JPH03218309A - リポソーム表面への蛋白質吸着抑制剤 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリポソーム表面への蛋白質吸着抑制剤に関する
。

本発明はさらにリポソーム凝集防止剤に関する。

本発明はさらに蛋白質吸着の抑制されたあるいはリポソ
ーム同士の凝集が防止されたリポソームおよびその製法
に関する。

〔従来の技術〕

リポソームを水溶性あるいは脂溶性の薬物の担体として
利用しようとする試みが広く行われている（Ｇｒｅｇｏ
ｒｉａｄｉｓ　ｅｔ　ａｔ．，　Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．
　Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．，　４４６，　３１９（１９８５
乃。また、リポソームの内水相に動物の酸素運搬体であ
るヘモグロビンを含有させ、リポソームを人工赤血球と
して利用する試みも行われている（特開昭８２　−　１
７８５２１）。

〔発明が解決しようとする課題〕 リポソームを薬物等の運搬体として利用する場合、リポ
ソームを生体の血管内へ投与する必要がある。しかし、
従来一般に使用されているリポソーム膜が脂質のみから
成るリポソームは、生体の血漿中の蛋白質（例えばアル
ブミン、グロプリン、フィブリノーゲン等）を吸着し、
吸着された蛋白質を介してリポソーム同士が凝集すると
いう問題があった。特にリポソームの粒径が０．１一を
越える場合に、この問題は顕著であった。通常一般に利
用されるリポソームの粒径は０．１虜〜１一であって、
そのままの状態であれば、毛細血管でも内径が数虜はあ
るので生体の血管内を通過するのに障害とはならない。

しかしながら、リポソームが血漿中の蛋白質を吸着する
ことにより凝集してしまうと、その凝集物の大きさは数
十扉にも達する。もし、血管内で凝集が生起すればリポ
ソームの凝集物が血管を栓塞し、血流を阻害して生体を
死に至らしめる危険性がある。

特にリポソームを人工赤血球として利用する場合、大量
のリポソームを投与しなければならず、血漿中でのリポ
ソームの凝集は無視できない問題であった。しかし、血
漿中でのリポソームの凝集を防Ｉ卜する技術は従来全く
なかった。

また、リポソームを生体内に投与した場合、リポソーム
を抗原とした抗体としての蛋白質（イムノグ口プリン）
がリポソームに吸着し、倉食細胞（マクロファージ）に
異物認識を与え、リポソームがマクロファージに取り込
まれ、リポソームが短時間のうちに消失してしまう。そ
こでリポソーム表面への蛋白質吸着を抑制することによ
り、血漿中におけるリポソームの消失時間を遅延させる
ことができる。

さらにリポソームを人工赤血球として利用する場合、血
液中に存在する赤血球に対して溶血等の有害な作用のな
いリポソームが望まれる。

従って本発明の目的は、リポソーム表面への蛋白質吸着
抑制剤およびリポソーム凝集防止剤、血漿中での蛋白質
吸着が抑制されたリポソームおよびその製法を提供する
ことにある。さらに本発明の目的は、リポソームを人工
赤血球として使用する場合に、溶血等の毒作用のないリ
ポソームを提供することにある。

５ 〔問題点を解決するための手段〕 上記目的を達成するため、本発明者が鋭意研究を重ねた
結果、リポソームの脂質層に特定の蛋白質吸着抑制剤を
含有させることにより血漿中で蛋白質がリポソーム表面
に吸着するのを防止することができ、ひいてはリポソー
ム同士の凝集を防止することができることを見い出し、
本発明を完成した。

本発明によれば下記のリポソーム表面への蛋白質吸着抑
制剤、リポソーム凝集防止剤、これらを含有するリポソ
ームおよびその製法が提供される。

１）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
からなることを特徴とするリポソーム表面への蛋白質吸
着抑制剤。

２）ポリエチレングリコールの両末端に水素添加天然リ
ン脂質が結合しているものである１項記載のリポソーム
表面への蛋白質吸着抑制剤。

３）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
の水素添加天然リン脂質部分がリポソーム膜を構成する
脂質層に固定され、ポリエ６ チレングリコール部分がリポソーム表面から外方向に伸
びてなる蛋白質の吸着が抑制されたリポソーム。

