CN102946893B - 包含彩色豆提取物的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含彩色豆提取物或所述提取物的馏分的抗血栓组合物。所述抗血栓组合物对于治疗循环***的疾病,包括由血栓形成引起的心脑血管疾病、脑血管疾病、动脉硬化、高血压和糖尿病非常有效。
Description
技术领域
本发明涉及抗血栓组合物,该组合物含有作为活性成分的彩色豆提取物或所述提取物的馏分,所述彩色豆通过水、C1-C5醇或它们的混合物和有机酸提取而得。
背景技术
近年来,由于饮食生活方式的改变和内在和外在压力的增加,中年人和老年人循环***疾病的发展已经增长,并且该增长已经成为一个严重的问题。根据韩国国家***2008年的统计数据,包括动脉硬化、脑出血、中风和脑梗塞的脑血管疾病和心脏病成为除了癌症之外,死亡原因中首要或第二大原因。这些疾病中的最主要的原因是血栓形成,血栓形成是由于血小板过度聚集造成的病理。当血管破损时,血小板被如胶原质、凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)等的激动剂激活,导致血小板附着、分泌和聚集。该过程不仅在止血中,而且在包括血栓形成的循环***疾病的发展中发挥重要作用。
已知一种循环***疾病,冠状动脉疾病是在全球范围内最常见的导致死亡的一种原因。具体地,急性冠脉综合症是一种冠状动脉疾病,它是导致死亡的直接原因。急性冠脉综合征可分为不稳定心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死(NSTE;非Q波MI),以及ST段抬高心肌梗死(STEMI;Q-波MI),因为前两个的治疗和预测相似,因此前两个也统称为NSTEACS(非-ST-抬高型急性冠脉综合征)。在慢性稳定型心绞痛中,局部贫血是由于动脉硬化引起的冠状动脉有效直径的减少引起的,但是急性冠脉综合征具有与上述慢性稳定型心绞痛不同的病理。当由于动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀引起的冠脉内急性血栓形成导致的血流迅速减少或阻塞时,发生急性冠脉综合征。
更具体地,在急性冠脉综合征中,血管内血栓形成的过程与发生创伤性血管损伤之后的止血过程一样。换句话说,当发生脆弱的动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀时,位于内皮细胞下面的***暴露于血液中。血液中的血小板粘附到暴露的***上(血小板附着),所述血小板被机械和生化刺激激活,以分泌TxA2(凝血氧烷A2),ADP(二磷酸腺苷),肾上腺素等(血小板激活)。这些分泌物质激活血小板表面的GPIIb/IIIa受体,且所述激活的GPIIb/IIIa受体使血小板通过纤维蛋白原聚集起来(血小板聚集)。血小板被多种途径激活,但是最终通过GPIIb/IIIa受体,经纤维蛋白原聚集起来,从而该过程为血小板聚集的最终共同途径。产生的主要的血栓形富集在血小板上的“白血栓”,与止血过程中的初级止血对应。
产生的PRT(富血小板血栓)在动脉粥样硬化斑块的受伤部分的血管壁上产生,通常不会完全堵塞冠状动脉(附壁血栓)。这在临床上与NTSEACS对应。在PRT(富血小板血栓)上,通过凝血和连锁反应的激活产生凝血酶(IIa因子)。凝血酶将纤维蛋白原激活至纤维蛋白,当形成含有血细胞,如红细胞的血栓时,被激活的纤维蛋白形成网状组织。所述形成的血栓为“红血栓”,与止血过程的二级止血对应。血栓形成/溶栓溶解平衡继续朝着血栓形成生成的方向进行,血管被完全堵塞,导致STEMI。
抗血栓形成药物可分为用于在初级止血中抑制血小板的抗血小板剂,以及用于在二级止血中抑制凝血的抗凝血剂。抗血小板剂包括阿司匹林,其抑制TxA2的产生;氯吡格雷和噻氯匹定,为ADP受体阻断剂;阿昔单抗,为GPIIb/IIIa受体阻断剂,及类似物。此外,已知茶碱、吗斯酮胺、戊酸丙胺、硝苯吡啶、***等促进cAMP和cGMP,cAMP和cGMP抑制Ca2+的补充。抗凝血剂包括激活抗凝血酶III以降低凝血酶的肝磷脂,直接的凝血酶抑制剂(DTI)水蛭素,维生素K拮抗剂、华法令阻凝剂等等。
然而,上述药物可能产生各种副作用,包括在人体内过度的抑制止血、不育以及消化***疾病。因此,需要开发一种制剂,可明显减低抗血栓形成药物的副作用,同时是安全的。
