CN102944622B - 菊芋果聚糖的提取与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测领域,涉及一种菊芋果聚糖的提取与检测方法。发明者在菊芋植物样品提取中,采用GRACE公司的GracePureTM SPE C18-Max柱进行样品过滤,该柱可以去除水溶液中的极性物质,几乎对糖分无吸附,可有效的降低检测的背景。采用普通HPLC仪器,但选用对糖份分离非常好的GRACE公司PREVAIL Carbohydrate ES专用糖柱,该糖柱为聚苯乙烯一二乙烯基苯键合的氨基糖柱,不存在困扰其他氨基柱的问题,没有化学降解现象,且在室温及梯度洗脱的情况下亦很稳定;糖分检测采用ELSD检测器,首次建立了一整套菊芋植物样品果聚糖的提取和检测流程。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域,涉及一种菊芋果聚糖的提取与检测方法。
背景技术
植物果聚糖主要是由多个果糖基通过糖苷键连接而成的一类水溶性的碳水化合物的总称。虽然15%的被子植物中均能发现果聚糖,但植物体中果聚糖的总量一般较低,只有在菊芋(Helianthus tuberosus,也称为鬼子姜,洋姜)的块茎;菊苣(Cichoriumintybus)、牛蒡(Arctium lappal)和鸡脚草(Dactylis glomeratus)的根;百合(Liliumbrownii)和洋葱(Allium cepa)的球茎;黑麦草(Lolium perenne)、大麦(Hordeumvulgare)和小麦(Triticum aestivum)茎叶等少数几种植物的组织中含量相对较高(VanLaere and Van Den Ende,2002;Ritsema and Smeekens,2003a)。
从菊芋块茎中提取的菊粉(Inulin)是果聚糖的一种,基本由果糖基通过β(2-1)键连接,末端存在一个葡萄糖基。菊芋中的菊粉的聚合度在3~50之间,其聚合度就是果糖基的数目(Van Der Meer et al.,1998)。菊芋的菊粉就是不同聚合度的果聚糖混合而成的。菊粉最大可以占到菊芋块茎鲜重的20%或者干重的90%(Van den Ende et al.,2004)。
果聚糖是一类非常有益于人类健康的可溶性碳水化合物。由于人体不含分解果聚糖的酶,因此人类本身不能消化吸收果聚糖,而是通过果聚糖进入结肠后,成为肠道菌群的营养物质,选择性地促进肠道中双歧杆菌和乳酸菌的生长而进行消化吸收。同时这些益生细菌的生长又可减少与人体肿瘤发生有关物质的产生。此外,短链的果聚糖作为一种低热量的甜味成分,可作为糖类或脂类替代物被用在酸奶和冰激凌等中,也可用于糖尿病患者的特殊食品中(李兴军,2010)。
由于菊芋尤其是块茎中的果聚糖含量较高,经济价值高,但成分复杂,不同聚合度的果聚糖混合在一起,不同成分的果聚糖的功能不同,因此分离并检测这些果聚糖成分就显得尤为重要。
由于传统分光光度计或者薄层层析的方法只能检测植物水溶性总糖或者极少数几个糖类,在检测植物多种糖分中用的不多。目前检测植物中多种糖类的方法基本是用高效液相色谱法(HPLC)。HPLC具体方法中又可以分为两类:一类是普通的HPLC法,通过采用示差检测器(RID)或者蒸发光检测器(ELSD)来检测,例如采用RID检测器检测低聚糖中的果糖以及三糖四糖(蒋世琼,1996),检测菊芋中高聚合度果聚糖(聚合度高于6)(孙雪梅等,2011)等,采用ELSD检测器检测烟草中单糖或二糖(孙雨安,2004;程勇,2010);一类是相对特殊的色谱-离子色谱法(HPAEC),主要采用脉冲安培检测器(PAD)等,例如检测烟草中的葡萄糖等小分子单糖(徐祎然等,2010),检测大豆中的单糖和蔗糖和蜜二糖等二糖或者三糖等(李仁勇等,2009),PAD检测器理论上可检测皮克级的糖类。