滲ポリエチレングリコールの両末端に結合した水素添加
天然リン脂質がリポソームを構成する脂質層に固定され
、ポリエチレングリコール部分がループ状にリポソーム
表面から外方向に伸びてなる３項記載の蛋白質の吸着が
抑制されたリポソーム。

５）リポソームの懸濁液に１項に記載のリポソーム表面
への蛋白質吸着抑制剤を添加し、次いで該懸濁液からリ
ポソームを採取することを特徴とする蛋白質の吸着が抑
制されたリポソームの製法。

６）１又は２項に記載の蛋白質吸着抑制剤をリポソーム
膜構成脂質と均一に混合し、得られた混合物を用いてリ
ポソームを形成させることを特徴とする蛋白質の吸着が
抑制されたリポソームの製法。

７）ポリエチレングリコール結合水素添加天然７ リン脂質がポリエチレングリコール結合水素添加天然ホ
スファチジルエタノールアミンである１〜６項のいずれ
かの項に記載の蛋白質吸着抑制剤あるいはリポソームも
しくはその製法。

８）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
からなることを特徴とするリポソーム凝集防止剤。

本発明におけるリポソーム表面への蛋白質吸着抑制剤ま
たはリポソーム凝集防止剤は、ポリエチレングリコール
（以下ＰＥＧという）と水素添加天然リン脂質とが結合
したポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
（以下ＰＥＧ結合リン脂質という）である。

本発明におけるＰＥＧ結合リン脂質は、水素添加天然リ
ン脂質の親水部（極性頭部）にポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）を共有結合した構造を有し、１分子中に１ま
たは複数のＰＥＧ鎖を含有する。ＰＥＧ鎖の該リン脂質
と結合していない側の末端は、水酸基あるいはメチル、
エチル等の短鎖のエーテル、酢酸、乳酸等の短鎖のエス
テルで８ あっでも良い。またＰＥＧ鎖の両末端に水素添加天然リ
ン脂質を共有結合した構造でもよい。

本発明の目的のためには、ＰＥＧ結合リン脂質分子中の
ＰＥＧ鎖長は、平均重合度で５〜１０００モルの範囲が
望ましく、より好ましくは４０〜２００モルである。こ
の範囲を下回る場合には血漿中での蛋白質の吸着抑制お
よびリポソーム凝集防止効果が発現され難く、この範囲
を上回る場合にはＰＥＧ結合リン脂質の水溶性が高くな
り、リポソーム膜中に固定され難くなる。

本発明のＰＥＧ結合水素添加天然リン脂質における水素
添加天然リン脂質としては、天然のリン脂質を常法に従
って水素添加したものが用いられる。

大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルエタノー
ルアミン等の天然のリン脂質は全て不飽和脂肪酸を分子
中に含んでいるが、本発明においては上記天然リン脂質
の不飽和脂肪酸を水素で飽和した水素添加天然リン脂質
が使用される。合成ジバルミトイルレシチンホスファチ
ジルエタノー９ ルアミンは分子中に不飽和脂肪酸を含んでおらず、リポ
ソーム表面への蛋白質吸着抑制作用やリポソーム凝集防
止作用は水素添加天然リン脂質と同等であるが、価格の
高い点および溶血作用が見られる点で劣っている。

本発明において用いる水素添加天然リン脂質の水素添加
度は臨界的ではないがヨウ素価で表わして３０以下、好
ましくはｌＯ以下である。水素添加天然リン脂質の例と
しては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、カ
ルジオリピン等を常法に従って水素添加したものがあげ
られる。

特に水素添加天然ホスファチジルエタノールアミンが好
ましい。

ＰＥＧと上記リン脂質と共有結合させるには該リン脂質
の極性部に反応活性な官能基が必要である。これには、
ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基、ホスファ
チジルグリセロールの水酸１　０ 基、ホスファチジルセリンのカルボキシル基等があり、
ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が好ましく
利用される。