发明内容
技术问题
本发明的一方面在于提供具有抗血栓形成效果的组合物。
本发明另一方面在于提供具有抗血栓形成效果的药物组合物或健康食品组合物。
技术方案
本发明一方面在于提供一种组合物,所述组合物含有作为活性成分的彩色豆提取物或所述提取物的馏分,所述彩色豆提取物通过水、C1-C5醇或它们的混合物和有机酸提取而得。
有益效果
本发明的组合物具有卓越的抗血栓形成的效果,包含无副作用的天然物质,可广泛用于药物和健康食品领域。
附图说明
图1展示了通过HP-20树脂分馏蚕豆的20%乙醇有机酸提取物得到的50%乙醇馏分的浓度对血小板聚集的抑制效果。
图2展示了用HP-20树脂分馏各种豆的20%乙醇有机酸提取物得到的50%的乙醇馏分口服给药对血栓形成的抑制效果。
图3展示了20%乙醇有机酸提取物、所述提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分和没有使用有机酸的蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分口服给药对血栓形成的抑制效果。
图4展示了用HP-20树脂分馏蚕豆的含有有机酸的20%乙醇提取物得到的50%的乙醇馏分对血栓形成的抑制效果,以所述乙醇馏分的剂量为函数。
具体实施方式
以前对豆类进行的研究在于从豆类中分离并提纯药理学活性成分,对豆类自身的药物用途的研究仍是不足的。此外,通过用高浓度有机溶剂的提取方法提取豆类,该提取方法为通常用于提取天然物质的提取方法。
除了识别出的成分,豆提取物含有几种未知成分,这些成分中的一些可抑制对人体有益的药理效果。此外,豆类的有用成分也不能被使用高浓度有机溶剂的提取方法提取出。与通常用于天然物质和药草的提取方法不同,本发明人已经利用水或低浓度有机溶剂作为提取溶剂,从豆类中得到了提取物,并发现用树脂分馏所获得的豆提取物得到的馏分表现了强有力的抗血栓形成的效果。
根据本发明一方面的组合物,其特征在于,它含有利用水或低浓度有机溶剂和有机酸得到的豆提取物的馏分。根据本发明的一方面的组合物可以是抗血栓组合物,含有利用水、C1-C5醇或它们的混合物和有机酸得到的彩色豆提取物。根据本发明的一方面的组合物可以是抗血栓组合物,含有利用水、C1-C5醇或它们的混合物和有机酸得到的彩色豆提取物的馏分。
在本发明的一个实施例中,所述有机酸可以是选自以下的一种或多种物质:柠檬酸、乙酸、丁酸、棕榈酸、草酸、酒石酸、羧酸和磺酸。更具体地,所述有机酸可以是柠檬酸。当所述有机酸与所述低浓度有机溶剂一起用于从彩色豆中提取活性成分时,可提高从豆类中的提取效率,以及可提高对所述活性成分的选择性。
在本发明的一个实施例中,所述有机溶剂不受具体限制,可以是C1-C5低级醇。所述C1-C5低级醇可以是,例如选自以下的任意一种或两种或多种的混合物:甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇和异丁醇。具体地,所述C1-C5低级醇可以是乙醇。
在本发明的另一个实施例中,所述C1-C5低级醇的体积浓度为1-70%(v/v),优选1-40%(v/v),更优选5-25%(v/v),更优选7-20%(v/v)。例如,所述溶剂可以是体积浓度为5-25%(v/v)乙醇,更优选为10%或20%(v/v)的乙醇。
在本发明中,用水或低浓度低级醇及有机酸提取豆。本发明人已经进行了各种研究,并重复测试,最终发现在各种有机溶剂中,利用低级醇,如乙醇,特别是低浓度乙醇与有机酸一起提取得到的彩色豆可有效改善血液循环,预防并治疗肥胖及糖尿病,且对预防和治疗高血脂具有卓越的效果,从而完成了本发明。
在本发明的一个实施例中,所述彩色豆提取物为用水、C1-C5醇或它们的混合物和有机酸得到的提取物,所述提取物的馏分为通过树脂从所述彩色豆提取物分离得到的馏分,或者用丁醇分馏所述彩色豆提取物得到的馏分。所述树脂馏分为,例如利用包含苯和聚苯乙烯聚合物的合成吸附柱分馏得到的馏分,更具体地为HP-20树脂馏分。本发明人进行了测试,从通过低浓度乙醇得到的彩色豆提取物中提取各种馏分,作为典型实施例。结果发现与水馏分相比,HP-20树脂馏分或丁醇馏分具有卓越的抗血栓形成效果。
