CN102933704A - 软骨祖细胞、用于细胞衍生的方案和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供软骨前体细胞分离群,其中1%或更少的细胞表达Oct4、Nanog和/或TRA-1-60,7%或更少的细胞不表达II型胶原、X型胶原、CD105或Stro-1和85%或更多的细胞表达CBFA1,制备这些细胞的方法和源自所述前体细胞的软骨细胞的用途。
Description
技术领域
本发明一般涉及细胞生物学、胚胎干细胞和细胞分化领域。本发明公开了软骨祖细胞以及制备该细胞和完全分化的软骨细胞的方法,包括所述细胞的用途。
背景技术
软骨细胞是软骨中发现的专能细胞。软骨中的软骨细胞产生大量胞外基质,其由胶原纤维、基质组成,富含蛋白聚糖和弹性蛋白纤维。所述软骨组织在骨骼关节中起结构和机械功能,因此任何疾病或损伤引起患者虚弱。
软骨退化是两种疾病组的特征:退化性病症的骨关节炎和主要由炎症引起的风湿性关节炎。所述退化引起关节疼痛和移动受损到残疾的程度。
有效抑制此类疾病进展的抗炎剂开发已取得重大进展。然而,退化或损伤已发生时,需要新疗法来协助关节软骨的再生。
在再生医学领域,已进行努力开发能修复软骨的细胞群。关节软骨细胞的已建立细胞系如WO 96/18728所述,软骨细胞生长和分化的方法如WO 98/55594中报道。WO 00/27996报道了软骨细胞样细胞的无血清培养基,包括最小必须培养基、生长因子、脂质和氨基酸。US 6,150,163描述了软骨细胞培养基制剂和培养程序,其中去分化的人关节软骨细胞在含TGFβ和胰岛素或胰岛素样因子的培养基中生长。已报道若未用合适的因子处理,体外培养的初级软骨细胞会去分化(Benya等Cell 198230:215)。产生的细胞形态是成纤维细胞且可为MSC-样的。
Jorgensen等(Ann.Rheum.Dis.60:305,2001)综述了用于修复关节中软骨和骨的干细胞的近期进展。Jakob等(J.Cell.Biochem.26:81,2001)研究了参与成人关节软骨细胞扩增和去分化的特异生长因子,其增强软骨发生和软骨形成。M.Brittberg(Clin.Orthop.367增刊:S147,1999)综述了当前软骨细胞移植方法,其中纯化软骨细胞或其他间充质细胞自体收获或作为来自健康组织来源的同种异体移植物、体外扩张、然后以高密度移植到缺陷处。
尽管迄今为止报道的临床方法取得初步成功,很明显当前软骨细胞的来源不足以治疗临床本身表现出的大多数软骨退化病例。此外,有关使用免疫抑制药物的问题使成功开发新移植方案更复杂。
再生医学也从有关各类祖细胞的分离、培养和使用的近期进展中收益。胚胎干细胞具有两种非常特殊的性质:首先,不同于其他常见的哺乳动物细胞类型,其可在培养基中几乎无限地增殖而维持其多潜能性,提供几乎不受限制的供给。其次,其可用于生成各种感兴趣的组织类型作为用于组织治疗或用于筛选药物试剂的替代细胞和组织来源。因此,干细胞被认为是软骨细胞的可能来源。
Kramer等(Mech.Dev.92:193,2000)报道小鼠胚胎干细胞可用骨形态发生蛋白(BMP-2和BMP-4调节)以产生阿辛蓝(Alcian blue)染色(软骨细胞特征)的细胞,并表达转录因子scleraxis。然而,胚胎干细胞发育的小鼠模型不需要产生适用于其他物种的分化策略(参见例如Ginis等.(2004)Dev.Biol 269:360)。
Thomson等(US 5,843,780;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)首次成功从灵长类动物中分离并繁殖了多潜能干细胞。他们随后从人胚胞建立了人胚胎干细胞(hES)系(Science 282:114,1998)。Gearhart和同事从胎儿生殖腺组织建立了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998;和US 6,090,622)。hES和hEG细胞都具有长久以来寻求的多潜能干细胞特征:其可大量培养而不分化,其具有正常的染色体组型,且其能产生许多重要细胞类型,包括来自所有三个初级胚层的细胞类型。
间充质祖细胞可根据WO 03/004605所述的方法从hES细胞生成。然后hES-衍生的间充质细胞可在含成骨因子的培养基中进一步分化为成骨细胞谱系细胞,所述成骨因子如骨形态发生蛋白(具体是BMP-4)、人TGF-β受体的配体或人维生素D受体的配体(WO 03/004605;Sotile等,Cloning Stem Cells2003;5(2):149-55)。软骨细胞或其祖细胞可通过在具有WO 03/050250所列分化因子的有效组合的微团聚体中培养hES细胞来生成。
Hegert等.(J.Cell Sci.115:4617,2002)报道了从由小鼠胚胎干细胞组成的胚状体衍生的软骨细胞的分化可塑性。Toh等描述了体外人胚胎干细胞的可扩增软骨生成细胞的分化和富集(J.Cell.Mol.Med.,2009-早期在线公开引用文献10.1111/j.1582-4934.2009.00762.x)。
仍需要生产足量软骨谱系细胞的有效的可规模化方法,包括软骨祖细胞以及用于治疗和研究应用的成熟软骨细胞。分离稳定的软骨细胞前体是有用的,所述细胞能在可规模化条件下维持培养且能容易地分化为成熟的软骨细胞或表达蛋白如II型胶原、蛋白聚糖聚合物(aggrecan)和糖胺聚糖的细胞。
然而,即使制备源自未分化祖细胞群如hES细胞的软骨细胞,仍需要在使用软骨细胞群的移植治疗中使用免疫抑制药物,所述软骨细胞群对患者移植物的长期成功不利。
因此,需要开发新方法使灵长类多潜能细胞分化为完全功能性软骨细胞,其避免在移植中使用免疫抑制药物,以及能容易产生该软骨细胞的软骨前体细胞类型。还需要开发治疗性应用软骨细胞如从灵长类多潜能干细胞体外分化的软骨细胞而不用免疫抑制和/或抗炎剂的新方法。还需要开发用软骨细胞如从灵长类多潜能干细胞体外分化的软骨细胞治疗对象而不用免疫抑制和/或抗炎剂的新方法。
发明内容
本发明提供新的软骨祖细胞或前体细胞群,其特征为表达本文所定义的某些蛋白标记。细胞的特征还可为丧失转分化能力。
软骨细胞前体或祖细胞群可由分化的pPS细胞通过本发明方法获得,且可形成具有成熟软骨细胞特征的后代。所述软骨祖细胞不再具有多潜能,但定向软骨细胞发育途径。
本发明还提供本文定义的***用于制备软骨细胞和软骨祖细胞或软骨前体细胞。软骨祖细胞或软骨前体细胞的分离群或体外群如下制备:在软骨生成培养基中分化灵长类多潜能干细胞(pPS)群直到所述细胞多于75%融合,然后所述细胞在定义的最小生长培养基中清洗和重悬并再培养一段时间,直到所述细胞分化成特征为丧失转分化能力的细胞群,如不能在成骨培养基中后续培养以形成成骨细胞的细胞。该培养细胞的特征还为成纤维形态、不表达ES多潜能标记或间充质干细胞(MSC)标记、且不表达软骨生成标记。该培养细胞的特征还为存在肥大软骨细胞和骨生成的核标记表达。因此该特征区分所述细胞和初级(非肥大的)软骨细胞。
本文描述了检测这些标记的合适试验。多潜能标记包括Oct4、Nanog和/或TRA-1-60。软骨生成标记包括II型胶原。肥大软骨细胞和骨生成的核标记包括CBFA1/RunX2。
丧失转分化能力如所述细胞不能在成骨培养基中后续培养以形成成骨细胞可通过软骨前体细胞在成骨培养基中进一步培养后缺失矿化作用来显示。
根据本发明方法制备的软骨祖细胞或软骨前体细胞的表达标记的特征示于表1,不表达(“阴性”)表示为“-“,有表达(“阳性”)表示为“+”:
表1
标记 | 表达状态(-/+) | 特征 |
Nanog | - | 多潜能 |
Oct4 | - | 多潜能 |
Tra-1-60 | - | 多潜能 |
II型胶原 | 低 | 软骨发生 |
CBFA1/RunX2 | + | 肥大软骨细胞/骨生成 |
X型胶原 | - | 肥大软骨细胞 |
骨钙蛋白 | - | 骨生成 |
CD105 | - | 软骨细胞 |
Stro-1 | - | 间充质干细胞 |
群中少于约7%的细胞不表达II型胶原,而群中剩余93%表达低水平的标记。因此该标记的表达低于完全分化的软骨细胞群中观察到的表达水平。
考虑上述特征,软骨祖细胞或软骨前体细胞与先前已知的软骨细胞或前体细胞相区分。根据用于制备所述细胞的方法,该细胞可称为去分化的定向软骨祖细胞(DCCPC)或诱导的软骨前体细胞(ICPC)。考虑细胞后续分化为软骨细胞的能力,所述细胞还可称为“向前-向后软骨细胞”或FBC。任何这些术语可互换使用。
DCCPC还可在清洗后于软骨生成培养基中培养。后续培养产生可用标记II胶原和X型胶原表征为软骨细胞的细胞群。产生的软骨细胞表达高水平的II型胶原但很少或不表达X型胶原。
本发明还提供从根据本发明制备的DCCPC中分化的软骨细胞群用于移植。令人惊奇的是,完全分化的软骨细胞群可给予对象,而不用免疫抑制化合物如FK-506、环孢菌素等。此外,抗炎剂如强的松等也不需要。本发明的该实施方式延伸到治疗退化软骨疾病或软骨损伤的方法,所述方法包括移植本发明的DCCPC制备的软骨细胞群到需要的对象中。
本发明还提供含软骨细胞的分离或体外细胞群,所述细胞通过分化本文所述DCCPC获得。软骨细胞谱系细胞可通过从内源基因合成例如II型胶原或蛋白聚糖聚合物的能力来鉴定。优选地,所述群含有最小比例的合成弹性软骨、纤维软骨、肥大软骨或骨的细胞。
未分化的多潜能细胞在所述群中的比例优选最小,且任何剩余的未分化细胞不是负责进一步增殖后形成软骨细胞的细胞。