該リン脂質の反応活性な官能基とＰＥＧを共有結合させ
るには、塩化シアヌルを用いる方法、カルボジイミドを
用いる方法、酸無水物を用いる方法、グルタルアルデヒ
ドを用いる方法、等がある。

ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とＰＥＧを
結合するには、塩化シアヌル（２，４．６−　トリクロ
口ーＳ−トリアジン）を用いる方法が好ましく利用され
る。例えば、モノメトキシポリエチレングリコールと塩
化シアヌルを公知の反応操作で結合することにより、２
−０−メトキシポリエチレングリコールー４．６−ジク
ロローＳ−｝リアジン（活性化ＰＥＧＩ）または２，４
−ビス（０−メトキシポリエチレングリコール）−６−
クロローＳ−｝リアジン（活性化ＰＥＧ２）が得られる
　（Ｙ，　Ｉｎａｄａ，　ｅｔ　ａｌ．．　Ｃｈｅｔｐ
．　Ｌｅｔｔ．．　７　．　７７３−７７６（１９８０
）ｌ。これらとアミノ基を脱塩酸縮合反応により結合さ
せることで、ホスファチジルエタ１１ ノールアミンの極性頭部にＰＥＧを共有結合させたリン
脂質が得られる。ここで、活性化ＰＥＧＩを用いた場合
は１分子のリン脂質中に１本のＰＥＧ鎖を、活性化ＰＥ
Ｇ２を用いた場合は２本のＰＥＧ鎖を含有することにな
る。また、モノメトキシＰＥＧと無水コハク酸を反応さ
せてＰＥＧ末端にカルボキシル基を導入し、これとホス
ファチジルエタノールアミンをカルボジイミド存在下で
反応させることにより、アミド結合を介したＰＥＧ結合
リン脂質が得られる。

本発明のＰＥＧ結合リン脂質を脂質層に含有するリポソ
ームを製造するには、ＰＥＧ結合リン脂質をリポソーム
形成脂質と予め均一に混合して、得られた混合脂質を用
いて常法によりリポソームを形成させれば良い。リポソ
ーム形成脂質に対するＰＥＧ結合リン脂質の混合比は、
モル比で０．１モル％〜５０モル％、好ましくは０．５
モル％〜２０モル％、より好ましくは１モル％〜５モル
％である。

この範囲を下回る場合には、血漿中でのリポソーム凝集
防１１ユ効果が不十分となり、この範囲を上回１２一 る場合には、ＰＥＧ結合リン脂質の可溶化能により、リ
ポソームが不安定となる。

ＰＥＧ結合リン脂質と予め均一に混合するには、例えば
、両者を揮発性の有機溶媒に溶解させた後、エバポレー
ションにより、有機溶媒を除去すれば良い。もし、脂溶
性の薬物等をリポソームに含有させるのであれば、この
とき、リポソーム形成脂質と共に混合しておけば良い。

得られた混合脂質からリポソームを形成させるには、通
常一般に行われているリポソーム化の方法に従って行う
ことが可能であり、例えば、振とう法、超音波照射法、
フレンチプレス法等いずれの方法を用いても良い。

上記のＰＥＧ結合リン脂質を上記の範囲で使用するかぎ
りにおいては、粒径０．１μｍ〜１庶のリポソームが得
られ、内水相に十分な水溶性の薬物や生理活性物質等を
担持させることができる。得られたリポソームの脂質層
中にはＰＥＧ結合リン脂質が含有されているが、その含
有率は必ずしも初めの脂質との混合割合と同一ではない
。ＰＥＧ結合リン脂質の水溶性が高い場合にはリポソー
ム化１３ の過程で、その一部が膜外の水相中に溶出している場合
もありうる。リポソーム脂質膜中におけるＰＥＧ結合リ
ン脂質の存在状態は明らかではないが、ＰＥＧ結合リン
脂質の疎水性部がリポソーム膜中の疎水性領域内にあっ
て、親水性のＰＥＧ鎖が膜中の親水性領域から膜外の水
性媒体中にかけて存在しているものと推定される。特に
ＰＥＧの両末端にリン脂質が結合した構造を有するＰＥ
Ｇ結合リン脂質の場合には、両末端のリン脂質がリポソ
ーム膜中の疎水性領域に疎水性相互作用によって固定さ
れ、親水性のＰＥＧ鎖はリポソーム膜中の親水性領域へ
あるいは膜外の水性媒体中へループ状に露出しているも
のと推定される。従って、本方法によって得られたリポ
ソームにおいては、ＰＥＧ結合リン脂質のＰＥＧ鎖がリ
ポソームの外水相側及び内水相側の両側に存在すること
になる。