文中使用的术语“彩色豆”指的至其外壳为深颜色的豆类,包括黑色、红色、黄色和绿色。所述彩色豆可以为选在以下的一种或多种豆:“霜太”黑豆(GlycinemaxMERR,黑豆的一个品种)、“鼠目太”黑豆(RhynchosiaNolubilis,黑豆的一个品种)、蓝豆(GlycinemaxMERR)、黄豆(GlycinemaxMERR)、蚕豆(PhaseolusvulgarisL.)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、黑白斑豆(PhaseolusvulgarisL.)、小红豆(Vignaangularis)、小黑豆(PhaseolusangularisW.F.WIGHT.)、发芽的豆(Glycinemax(L.)Merr.)、大豆(Glycinemax)和黑大豆(Glycinemax(L.)Merr.)。在本发明的一个实施例中,所述彩色豆可以是蚕豆。所述彩色豆可以根据其地区、分类、俗称等各种方式命名。本文中所使用的术语“彩色豆提取物”统称为通过各种提取方法从彩色豆中提取的物质,包括,例如利用水和有机溶剂提取的物质。所述提取物可包括各种馏分(例如,HP-20树脂馏分)。
本发明的含有所述彩色豆提取物馏分的组合物具有抑制血小板聚集,从而抑制血栓形成的效果,并具有抑制血管收缩,从而诱发血管舒张的效果。由于这些效果,本发明的所述组合物可有效改善血液循环,并可有效用于预防和治疗肥胖、糖尿病和高血脂。
本发明一方面在于提供一种药物组合物,该药物组合物包括作为活性成分的上述组合物。在本发明的一个实施例中,所述药物组合物可以是用于预防、缓解或治疗血管疾病的组合物。含有本发明所述组合物的所述药物组合物具有预防血栓形成、抑制血管收缩和抑制胆固醇的效果。具体地,所述药物组合物可以是通过抗血栓形成活性来改善血管循环的药物组合物,可以是用于缓解或治疗包括肥胖、糖尿病和高血脂的血管疾病的药物组合物。例如,所述血管疾病包括肥胖、糖尿病、中风、脑出血、动脉硬化、心绞痛、心肌梗死、高血压、贫血、偏头疼或高血脂。
当本发明的所述组合物用于药物时,可通过使用传统无机或无机载体将其制成液体、半固体或固体剂型,用于口服或肠胃外给药。
例如,用于口服给药的剂型包括片剂、丸剂、颗粒剂、软胶囊或硬胶囊、粉剂、细粉剂、乳剂、糖浆、小丸剂等。例如,用于肠胃外给药的剂型包括注射溶液、滴剂、软膏、洗剂、喷剂、悬浮剂、栓剂等。根据传统方法可容易的制备本发明的所述活性成分,表面活性剂、辅剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂和其它传统添加剂可适用于所述剂型。
本发明的所述药物组合物可通过口服给药、肠胃外给药、直肠给药、局部给药、经皮给药、静脉注射、肌肉注射、腹腔给药或皮下给药。
此外,根据包括年龄、性别和待治疗的受试者的体重,待治疗的具体疾病或生理状况,生理状况的严重程度,给药途径,以及医生的判断等各种因素,所述活性成分的剂量将有所不同。剂量的确定基于本领域技术人员了解的因素。所述活性成分的给药剂量一般可以是0.001mg/kg/天至2000mg/kg/天,优选0.5mg/kg/天之1500mg/kg/天,但是不限于此。
本发明的一方面在于提供含有作为活性成分的本发明所述的组合物的食品添加剂、功能食品或健康食品组合物。在本发明的一个实施例中,含有作为活性成分的本发明所述的组合物的所述食品添加剂、功能食品组合物或健康食品组合物可以是用于改善血液循环的组合物,可以是用于预防或缓解包括肥胖、糖尿病或高血脂等的血管疾病的组合物。例如,所述血管疾病包括肥胖、糖尿病、中风、脑出血、动脉硬化、心绞痛、心肌梗死、高血压、贫血、偏头疼或高血脂。
例如,含有本发明所述的组合物的食品添加剂或功能食品包括发酵牛奶、乳酪、酸奶、果汁、益生菌、保健品食品等等。
在本发明的一个实施例中,所述组合物可以含有其它可改善本发明效果的成分,只要该成分不损害本发明的效果。例如,本发明的所述组合物还可含有添加剂,包括香味剂、天然色素、杀菌剂、抗氧化剂、防腐剂、湿润剂、增稠剂、无机盐、乳化剂和合成聚合物。此外,本发明的所述组合物还可包括辅助成分,包括水溶性维生素、油溶性维生素、聚合物肽、多糖和海藻提取物。本领域技术人员可根据所述组合物的剂型和使用目的容易地对上述成分进行合适地选择,且可在不损害本发明效果的范围内选择添加含量。例如,上述成分可添加的含量为占所述组合物总质量的0.01-5wt%,优选0.01-3wt%。
本发明的所述组合物可被制成各种剂型,包括溶液、乳剂、粘胶纤维混合物、片剂和粉剂,可通过各种方法进行给药,包括样品饮用、注射、喷雾或挤出。
