起，所述相为在所述极性水（缓冲液）相下分层的所述非极性有机相。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：由于搅拌元件的旋转运动，较大体积的所述相在室温被带入涡旋运动，然后将较小体积的所述相注入、喷射或最优选滴入所述涡旋中。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：通过离心旋转所述混合容器将较大体积的所述相在室温带入涡旋运动，然后将较小体积的所述相注入、喷射或最优选滴入所述涡旋。
10.如权利要求7至9的任一项所述的方法，其特征在于：通过沉降、过滤或离心去除与不与水混溶的所述制造的成品的组分。
11.制备体外凝固诊断凝血酶原时间(PT)的试剂的方法，所述试剂的一种成分为用根据权利要求1至10的任一项所述的方法制造的脂质体，其特征在于：在制备所述PT试剂的过程中，不使用任何洗涤剂，将蛋白类型的活性组分组织因子锚定到所述具有独特结构的脂质体的所述膜表面。
12.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其特征在于：所述具有独特结构的脂质体组分在预备生产步骤中生产。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述活性成分为从天然来源分离的组织因子。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述活性成分为通过发酵生产的重组组织因子。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于：所述天然或重组组织因子（活性成分）优选使用0.5至1.0μΜ的浓度。
16.如权利要求1至15的任一项所述的方法，其特征在于：包含所述具有独特结构的脂质体乳剂的所述溶液与所述天然或重组组织因子（活性成分）混合到一起，并静置优选10分钟。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于：所述脂质体乳剂与所述组织因子以2∶1的比例混合。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：通过用合适组成的缓冲液稀释来调节通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和组织因子并静置而生产的产品的最终血液凝固特性。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于：具有合适组成的缓冲液优选使用包含0.025M三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、0.11M NaCl、0.02M CaCl2、0.025M NaN3、16g/1PEG 4000和0.0024M聚凝胺的溶液。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：用5M NaOH将所述具有合适组成的缓冲液pH值调节在pH=7.0和pH=7.8之间、优选pH=7.4。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和组织因子并静置而生产的产品与具有7.4的pH值的所述合适组成的缓冲液的混合比例为3∶1。
22.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其特征在于：在同一生产步骤中，在制备所述具有独特结构的脂质体组分的同时生产所述PT试剂，以使所述极性水相包含优选0.5至1.0μΜ浓度的所述活性组分（组织因子）。
23.如权利要求1至22的任一项所述的方法，其特征在于：在所述进一步稳定（冻干）的步骤前，将基质形成添加剂加入到所述体外诊断试剂产品中。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于：优选0.1mM浓度的牛血清白蛋白（BSA）用作基质形成添加剂。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于：将甘露醇用作基质形成添加剂，优选浓度为1至3%。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于：将蔗糖用作基质形成添加剂，优选浓度为1至3%。
27.如权利要求1至26的任一项所述的方法，其特征在于：通过冷冻干燥（冻干）稳定生产的所述诊断试剂。
28.制备体外凝固诊断激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的试剂的方法，其中，一种组分为优选用根据权利要求1至10的任一项所述的方法制造的脂质体，其特征在于：在制备所述激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的试剂的过程中，添加非蛋白类型的活性成分[例如有机酸和无机酸]到所述具有独特结构的脂质体乳剂中。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述具有独特结构的脂质体组分在预先生产步骤中生产。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为鞣酸。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于：鞣酸组分优选以1.66%的浓度使用。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于：所述具有独特结构的脂质体乳剂与所述鞣酸溶液以1∶1的比例混合。
33.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为鞣花酸。
34.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为芸香苷。
35.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为槲皮苷。
36.如权利要求28或29所述的方法，其特征在于：所述活性成分为SiO2。
37.如权利要求28至36的任一项所述的方法，其特征在于：将所述具有独特结构的脂质体乳剂的和包含所述活性组分的溶液混合到一起，并静置优选10分钟。
38.如权利要求28至36的任一项所述的方法，其特征在于：通过用合适组成的缓冲液稀释来调节由混合包含所述具有独特结构的脂质体乳剂的溶液和所述活性组分并静置而生产的所述产品的所述最终血液凝固特性。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于：具有合适组成的缓冲液优选使用包含0.25M甘氨酸、0.01M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.001M NiSO4和0.2mM硫汞撒的溶液。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于：用5M NaOH将具有合适组成的所述缓冲液pH值调节在pH=6.8和pH=7.8之间、优选pH=7.0。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于：通过混合具有独特结构的脂质体乳剂和活性成分并静置而生产的所述产品与具有7.0的pH值的合适组成的所述缓冲液的混合比例为3∶1。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106405119A (zh) * 2015-07-30 2017-02-15 希森美康株式会社 凝固时间测定方法及装置、凝固时间测定用试剂及试剂盒