本発明のＰＥＧ結合リン脂質は、必ずしも水に透明に溶
解する必要はない。しかし、本発明のＰＥＧ結合リン脂
質が水に対し、均一に溶解する１４ 場合は、さらに別の方法によっても本発明のリポソーム
を製造することができる。すなわち、通常一般に行われ
ているリポソーム化の方法に従って製造された、すでに
水溶性あるいは脂溶性の薬物等を担持しているリポソー
ムの懸濁液に、本発明のＰＥＧ結合リン脂質をそのまま
あるいは水溶液として添加することによっても、本発明
のＰＥＧ結合リン脂質を脂質層中に含有するリポソーム
を製造することができる。この場合、ＰＥＧ結合リン脂
質は水溶液中でミセル様の分子集合体を形成して分散し
ていると思われるが、ここにリポソームが共存すれば、
ＰＥＧ結合リン脂質分子中の疎水性部が、リポソーム膜
中の疎水性領域に疎水的相互作用によって固定され、親
水性のＰＥＧ鎖はり１ポソームの外水相側表面にのみ露
出した構造となる。

ＰＥＧ結合リン脂質を水溶液として添加する場合、その
濃度は、臨界ミセル濃度以上であれば良いが、その濃度
が低いと、リポソームへの吸着量が不十分となり血漿中
でのリポソーム凝集防止効１５ 果が低下し、その濃度が高すぎるとリポソームを不安定
にし、内水相に担持された水溶性薬物等の漏れ出しを引
き起こしてしまう。従って、その濃度はリポソーム懸濁
液中の濃度で０，０１％〜２０％、より好ましくは、０
．０５％〜２％である。

本発明のＰＥＧ結合リン脂質を脂質層に含有するリポソ
ームは、また別の方法によっても製造することができる
。すなわち反応活性な官能基を持つリン脂質を含有する
リポソームを常法にて製造した後、リポソーム外液に片
末端活性化ＰＥＧを添加してリン脂質と結合させる。例
えば、ホスファチジルエタノールアミンを全リン脂質中
１モル％〜５０モル％含有するリポソームを製造し、塩
基性（　ａｌｌ　９以上）緩衝液中、活性化ＰＥＧ２を
１％〜２０％の濃度で添加し、室温で１時間〜２４時間
反応させる。この場合、親水性のＰＥＧ鎖はリポソーム
の外水相側表面にのみ露出した構造となる。

本発明で使用するリポソーム形成脂質は、ホスファチジ
ルコリン（レシチン）、スフィンゴミエ１６ リン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルセリン等に代表されるリン脂質で卵黄、大豆その他の
天然材料に由来するもの、または、有機化学的な合成手
段により得られるものを単独でまたは混合して主成分と
する。さらに膜安定化剤としてコレステロール、コレス
タノール等のステロール類や、荷電物質としてホスファ
チジン酸、ジセチルホスフェート、高級脂肪酸等を添加
しても良い。