在下文中,参考实施例和测试实施例,将进一步详细描述本发明。但是可以理解,这些实施例和测试实施例用作解释目的,而不是用于限制本发明的范围。
实施例1:使用20%的乙醇和有机酸制备“霜太”黑豆(Seoritae)提取物
将1Kg的干“霜太”黑豆浸入5L含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例2:使用20%的乙醇和有机酸制备“鼠目太”黑豆(Seomoktae)提取物
将1Kg的干鼠目太黑豆浸入5L含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例3:使用20%的乙醇和有机酸制备菜豆提取物
将300g的干菜豆浸入1.5L含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例4:使用20%的乙醇和有机酸制备黑白斑豆提取物
将300g的干黑白斑豆浸入1.5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例5:使用20%的乙醇和有机酸制备发芽的豆提取物
将300g的干的发芽的豆浸入1.5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例6:使用20%的乙醇和有机酸制备黄豆提取物
将300g的干黄豆浸入1.5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例7:使用20%的乙醇和有机酸制备蓝豆提取物
将300g的干蓝豆浸入1.5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例8:使用20%的乙醇和有机酸制备蚕豆提取物
将1Kg的干蚕豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例9:使用20%的乙醇和有机酸制备大豆提取物
将1Kg的干大豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例10:使用20%的乙醇和有机酸制备小黑豆提取物
将300g的干小黑豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例11:使用20%的乙醇和有机酸制备小红豆提取物
将300g的干小红豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例12:使用20%的乙醇和有机酸制备黑大豆提取物
将300g的干黑大豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇水溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备粉末样品(产率:3-15%)。将所制的粉末储存在低温下,直至使用。
实施例13:用HP-20树脂分离出“霜太”黑豆提取物
将1Kg的干“霜太”黑豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备20%的乙醇提取物样品。使用疏水性树脂DIAIONHP-20(SUPELCO),按照以下的方法从所述“霜太”黑豆的20%乙醇有机酸提取物中得到树脂馏分。
为了通过HP-20树脂分离,将HP-20树脂装入长度为30cm的柱内,然后用500ml的乙醇洗两次,500ml的50%的乙醇洗两次,500ml的蒸馏水洗两次。将6g所述“霜太”黑豆的20%的乙醇有机酸提取物溶解于水中,并加入所述HP-20树脂填充柱内,然后将750ml的蒸馏水,750ml的50%的乙醇和500ml的乙醇顺序注入所述柱内,当每种所述溶剂从所述柱内排出时,被接收到250ml的锥形瓶中。减压浓缩所述每种排出的溶剂,并冷冻干燥,从而得到馏分样品。
实施例14:用HP-20树脂分离出蚕豆提取物
将1Kg的干蚕豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备20%的乙醇提取物样品。使用疏水性树脂DIAIONHP-20(SUPELCO),按照以下的方法从所述蚕豆的20%乙醇有机酸提取物中得到树脂馏分。