CN107356768A (zh) * 2017-06-23 2017-11-17 宁波艾科生物科技有限公司 一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂
CN109613279A (zh) * 2018-12-06 2019-04-12 太原博奥特生物技术有限公司 一种新型鞣花酸化合物及利用鞣花酸化合物制备活化部分凝血活酶时间测定试剂
CN110133304A (zh) * 2019-05-21 2019-08-16 北京赛科希德科技股份有限公司 组合物、含有该组合物的试剂及其应用
CN113367348A (zh) * 2021-06-24 2021-09-10 青岛农业大学 一种脂质体稳定的乳液及其制备方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102565427A (zh) * 2011-12-28 2012-07-11 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种凝血酶原时间测定试剂的制备方法
HUP1300542A2 (hu) 2013-09-19 2015-03-30 Diagon Kft Eljárás és mérõrendszer véralvadási jellemzõk meghatározására
UA111762C2 (uk) * 2014-07-08 2016-06-10 ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НаноМедТраст" Спосіб отримання фармакологічно активного ліпосомального засобу, що містить кверцетин
US10247741B2 (en) 2014-09-26 2019-04-02 Abbott Point Of Care Inc. Microfabricated device with micro-environment sensors for assaying coagulation in fluid samples
EP3955003B1 (en) 2014-09-26 2023-06-21 Abbott Point Of Care Inc Sensors for assaying coagulation in fluid samples
WO2016049527A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Abbott Point Of Care Inc. Cartridge device with segmented fluidics for assaying coagulation in fluid samples
US10473612B2 (en) 2014-09-26 2019-11-12 Abbott Point Of Care Inc. Cartridge device identification for coagulation assays in fluid samples
EP4043879A1 (en) 2014-09-26 2022-08-17 Abbott Point Of Care Inc Single channel cartridge device for coagulation assays in fluid samples
CN107110875A (zh) 2014-09-26 2017-08-29 雅培医护站股份有限公司 用在凝固测定中的鞣花酸制剂
US10048282B2 (en) 2014-09-26 2018-08-14 Abbott Point Of Care Inc. Cartridge device with fluidic junctions for coagulation assays in fluid samples
KR20210028668A (ko) * 2018-07-06 2021-03-12 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 리포좀을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약
CN111020004B (zh) * 2019-12-28 2022-09-30 哈尔滨工业大学 一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法
CN111729126B (zh) * 2020-07-10 2022-04-05 北京红立方医疗设备有限公司 一种基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料及其制备方法
CN112481355B (zh) * 2020-11-16 2023-05-30 武汉市长立生物技术有限责任公司 液体型凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法
CN113201532B (zh) * 2021-04-30 2023-10-20 南京邮电大学 Dna折纸框架脂质体及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522803A (en) * 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US20020182225A1 (en) * 2001-03-22 2002-12-05 Jianfang Wang Use of liposomes of defined composition and size for the preparation of prothrombin time reagents

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4529561A (en) 1978-03-24 1985-07-16 The Regents Of The University Of California Method for producing liposomes in selected size range
ATE8584T1 (de) 1980-01-16 1984-08-15 Hans Georg Prof. Dr. Weder Verfahren und dialysiereinrichtung zur herstellung von bilayer-vesikeln und verwendung der bilayer-vesikel.