本发明的另一实施方式是在生成***蛋白的条件下通过孵育本发明细胞群来生产软骨的方法。本发明的另一实施方式是就其调节软骨细胞生长、分化或软骨组分合成的能力筛选化合物的方法,这是通过联合所述化合物和本发明的细胞群并测定其效果。
本发明的另一实施方式是将pPS细胞体外分化为软骨细胞的方法,包括在适于将所述pPS细胞分化为软骨前体细胞的培养基中培养pPS(并任选地分离所述软骨前体细胞),然后改变培养条件从而所述软骨前体细胞去分化为具有成纤维细胞样形态和核CBFA-1表达的细胞,然后所述细胞再分化为完全分化的软骨细胞。
任选地,干细胞的复制能力如灵长类多潜能干细胞或人胚胎干细胞可通过增加端粒酶活性来改进。
本发明的另一实施方式是用于体内产生、修复或维持软骨的药物组合物,包括本发明的细胞群或源自其的完全分化软骨细胞群–和该药物如在美容手术或治疗关节外伤、关节炎或骨关节炎中重建对象软骨的用途,包括关节软骨。
本发明的这些和其他实施方式如下进一步描述。
附图
图1显示通过DCCPC方案的形态学改变。初始软骨生成分化14天后,H7细胞浓缩为致密三维集落。观察到大量细胞死亡,这里显示为活粘附细胞(A)顶部的亮相簇。在去分化培养基中5天后,细胞从三维集落迁移进入围绕其的自由空间以形成单层成纤维细胞样细胞(B)。
图2通过DCCPC上的CBFA-1/RunX2染色显示DCCPC中的核CBFA-1蛋白表达。mTeSRTM或条件培养基(CM)中培养的H7细胞在进入DCCPC方案前用抗CBFA-1抗体染色。hESC系RCM1也用相同抗体染色。在所有情况中,所述CBFA-1抗体与DNA结合染料DAPI共定位。
图3显示用成骨培养基分化的DCCPC中存在I型胶原和矿化作用。DCCPC未能在成骨分化后矿化基质。从H7(A)和H1(B)细胞系生成的DCCPC显示在成骨培养基中培养后增加胞外I型胶原蛋白生。冯库萨(Von Kossa)染色方案在钙沉降物存在时会产生深褐色/黑色染色。两种细胞系中没有染色表明缺少钙,且因此没有基质矿化作用。
图4显示使用再分化DCCPC的WT大鼠21天后DCCPC对体内软骨修复的促进。先前在CM中培养的H7系生成的DCCPC以构建体形式培养并移植到WT大鼠中。一种构建体置于大鼠后肢滑车沟的1mm缺陷中。21天后,所述肢进行冰冻切片并用H&E染色。箭头表示再生材料的范围。
图5显示DCCPC方案的示意图。使用软骨生成培养基pPS向软骨祖细胞样细胞分化(1)。该过程表征为高细胞死亡、缺失多潜能性和多能性标记且抑制II型胶原生产。软骨生成培养基的其他应用产生完全分化软骨细胞,但并非DCCPC方案的一部分(2),而是所述软骨前体细胞用去分化培养基孵育直到所述细胞显示成纤维细胞样形态和核CBFA-1表达。仍维持缺失多潜能和多能标记(3)。然后DCCPC可用软骨生成培养基再分化为完全分化的软骨细胞(4)。
具体实施方式
本发明提供制备具有重要且有用特性的DCCPC群的方法。其可分批生长和维持,然后容易分化为表达II型胶原的细胞,如成熟软骨细胞。此类细胞制备的分化软骨细胞可用于如本文所述的移植治疗和筛选方法的应用。
后续公开提供了如何制备本发明软骨细胞前体细胞以及源自其的软骨细胞的充分描述。其提供这些细胞如何能用于研究和药物开发的广泛说明。本公开还提供用DCCPC再生和重塑软骨以修复关节移动性以及化妆品用途的药物组合物、设备和治疗方法。
定义
用于本公开的目的,除非另有明确说明,术语“软骨细胞”指能通过合成II型和蛋白聚糖聚合物来重塑软骨的成熟细胞。术语“去分化的定向软骨祖细胞(DCCPC)”用于表示本发明方法制备的专能祖细胞,其可分化形成成熟软骨细胞且特征为下文所述的标记表达概况。有软骨细胞形态的细胞具有聚拢的细胞体且在软骨生成培养基中所述细胞聚集为致密集落。
在细胞个体发生的环境中,形容词“分化的”是相对术语。“分化的细胞”是比相比较的细胞进展到发育途径更下游的细胞。
本文所用的“分化剂”指本发明培养***中使用的化合物集合,用于产生软骨细胞谱系的分化细胞(包括前体细胞如DCCPC和终末分化细胞如成熟的软骨细胞)。对化合物作用模式没有限制。例如,所述试剂可通过诱导或协助表型改变、促进具有特定表型的细胞生长或减缓其他细胞生长来协助所述分化过程。其还可作为培养基中或所述细胞群合成的其他因子的抑制剂,否则所述因子会引导沿着途径分化为不利的细胞类型。
原型“灵长类多潜能干细胞”(pPS细胞)是能在正确的条件下生产数种不同细胞类型后代的多潜能细胞。根据本领域接受的标准测试,pPS细胞能产生三种胚层:内胚层、中胚层和外胚层的各自衍生物后代,如在合适的宿主中形成畸胎瘤的能力或分化为就培养中所有三种胚层的组织类型具有标记的细胞的能力。
pPS细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞,如hES细胞所示例,如下定义;其他灵长类的胚胎干细胞如Rhesus或狨干细胞(Thomson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995;Developmental Biology 38:133,1998);和人胚胎生殖细胞(hEG)(Shamblott等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)。多潜能细胞的其他类型也包括在术语中。包括能产生所有三种胚层的衍生物后代的任何灵长类来源细胞,不论其是否源自胚胎组织、胎儿组织或其他来源。使用核型正常且非恶性来源的pPS细胞是有益的。
pPS细胞包括细胞和已建立的细胞系。所述细胞可源自受精后任何时间的胚前期、胚胎或胎儿组织。该术语还包括具有上述特征的诱导多潜能干细胞(iPS)(参见例如Takahashi等(2007)Cell 131:1)。
灵长类多潜能干细胞通常表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4,和可用称为TRA-1-60和TRA-1-81的抗体检测的标记。根据RT PCR所测,未分化的pPS细胞还通常表达转录因子Oct 3/4、Cripto、胃泌激素释放肽(GRP)受体、足细胞标记蛋白样蛋白(PODXL)、nanog和端粒酶逆转录酶如hTERT(US 2003/0224411A1)。
原型“人胚胎干细胞”(hES细胞)如Thomson等所述(Science 282:1145,1998;美国专利6,200,806)。所述术语的范围包括在所述细胞基本分化为三种胚层之前,源自植入前胚泡的多潜能干细胞,如体外受精卵。本领域技术人员应理解除了明确需要以外,所述术语包括具有hES细胞表型特征的初级组织和已建立的细胞系,以及仍具有生产三种胚层各自后代的能力的该细胞系衍生物。
当所述群中大部分干细胞及其衍生物表现未分化细胞的形态学特征,能清楚的区分它们和胚胎或成人来源的分化细胞时,pPS细胞培养物如hES细胞培养物称为“未分化的”。未分化pPS细胞容易被本领域技术人员识别,且二维显微图像通常显示为具有高核/质比和明显的核。应理解所述群内未分化细胞的集落通常被邻近分化细胞环绕。然而,当所述群在合适条件下培养或传代时,未分化的集落会保持,且个体未分化细胞构成细胞群的主要部分。基本未分化的培养物在持续基础上含至少20%未分化的pPS细胞,且按优选提高的顺序可含至少40%、60%或80%(以具有相同基因型的未分化细胞的百分比计)。
如上所述,多潜能细胞的其他来源包括诱导的多潜能干细胞(iPS)。所述iPS细胞可通过Yamanaka等所述的技术制备,使用具有基因Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4的成纤维细胞的逆转录酶病毒感染。用标记Nanog选择iPS细胞似乎具有优势(Takahashi,K.和Yamanaka,S.,Cell,126:663,2006;Yamanaka S,等Nature448:313,2007;Wernig M,等Nature 448:318,2007;Maherali N,等Cell Stem Cell1:55,2007)。最近,Thomson等通过慢病毒***使用了稍稍改变的基因OCT4、SOX2、NANOG和不同基因LIN28的混合物(Science,318:1917,2007)且还成功使用未整合的附加型载体(Science,324:797,2009)。
本发明中培养物或细胞群称为“不分化”增殖时(表示增殖后),所述组合物根据前述定义为基本不分化。当在原始培养物相同的融合程度评价时,通过至少4代传代增殖而不分化的群(约20次加倍)基本含有与未分化细胞相同的比例(或可能未分化细胞比例更高)。
“营养培养基”是用于培养细胞的含促进增殖营养物的培养基。所述营养培养基通常含等渗盐水、缓冲液、蛋白源(以一种或多种添加蛋白或氨基酸的形式)和可能的其他外源添加营养物和生长因子。
“软骨生成培养基”主要由矿物质、氨基酸、维生素和培养细胞的底物以及使细胞分化为软骨细胞所需的因子组成。通常软骨生成培养基可由定义的最小生长培养基组成,补充有至少一种激素、生长因子、非必须氨基酸和/或辅因子。
“条件培养基”通过在培养基中培养第一细胞群,然后收集该培养基制得。然后所述条件培养基(和细胞分泌到培养基中的任何物质)可用于支持第二细胞群的生长。具体成分或因子描述为已加入到培养基中时,表示所述因子(或工程改造成分泌所述因子的细胞或颗粒)通过审慎操作混合到所述培养基中。
“定义的最小生长培养基”由必须矿物质、氨基酸、维生素和培养细胞所用的底物组成。通常定义的生长培养基可包含一种或多种无机盐、氨基酸、维生素、糖、缓冲液、指示剂染料或着色剂。