特に、これらリン脂質が不飽和結合を有する場合、これ
が過酸化反応を受けることによって発生する脂質過酸化
物による毒性の問題、また内包ヘモグロビンが酸化変性
を受け易いといった問題があるため、この不飽和基に水
素添加したものが好適に用いられる。例えば、入手が容
易な水素添加天然リン脂質として水素添加卵黄レシチン
、水素添加大豆レシチンなどがある。これら水素添加天
然リン脂質を主成分とする場合、その相転移温度は５０
℃程度と高温である。一般にリポソームは相転移温度以
上で操作しなければ形成され難いが、１７ ヘモグロビンをリポソーム化する場合、４０℃以上で操
作するとヘモグロビンが熱変性を受けてしまう。しかし
、リポソーム形成脂質としてステロール類を含有させれ
ば、脂質混合物全体として明確な相転移点が存在しなく
なり、操作温度が主成分リン脂質の相転移温度以下でも
十分に人工赤血球を製造することができる。また、生成
した人工赤血球同士が凝集することを防止するために通
常、荷電物質を含有させるが、これには高級飽和脂肪酸
が好ましく用いられる。これらリポソーム形成脂質の混
合比率はリン脂質１重量部に対してステロール類０．２
〜１重量部、高級飽和脂肪酸０．０５〜０．２重量部が
適当である。

ＰＥＧ結合リン脂質とリポソーム形成脂質を混合するに
は、例えばクロロホルム、ジクロ口メタン等のＰＥＧ結
合リン脂質とリポソーム形成脂質を均一に溶解しつる揮
発性有機溶媒に、これらを均一溶解後、有機溶媒をエバ
ポレーション、凍結乾燥、スプレードライ等の方法によ
り除去すれば良い。

１８ 得られた混合脂質から人工赤血球を形成させるには、ヘ
モグロビン水溶液中に該混合脂質を永和分散させればよ
い。水利分散の方法は単に両者を機械的に混合するだけ
でも良いが、さらに、フレンチプレス細胞破砕機等を用
いての高圧吐出処理を行うことが望ましい。ヘモグロビ
ン水溶液のヘモグロビン濃度は３０〜６０％が好ましく
、この範囲を下回る場合には、ヘモグロビンのカプセル
化効率が低く、この範囲を上回る場合には、ヘモグロビ
ン水溶液の粘度が著しく高くなり、ＰＥＧ結合リン脂質
を加えた場合でも、水和分散が困難になる。

特に、水素添加リン脂質、ステロール類、高級飽和脂肪
酸を上記範囲で混合したリポソーム形成脂質と上記範囲
のヘモグロビン水溶液を使用する本発明の人工赤血球の
製造方法においては、ヘモグロビンカプセル化効率の著
しく低い粒径０，０１μｍ〜０．０３陣の人工赤血球は
殆ど生成せず、大部分が粒径０．１μｍ以上のヘモグロ
ビンカプセル化効率の高い人工赤血球となる。

１９ 得られた人工赤血球の脂質層中にはＰＥＧ結合リン脂質
が含有されているが、その含有率は必ずしも初めの脂質
との混合割合と同一ではない。

ＰＥＧ結合リン脂質の水溶性が高い場合にはリポソーム
化の過程で、その一部が膜外の水相中に溶出している場
合もありうる。

次に実施例および比較例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。

実施例　１ 水素添加天然ホスファチジルエタノールアミン１５０ｍ
ｇ，活性ＰＥＧ２　（ＰＥＧ平均分子量５，０００Ｘ２
，生化学工業■製）　２．５ｇを脱水クロロホルム５０
ｍｌに溶解、炭酸ナトリウム２ｇを加えて、室温で終夜
反応させた。ニンヒドリン呈色の消失により反応終了を
確認後、反応液を濾過し、ヘキサンを加えて再沈精製、
真空乾燥してＰＥＧ結合リン脂質を得た。

水素添加卵黄レシチン６３０ｍｇ，コレステロール３１
７ｍｇ，　ミリスチン酸５３■、上記のＰＥＧ結合リン
脂質１５０ｍｇをジクロ口メタン２０ｍｌに溶解し、２
０ エバボレーションにより有機溶媒を除去した。