为了通过HP-20树脂分离,将HP-20树脂装入长度为30cm的柱内,然后用500ml的乙醇洗两次,500ml的50%的乙醇洗两次,500ml的蒸馏水洗两次。将6g所述蚕豆的20%的乙醇有机酸提取物溶解于水中,并加入所述HP-20树脂填充柱内,然后将750ml的蒸馏水,750ml的50%的乙醇和500ml的乙醇顺序注入所述柱内,当每种所述溶剂从所述柱内排出时,被接收到250ml的锥形瓶中。减压浓缩所述每种排出的溶剂,并冷冻干燥,从而得到馏分样品。
实施例15:用HP-20树脂分离出菜豆提取物
将1Kg的干菜豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备20%的乙醇提取物样品。使用疏水性树脂DIAIONHP-20(SUPELCO),按照以下的方法从所述菜豆的20%乙醇有机酸提取物中得到树脂馏分。
为了通过HP-20树脂分离,将HP-20树脂装入长度为30cm的柱内,然后用500ml的乙醇洗两次,500ml的50%的乙醇洗两次,500ml的蒸馏水洗两次。将6g所述菜豆的20%的乙醇有机酸提取物溶解于水中,并加入所述HP-20树脂填充柱内,然后将750ml的蒸馏水,750ml的50%的乙醇和500ml的乙醇顺序注入所述柱内,当每种所述溶剂从所述柱内排出时,被接收到250ml的锥形瓶中。减压浓缩所述每种排出的溶剂,并冷冻干燥,从而得到馏分样品。
实施例16:用HP-20树脂分离出大豆提取物
将1Kg的干大豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备20%的乙醇提取物样品。使用疏水性树脂DIAIONHP-20(SUPELCO),按照以下的方法从所述大豆的20%乙醇有机酸提取物中得到树脂馏分。
为了通过HP-20树脂分离,将HP-20树脂装入长度为30cm的柱内,然后用500ml的乙醇洗两次,500ml的50%的乙醇洗两次,500ml的蒸馏水洗两次。将6g所述大豆的20%的乙醇有机酸提取物溶解于水中,并加入所述HP-20树脂填充柱内,然后将750ml的蒸馏水,750ml的50%的乙醇和500ml的乙醇顺序注入所述柱内,当每种所述溶剂从所述柱内排出时,被接收到250ml的锥形瓶中。减压浓缩所述每种排出的溶剂,并冷冻干燥,从而得到馏分样品。
实施例17:用HP-20树脂分离出“鼠目太”黑豆提取物
将1Kg的干“鼠目太”黑豆浸入5L的含有1%的柠檬酸的20%的乙醇溶液中,并在60℃下回流提取3小时,将所述提取物在室温下静置预定时间。然后,过滤所述提取物,减压浓缩并冷冻干燥,从而制备20%的乙醇提取物样品。使用疏水性树脂DIAIONHP-20(SUPELCO),按照以下的方法从所述“鼠目太”黑豆的20%乙醇有机酸提取物中得到树脂馏分。
为了通过HP-20树脂分离,将HP-20树脂装入长度为30cm的柱内,然后用500ml的乙醇洗两次,500ml的50%的乙醇洗两次,500ml的蒸馏水洗两次。将6g所述“鼠目太”黑豆的20%的乙醇有机酸提取物溶解于水中,并加入所述HP-20树脂填充柱内,然后将750ml的蒸馏水,750ml的50%的乙醇和500ml的乙醇顺序注入所述柱内,当每种所述溶剂从所述柱内排出时,被接收到250ml的锥形瓶中。减压浓缩所述每种排出的溶剂,并冷冻干燥,从而得到馏分样品。
实施例18:蚕豆提取物的溶剂分馏
将实施例8所得的10.18g的蚕豆的20%的乙醇有机酸提取物溶解于100ml的蒸馏水中,然后经分液漏斗用100ml的乙酸乙酯(EtOAc)提取两次。用100ml的正丁醇(n-BuOH)将该剩余的水层提取两次。减压浓缩每种所得的乙酸乙酯(EtOAc)层、正丁醇(n-BuOH)层和水层,并冷冻干燥,从而制备样品。所述乙酸乙酯(EtOAc)层的产率为4.62%,正丁醇(n-BuOH)层的产率为6.58%,所述水层的产率为8.88%,将所述样品低温保存直至使用。
测试实施例1:对由于胶原质诱导的人体血小板聚集的抑制作用的观察
为了检查随提取溶剂中乙醇含量的改变,提取物活性的变化,利用蚕豆提取物进行如下测试,该蚕豆提取物通过具有不同的水和乙醇含量的提取溶剂提取而得。
为了分离人体富血小板血浆(PRP),使用3.2%柠檬酸钠作为抗凝结剂,然后从2周或更长时间没有使用过药物的健康人的血管中采集血液。将150g所述采集的血液离心15分钟,收集上清液(PRP),并将剩余物离心,以分离贫血小板血浆(PPP)。用细胞计数器计算在所述收集的PRP中的血小板,并用PPP将PRP稀释至浓度为3x108血小板/ml,用于测试中。