虽然离子色谱检测植物糖类的检测下限理论上比普通HPLC低,但由于离子色谱仪器体系中流动相为强酸强碱,仪器价格普遍较贵,基本是传统HPLC价格的2倍~3倍。平时使用中对流动相水的要求极高,日常使用维持成本也较高。此外PAD检测器的多功能性不强,糖类的检测会在电极表面上对某些分子产生氧化或还原。由于传统HPLC使用范围和对象比离子色谱大的多,有机的非极性、极性及离子化合物都可以,而离子色谱目前主要用于无机离子的分析,及少量有机离子化合物的分析。因此,作为分析仪器使用中应用最为广泛的HPLC,如何利用普通HPLC建立一个高效分离并检测植物果聚糖的方法就显得尤其重要。
在传统HPLC中,虽然RID检测器也可以用于检测糖类物质,但RID检测器是基于连续测定色谱柱流出物折射率的变化,仅适用于紫外(UV)吸收很弱的糖类的测定;同时RID对温度极其敏感使得基线很不稳定,与梯度洗脱不相容,且检测灵敏度很低。因此,RID用于检测糖类物质存在相当的限制。
虽然以前的研究也有利用HPLC-ELSD法测定植物中的糖类物质,但存在一定的缺陷,具体体现在(一):部分研究使用普通的硅胶基氨基柱,该柱耐用性不强(因水分可引起氨基固定相的自身水解),柱子的寿命不长。同时样品提取中,简单的进行加热和离心,非糖类物质对于检测有干扰;(二):以前的研究对小分子的单糖二糖或糖醇等分析检测较多,对于寡聚糖和多聚合度的糖的研究较少。菊芋组织中葡萄糖,果糖,蔗糖,以及寡果聚糖含量较高,其它糖分很少或者几乎没有;(三)对于果聚糖含量较高的植物例如菊芋等检测较少,对烟草大豆等植物检测较多。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷,提供一种菊芋果聚糖的提取与检测方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
菊芋果聚糖的提取与检测方法,包含以下步骤:
(1)菊芋组织可溶性总糖的提取与纯化:
a菊芋组织鲜样于烘箱中70~80℃下恒温烘40~55h,
b组织样品研磨后,与去离子水按1:2~5的质量体积比混匀,放进100℃的水浴锅中15~25分钟,反复抽提3~5次,收集三次提取的所有溶液以去除蛋白,
c将b中所得的溶液过滤,滤液8000~12000g离心20~30分钟,收集上清,
d上步获得的滤液过固相萃提柱GracePureTM SPE C18-Max,
e滤液过0.45μm水相滤膜过滤,作为下一步HPLC的样品;
(2)菊芋果聚糖的检测:上一步制备的样品通过HPLC检测,检测条件如下:
色谱柱:PrevailTM Carbohydrate ES Coloumn-W250*46mm 5um;
检测器:蒸发光检测器ELSD,Alltech 3300;
进样量为10ul;
流速为1ml/min,每次样品的运行时间为55min,
流动相:B相:水,C相:乙腈;
洗脱方式:梯度洗脱,洗脱程序如表1所示:
表1
时间(min) | %B | %C | |
1 | 0 | 25 | 75 |
2 | 15 | 35 | 65 |
3 | 30 | 50 | 50 |
4 | 40 | 50 | 50 |
5 | 42 | 25 | 75 |
6 | 55 | 25 | 75 |
表中的“%”表示体积百分含量。
所述的菊芋组织可溶性总糖的提取与纯化优选包含:
a菊芋组织鲜样于烘箱中80℃下恒温烘48h,
b组织样品研磨后,与去离子水按1:3的质量体积比混匀,放进100℃的水浴锅中20分钟,反复抽提3次,收集三次提取的所有溶液以去除蛋白,
c将b中所得的溶液过滤,滤液10000g离心20分钟,收集上清,
d上步获得的滤液过固相萃提柱GracePureTM SPE C18-Max,