得られた混合脂質に５０％ヘモグロビン水溶液２０ｍｌ
を加え、振とう混合後、２５０ｋｇ／ｃｍ２の圧力でフ
レンチプレス処理を１０回繰り返した。得られたフレン
チプレス処理液を生理食塩水により１０倍に希釈して遠
心分離処理（１７．００Ｏｒ．ｐ．ｍ．３０分）し、沈
澱リポソームを生理食塩水１４０ｍｌにより、さらに遠
心洗浄を２回繰り返した。洗浄後の沈澱リポソームをヘ
モグロビン濃度で５％となるように生理食塩水中に懸濁
させた。得られたリポソームの平均粒径は０．２μｍで
あった。このリポソーム懸濁液０．１ｍｌとクエン酸加
ヒト血漿０．５ｍｌを混合し、光学顕微鏡（４００倍）
により観察したところ、１ｕｎを越えるリポソーム凝集
物はほとんど認められなかった。

実施例　２ 水素添加卵黄レシチン８３０ｍｇ，コレステロール３　
１　７　１１ｇ　％　ミリスチン酸５３［Ｉｌｇをジク
ロ口メタン２０ｍｌに溶解し、エバポレーションにより
有機溶媒を除去した。得られた混合脂質に５０％ヘモグ
ロビン水２１ 溶液２０ｍｌを加え、振とう混合後、５００ｋｇ／ｃｍ
２の圧力でフレンチプレス処理をｌＯ回繰り返した。得
られたフレンチプレス処理液を生理食塩水により１０倍
に希釈して遠心分離処ＰＩ！　（１７．００Ｏｒ．ＬＩ
Ｉ１．３０分）し、沈澱リポソームを生理食塩水１４０
ｍｌにより、さらに遠心洗浄を２回繰り返した。洗浄後
の沈澱リポソームをヘモグロビン濃度で５％となるよう
に生理食塩水中に懸濁させた。得られたリポソームの平
均粒径は０．２ａｍであった。このリポソーム懸濁液０
．１ｍｌとクエン酸加ヒト血漿０．５ｍｌを混合し、光
学顕微鏡（４００倍）により観察したところ、リポソー
ムは完全に凝集し、その凝集物の大きさは５０−を越え
るものであった。

ヘモグロビン濃度で５％に調整した上記のリポソーム懸
濁液１ｍｌに、１％の実施例１で得られたＰＥＧ結合リ
ン脂質を含む生理食塩水９ｍｌを加え、室温で３０分間
放置した後、生理食塩水により１０倍に希釈して遠心分
離処理（１７．０００ｒ．ｐ．ｍ．３０分）し、沈澱リ
ポソームを生理食塩水１４０ｍｌにより、さらに遠心洗
浄を２回繰り返した。洗浄後の沈澱リポ２２ ソームをヘモグロビン濃度で５％となるように生理食塩
水中に懸濁させた。このリポソーム懸濁液０．１ｍｌと
クエン酸加ヒト血漿０．５ｍｌを混合し、光学顕微鏡（
４００倍）により観察したところ、１μｓを越えるリポ
ソーム凝集物はほとんど認められなかった。

実施例　３ 水素添加天然ホスファチジルエタノールアミンを３０モ
ル％含有する水素添加大豆レシチンを水素添加卵黄レシ
チンのかわりに用いる以外は実施例２と同様にして、ヘ
モグロビン含有リポソームを得た。０．１Ｍほう酸緩衝
液（ｐＨｌＯ）中ヘモグロビン濃度で５％に調整した上
記のリポソーム懸濁液１ｍｌに、活性化ＰＥＧ２を１０
０ｍｇ添加し、室温で終夜反応させた。生理食塩水によ
りＩＯ倍に希釈して遠心分離処理（１７．００Ｏｒ．Ｉ
）．ｉｌ．３０分）し、沈澱リポソームを生理食塩水１
４０ｍｌにより、さらに遠心洗浄を２回繰り返した。洗
浄後の沈澱リポソームをヘモグロビン濃度で５％となる
ように生理食塩水中に懸濁させた。このリポソーム懸濁
液０．１２３ ｍｌとクエン酸加ヒト血漿０．５ｍｌを混合し、光学顕
微鏡（４００倍）により観察したところ、１μｍを越え
るリポソーム凝集物はほとんど認められなかった。