使用冷光血小板凝集仪(Chrono-LogCo.,美国)基于吸收率的改变,测定血小板聚集的活性。将PRP在37℃下的热混合器中预孵化2分钟,然后将浓度为200μg/ml的蚕豆提取物加入所述预孵化的PRP,并孵化7分钟。将500μl所述孵化的PRP加入聚硅氧烷涂覆的反应杯中孵化3分钟,用于血小板聚集。然后,加入最低浓度为1-3μg/ml的胶原质,作为血小板聚集诱导剂,在该浓度下可产生最大化的血小板聚集。之后观察该反应6分钟。观察的结果以相对于仅使用胶原质处理的对照组的血小板聚集抑制率(0%)的血小板聚集抑制率(%)形式展示于下表1中。
[表1]
样品 | 抑制率(%) |
水有机酸提取物 | 39.3 |
10%乙醇有机酸提取物 | 53.5 |
20%乙醇有机酸提取物 | 63.7 |
30%乙醇有机酸提取物 | 17.3 |
40%乙醇有机酸提取物 | 9.3 |
50%乙醇有机酸提取物 | 6.0 |
70%乙醇有机酸提取物 | 1.0 |
从上表1中可以看出,与其它提取物相比,水、10%和20%的乙醇提取物展示了卓越的血小板聚集抑制效果。其中,20%的乙醇提取物展示了最好的血小板聚集抑制效果,用于以下测试中。
测试实例2:观察各种豆类对人体血小板聚集的抑制效果
在同样的条件下制备的所述20%乙醇有机酸提取物展示了最好的活性,进行下面测试,以检查是否各种豆类具有血小板聚集抑制效果。用于该测试的所述豆类均为在韩国生产的。
对小黑豆、大豆、“霜太”黑豆、“鼠目太”黑豆、蚕豆、菜豆、黑白斑豆、小红豆、蓝豆、发芽的豆、黄豆和黑大豆进行所述测试。根据实施例中所述的方法提取所述豆类。此外,为了观察所述提取物对血小板聚集的抑制效果,使用200μg/ml所述每种豆的20%的乙醇有机酸提取物在与测试实施例1相同的条件下进行所述测试。测试结果以血小板聚集聚集抑制率形式展示于下表2中。
[表2]
样品 | 抑制率(%) |
小黑豆 | 5.0 |
大豆 | 32.3 |
“鼠目太”黑豆 | 27.7 |
“霜太”黑豆 | 12.0 |
蚕豆 | 63.7 |
菜豆 | 24.0 |
黑白斑豆 | 15.0 |
小红豆 | 7.0 |
蓝豆 | 12.5 |
发芽的豆 | 25.0 |
黄豆 | 7.0 |
黑大豆 | 11.5 |
从上表2可以看出,蚕豆提取物具有最好的血小板聚集抑制效果。
测试实施例3:每种豆提取物的馏分对血小板聚集的抑制活性
在相同条件下制备的20%的乙醇有机酸提取物展示了最好的活性,根据实施例中描述的方法,用HP-20树脂对各种豆类的提取物进行分馏。
在与测试实施例1相同的条件下,使用200μg/ml的水馏分(下文中称为“HP-20树脂水馏分”)和50%的乙醇馏分(下文中称为“HP-20树脂50%乙醇馏分”),它们通过分馏所述每种豆的20%的乙醇有机酸提取物而得到。该测试的结果以血小板聚集抑制率(%)展示于下表3。
[表3]
从上表3可以看出,在所有豆类中,与HP-20树脂水馏分相比,HP-20树脂50%的乙醇提取物展示了明显优越的血小板聚集的抑制效果,且所述活性成分大部分集中于HP-20树脂50%乙醇馏分。该活性为浓度依赖性的,图1展示了蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分的血小板聚集抑制效果。
测试实施例4:对每种血小板聚集刺激源的特殊抑制活性的观察
为了检查展示出最高抑制活性的、每种豆20%的乙醇提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分是否具体地抑制每种血小板聚集刺激源,进行下面的测试。
当血管破损,破损部位的内皮细胞层也将破损,血管暴露于胶原质,血小板分泌ADP(二磷酸腺苷)以及凝血酶。已知这些物质刺激血小板聚集。因此,为了检查所述HP-20树脂乙醇50%乙醇馏分是否具体地抑制由于ADP和凝血酶引起的血小板聚集活性,以与测试实施例相同的方式进行测试,除了ADP和凝血酶刺激剂是施加的,而不是胶原质刺激的。测试结果以血小板聚集的抑制率(%)展示于下表4中。
[表4]
ADP | 凝血酶 | |
大豆 | 66.3 | 45.39 --> |
“鼠目太”黑豆 | 79.3 | 62.7 |
“霜太”黑豆 | 44.0 | 34.3 |
蚕豆 | 92.0 | 74.3 |
