CN102952894A - 基于颜色的环介导等温扩增技术检测hpv6,11,16,18,52,58 - Google Patents

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马学军
聂凯
罗乐
杨梦婕
李瑾
董小平
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National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
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National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
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Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，***瘤病毒检测网络实验室，哨点医院等用于对以生殖器损伤(生殖器疣和宫颈上皮病变)为主要症状的疑似HPV感染病人的宫颈刮片标本的中国人常见的六种***瘤病毒的检测和监测。具体是应用基因颜色的环介导等温扩增技术(LAMP)，通过生物信息学专业软件分析6种HPV亚型的E6，E7或L1基因的保守序列，设计出每种亚型的六条引物完全与各靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)染料，只需一步就可完成在63℃等温环境中扩增1小时，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果，与传统的PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。

Description

基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV6,11,16,18,52,58
发明领域
本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测中国人常见的6种***瘤病毒(HPV)E6，E7或L1基因。用于各级疾病预防控制机构，HPV检测网络实验室，哨点医院对中国人常见的6种HPV的检测和监测。
发明背景
***在世界妇女癌症中居第二位，全球每年新增病例49.3万，每年死于***的妇女约27万。其中99％***的发生与***瘤病毒感染有关。HPV划分为低危型和高危型。LR-HPV感染会引起人类良性肿瘤和生殖器疣，HR-HPV感染则是引起***的主要原因。中国人常见低危型为6型和11型，常见高危型为16型，18型，52型和58型。
为有效提高我国宫颈普查的质量以及控制我国***的发病率，必须扩大监测网络的覆盖范围，将网络实验室扩大到整个地市一级。目标是使全国300多个地市都具备能够进行宫颈筛查的能力，切实做到早发现、早报告、早治疗。本课题拟建立的基于颜色的可视化LAMP检测中国人常见HPV的方法，具有快速、灵敏和简单操作的特点，无需PCR仪器，无需电泳设备，将为提高我国疾病监测网络实验室和哨点医院对中国人常见HPV的监测能力，实现对HPV感染者的快速筛查提供了有力的技术保障。
基于颜色的LAMP技术在DNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到一小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在63℃等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色沉淀，HNB染料在扩增前加入，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内颜色的变化，可以直接判定检测结果。
发明内容
1.本发明是对目前对中国人常见6种HPV检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在63℃同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求，由于HNB染料在扩增前加入，可以肉眼直接判定检测结果，无需电泳。第四，较PCR缩短了检测所需的时间。
2.分别选择HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV52，HPV58型的E6，E6，E7，L1，E6，L1基因的相对保守区设计相应的LAMP引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(LF、LB)。所有引物的具体序列见表1。
表1：LAMP检测中国人群中6种常见HPV亚型的核苷酸引物序列表
  Primer names   Sequences(5’-3’)
  HPV6E6-F3   CAAATGCCTCCACGTCTG
  HPV6E6-B3   AAATTCTAGGCAGCACGC
  HPV6E6-FIP   ACACAATTAATTTGCAACGTATGCACAACGACCATAGACCAGT
  HPV6E6-BIP   GCACTGACCACTGCAGAGATCTGCATATGGATAGCCGC
  HPV6E6-LF   GATAGATTAAACGTCTTGCAC
  HPV6E6-LB   AACAGCTAAAGGTCCTGTTTCG
  HPV11E6-F3   GTAAAGATGCCTCCACGT
  HPV11E6-B3   TGCAGTTCTAAGCAACAGG
  HPV11E6-FIP   ACTGAATTTGCAGAGTGTGCAAAGGCAACATCCATAGACCAGT
  HPV11E6-BIP   TGCAGGAATGCACTGACCACTTTTGGAAAGTTGTCTCGCCAC
  HPV11E6-LF   AAGATTAAACGTCTTGCAC
  HPV11E6-LB   CGCAGAGATATATGCATATGCCT
  HPV16E7-F3   AGACAACTGATCTCTACTGTT
  HPV16E7-B3   CTTCCAAAGTACGAATGTCTAC
  HPV16E7-FIP   TTCTGCTTGTCCAGCTGGACGCAATTAAATGACAGCTCAGAG