実施例　４ モノメトキシＰ　Ｅ　Ｇ５０００　（ユニオンカーバイ
ド．社製）５０ｇを１．２−ジクｏｏエタン２５０ｍｌ
に溶解、無水コハク酸５ｇとピリジン４ｍｌを加えて、
３日間沸点還流した。濾過、エバポレーション後、１０
０ｍｌの蒸留水に溶解し、水相をエーテルで洗浄後クロ
ロホルム１００ｍｌに抽出した。エバポレーション後、
酢酸エチルで再結晶して片末端力ルボキシＰＥＧを得た
。これを７２５ｍｇと水素添加天然ホスファチジルエタ
ノールアミン■ロＯＩＩ＋ｇ，さらにジシクロへキシル
カルボジイミド３０ＩＩｌｇを３０ｍｌのクロロホルム
に溶解、５０℃で終夜反応させた。反応液をヘキサン３
００ｍｌに再沈してアミド結合を介するＰＥＧ結合リン
脂質を得た。これを用いた実施例１および２と同様の実
験で同様の結果を得た。

実施例　５ ポリエチレングリコール（ユニオンカーバイド２４ 社製）５０ｇを、■，２−ジクロ口エタン２５０ｍｌに
溶解し、これに無水コハク酸１０ｇとピリジン８ｍｌを
加えて、３日間沸点還流した。濾過、エバポレーション
後、ＩＯＯｍｌの蒸留水に溶解し、水相をエーテルで洗
浄後、クロロホルム１００ｍｌに抽出した。

エバポレーション後、酢酸エチルで再結晶して両末端カ
ルボキシＰＥＧを得た（数平均分子量４３４０）。これ
を３．００ｇと水素添加天然ホスファチジルエタノール
アミン２．５ｇ，さらに１．１’一カルポニルジイミダ
ゾール２７０■を、３０ｍｌのクロロホルムに溶解し、
５０℃で終夜反応させた。エバポレーション後、エタノ
ール１００ｍｌを加えて加熱溶解した。室温まで放冷し
た後、濾過、エバポレーションした。さらにクロロホル
ム５０ｍｌに溶解後、ジエチルエーテル５００ｍｌに再
沈させ、グラスフィルターで濾集した。真空乾燥後、Ｒ
Ｏ水１ｇに溶解し、０．２μフィルターで濾過した。濾
液を凍結乾燥して、アミド結合を介してＰＥＧ両末端に
リン脂質が結合したＰＥＧ結合リン脂質を得た。

これを用いた実施例１および２と同様の実験で同２５ 様の結果を得た。

試験例 所定濃度の試料を含む被験液０．８ｍｌにヘモグロビン
濃度２．５％の家兎洗浄赤血球０．２ｍｌを添加し、３
７℃で２４時間静置後、３．００Ｏｒ．ｐ．ｉで１０分
間遠心し、上清中のヘモグロビン量を定量して溶血率を
求めた。

結果を表１に示す。

２６ 特開平３ ２１８３０９　（８） 上記の試験の結果から、本発明の蛋白質吸着抑制剤は他
の蛋白質吸着抑制剤に比しては溶血毒性が低いことが明
らかである。また上記の表に示さないポリエチレングリ
コールの両末端にリン脂質を結合した構造の蛋白質吸着
抑制剤についても同様に溶血毒性が低いことが確認され
た。

〔発明の効果〕

以上詳しく説明したように、本発明によればリポソーム
の脂質層に特定の蛋白質吸着抑制剤を含有させることに
よって、血漿中でのリポソームへの蛋白質の吸着を抑制
し、リポソームの凝集を防止したリポソームを提供する
ことができる。

蛋白質吸着抑制剤は疎水性であるリン脂質と親水性高分
子鎖であるポリエチレングリコールの結合体であり、親
水部がリポソームの表面に露出していることによって、
血漿タンパクのリポソームへの吸着が抑制され、その結
果、血漿中でのリポソームの凝集が防止される。従って
、生体の血管内へリポソームを投与した場合でも、リポ
ソームの凝集物が血管内で栓塞して血流を阻害する心配
２８ がなく、特に大量のリポソームを投与する必要がある人
工赤血球として有用性が高い。