e滤液过0.45μm水相滤膜过滤,作为下一步HPLC的样品。
有益效果:
本发明首次建立了一整套菊芋植物样品果聚糖的提取和检测流程。在菊芋植物样品提取中,采用GRACE公司的GracePureTM SPE C18-Max反向固相萃取柱进行样品过滤,该柱适合于复杂样品检测。由于糖在水溶液中为非极性或中等极性,该柱可以有效去除水溶液中的极性物质,对糖分几乎无吸附,可有效的降低检测的背景,并可以浓缩样品。利用本发明建立的方法,通过使用常规HPLC仪器,避免了昂贵且常规实验室较少使用的HPAEC仪器。通过在样品提取过程中使用的GracePureTM SPE C18-Max柱,有效去除非糖物质对糖分的干扰;利用PREVAIL Carbohydrate ES专用糖柱,该糖柱为聚苯乙烯一二乙烯基苯键合的氨基糖柱,不存在困扰其他氨基柱的问题,没有化学降解现象,且在室温及梯度洗脱的情况下亦很稳定,可长期并高效的分离各种糖类化合物。通过建立的该检测方法,在常规分析实验室,利用普通HPLC仪器,可以达到与HPAEC分离和检测多种糖分的效果,而使用和维护的成本均较低。
附图说明
图1:果糖标准曲线(果糖浓度0.01~6mg/ml,5倍梯度稀释)
横坐标为以10为底的各自糖分浓度对数,纵坐标为以10为底的峰面积的对数。
图2:葡萄糖的标准曲线(葡萄糖的浓度范围为6.7~4×103μg/ml,5倍梯度稀释)
横坐标为以10为底的各自糖分浓度对数,纵坐标为以10为底的峰面积的对数。
图3:蔗糖的标准曲线(浓度范围为0.01~6mg/ml,5倍梯度稀释)
横坐标为以10为底的各自糖分浓度对数,纵坐标为以10为底的峰面积的对数。
图4:蔗果三糖的标准曲线(浓度范围为8.3~5×103μg/ml,5倍梯度稀释)
横坐标为以10为底的各自糖分浓度对数,纵坐标为以10为底的峰面积的对数。
图5:蔗果四糖的标准曲线(浓度范围为8.3~5×103μg/ml,5倍梯度稀释)
横坐标为以10为底的各自糖分浓度对数,纵坐标为以10为底的峰面积的对数。
图6:蔗果五糖的标准曲线(浓度范围为8.3~5×103μg/ml,5倍梯度稀释)
横坐标为以10为底的各自糖分浓度对数,纵坐标为以10为底的峰面积的对数。
图7:6种糖分的HPLC图
果糖浓度,0.1mg/ml;葡萄糖浓度,0.067mg/ml;蔗糖浓度,0.1mg/ml;蔗果三糖浓度,0.083mg/ml;蔗果四糖浓度,0.083mg/ml;蔗果五糖浓度,0.083mg/ml。
图8:菊芋叶片的HPLC分析
图9:菊芋茎秆的HPLC分析
图10:菊芋块茎的HPLC分析
具体实施方式
实施例1
样品:
菊芋品种:常规菊芋
糖:果糖(SIGMA)、蔗糖(SIGMA)、葡萄糖(SIGMA)、蔗果三糖(Wako)、蔗果四糖(Wako)、蔗果五糖(Wako)标准液
试验方法:
1.菊芋组织可溶性总糖的提取与纯化:
a菊芋茎、叶或者块茎等鲜样于烘箱中80℃下恒温烘48h;
b组织样品研磨后,与去离子水按1:3(g/ml)比例混匀,放进100℃的水浴锅中20分钟,反复抽提3次,收集三次提取的所有溶液以去除蛋白;
c将第二步所得的溶液过滤,滤液10000g离心20分钟,收集上清;
d上步获得的滤液过固相萃提柱GracePureTM SPE C18-Max(GRACE公司);
e滤液过0.45μm水相滤膜过滤,注射进HPLC。
2.HPLC糖测定
所需设备:高效液相色谱仪(Agilent1200)、糖柱(PrevailTM Carbohydrate ESColoumn-W250*46mm 5um)、蒸发光检测器(ELSD,Alltech 3300)
所需试剂:HPLC级乙腈(分析纯)、HPLC级水HPLC测定方法:
样品进样量为10ul。
梯度洗脱方法:流速为1ml/min,每次样品的运行时间为55min,
流动相:B相:水,C相:乙腈。梯度洗脱中水和乙腈的体积比具体见下表。