  HPV16E7-BIP   CCGGACAGAGCCCATTACAATGTGTGTGCTTTGTACGCA
  HPV16E7-LF   CATCTATTTCATCCTCCTC
  HPV16E7-LB   TGCAAGTGTGACTCTACGCT
  HPV18L1-F3   CGCGTCCTTTATCACAGG
  HPV18L1-B3   TGGAATCCCCATAAGGATC
  HPV18L1-FIP   GGCACCATATCCAGTATCTACCATAATTGCCCCCCTTTAGAACT
  HPV18L1-BIP TGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCGCAGACATTTGTAAATAA TCAGGAT
  HPV18L1-LF   TCACCATCTTCCAAAACTG
  HPV18L1-LB   ATTGGATATTTGTCAGTCT
  HPV52E6-F3   TTGAGGATCCAGCAACAC
  HPV52E6-B3   GCGTAGGCACATAATACACA
  HPV52E6-FIP   GCACACACTGCAGCCTTATTTCTTTTGACCCTGCACGAATTGTG
  HPV52E6-BIP   AAGAGCTACAACGAAGAGAGGTCGCCATATGGATTATTGTCTC
  HPV52E6-LF   CACCGATTCTTCCAGCACC
  HPV52E6-LB   GTTTCTATTTACAGATTTACG
  HPV58L1-F3   ACAGGGAATGCTTATCTATGG
  HPV58L1-B3   TGTACCAAAGTCCATGCA
  HPV58L1-FIP   GCATTATTGTTACAGGCAACACCTTGTTTAATTGGCTGTAAACCTC
  HPV58L1-BIP   GCTGCTACTGATTGTCCTCCATTCCAAACCCTGTATCTACCAT
  HPV58L1-LF   ACCCCAATGCTCACCAGTG
  HPV58L1-LB   TTCTATTATTGAGGATGG
3.建立了如下的检测过程，详见如下：
(1)合成引物：invitrogen公司合成并经HPLC纯化。
(2)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的DNA。
(3)LAMP反应。
(4)阳性反应结果用肉眼可观察到白色沉淀和颜色从紫色变成天蓝色，也可用650nm的吸光值判定
具体实施方式
实施方案1：基于颜色的LAMP检测人***瘤病毒HPV6，11，16，18，52，58型的特异性
按Qiagen试剂盒说明提取宫颈刮片样本中的病毒DNA。建立如下扩增反应体系：2.5μl Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)、2.5μl dNTP(10mmol/L)、六条引物各1μl(引物浓度为F3与B3：5pmol/μL、BIP与FIP：40pmol/μL、Loop-1与Loop-2：20pmol/μL)、8μl dH2O、1μl Betaine(250mmol/L)、1μlMgSO4(150mmol/L)、1μl HNB(3mmol/L)、1μl Bst DNA聚合酶(8U/μL)、2μl DNA样品。混匀，63℃，水浴1h，80℃，5min终止反应，，观察颜色变化和白色沉淀。只有与引物相对应的HPV亚型有特异性扩增，其他***瘤病毒(HPV6，11，16，18，31，33，39，45，51，52，56，58，59，68)无扩增。
实施方案2：基于颜色的LAMP检测人***瘤病毒HPV6，11，16，18，52，58型的灵敏度
利用F3和B3扩增相应的HPV亚型，然后构建载体pMD-18T-HPVDNA；将载体转化到感受态细胞TOP10扩大培养；用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒并测OD260；计算质粒拷贝数；将质粒梯度稀释。LAMP检测的体系同实施方案1。6种HPV亚型检测的灵敏度均可达到100拷贝的水平。
实施方案3：基于颜色的LAMP检测6种常见HPV的结果可用肉眼(观察颜色变化和白色沉淀)或比色值判定
LAMP反应完成后，用肉眼观察颜色的变化和管底的白色沉淀，也可取20μl测定650nm的吸收值。阳性反应管用肉眼可在管底观察到白色沉淀，管内颜色从反应前的紫色变成了反应后的天蓝色，650nm的吸光值≥0.30。
Figure ISA00000560714500011
Figure ISA00000560714500021
Figure ISA00000560714500031
Figure ISA00000560714500041
Figure ISA00000560714500051
Figure ISA00000560714500061
Figure ISA00000560714500071
Figure ISA00000560714500081

Claims (5)

1.一种用于人生殖器肿瘤和生殖器疣的病原体人***瘤病毒(HPV)E6，E7或L1基因检测的基于HNB颜色的环介导等温扩增技术(LAMP)，其中包括：用于中国人群中6种常见HPV病毒检测的36条寡核苷酸引物和HNB(羟基萘酚蓝)染料。
2.权力要求1所述的中国人群中常见的6种HPV病毒E6，E7或L1基因检测的环介导等温扩增技术(LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求1所述的中国人群中常见的6种HPV病毒E6，E7或L1基因检测的环介导等温扩增技术(LAMP)包括6种HPV病毒及其变异株。
4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，***瘤病毒检测网络实验室，哨点医院用于中国人群中常见的6种HPV病毒的检测和监测。
5.权力要求1所述的中国人群中常见的6种HPV病毒E6，E7或；L1基因检测的基于HNB颜色的环介导等温扩增技术(LAMP)的反应程序和检测程序。
CN 201110242077 2011-08-23 2011-08-23 基于颜色的环介导等温扩增技术检测hpv6,11,16,18,52,58 Pending CN102952894A (zh)

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