CN102936275A

CN102936275A - 一种丹参酮iia磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法

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Publication number: CN102936275A
Application number: CN201210452123XA
Authority: CN
Inventors: 范国荣; 周婷婷; 陈山乔; 赵鑫; 孙范露; 杨丹
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2012-11-13
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-11-13
Also published as: CN102936275B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，丹参酮IIA磺酸钠目前已广泛应用于心脑血管疾病以及其他***疾病的治疗。1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，丹参酮IIB磺酸钠和1-羟基丹参酮IIA磺酸钠是丹参酮IIA磺酸钠原料药中的三种主要杂质。本发明提供了一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，是用高速逆流色谱从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化上述三种主要杂质。本发明的方法简单快速且回收率高，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有制备量大、分离效率高、产品纯度好、简便、适用于对照品研究等优点。

Description

一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化其中三种主要杂质的方法。

背景技术

丹参酮IIA磺酸钠（Sodium Tanshinone II A Sulfonate，Phenanthro[1，2-b]furan-2-sulfonicacid,6,7,8,9,10,11-hexahydro-1,6,6-trimethyl-10,11-dioxo-,sodiumsalt）具有活血化瘀、抑制血小板聚集、降低血液黏滞度、扩张小动脉、改善全身微循环、清除氧自由基、改善组织缺氧、抗炎等作用，目前已广泛应用于心脑血管疾病以及其他***疾病的治疗。1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，丹参酮IIB磺酸钠和1-羟基丹参酮IIA磺酸钠是丹参酮IIA磺酸钠原料药中的三种主要杂质，它们的结构式分别为：

对于丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的相关研究意义重大(李军等，丹参酮ⅡA磺酸钠有关物质和含量测定方法研究，中南药学.2006，4（4）：291)。在对丹参酮IIA磺酸钠原料药进行质量研究时，需要使用相关杂质的对照品对原料药中的杂质进行含量监控，以确保制备得到符合药用要求，能够用于制备安全有效的药物制剂的原料药。

目前，国内外多采用制备型高效液相色谱与常压或中压柱色谱相结合分离纯化丹参酮IIA磺酸钠原料药中的相关杂质，这类方法操作繁琐耗时，有机溶剂消耗量巨大，且样品在柱色谱分离后需要经过浓缩后再转移到制备型高效液相色谱，不可避免会造成样品的损失和污染（Wang B,et al.Isolation and structurecharacterization of related impurities in Sodium Tanshinone IIA Sulfonate by LC/ESI-MSn andNMR,J Pharm Biom Anal.2012,36:67;Zou Q,et al.Identification,Isolation,andCharacterization of Impurities in Sodium Tanshinone IIA Sulfonate,J Liq Chrom Rel Tech.2009,32:2346）。因此，如果可以不经过传统柱层析过程而直接通过制备型高效液相色谱技术对杂质进行分离制备，则可以有效的克服上述局限。然而，由于原料药中主药与杂质含量相差过大，当主药量已经超载时杂质的含量却极其低微，无法直接用于制备型高效液相色谱，而且制备型高效液相色谱所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。

高速逆流色谱（High-speed counter-current chromatography，HSCCC）是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、分离量大等优点，但目前国内外还未见有将高速逆流色谱应用于丹参酮IIA磺酸钠原料药中相关杂质的分离纯化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备工艺简单快速、回收率高、纯度高且适于对照品研究的从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化三种主要杂质—1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠、丹参酮IIB磺酸钠和1-羟基丹参酮IIA磺酸钠的方法。

本发明提供了一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，是用高速逆流色谱从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化三种主要杂质-1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠、丹参酮IIB磺酸钠和1-羟基丹参酮IIA磺酸钠，所述的高速逆流色谱的条件为以三氯甲烷、正丁醇、甲醇和0.5%饱和醋酸铵水溶液配制构成固定相、流动相的溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相，先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，将丹参酮IIA磺酸钠原料药溶于少量下相中,由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”，流分“Ⅰ”为1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，流分“Ⅱ”为丹参酮IIB磺酸钠，流分“Ⅲ”为1-羟基丹参酮IIA磺酸钠。

所述的溶剂体系中，三氯甲烷、正丁醇、甲醇和0.5%饱和醋酸铵水溶液的用量体积比为16~18︰0.2~0.4︰13~15︰8~10。

优选的，所述的溶剂体系中三氯甲烷、正丁醇、甲醇和0.5%饱和醋酸铵水溶液的用量体积比为17︰0.3︰14︰9。

本发明的方法具体步骤如下：

用高速逆流色谱从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化三种主要杂质：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为三氯甲烷:正丁醇:甲醇：0.5%饱和醋酸铵水溶液=16~18︰0.2~0.4︰13~15︰8~10。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相。固定相和流动相超声脱气后，先用固定相充满整个柱体，然后开启高速逆流色谱仪，转速为800~1200rpm，以1.0~3.0ml/min流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，再进行进样；优选转速为950rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内。取丹参酮IIA磺酸钠原料药溶于少量下相,由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”。采用高效液相色谱法对所得流分进行纯度检测（峰面积归一化法），测得流份“Ⅰ”纯度高于95%，流份“Ⅱ”纯度高于96%，流份“Ⅲ”纯度高于96%。挥干溶剂后对流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”进行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“Ⅰ”为1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，流分“Ⅱ”为丹参酮IIB磺酸钠，流分“Ⅲ”为1-羟基丹参酮IIA磺酸钠。