“新鲜培养基”是与其最终设计支持的细胞类型一起使用前未通过用不同细胞类型培养而有意调整的培养基。另外,对其制备、储存或使用的方法没有限制。其被新鲜加入(通过交换或灌注)最终培养物,在这里其可被消耗或由已存在的细胞类型加工。
“成骨培养基”主要由矿物质、氨基酸、维生素和培养细胞的底物以及使细胞分化为骨细胞所需的因子组成。通常成骨培养基可由定义的生长培养基组成,补充有一种或多种血清蛋白、氨基酸、非必须氨基酸和/或辅因子。
术语“饲养细胞”或“饲细胞”用于描述一种细胞类型,其与另一种细胞类型共培养以提供第二种细胞类型能生长的环境。pPS细胞的某些类型可由初级小鼠胚胎成纤维细胞、永生的小鼠胚胎成纤维细胞或从hES细胞分化的人成纤维细胞样细胞所支持。若细胞***后已至少经过一轮,则认为pPS细胞群“基本不含”饲养细胞,其中未加入新鲜的饲养细胞以支持pPS细胞的生长。
术语“拟胚体”是“聚集体”同义的本领域术语,表示pPS细胞在单层培养物中过生长时或维持在悬浮培养基中时,出现的分化和未分化细胞聚集物。形成拟胚体的起始材料是未分化的多潜能干细胞培养物。拟胚体是不同细胞类型的混合物,通常来自数种胚层,以及至少一些可通过形态学标准以及免疫细胞化学可检测的细胞标记来区别的多潜能细胞。通常拟胚体中多潜能干细胞的数量随着时间下降,分化细胞数量增加。拟胚体环境中发生的分化本质上是随机的事件,因此相同条件下培养的各拟胚体通常在细胞组成方面不同。该术语与软骨细胞谱系细胞生成中所用的构建体培养物的区别在于构建体培养物的起始材料不是主要由未分化多潜能干细胞组成的培养物,而是由通常沿着软骨细胞谱系途径开始分化而远离多潜能状态的细胞组成。因此,构建体的起始材料是发育阶段更高级的细胞。此外构建体培养物通常包含特异性指导培养物沿着所需途径如软骨细胞途径分化的一种或多种因子。
“生长环境”是感兴趣的细胞体外增殖、分化或成熟的环境。环境特征包括培养细胞的培养基、可存在的任何生长因子或诱导分化因子、和支持结构(如固体表面的底物)(如存在)。
当通过任何合适的人工操作方法将多核苷酸转移到细胞中时,或细胞是遗传所述多核苷酸的最初改变细胞的后代时,所述细胞称为“遗传改变的”、“转染的”或“遗传转化的”。多核苷酸通常包含编码感兴趣蛋白的可转录序列,其使所述细胞以升高的水平表达所述蛋白。若改变的细胞后代具有相同的改变,则所述遗传改变称为“可遗传的”。
本文所用的治疗、疗法、处理表示下述的任何一种:疾病或病症的严重性下降;病程持续时间减少;与疾病或病症有关的一种或多种症状缓解;为患疾病或病症的对象提供有益的效果,而不需治愈所述疾病或病症;与疾病或病症有关的一种或多种症状的预防。
综合技术
分子遗传和遗传工程中的常见方法描述于最新版本的Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆:实验室手册》),(Sambrook等,冷泉港(ColdSpring Harbor));Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(《哺乳动物细胞中的基因转移载体》)(Miller和Calos编.);和Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编,韦利森公司(Wiley&Sons))。细胞生物学、蛋白化学、和抗体技术参见Current Protocols in Protein Science(《新编蛋白质科学实验指南》)(J.E.Colligan等编,韦利森公司);CurrentProtocols in Cell Biology(新编细胞生物学实验指南》)(J.S.Bonifacino等,韦利森公司)和Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)(J.E.Colligan等编,韦利森公司)。本公开中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商业供应商,如伯乐公司(BioRad)、斯查塔基公司(Stratagene)、英杰公司(Invitrogen)、克隆泰克公司(ClonTech)和西格玛-奥德里奇公司(Sigma-AldrichCo.)。
细胞培养方法一般描述于最新版本的Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique (《动物细胞培养:基本技术手册》)(R.I.Freshney编,韦利森公司);General Techniques of Cell Culture(《细胞培养一般技术》)(M.A.Harrison和I.F.Rae,剑桥大学出版社(Cambridge Univ.Press)),和Embryonic Stem Cells:Methods and Protocols(《胚胎干细胞:方法和方案》)(K.Turksen等,胡马纳出版社(Humana Press))。感兴趣的其他参考文献包括CultureIsOurBusiness (《培养是我们的工作》)(M.McLuhan,巴兰坦图书公司(Ballantine Books),1970);和Understanding Media(《理解培养基》)(M.McLuhan,***公司(Signet),1970)。组织培养供给和试剂可购自商业供应商如吉布可/BRL公司(Gibco/BRL)、耐洁纽恩克国际公司(Nalgene-Nunc International)、西格玛化学公司(Sigma ChemicalCo.)和ICN生物医药公司(ICN Biomedicals)。
软骨的生物和病理学的一般方面以及软骨细胞在维持关节中的作用可参见以下教材:Mechanobiology:Cartilage and Chondrocyte(《机械生物学:软骨和软骨细胞》),J.F.Stoltz编,IOS出版社(IOS Press)2000;Biological Regulations of theChondrocytes (《软骨细胞的生物调控》),M.Adolphe编,CRC出版社(CRC Press)1992;Bone and Cartilage Allografts(《骨和软骨异体移植》),G.E.Friedlaender等编,Amer.Acad.Orthopaedic 1991;Joint Cartilage Degradation (《关节软骨退化》),J.F.Woessner和D.S.Howell编,马塞尔-德克公司(Marcel Dekker)1992;Skeletal Tissue Mechanics (《骨骼组织力学》),第二版R.B.Martin等,施普林格公司(Springer Verlag)1998;Molecular and Developmental Biology of Cartilage (《软骨的分子和发育生物学》),B.De Crombrugghe等编,Ann.N.Y.Acad.Sci.第785卷:1996;和Joint Structure and Function:A Comprehensive Analysis (《关节结构和功能:综合分析》),第三版,P.K.Levangie等编,F A Davis,2000。
软骨细胞和软骨祖细胞的制备
本发明方法提供本文定义的***用于制备软骨细胞和软骨祖细胞或前体细胞。hES培养条件下hES细胞的培养物贴壁生长而不形成拟胚体到多于四分之三完全融合。
然后所述培养基换为本文所述软骨生成分化培养基并培养合适的时间,如约13-15天,适当的为14天,清洗并将其置于去分化培养基且再贴壁培养一段合适时间而不形成构建体培养物,如4-6天,适当的为5天,进行胰蛋白酶化并重悬。此时,所述细胞与分离的初级软骨细胞根据形态学和特征相区分。软骨生成培养基中的细胞进一步培养21天能产生软骨细胞。然而,成骨培养基(包括***、β磷酸甘油、抗坏血酸、丙酮酸钠和L-谷氨酰胺,合适的基础培养基可包括市售可得的KnockoutTM D-MEM(英杰公司),其可添加到血清中)中相同软骨细胞前体的培养物没有引起功能性成骨细胞衍生。
合适的软骨生成培养基类型包括含***、胰岛素、铁传递蛋白、***、牛血清白蛋白和亚油酸、L-脯氨酸、抗坏血酸、丙酮酸钠和TGF-β(例如TGF-β3)的培养基。合适的基础培养基包括市售可得的培养基如DMEM(生命技术公司(Life Technologies))。去分化培养基可为补充有血清的DMEM。
软骨细胞分化的合适标记包括II型胶原和蛋白聚糖聚合物,多潜能性的合适标记包括Oct4、Tra-1-60和Nanog。
干细胞来源
胚胎干细胞可从灵长类物种成员的胚泡中分离(US 5,843,780;Thomson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)。人类胚胎干细胞(hES)可用初级小鼠成纤维细胞饲养细胞从人类胚泡细胞中制备,按照Thomson等(US 6,200,806;Science 282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998)和Reubinoff等,NatureBiotech.18:399,2000所述的技术。hES细胞系还可源自人饲细胞(US 6,642,048),或在完全没有饲养细胞的条件下(US 2002/0081724)或Klimanskaya等,Lancet,365(9471):1636-41(2005))。与hES细胞等同的细胞类型包括其多潜能衍生物如原始外胚层样(EPL)细胞,如WO 01/51610所示。胚胎干细胞可选自胚胎干细胞系或可直接获自原始胚胎组织。