US4880635B1 (en) 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4622188A (en) 1984-12-21 1986-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for manufacturing liposomes
US5041278A (en) 1985-10-15 1991-08-20 The Liposome Company, Inc. Alpha tocopherol-based vesicles
US5204112A (en) 1986-06-16 1993-04-20 The Liposome Company, Inc. Induction of asymmetry in vesicles
US5723147A (en) 1987-02-23 1998-03-03 Depotech Corporation Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride
JPH0683633B2 (ja) * 1987-04-08 1994-10-26 花王株式会社 食品用離型油組成物
US5160669A (en) * 1988-03-03 1992-11-03 Micro Vesicular Systems, Inc. Method of making oil filled paucilamellar lipid vesicles
US5556637A (en) 1990-08-06 1996-09-17 A. Nattermann & Cie. Gmbh Water containing liposome system
US5314695A (en) 1990-11-13 1994-05-24 Corvas International, Inc. Tissue factor based prothrombin time reagent
US6203816B1 (en) * 1990-11-13 2001-03-20 Corvas International, Inc. Tissue factor based prothrombin time reagent
US6261792B1 (en) 1990-12-07 2001-07-17 The Liposome Company, Inc. Lipid-dependent diagnostic assays
JP3416778B2 (ja) 1991-10-04 2003-06-16 デイド、ベーリング、インコーポレイテッド 組換えヒト組織因子及び精製された天然及び合成のリン脂質からのプロトロンビン時間試薬の製造
GB9320668D0 (en) * 1993-10-07 1993-11-24 Secr Defence Liposomes containing particulare materials
US5827533A (en) 1997-02-06 1998-10-27 Duke University Liposomes containing active agents aggregated with lipid surfactants
WO1998045713A1 (de) 1997-04-09 1998-10-15 Blutspendedienst Der Drk-Landesverbände Nordrhein- Und Westfalen-Lippe Gmbh Verfahren zur bestimmung von aktivierten blutgerinnungsfaktoren in plasma und plasmaderivaten
EP1071401A4 (en) 1998-03-31 2002-05-15 Yissum Res Dev Co LIPOSOME COMPOSITION OF BUPIVACAIN AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
US7169410B1 (en) 1998-05-19 2007-01-30 Sdg, Inc. Targeted liposomal drug delivery system
US6733985B1 (en) * 1999-05-19 2004-05-11 International Technidyne Corporation Preparation of stable liquid and dried synthetic prothrombin time reagents
US7358337B2 (en) * 2002-08-16 2008-04-15 International Technidyne Corporation Assay for low molecular weight heparin
US7049087B2 (en) 2002-11-05 2006-05-23 Lifescan, Inc. Method for manufacturing a tissue factor-based prothrombin time reagent
US7148067B2 (en) 2004-08-31 2006-12-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Thromboplastin reagents

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522803A (en) * 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US20020182225A1 (en) * 2001-03-22 2002-12-05 Jianfang Wang Use of liposomes of defined composition and size for the preparation of prothrombin time reagents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘庆良: "脂质体在医学领域的新应用", 《国外医学》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106405119A (zh) * 2015-07-30 2017-02-15 希森美康株式会社 凝固时间测定方法及装置、凝固时间测定用试剂及试剂盒
CN107356768A (zh) * 2017-06-23 2017-11-17 宁波艾科生物科技有限公司 一种液体即用型凝血酶原时间检测试剂
CN109613279A (zh) * 2018-12-06 2019-04-12 太原博奥特生物技术有限公司 一种新型鞣花酸化合物及利用鞣花酸化合物制备活化部分凝血活酶时间测定试剂
CN110133304A (zh) * 2019-05-21 2019-08-16 北京赛科希德科技股份有限公司 组合物、含有该组合物的试剂及其应用
CN110133304B (zh) * 2019-05-21 2022-07-12 北京赛科希德科技股份有限公司 组合物、含有该组合物的试剂及其应用
CN113367348A (zh) * 2021-06-24 2021-09-10 青岛农业大学 一种脂质体稳定的乳液及其制备方法

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