表1 果聚糖HPLC洗脱程序
时间(min) | %B | %C | |
1 | 0 | 25 | 75 |
2 | 15 | 35 | 65 |
3 | 30 | 50 | 50 |
4 | 40 | 50 | 50 |
5 | 42 | 25 | 75 |
6 | 55 | 25 | 75 |
表中的“%”表示体积百分含量。
3.果聚糖检测方法的建立
3.1标准曲线的建立
通过系列稀释,将单一成分的糖分别进行测定,建立各种糖分的标准曲线,如图1~6所示。从上述6种糖的标准曲线可以看出,利用发明者建立的HPLC-ELSD方法,菊芋组织中几种主要的糖分均可以测出,检测的下限基本为微克级别,同离子色谱方法相比,检测下限基本相当(王建华等,2007),可以满足绝大部分实验的需求。聚合度高于蔗果五糖的果聚糖由于没有标准品,实验者无从鉴别。
3.2多种糖分的分离效果
为检测多种糖分,发明者将上述6种糖混合在一起,上柱分离,结果如图7所示。从图7中,可以发现,通过发明者建立的方法,上述6种糖分均能很好的分离开来,说明发明者建立的实验方法可以用于菊芋复杂样品的检测。
3.3菊芋组织样品
依照发明者建立的分离和分析方法,发明者对菊芋不同组织(种植后5个月的叶片、茎秆、块茎)进行了分析测定。
从图8的检测结果发现,在生长了5个月的菊芋叶片中,1g菊芋叶干样中各糖分含量分别为:果糖,7.83mg;葡萄糖,10.08mg;蔗糖,19.44mg;蔗果三糖:0.9mg;蔗果四糖或聚合度高的果聚糖等几乎为检出。这也说明在菊芋叶片中,基本以单糖和二糖等小分子糖为主。
从图9的检测的结果中,生长了5个月的菊芋茎秆中,1g菊芋茎干样中各糖含量分别为:果糖,77.04mg;葡萄糖,18.18mg;蔗糖,38.25mg;蔗果三糖,24.21mg;蔗果四糖,26.55mg;蔗果五糖,36.09mg。在同期的茎秆中,逐步已经有了高聚合度的糖类并且茎秆作为一个暂时的糖类储存器官。
从图10的检测结果发现,在块茎发育期中,1g菊芋块茎干样中各糖含量:果糖,33.03mg;葡萄糖,7.56mg;蔗糖,30.78mg;蔗果三糖,20.97mg;蔗果四糖,32.85mg;蔗果五糖,39.06mg,其余高聚合度的糖大量出现。说明在块茎中,不同聚合度的果聚糖已经占到主导地位。
Claims (1)
1.菊芋果聚糖的提取与检测方法,其特征在于包含以下步骤:
(1)菊芋组织可溶性总糖的提取与纯化:
a菊芋组织鲜样于烘箱中80℃下恒温烘48h,
b组织样品研磨后,与去离子水按1:3的质量体积比混匀,放进100℃的水浴锅中20分钟,反复抽提3次,收集三次提取的所有溶液以去除蛋白,
c将b中所得的溶液过滤,滤液10000g离心20分钟,收集上清,
d上步获得的滤液过固相萃提柱GracePureTM SPE C18-Max,
e滤液过0.45μm水相滤膜过滤,作为下一步HPLC的样品;
(2)菊芋果聚糖的检测:上一步制备的样品通过HPLC检测,检测条件如下:
色谱柱:PrevailTM Carbohydrate ES Coloumn-W250×46mm5μm;
检测器:蒸发光检测器ELSD,Alltech3300;
进样量:10μl;
流速:1ml/min,每次样品的运行时间为55min,
流动相:B相:水,C相:乙腈;
洗脱方式:梯度洗脱,洗脱程序如表1所示:
表1
。
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CN201210457010.9A CN102944622B (zh) | 2012-11-14 | 2012-11-14 | 菊芋果聚糖的提取与检测方法 |
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