菜豆 | 74.0 | 46.0 |
从表4可以看出,所述HP-20树脂50%乙醇馏分不仅对胶原质诱导的血小板聚集表现出抑制效果,而且对其它刺激剂,如ADP和凝血酶诱导的血小板聚集表现出抑制效果。具体地,所述“鼠目太”黑豆(Seomoktae)和蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分具有较好的血小板聚集抑制效果。
测试实施例5:对蚕豆提取物的每种馏分对人体血小板聚集的抑制效果的观察
为了确定所述蚕豆提取物的溶剂馏分中展示最高活性的溶剂馏分,进行以下测试,所述蚕豆提取物在所述豆提取物中表现了最好的活性。
首先,根据实施例18的方法制备所述蚕豆提取物的乙酸乙酯馏分、丁醇馏分和水馏分。为了检查每种馏分的血小板聚集抑制效果,使用200μg/ml的每种馏分在与测试实施例1相同的条件下进行测试。测试结果以血小板聚集抑制率(%)展示于表5中。
[表5]
乙酸乙酯馏分 | 丁醇馏分 | 水馏分 | |
蚕豆 | 23.0 | 86.5 | 23.5 |
从上表5中可以看出,所述血小板聚集活性在所述丁醇馏分中最高,在所述乙酸乙酯馏分和所述水馏分中类似。这表明,低浓度的蚕豆的乙醇提取物对血小板聚集的抑制效果是由于所述丁醇馏分所含有的活性成分。
测试实施例6:对丁醇馏分对每种血小板聚集刺激源活性的抑制效果的观察
为了检查是否所述蚕豆提取物的丁醇馏分具体地抑制每种血小板聚集刺激源的活性,以与测试实施例4相同的方式对ADP和凝血酶的刺激进行测试。在该测试中,使用浓度为200μg/ml的丁醇馏分。测试的结果以血小板聚集抑制率(%)展示于下表6中。
[表6]
ADP | 凝血酶 |
66.0 | 63.5 |
从上表6中可以看出,所述蚕豆提取物的丁醇馏分不仅抑制胶原质诱导的血小板聚集,而且抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集。
测试实施例7:馏分对血小板聚集后的活化物质分泌的抑制效果的观察
为了检查每种豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分对血小板聚集后,凝血氧烷的生成的抑制效果,将400μg/ml的每种馏分样品加入测试实施例1中得到的PRP,并在37℃下孵化10分钟,然后加入5μg/ml的胶原质,并使其反应6分钟。向其中加入2mMEDTA和50μM消炎痛,以停止所述反应。将最终所得的反应液在2000xg条件下,离心20分钟,提取上清液。通过酶免疫分析法确定所述上清液中凝血氧烷的量。测试结果以凝血氧烷的生成抑制率(%)展示于下表7中。
[表7]
抑制率(%) | |
大豆 | 36.9 |
“鼠目太”黑豆 | 52.7 |
“霜太”黑豆 | 24.5 |
蚕豆 | 44.8 |
菜豆 | 36.7 |
蚕豆的丁醇馏分 | 40.5 |
从上表7中可以看出,每种豆的所述HP-20树脂50%的乙醇馏分,以及每种豆的丁醇馏分都可抑制血小板聚集之后凝血氧烷的生成。
测试实施例8:对SD大鼠的静脉血栓形成的抑制效果的观察
为了检查所述“霜太”黑豆、蚕豆、“鼠目太”黑豆和大豆提取物的馏分在体内给药时是否表现出对血栓形成的抑制效果,进行以下测试。对体重为220-250g的雄性SD(SpragueDawley)大鼠进行静脉血栓形成测试。
将200mg的每种馏分的盐溶液以10ml/kg的剂量给药至SD大鼠。给药所述馏分1小时后,通过腹内给药12.5g/kg的氨基甲酸酯,对所述大鼠进行麻醉,然后打开腹部,去除脂肪组织,从而尾部下腔静脉暴露出。以周围血管不会受到损伤的方式,小心地移除脂肪组织。用3μl的5%FeCl3溶液润湿滤纸(2mmx4mm),并将其应用至所述尾部下腔静脉5分钟,然后移除。30分钟后,将含有血栓的尾部下腔静脉扎成12mm长,并切除。之后将血栓块放置于盐水中,脱水,测量其重量。测试结果如图2所示。
从图2中可以看出,当口服给药剂量为200mg/kg时,所述“霜太”黑豆和蚕豆的HP-20树脂乙醇馏分明显抑制血栓形成。
以与上述相同的方式,对蚕豆的20%乙醇有机酸提取物、所述提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分、以及没有使用有机酸的蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分。测试结果展示于如图3。从图3可以看出,当口服给药剂量为200mg/kg时,所述蚕豆提取物的20%的乙醇有机酸提取物,和所述提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分明显抑制血栓形成。