本发明的实践不需要人类胚泡细胞解聚来产生hES或用于本发明实施的胚胎干细胞。hES细胞可获自已建立的细胞系,所述细胞系可获自公开保藏所(例如美国威斯康星州麦迪逊的WiCell研究所或美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))。
已建立许多胚胎干细胞系,包括但不限于H1,H7,H9,H13或H14(Thompson等);hESBGN-01,hESBGN-02,hESBGN-03(美国佐治亚州埃瑟的布勒萨基因有限公司(BresaGen,Inc.,Athens,GA));HES-1,HES-2,HES-3,HES-4,HES-5,HES-6(新加坡的ES细胞国际有限公司(ES Cell International,Inc.,Singapore));HSF-1,HSF-6(美国圣弗朗西斯科的加利福尼亚大学(University of California,San Francisco));I3,I 4,I 6(以色列海法的以色列科技研究所(Technion-Israel Institute of Technology,Haifa,Israel));UCSF-1和UCSF-2(Genbacev等人,Fertil.Steril.83(5):1517-29,2005);细胞系HUES 1-17(Cowan等,NEJM 350(13):1353-56,2004);以及细胞系ACT-14(Klimanskaya等人,Lancet,365(9471):1636-41,2005)。已建立的hES细胞系可获自各种来源,包括英国干细胞库(英国国家生物标准和控制研究所)、国家干细胞库(美国威斯康星大学麦迪逊分校)或WiCell(美国威斯康星麦迪逊)。
人类胚胎生殖细胞(hEG)可如Shamblott等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:13726,1998和US 6,090,622所述从原生殖细胞制备。US 2003/0113910报道了不用胚胎或胎儿组织的衍生多潜能干细胞。还可用诱导多潜能表型的因子将其他祖细胞重编程为hES细胞(Chambers等,Cell 113:643,2003;Mitsui等,Cell 113:631,2003)。在合适的条件下,具有合适的增殖和分化能力的任何细胞可用于本发明所用分化组织的衍生。
已描述pPS细胞的增殖和维持,从而使细胞保持多潜能性。pPS细胞可用饲细胞层或无饲细胞条件增殖或维持(参见例如US 5,843,780;US 6,090,622,6,800,480,WO 01/51616;WO 03/020920;WO 06/017370;WO 07/002086;WO09/099539;WO 09/099555和Xu等.(2001)Nature Biotechnology 19:971,
已开发许多合适的市售可得基础培养基用于培养增殖细胞类型,因此其适于培养pPS细胞如hES细胞。示例为X-VIVOTM10扩增培养基(BW公司(BioWhittaker))和QBSFTM-60(品质生物公司(Quality Biological Inc.))。参见例如WO 98/30679(生命技术公司(Life Technologies Inc.))和US 5,405,772(安进公司(Amgen))。X-VIVOTM10制剂包括药物级的人白蛋白、重组人胰岛素和巴氏杀菌的人转铁蛋白。细胞增殖的外源生长因子、人工刺激物或未定义的补充物不包括在X-VIVOTM 10培养基中。其还可不含任何蛋白激酶C刺激物。QBSFTM-60是含重组或巴氏杀菌的人蛋白的无血清制剂。其他可能的替代物是JRH生物科学公司(JRH Biosciences)生产的Ex-Cell VPROTM培养基和海克隆公司(Hyclone)生产的HyQ CDM4TM和干细胞技术公司(StemCell Technologies)生产的mTESRTM。
所述基础培养基可补充有促进未分化表型增殖而同时抑制分化的添加剂。高浓度的成纤维细胞生长因子特别有效促进hES细胞增殖而不分化。示例是碱性FGF(FGF-2)和FGF-4,但所述家族的其他成员也可使用。等同形式是物种同系物、人工类似物、FGF受体的各自抗体和其他受体活化分子。从基因表达分析中已测定未分化的hES细胞表达酸性FGF(FGF-1)的受体。高浓度时,FGF单独足以促进未分化状态的hES细胞的生长。有效促进未分化hES细胞自身生长的FGF浓度通常下限为约20、30或40ng/mL,实践上限为约200、500或1000ng/mL。至少60、80或100ng/mL bFGF的浓度既可靠又节省成本。FGF的其他形式和类似物的等价浓度可通过从bFGF到推荐替代物的离乳培养,并根据下述标记***监控培养物分化而凭经验确定。
通过另一培养方法(或从初级来源获得的)扩增的pPS细胞可接种到适于维持细胞悬浮的容器中。所述容器壁通常可为惰性或对未分化pPS细胞粘附有抗性的。还有方法用于阻止细胞沉降,如搅拌机制如磁力或机械驱动的搅拌棒或桨、震动机制(通常外部结合所述容器)、或颠倒机制(即旋转所述容器以改变其在细胞上重力方向的设备)。考虑使用任何合适的搅动方法。
工艺开发所用的适于悬浮培养的容器包括通常范围的市售可得的旋转球或振荡烧瓶。适于商业生产的发酵桶是Celligen PlusTM(NB科学公司(New BrunswickScientific Co.))和搅拌釜式反应器(Stirred-Tank ReactorTM)(阿普利康公司(Applikon Inc.))。其他合适的生物反应器包括波浪式生物反应器(GE健康公司(GE Healthcare))。这些生物反应器可用培养基连续灌注或用于补料分批模式,且具有各种大小。
有关悬浮pPS细胞增殖的其他细节可参见WO 07/002086。
悬浮培养***的最优化可通过经验测试完成。先前表面或悬浮培养物中的未分化细胞可传代到测试条件中,并培养一周或更长。所述细胞可定期检测hES细胞特征,例如,使用下节所述的标记***。所述细胞还可传代回已建立的培养***,并评价未分化细胞的典型形态学特征以及与本文所述多潜能干细胞有关的任何标记。
根据本发明所用的hES细胞最终旨在分化为软骨细胞谱系的细胞。培养期间所用的合适测试可能并非未分化培养的标记概况,而是所需的细胞分化的能力。hES悬浮培养物的多潜能性可通过取样细胞、在SCID小鼠中产生畸胎瘤或就代表3种胚层的标记对EB衍生细胞染色来证实。多潜能标记包括Oct4和Nanog。
或者或此外,所述悬浮培养可包括在所述悬浮内产生表面但仍有利于在三维空间培养所述细胞的具体运载体。所述细胞可用相同的方法培养并传代,除了在培养基交换期间所述颗粒保留在容器中,和细胞***时加入更多颗粒。
一种类型的微载体是具有正电荷以增强细胞粘附的玻璃、塑料和右旋糖苷(Cytodex)等制备的固体球或半球颗粒。另一类型是盘型培养塑料如NB科学公司的Fibra-cel DisksTM固体。1克这些盘提供1200cm2的表面积。另一类型的微载体是具有允许细胞驻留内部以及外部的各种孔径的巨孔颗粒,以潜在增加保护效果。为了恢复破坏最小的hES细胞,使用温和机械或酶反应可容易溶解或分散的材料如琼脂糖制备的颗粒,从而释放细胞用于收获进一步培养。固体运载体任选用hES细胞友好的胞外基质包被,如层连蛋白、等从而粘附的细胞具有与接种在固体表面的细胞相同的微环境。
未分化的hES细胞的特征
人ES细胞具有未分化干细胞的特征性形态学特性。在标准二维显微镜图像中,hES细胞在图像平面中具有高核/质比、突出的核以及含难以辨别的细胞连接的紧凑集落形式。细胞系可用标准G-带技术(可获自许多提供常规分核型服务的临床诊断实验室如加州奥克兰的细胞遗传学实验室(Cytogenetics Lab))分核型并与公开的人核型比作较。需要获得具有“正常核型”的细胞,这表示这些细胞是整倍体,其中存在所有人染色体且未显著改变。
hES细胞可通过能被抗体检测的表达细胞标记(流式细胞术或免疫细胞化学)或通过逆转录酶PCR来表征。hES细胞通常具有抗体可检测的SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81,但几乎没有SSEA-1,且具有碱性磷酸酶活性。mRNA水平的适当可检测标记物组列于US 2003/0224411。示例为Cripto、胃泌激素释放肽(GRP)受体、足细胞标记蛋白样蛋白(PODXL)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)和POU转录因子Oct 3/4。
如上所述,已增殖hES细胞的重要特性是能分化为所有三种胚层的细胞:内胚层、中胚层和外胚层。hES细胞的多潜能性可通过形成SCID小鼠中的畸胎瘤来证实,并就所有三种胚层的代表性组织对其检测。或者,多潜能性可通过使hES细胞非特异分化(例如通过形成拟胚体)、然后通过免疫细胞化学检测培养物中呈现的细胞类型来检测。
分化多潜能细胞或软骨前体细胞为软骨细胞的标准方法
软骨细胞可通过在能富集具有所需表型的细胞(通过所需细胞过生长,或通过抑制或杀死其他细胞类型)的特定生长环境中培养、分化或重编程所述软骨前体细胞而获自本发明的DCCPC。这些方法还可用于许多形式的干细胞,包括本文所述的灵长类多潜能干细胞(pPS),包括iPS细胞。