さらに、本発明の蛋白質吸着抑制剤はポリエチレングリ
コールと水素添加天然リン脂質との結合体からなり、溶
血毒性が低いという特長を有する。

従って本発明の蛋白質吸着抑制剤は人工赤血球としての
リポソームに特に好適に適用される。

本発明のリポソームの製造方法は、リポソーム形成脂質
と蛋白質吸着抑制剤を予め均一に混合して、得られた混
合脂質を用いて常法によりリポソームを形成させる方法
及び常法により製造されたリポソームの懸濁液に蛋白質
吸着抑制剤を添加する方法であるので、従来知られてい
るリポソームの応用技術のいずれの例にも広く適用する
ことができる。

さらに本発明のリポソーム蛋白質吸着抑制剤を使用する
ことにより、リポソーム形成脂質の永和分散が促進され
、高濃度のヘモグロビン水溶液を用いた場合でも、ヘモ
グロビンカプセル化効率の高い人工赤血球を高い収率で
得ることができる。

２９ 特に、水素添加リン脂質、ステロール類、高級飽和脂肪
酸を混合したリポソーム形成脂質と高濃度のヘモグロビ
ン水溶液を使用する本発明の人工赤血球の製造方法にお
いては、ヘモグロビンカプセル化効率の著しく低い粒径
０．０１ｔｍ〜０．０３ｕｍの人工赤血球は殆ど生成せ
ず、大部分が粒径０．１問以上のヘモグロビンカプセル
化効率の高い人工赤血球となる。

本発明の製造方法で得られるヘモグロビンカプセル化効
率の高い人工赤血球では、人工赤血球懸濁液中のヘモグ
ロビン濃度を高くしても、全脂質濃度は低く抑えること
ができるので、循環血流中へ投与した時の循環動態に与
える悪影響も少なく、また脂質に由来する毒性も低く抑
えることができる。しかも、従来の脂質分散のための手
法はそのまま適用できるので、工業的な人工赤血球の製
造方法として広範に応用し得る極めて優れた方法である
。

３０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
   からなることを特徴とするリポソーム表面への蛋白質吸
   着抑制剤。 ２）ポリエチレングリコールの両末端に水素添加天然リ
   ン脂質が結合しているものである請求項１記載のリポソ
   ーム表面への蛋白質吸着抑制剤。 ３）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
   の水素添加天然リン脂質部分がリポソーム膜を構成する
   脂質層に固定され、ポリエチレングリコール部分がリポ
   ソーム表面から外方向に伸びてなる蛋白質の吸着が抑制
   されたリポソーム。 ４）ポリエチレングリコールの両末端に結合した水素添
   加天然リン脂質がリポソームを構成する脂質層に固定さ
   れ、ポリエチレングリコール部分がループ状にリポソー
   ム表面から外方向に伸びてなる請求項３記載の蛋白質の
   吸着が抑制されたリポソーム。 ５）リポソームの懸濁液に請求項１に記載のリポソーム
   表面への蛋白質吸着抑制剤を添加し、次いで該懸濁液か
   らリポソームを採取することを特徴とする蛋白質の吸着
   が抑制されたリポソームの製法。 ６）請求項１又は２に記載の蛋白質吸着抑制剤をリポソ
   ーム膜構成脂質と均一に混合し、得られた混合物を用い
   てリポソームを形成させることを特徴とする蛋白質の吸
   着が抑制されたリポソームの製法。 ７）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
   がポリエチレングリコール結合水素添加天然ホスファチ
   ジルエタノールアミンである請求項１〜６のいずれかの
   項に記載の蛋白質吸着抑制剤あるいはリポソームもしく
   はその製法。 ８）ポリエチレングリコール結合水素添加天然リン脂質
   からなることを特徴とするリポソーム凝集防止剤。