最后,以上述相同的方式,对100mg/kg和200mg/kg的蚕豆的20%的乙醇提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分,以及2.5mg/kg的商用抗血栓形成剂氯吡格雷进行测试。溶剂(不含有所述活性成分)用作阴性对照组。测试结果展示于图4。从图4可以看出,与阴性对照组相比,所述蚕豆的20%的乙醇提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分以浓度依赖性的方式抑制血栓形成。在它们之中,200mg/kg的蚕豆的20%的乙醇提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分表现出与2.5mg/kg的氯吡格雷相似的效果。因此,可以看出所述蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分可以作为优良的抗血栓形成剂。
测试实施例9:对从SD大鼠分离出的血小板聚集的抑制效果的观察
为了检查所述蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分,以及大豆(通常作为食品)提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分是否对从大鼠分离出的血小板聚集具有抑制效果,按照与测试实施例1相同的方式,使用15μg/ml的胶原质进行测试。测试结果以血小板聚集抑制率(%)展示于下表8中。
[表8]
抑制率(%) | |
大豆 | 96 |
蚕豆 | 98 |
蚕豆的丁醇馏分 | 98 |
从表8中可以看出,所述蚕豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分,所述蚕豆提取物的丁醇馏分,以及所述大豆提取物的HP-20树脂50%乙醇馏分都表现了对大鼠的血小板聚集的优良的抑制效果。
Claims (9)
1.用柠檬酸与5-25%(v/v)乙醇的混合物提取而得的彩色豆提取物在制备抗血栓组合物中的用途,
其中,所述彩色豆选自以下一种或几种豆:、“鼠目太”黑豆、菜豆、小红豆、小黑豆和大豆。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述大豆为选自“霜太”黑豆、蓝豆、黄豆和黑大豆中的一种或多种豆,且所述菜豆为选自蚕豆和黑白斑豆中的一种或多种豆。
3.含有彩色豆提取物的树脂馏分的抗血栓组合物,所述彩色豆提取物是用柠檬酸与5-25%(v/v)乙醇的混合物提取而得的,
其中,所述彩色豆选自以下一种或几种豆:“鼠目太”黑豆、菜豆、小红豆、小黑豆和大豆,且
所述树脂馏分为通过利用含有苯和聚苯乙烯的聚合物的合成吸附柱分馏彩色豆提取物得到的馏分。
4.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述大豆为选自“霜太”黑豆、蓝豆、黄豆和黑大豆中的一种或多种豆,且所述菜豆为选自蚕豆和黑白斑豆中的一种或多种豆。
5.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述馏分为通过用丁醇分馏所述彩色豆提取物得到的馏分。
6.根据权利要求3所述的作为活性成分的组合物在制备用于缓解或治疗血管疾病的药物组合物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述血管疾病为肥胖、糖尿病、中风、脑出血、动脉硬化、心绞痛、心肌梗死、高血压、贫血、偏头痛或高血脂。
8.根据权利要求3的作为活性成分的所述组合物在制备用于预防或缓解血管疾病的健康食品组合物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述血管疾病为肥胖、糖尿病、中风、脑出血、动脉硬化、心绞痛、心肌梗死、高血压、贫血、偏头痛或高血脂。
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