当源自己建立的pPS细胞系时,本发明的细胞群和分离的DCCPC具有与其源自的细胞系相同的基因组。参考具有相同基因型的细胞并非旨在表示所述细胞不能由人类手工遗传操作(下文描述涵盖遗传改变细胞的实施方式)或非常小的变化(如少于完整基因组的某一百分比部分)可自发产生(如在非编码区域),而是仅表明从pPS细胞分化为软骨细胞谱系细胞的作用不会自身导致基因型改编。通常亲本(未分化细胞)和其分化后代的遗传相同性与同卵双胞胎之间的遗传相同性相似。通常所述pPS细胞系和其DCCPC或软骨细胞后代共有约96%、约97%、约98%、约99%、约99.9%遗传相同性。
本发明制备软骨前体细胞的方法不需要形成拟胚体。
在某些实施方式中,本发明制备成熟软骨细胞和/或表达II胶原的细胞的方法不需要形成构建体。在其他实施方式中,形成含软骨祖细胞的构建体可有助于DCCPC分化为成熟软骨细胞和/或表达II胶原的细胞。
为了将软骨前体细胞培养物导向软骨细胞途径,如上所述制备的前体细胞可在软骨细胞分化因子混合物中培养。各因子可单独或组合引导细胞向下游软骨途径分化,长出具有软骨细胞表型的细胞,抑制其他细胞类型生长或以另一形式富集软骨细胞:实施本发明不需要理解导致软骨细胞富集的机制。
软骨细胞分化混合物的组分可包括转化生长因子(尤其是TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)、成纤维细胞生长因子(尤其是碱性成纤维细胞生长因子,FGF-2)、生长和分化因子(尤其是GDF-5、GDF-6和GDF-7)、骨形态发生蛋白(尤其是BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7)、刺猬蛋白(尤其是印度刺猬因子,IHH)、L-抗坏血酸和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)。吉布可公司是优选的碱性FGF来源。大多数其他化合物可获自明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D***公司。
结合相同受体的其他配体或抗体可认为是本公开所述任何受体配体的等价物。
转化生长因子β(TGFβ)调节胚胎发育的各方面并在交感肾上腺祖细胞的环境中表达(Wall等,Curr.Opin.Genet.Dev.4:517,1994)。在一些***中,TGFβ调节甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)表达(Pateder等,J.Cell Physiol.188:343,2001)。认为BMP和生长分化因子(GDF)在包括关节形成在内的骨骼发生中起中心作用(Francis-West等,Cell Tissue Res 1296:111,1999)。印度刺猬因子(IHH)是刺激软骨细胞增殖的力转导复合物的关键组分(Wu等,J.Biol.Chem.276:35290,2001)。认为软骨内骨化期间两种分泌信号IHH和PTHrP形成负反馈环,调节软骨细胞肥大分化的发生。认为骨形态发生蛋白(BMP)是骨骼元件模式的信号途径和诱导软骨和骨形成机制的介质(Hoffmann等,Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.11:23,2001)。已显示BMP是IHH/PTHrP反馈环的可能相互作用物(Minina等,Development 128:4523,2001)。BMP与IHH和PTHrP良好地相互作用,协调软骨细胞增殖和分化。
软骨细胞的表型标记
II型胶原和蛋白聚糖聚合物可用作模拟关节软骨的细胞的特异标记。可就缺失弹性蛋白和I型胶原(分别为弹性软骨和纤维软骨的标记)筛选培养物。还可就缺失X型胶原和骨钙素(分别为肥大软骨和骨的标记)筛选培养物,其表明软骨内骨形成发展中生成短暂的软骨细胞表型。针对这些人类标记的市售可得抗体表如下所示(表2)。
组织特异标记可用任何合适的免疫学技术检测,如用于细胞表面标记的流式免疫细胞化学,或用于细胞内或细胞表面标记的免疫组化(例如固定细胞或组织切片)。流式细胞分析的详细方法在Gallacher等,Blood 96:1740,2000中提供。如果标准免疫细胞化学或流式细胞试验中有显著可检测量的抗体结合抗原,则细胞表面抗原的表达定义为阳性,任选细胞固定后,且任选使用已标记的二级抗体或其他偶联物来放大标记。显著可检测量的抗体可为例如与针对不相关表位的同种型抗体对照相比较时过量。可能的特异抗体来源示于表2。
表2
组织特异基因产物的表达还可通过Northern印迹分析、点印迹杂交分析或通过逆转录酶起始的聚合酶链式反应(RT-PCR)在mRNA水平检测,使用标准扩增方法中的序列特异引物。详见US 5,843,780。实时PCR还可用市售可得的***如(应用生物***公司(Applied Biosystems))进行。本公开中列举的具体标记的序列数据可获自公开数据库如GenBank。
为了方便移植,通过改进分化因子的混合物、培养条件和时机以及跟踪这些标记来使所述群中具有软骨细胞或其前体如DCCPC特征的细胞比例最大化是有益的。其中至少5%细胞合成II型胶原或蛋白聚糖聚合物或二者的群是非常合适的。富集到至少25%的细胞合成II型胶原或蛋白聚糖聚合物的群在许多环境中有效。
对于有关软骨再生的治疗应用,需要最小化所述细胞群形成弹性软骨、纤维软骨、肥大软骨和骨的能力。这表示合成I型胶原、X型胶原、或骨钙素(单独或组合)的细胞比例尽可能低,优选低于1/5的细胞就II型胶原或蛋白聚糖聚合物染色阳性,或少于1%。还需要所述群具有低剩余比例的未分化pPS细胞。优选的群有低于1%或0.2%的SSEA-4阳性(+ve)、Oct-4阳性(+ve)或内源端粒酶反转录酶表达阳性。本领域已知的任何消耗技术可用于消除不需要的细胞群。例如可使用与胞外标记特异性抗体偶联的磁珠。
动物模型实验
用于临床应用的软骨细胞开发中非常感兴趣的是细胞群在宿主中模拟软骨和恢复关节功能的能力。软骨细胞功能的重建可用数种已建立的动物模型测试。
可用模型进行预实验,所述模型中在兔子的外耳设置6mm孔,保持粘附皮肤完整。然后移植用软骨细胞接种的基质,并监控动物的孔闭合(ten Koppel等,Biomaterials 22:1407,2001)。
或者,兔子腿节的中股骨髁的承重表面产生全厚度缺损(full thickness defects)(Grigolo等,Biomaterials 22:2417,2001)。全厚度缺损使血液从骨髓腔渗入位点,形成含内源干细胞的凝块。
或者,可形成不刺穿皮下骨的部分厚度缺损(Nehrer等,Biomaterials19:2313-2328,1998)(Hunziker等,Clin.Orthop.391增刊:S171,2001)。部分厚度缺损更精确模拟外伤引起的急性软骨缺损。在该模型中,先天软骨修复的自发愈合组分降低,且内源干细胞对软骨再生长贡献很小。
用接种在生物材料上的软骨细胞修复伤口,作为单一细胞注射或用作来自构建体培养物的多细胞聚集物。生物膜如骨膜或筋膜片可用于维持适当位置的移植物。或者可使用合成基质如薇乔(vicryl)或聚二烷酮网。基质-细胞移植物还可用手术镖(surgical dart)固定。
所述工作可用滑车槽中形成的缺损完成,而不用内侧髁(medial chondyle)。其为非承重位点,且从中移动移植物没有内侧髁容易。
对于具有移植细胞和软骨沉积物的群,在手术1-6个月后检测治疗位点的组织样品。这包括II型胶原和蛋白聚糖聚合物的免疫染色。移植物的重要形态学特征包括软骨厚度、平滑关节表面、完整或重建的粘合线以及移植物和内源软骨在缺损边界的整合。移植物的长期稳定性可在12个月时确认。
作为另一选择,骨关节炎可通过向去卵巢兔子膝关节注射***来模拟,引起骨节表面一致性丧失,类似人骨关节炎中观察到的缺损(Tsai等,Clin Orthoop.291:295,1993)。或者通过支持性韧带处理的关节去稳定可用于模拟骨关节炎(Glasson S.,OsteoArthritis and Cartilage(2007)15,1061-1069)。
其他哺乳动物可用作动物模型。合适的哺乳动物包括啮齿类如大鼠和小鼠,有蹄类如猪、羊、牛和马,猫科,犬科和非人类灵长类。
上述动物模型也可用于研究移植细胞的接受或排斥。因此可研究免疫排斥的证据。免疫排斥的证据可包括白细胞浸润移植位点、炎症的证据如存在促炎细胞因子。移植细胞的损失也可表明免疫排斥。免疫排斥的其他信号可包括淋巴细胞增殖和刺激干扰素γ生产。
分化细胞的遗传修饰
本发明的某些软骨前体细胞群如DCCPC具有显著的增殖能力。若需要,还可通过增加内源基因的转录或导入转基因从而增加细胞中的端粒酶逆转录酶(TERT)水平来进一步提高复制能力。尤其适用的是国际专利申请WO 98/14592中提供的人端粒酶(hTERT)的催化组分。人细胞中端粒酶的转染和表达如Bodnar等,Science 279:349,1998和Jiang等,Nat.Genet.21:111,1999所述。根据标准方法,可就hTERT表达(通过RT-PCR)、端粒酶活性(TRAP试验)、hTERT的免疫细胞化学染色或复制能力评估遗传改变的细胞。预期使用其他使细胞永生化的方法,如用编码myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA转化所述细胞(US 5,869,243,WO 97/32972和WO 01/23555)。