本发明采用高速逆流色谱从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化三种主要杂质，方法简单快速且回收率高，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有有制备量大、分离效率高、产品纯度好、简便、适用于对照品研究等优点。

附图说明

图1为丹参酮IIA磺酸钠原料药的高速逆流色谱（HSCCC）的色谱图；

图2为丹参酮IIA磺酸钠原料药的高效液相色谱图；

图3为HSCCC分离流分“Ⅰ”（杂质1）高效液相色谱图；

图4为HSCCC分离流分“Ⅱ”（杂质2）高效液相色谱图；

图5为HSCCC分离流份“Ⅲ”（杂质3）高效液相色谱图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：

应用高速逆流色谱（深圳同田生化有限公司）从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化其中三种主要杂质：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为三氯甲烷︰正丁醇︰甲醇︰0.5%饱和醋酸铵水溶液=17︰0.3︰14︰9（体积比）。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，逆流色谱柱体积为300ml，固定相保留率75％,流速2.0ml/min，转速950rpm，检测波长280nm，取丹参酮IIA磺酸钠原料药100mg溶解于20ml下相中,由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”，见图1。

对该部分进行HPLC分析表明“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”均为单一色谱峰，峰纯度分别为95.60%、96.47%、97.03%。HPLC分析条件为色谱柱Diamonsil C18(250×4.6mm,5μm)；流动相为A=20mM醋酸铵，B=甲醇；梯度洗脱方式为：T(min)/%B:0/45,10/60,20/60,25/75,30/4545/45；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长270nm。在此条件下所得各高效液相色谱图见图2、图3、图4、图5。

将分离得到的“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”流分挥干，得流分“Ⅰ”褐色粉末26.43mg，得率为26.43%；流分“Ⅱ”黄色粉末18.61mg，得率为18.61%；流分“Ⅲ”砖红色粉末32.23mg，得率为32.23%。对流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”在Varian INOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行¹HNMR、¹³CNMR和MS分析，经结构解析确定流分“Ⅰ”为1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，流分“Ⅱ”为丹参酮IIB磺酸钠，流分“Ⅲ”为1-羟基丹参酮IIA磺酸钠。

实施例2:

按照实施例1的高速逆流色谱法操作步骤从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化其中三种主要杂质：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为三氯甲烷︰正丁醇︰甲醇︰0.5%饱和醋酸铵水溶液=18︰0.2︰15︰8。三种杂质的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠得率为24.8%，纯度为95.07%；丹参酮IIB磺酸钠得率为17.46%，纯度为96.14%；1-羟基丹参酮IIA磺酸钠得率为29.45%，纯度为97.57%。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，其特征在于，该方法是用高速逆流色谱从丹参酮IIA磺酸钠原料药中分离纯化1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠、丹参酮IIB磺酸钠和1-羟基丹参酮IIA磺酸钠，所述的高速逆流色谱的条件为以三氯甲烷、正丁醇、甲醇和0.5%饱和醋酸铵水溶液配制构成固定相、流动相的溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相，先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，将丹参酮IIA磺酸钠原料药溶于少量下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”，流分“Ⅰ”为1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，流分“Ⅱ”为丹参酮IIB磺酸钠，流分“Ⅲ”为1-羟基丹参酮IIA磺酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，其特征在于，所述的溶剂体系中，三氯甲烷、正丁醇、甲醇和0.5%饱和醋酸铵水溶液的用量体积比为16~18︰0.2~0.4︰13~15︰8~10。

3.根据权利要求1所述的一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，其特征在于，所述的溶剂体系中，三氯甲烷、正丁醇、甲醇和0.5%饱和醋酸铵水溶液的用量体积比为17︰0.3︰14︰9。

4.根据权利要求1或2所述的一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，其特征在于，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相；固定相和流动相超声脱气后，先用固定相充满整个柱体，然后开启高速逆流色谱仪，转速为800~1200rpm，以1.0~3.0ml/min流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，再进行进样；优选转速为950rpm，以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；取丹参酮IIA磺酸钠原料药溶于少量下相,由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”。

5.根据权利要求4所述的一种丹参酮IIA磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法，其特征在于，根据检测器谱图接收流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”之后，采用高效液相色谱法对所得流分进行纯度检测；挥干溶剂后对流分“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”进行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“Ⅰ”为1,2-脱氢丹参酮IIA磺酸钠，流分“Ⅱ”为丹参酮IIB磺酸钠，流分“Ⅲ”为1-羟基丹参酮IIA磺酸钠。