若需要,可制备或进一步处理本发明细胞以体外移出未分化细胞,或针对体内回复突变体进行保护。从所述群中消耗未分化干细胞的一种方法是用载体转染所述群,所述载体中有启动子控制下的效应基因,所述启动子引起未分化细胞中的优选表达,如TERT启动子或OCT-4启动子。效应基因可为指导细胞分选的受体如绿色荧光蛋白。效应子可直接溶解入细胞,编码例如毒素或凋亡介质,如胱冬酶(Shinoura等,Cancer Gene Ther.7:739,2000)。效应基因可具有使细胞对外源试剂如抗体或前药的毒性效应易感的效果。示例为单纯疱疹胸苷激酶(tk)基因,使表达其的细胞易受更昔洛韦影响(WO 02/042445)。或者,所述效应子可引起外源决定子在细胞表面表达,这使回复为未分化表型的任何细胞易于受到体内天然产生的抗体影响(WO 02/042445)。消除不需要多潜能细胞的其他方法包括使用免疫沉淀试剂如偶联多潜能干细胞上所表达细胞表面蛋白的抗体的珠。
增殖的软骨细胞的用途
本发明提供可从pPS细胞尤其是hES细胞商业规模生产大量软骨细胞或DCCPC的方法。软骨细胞或DCCPC用于许多研究和商业目的。
治疗用途
本发明还提供使用DCCPC和其衍生物治疗引起关节灵活性损伤或有关内源软骨体内功能能力的缺损或损耗的病症。合适的对象包括任何哺乳动物如大鼠、小鼠、兔子、猪、牛、马、羊、猫、狗、非人灵长类如大猩猩或短尾猿和人。
包括冲击性外伤和运动损伤引起的伤害。本发明的细胞可考虑用于治疗退化病症,如骨关节炎和风湿性关节炎以回复失去的功能,只要引起退化的主要病理足以被良好的控制。还预期使用本发明细胞用于美容手术,包括但不限于耳、脊柱和鼻手术(即鼻子的)。参见Aesthetic Reconstruction ofthe Nose (《鼻美学重建》),G.C.Burget和F.J.Menick,MY图书(Mosby Year Book)1994;The Nose (《鼻》),Nikolay Gogol等,David R.Godine出版社,1993;和Yoo等,J.Urol.162:1119,1999。
根据本发明制备的DCCPC和/或软骨细胞可制备用于在细胞悬液中给予(若需要,使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶),使用生理相容性赋形剂:例如,含1.25mL硫酸庆大霉素(70μmol/L)、2.0mL两性霉素(2.2μmol/L)、7.5mL L-抗坏血酸(300μmol/L)、25mL血清或其等价物(至10%vol/vol)的300mL等渗培养基。细胞移植过程中,受伤的软骨可用机械或粘附保持方法保护的帽覆盖,如生物相容的纤维蛋白胶。然后可在盖帽下用约23规格的针注射溶于移植赋形剂的培养细胞(约0.6mL,含10×106软骨细胞)。
或者,DCCPC和/或软骨细胞可通过在用例如胶原膜形成的基质上培养细胞来制备(市售可得的胶原基质垫可获自瑞士的艾德盖氏公司(Ed.GeistlichSohne))。移植前数天,生长培养基换为移植赋形剂。手术中,负载细胞的基质用生物相容性粘合剂粘入受伤软骨的区域中。盖帽或基质保持原位一段足以使软骨修复的时间,然后在例如2-3个月内由身体从移植处吸收或再吸收。所述设计的进一步加工以及可再吸收帽和基质的使用可参见国际专利申请WO 01/08610。
患者选择、给药模式和支持结构的选择以及手术选择在主管临床医生的技术范围内。
为了市售目的,本发明的软骨细胞通常以药物组合物的形式提供,包含充分灭菌条件下制备的等渗赋形剂用于人给药。对于细胞组合物的药物制剂中的一般原理,读者可参考Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and CellularImmunotherapy(《细胞治疗:干细胞移植、基因治和细胞免疫治疗》),G.Morstyn和W.Sheridan编,(剑桥大学出版社(Cambridge University Press)),1996。所述组合物还可含基质以在治疗后的最初数周内保持软骨细胞。可再吸收的生物材料免去了后续手术移除的需要。除了WO 01/08610l中所述的胶原基质垫,其他可能基质包括生物可再吸收聚合物羊毛基质(Rudert等,Cells Tissues Organs 167:95,2000);透明质酸衍生物(Grigolo等,Biomaterials 22:2417,2001);聚(L-丙交酯-ε-己内酯)制备的海绵(Honda等,J.Oral Maxillofac.Surg.58:767,2000)和胶原蛋白-纤维蛋白基质(Clin.Exp.Rheumatol.18:13,2000)。
筛选用途
软骨细胞或DCCPC可用于筛选影响培养物中软骨细胞或DCCPC特征的因子(如小分子药物、肽、多核苷酸等)或条件(如培养条件或操作)。该培养物还可用于在药物研究中测试药物化合物。候选药物化合物的活性评估通常涉及将本发明的分化细胞如软骨细胞或DCCPC与候选化合物组合,检测任何结果变化,然后将所述化合物的效果与观察的结果相关联。可与已用因子或化合物处理的等价培养物作比较。细胞毒性或代谢效果可通过细胞活力、形态学、某些标记的表达或释放、受体或酶、DNA合成或修复等来测定。根据本发明制备的细胞可用于药物筛选、制备药物组合物、研究和许多其他类似目的。
在一个实例中,所述DCCPC可用于筛选促进成熟为软骨细胞的因子或促进软骨细胞在长期培养物中增殖和维持的因子。例如,候选成熟因子或生长因子可通过将其加入不同孔中的细胞,然后根据进一步培养和使用细胞所需的标准测定产生的任何表型变化(如II型胶原和/或蛋白聚糖聚合物)。可与已用因子处理的等价培养物作比较。不仅对于pPS衍生的软骨细胞,而且对于分离自软骨的软骨细胞和其祖细胞来说,这都产生改良的衍生和培养方法。
另一示例是使用DCCPC测量能在应激条件下促进软骨细胞存活的分子的效应。例如那些由损伤、手术或骨关节炎引起的外伤。
另一示例是使用软骨前体细胞测量可能影响软骨细胞活性的小分子药物在其成形或重塑软骨作用中的作用。为此,细胞可与测试化合物体外组合,且可检测所述化合物对基因表达和蛋白合成的影响。还可体内通过测量所述化合物对动物模型中细胞行为的影响来完成筛选。未处理的细胞或动物可用于比较。
本发明的其他筛选方法涉及测试药物化合物对软骨细胞生长、发育或毒性的可能影响。此类筛选不仅在所述化合物设计为对软骨细胞自身具有药学效果的时候适用,而且适用于测试设计用于其他初级药学效果的化合物的软骨细胞相关副作用。
候选药物化合物的活性评估通常涉及本发明分化细胞和候选化合物的组合,单独或与其他药物组合。(“In vitro Methods in Pharmaceutical Research(药物研究的体外方法)”,学术出版社(Academic Press),1997;和US 5,030,015)。研究人员测定了细胞的形态学、标记表型或功能活性中由所述化合物引起的任何变化(相比未处理细胞或用惰性化合物处理的细胞),然后将所述化合物的效果和观察到的变化相关联。未处理的细胞可用于比较。
细胞毒性可最初通过对细胞活力、存活、形态学的影响和某些标记和受体的表达来测定。药物对染色体DNA的效果可通过测量DNA合成或修复测定。掺入[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷或BrdU与药物效果一致,尤其是在细胞周期的不定期时间,或以高于细胞复制所需的水平。不需要的效果还可包括姐妹染色单体交换的异常比例,通过中期分散测定(A.Vickers,“In vitro Methods in Pharmaceutical Research(药物研究的体外方法)”375-410页,学术出版社,1997)。
市售
本发明的软骨细胞分化的组分可与各种有用的组合一起制备,如以下两种或更多:
·适于悬浮或贴壁培养DCCPC和/或软骨细胞的培养基
·培养基中存在或待加入或包被在合适的细胞生长表面的胞外基质组分或稠化剂
·培养基中存在或待加入的微载体
·适于悬浮培养或贴壁培养的容器
·在培养***生长或以另一形式保存但旨在用于培养***的软骨细胞或DCCPC自身
·培养中或贮存于合适赋形剂或缓冲液中的pPS细胞
·适于促进pPS细胞生长、分化和/或成熟和/或软骨前体细胞成为成熟软骨细胞的一种或多种细胞因子、生长因子、成形素等
产品和产品组合可包装在合适的容器中,任选以药盒形式,且可附有关于本发明材料使用的书面信息-如维持或扩增软骨细胞。书面信息可使用容器或药盒上标签的形式,或与容器一起包装并销售的产品插页。等同形式是用户或预期用户可获得的复印件或者电子形式的书面描述、说明或示例作为参考或市售产品相关的资源材料。
本发明还可包括细胞组和其加工、销售、或使用中任何时间存在的其他组分。所述细胞组还可包括本发明所述的两种或更多细胞群的任何组合,例如但不限于本发明方法制备的分化pPS源软骨前体细胞类型,如DCCPC与未分化pPS细胞或其他分化细胞类型(如完全分化软骨细胞)的组合,有时共有相同的基因组。所述组中的各细胞类型可一起包装,或在单独的容器中。本发明产品与所需目的的书面说明任选包装在合适的容器或药盒中,所述目的如治疗软骨缺陷、关节软骨重建或美容手术。
本发明还显示若所述培养基中存在的分化因子被移出,软骨生成培养基中分化14天的ES细胞能回复为去分化状态(DCCPC)。基于许多原因细胞去分化是有价值的:1)使用本文所述软骨生成方案的初始分化步骤在移出或分化多潜能细胞中有效,因此限制了其形成畸胎瘤的能力;2)去分化使所述细胞增殖并提供第二膨胀阶段;和3)来自初级软骨细胞的去分化细胞显示出塑料粘附性且可作为单细胞传代(不同于hESCs)。所述去分化细胞稳定且可在贴壁条件或作为构建体悬浮生长时后续分化为II型胶原表达细胞和/或成熟的软骨细胞。这些特性对细胞治疗的大规模生产非常有益。
本发明其他实施方式
1.细胞培养和细胞群
在一些实施方式中,本发明提供包含细胞群的细胞培养物,其中所述细胞群是pPS细胞的体外后代且其中所述细胞群表达CBFA1/RunX2且Ki67阴性,对多潜能标记Tra 1-60、Oct 4和nanog也为阴性。细胞群还可对多潜能标记SSEA 3和SSEA 4为阴性。
在某些实施方式中,所述细胞培养物从不含拟胚体。在一些实施方式中,所述细胞培养物仅含贴壁细胞。在一些实施方式中,所述培养物不含构建体。在其他实施方式中,所述细胞培养物可含细胞构建体。
在本发明的一些实施方式中,所述细胞培养物含细胞,其中所述细胞培养物中多于10%、多于20%、多于30%、多于40%、多于50%、多于60%、多于70%、多于80%的细胞表达CBFA1/RunX2。在本发明的一些实施方式中,所述群中85%的细胞表达CBFA1/RunX2。
在本发明的一些实施方式中,所述细胞培养物含细胞,其中所述细胞培养物中少于20%、少于10%、少于5%、少于2%、少于1%的细胞表达一种或多种下述标记:Tra 1-60、Oct 4、nanog、SSEA4、SSEA 3和Ki67。在本发明的其他实施方式中,所述细胞培养物中就至少一种下述标记:Tra 1-60、Oct 4、nanog、SSEA4、SSEA 3和Ki67没有检测出细胞。
在一些实施方式中,所述细胞培养物在表面提供,从而所述细胞直接接触塑料表面如塑料组织培养皿。在其他实施方式中,所述培养物在包被组织培养物表面的底物上提供。在一些实施方式中,所述底物可由一种或多种胞外基质组分组成。在一些实施方式中,所述底物可由层连蛋白组成。在一些实施方式中,所述底物可包括鼠肉瘤细胞提取物如在一些实施方式中,所述底物不是胶原。在一些实施方式中,所述底物不是明胶。
在一些实施方式中,所述细胞培养物含营养培养基。营养培养基可由血清组成,如胎牛血清等。在一些实施方式中,所述培养基可由约5-20%血清组成。在一些实施方式中,所述培养基由10%血清组成。在一些实施方式中,所述营养培养基是市售可得的培养基如DMEM。在其他实施方式中,所述细胞培养物含去分化培养基,如10%FBS培养基如DMEM(英杰公司)。在一些实施方式中,所述营养培养基不包括超过含10%FCS的培养基中所含的外源添加的TGFβ1、FGF2和PDGFbb。
2.生产软骨细胞谱系细胞的***
在某些实施方式中,本发明提供生产软骨细胞谱系细胞的***。软骨细胞谱系细胞可包括成熟的软骨细胞、DCCPC和/或表达以下一种或多种的细胞:II型胶原、蛋白聚糖聚合物、粘多糖。
生产软骨细胞谱系细胞的***可包含1)含pPS细胞的第一细胞群和2)含DCCPC的第二细胞群,其中所述DCCPC是部分pPS细胞的体外后代。
在其他实施方式中,本发明提供生产软骨细胞谱系细胞的***,包括1)含pPS细胞的第一细胞群和2)含表达CBFA1/RunX2且不表达Ki67的细胞的第二细胞群,其中表达CBFA1/RunX2而不表达增殖标记Ki67的细胞是部分pPS细胞的体外后代。
由于pPS细胞可建立为细胞系并因此在培养中连续生长而同时维持其多潜能性状态,其可产生实际上无限制供给的软骨细胞谱系细胞。所述软骨细胞谱系细胞与亲本pPS细胞系在遗传上基本相同。因此所述***提供持续无限制来源的软骨细胞谱系细胞,所述细胞彼此在遗传上基本相同。
在一些实施方式中,所述***从不含拟胚体。在一些实施方式中,所述***从不含构建体。在一些实施方式中,所述细胞全程维持贴壁(除了需要传代如胰蛋白酶化作用等的时候)。在本发明的一些实施方式中,含所述***的一种或两种细胞群可在塑料表面如细胞培养制品表面提供。在本发明的其他实施方式中,含所述***的一种或两种细胞群在包被组织培养物表面的底物上提供。在一些实施方式中,所述底物可由一种或多种胞外基质组分组成。在一些实施方式中,所述底物可由层连蛋白组成。在一些实施方式中,所述底物可包括鼠肉瘤细胞提取物如在一些实施方式中,所述底物不是胶原。在一些实施方式中,所述底物不是明胶。在其他实施方式中,所述第二细胞群可提供为构建体。所述构建体可提供为非贴壁细胞群如不附于塑料表面或外源提供的底物如细胞基质的细胞群。所述构建体的细胞可附着所述构建体中的其他细胞。
在本发明的一些实施方式中,所述***还可包含一种或多种营养培养基。在本发明的某些实施方式中,所述第一细胞群在含一种或多种下述物质的培养基中提供:亚油酸和牛血清白蛋白。在一些实施方式中,所述培养基还可以包含下列的一种或多种:***、胰岛素、转铁蛋白、硒、抗坏血酸、丙酮酸钠、和转化生长因子β(TGFβ)如TGFβ3。在某些实施方式中,所述培养基不含外源添加的骨形态发生蛋白。在某些实施方式中,所述培养基不含血清替代物如敲除血清替代物。
亚油酸的合适培养基浓度可为约2mg/ml-约10mg/ml;约3mg/ml-约7mg/ml;约4mg/ml-约6mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约5.35mg/ml亚油酸组成。牛血清白蛋白的合适培养基浓度可为约0.5mg/ml-约5mg/ml;约0.8mg/ml-约3mg/ml;约1mg/ml-约2mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约1.25mg/ml牛血清白蛋白组成。***的合适培养基浓度可为约10-8M-约10-6M;约10-7M-约10-6M;约10-8M-约10-7M。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约10-7M***组成。胰岛素的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml胰岛素组成。转铁蛋白的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml转铁蛋白组成。***的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml***组成。脯氨酸的合适培养基浓度可为约20μg/ml-约80μg/ml;约30μg/ml-约70ug/ml;约40μg/ml-约60μg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约40μg/ml脯氨酸组成。抗坏血酸的合适培养基浓度可为约30μg/ml-约90μg/ml;约40μg/ml-约80ug/ml;约45μg/ml-约60μg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约50μg/ml抗坏血酸组成。TGFβ的合适培养基浓度可为约1ng/ml-约30ng/ml;约5ng/ml-约20ng/ml;约8ng/ml-约15ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约10ng/ml TGFβ组成。
在本发明的一些实施方式中,所述第二细胞群在营养培养基中提供,如市售可得的培养基如DMEM(英杰公司)。在一些实施方式中,所述营养培养基不包括含10%FCS的培养基中所含的外源添加的TGFβ3、FGF2和PDGFbb。
在一些实施方式中,所述第二细胞群在含血清的营养培养基中提供。营养培养基可由血清组成,如胎牛血清等。在一些实施方式中,所述培养基可由约5-20%血清组成。在一些实施方式中,所述培养基由10%血清组成。在一些实施方式中,所述营养培养基是市售可得的培养基如DMEM。在其他实施方式中,所述细胞培养物含去分化培养基,如10%FBS培养基如DMEM(英杰公司)。
在本发明的一些实施方式中,所述第二细胞群可从含10%血清的营养培养基中转移到用于培养所述第一细胞群的培养基中。
3.生产分化的定向软骨祖细胞(DCCPC)的方法。
在某些实施方式中,本发明提供生产(DCCPC)的方法,包括1)在软骨生成培养基中培养pPS细胞和2)移出所述软骨生成培养基并用去分化培养基替代其位置。
在其他实施方式中,本发明提供生产表达CBFA1/RunX2的细胞的方法,包括1)在软骨生成培养基中培养pPS细胞和2)移出所述软骨生成培养基并用去分化培养基替代其位置。表达CBFA1/RunX2的细胞可为Ki67阴性。表达CBFA1/RunX2的细胞可就一种或多种标记Oct4、nanog、SSEA4、SSEA3、TRA-1-60为阴性。表达CBFA1/RunX2的细胞可具有成纤维细胞样形态。
在本发明的某些实施方式中,所述软骨生成培养基含以下一种或多种:亚油酸和牛血清白蛋白。所述培养基还可以包含下列的一种或多种:***、胰岛素、转铁蛋白、硒、抗坏血酸、丙酮酸钠、和转化生长因子β(TGFβ)如TGFβ3。在某些实施方式中,所述培养基不含外源添加的骨形态发生蛋白。在某些实施方式中,所述培养基不含血清替代物如敲除血清替代物。
亚油酸和合适培养基浓度可为约2mg/ml-约10mg/ml;约3mg/ml-约7mg/ml;约4mg/ml-约6mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约5.35mg/ml亚油酸组成。牛血清白蛋白的合适培养基浓度可为约0.5mg/ml-约5mg/ml;约0.8mg/ml-约3mg/ml;约1mg/ml-约2mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约1.25mg/ml牛血清白蛋白组成。***的合适培养基浓度可为约10-8M-约10-6M;约10-7M-约10-6M;约10-8M-约10-7M。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约10-7M***组成。胰岛素的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml胰岛素组成。转铁蛋白的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml转铁蛋白组成。***的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml***组成。脯氨酸的合适培养基浓度可为约20μg/ml-约80μg/ml;约30μg/ml-约70ug/ml;约40μg/ml-约60μg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约40μg/ml脯氨酸组成。抗坏血酸的合适培养基浓度可为约30μg/ml-约90μg/ml;约40μg/ml-约80μg/ml;约45μg/ml-约60μg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约50μg/ml抗坏血酸组成。TGFβ的合适培养基浓度可为约1ng/ml-约30ng/ml;约5ng/ml-约20ng/ml;约8ng/ml-约15ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约10ng/ml TGFβ组成。
在本发明的一些实施方式中,所述去分化培养基包含市售可得的培养基如DMEM(英杰公司)。培养基可由血清组成,如胎牛血清(FCS)。在某些实施方式中,所述培养基约为10%FCS。在一些实施方式中,所述培养基不包括超过含10%FCS的培养基中所含的外源添加的TGFβ1、FGF2和PDGFbb。
在本发明的一些实施方式中,生产DCCPC的方法包括贴壁培养pPS细胞。在本发明的一些实施方式中,所述pPS细胞从未形成拟胚体。在本发明的某些实施方式中,所述方法还包括在软骨生成培养基中培养后从贴壁表面移除细胞,通过例如离心使所述细胞成团,在去分化培养基中重悬所述细胞(并过滤细胞形成单细胞悬液),然后在去分化培养基中的新贴壁表面重接种所述细胞。
在本发明的一些实施方式中,制备DCCPC的方法的步骤1)使pPS向软骨细胞谱系细胞途径分化。因此,步骤1)包括将pPS细胞分化为软骨细胞谱系细胞的方法。软骨细胞谱系细胞可表达一种或多种选自II型胶原、I型胶原、X型胶原、蛋白聚糖聚合物的标记。软骨细胞谱系细胞可具有圆形形态。
4.生产软骨细胞谱系细胞和软骨细胞的方法
在一些实施方式中,本发明提供生产软骨细胞的方法,包括1)获得DCCPC和2)将所述DCCPC分化为软骨细胞。
在其他实施方式中,本发明提供生产表达一种或多种下述标记的细胞的方法:II型胶原、蛋白聚糖聚合物和GAG,所述方法包括1)获得DCCPC和2)将DCCPC分化为表达一种或多种下述标记的细胞:II型胶原、蛋白聚糖聚合物和GAG。
在一些实施方式中,DCCPC可通过按照上述任何方法制备DCCPC而获得。在其他实施方式中,DCCPC可从个体或生产其的整体中获得。
在一些实施方式中,通过在软骨生成培养基中培养合适长度的时间,DCCPC分化为软骨细胞。在其他实施方式中,通过在软骨生成培养基中培养合适长度的时间,DCCPC分化为表达一种或多种下述标记的细胞:II型胶原、蛋白聚糖聚合物和GAG。
在本发明的一些实施方式中,DCCPC先在去分化培养基中生长。为了按照步骤2)开始分化细胞,所述细胞换到软骨生成培养基中。转换培养基可包括细胞传代的步骤,如用合适的化合物或化合物组合如胰蛋白酶从贴壁表面移除,通过离心成团和在软骨生成培养基中重悬并重接种到贴壁表面或作为所述软骨生成培养基中的细胞构建体在悬液中维持。在其它实施方案中,所述细胞不传代。所述细胞反而保持粘附贴壁表面并轻轻倒出培养基。所述细胞可任选用合适的缓冲液如PBS清洗,然后添加软骨生成培养基。
软骨生成培养基可包括以下一种或多种:亚油酸和牛血清白蛋白。所述培养基还可以包含下列的一种或多种:***、胰岛素、转铁蛋白、硒、抗坏血酸、丙酮酸钠、和转化生长因子β(TGFβ)如TGFβ3。在某些实施方式中,所述培养基不含外源添加的骨形态发生蛋白。在某些实施方式中,所述培养基不含血清替代物如敲除血清替代物。
亚油酸和合适培养基浓度可为约2mg/ml-约10mg/ml;约3mg/ml-约7mg/ml;约4mg/ml-约6mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约5.35mg/ml亚油酸组成。牛血清白蛋白的合适培养基浓度可为约0.5mg/ml-约5mg/ml;约0.8mg/ml-约3mg/ml;约1mg/ml-约2mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约1.25mg/ml牛血清白蛋白组成。***的合适培养基浓度可为约10-8M-约10-6M;约10-7M-约10-6M;约10-8M-约10-7M。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约10-7M***组成。胰岛素的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml胰岛素组成。转铁蛋白的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml转铁蛋白组成。***的合适培养基浓度可为约3ng/ml-约20ng/ml;约5ng/ml-约15ng/ml;约6ng/ml-约9ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约6.25ng/ml***组成。脯氨酸的合适培养基浓度可为约20μg/ml-约80μg/ml;约30μg/ml-约70ug/ml;约40μg/ml-约60μg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约40μg/ml脯氨酸组成。抗坏血酸的合适培养基浓度可为约30μg/ml-约90μg/ml;约40μg/ml-约80μg/ml;约45μg/ml-约60μg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约50μg/ml抗坏血酸组成。TGFβ的合适培养基浓度可为约1ng/ml-约30ng/ml;约5ng/ml-约20ng/ml;约8ng/ml-约15ng/ml。在本发明的一个实施方式中,所述培养基由约10ng/ml TGFβ组成。
在软骨生成培养基中培养DCCPC的合适时间长度可为约4-28天;约5-25天;约7-21天。在一些实施方式中,DCCPC在软骨生成培养基中培养约7天;约10天;约15天;约21天;约25天。在一个实施方式中,DCCPC在软骨生成培养基中培养21天。
在本发明的一些实施方式中,生产软骨细胞的方法包括贴壁培养DCCPC。在本发明的一些实施方式中,生产表达一种或多种以下标记:II型胶原、蛋白聚糖聚合物和GAG的细胞的方法包括贴壁培养DCCPC。在本发明的一些实施方式中,可获得DCCPC而不形成拟胚体。在本发明的一些实施方式中,所述细胞在该方法全过程中保持贴壁(应理解细胞可从贴壁表面短暂移除用于传代,但其他情况下都维持贴壁)。
在一些实施方式中,所述方法包括形成构建体的步骤。构建体可通过从贴壁表面移除细胞并例如通过离心使所述细胞成团而形成。例如可形成DCCPC的构建体并在进行步骤2)时置于软骨生成培养基中。在其他实施方式中,该方法可不包括形成细胞构建体的步骤。形成构建体的合适细胞数量可为约100,000细胞-约600,000细胞;约200,000细胞-约500,000细胞;约250,000细胞-约350,000细胞。在一个实施方式中,约250,000细胞用于形成构建体。
在一些实施方式中,贴壁培养DCCPC可包括在塑料组织培养物表面培养它们。在本发明的其他实施方式中,贴壁培养DCCPC可包括在底物上培养DCCPC。所述底物可包括胞外基质组分。在一些实施方式中,所述底物可包括层连蛋白。在一些实施方式中,所述底物可包括鼠肉瘤细胞提取物如在一些实施方式中,所述底物不是胶原。在一些实施方式中,所述底物不是明胶。在一些实施方式中,该方法的步骤1)和步骤2)在附于贴壁表面的细胞上进行。在其他实施方式中,DCCPC获自贴壁表面,但在细胞悬浮如采用构建体形式时进行步骤2)。
5.给予对象细胞组合物的方法
在某些实施方式中,本发明提供将含软骨细胞系细胞的细胞组合物给予对象的方法,从而所述细胞组合物移植入所述对象而不对所述细胞组合物产生排斥该移植细胞组合物的免疫响应,所述方法包括1)获得含软骨细胞系细胞的细胞组合物和2)将所述软骨细胞系细胞给予所述对象而不给予所述对象免疫调节化合物。合适的软骨细胞谱系细胞可包括例如成熟的软骨细胞、DCCPC、表达一种或多种下述标记的细胞:II型胶原、蛋白聚糖聚合物和GAG。在其他实施方式中,免疫抑制药物可适当地随后、同时或分别共给予。
在某些实施方式中,软骨细胞谱系细胞作为移植物维持约10天、约30天、约60天、约90天、约180天、约1年而不产生免疫响应。在其他实施方式中,软骨细胞谱系细胞作为移植物维持多于1个月、多于3个月、多于6个月、多于1年而不产生免疫响应。
软骨细胞谱系细胞可给予需要软骨修复或再生的任何位置。作为示例,所述细胞可给予关节炎性关节或遭受急性损伤的位置(图4)。使用软骨细胞修复患者膝盖软骨的这类过程为本领域已知。例如CARTICELTM自体软骨细胞移植(ACI)过程涉及从低承重位置取软骨样品并体外扩增外植软骨细胞。在后期手术中,骨膜贴片缝合到软骨缺陷表面,且培养的软骨细胞制品在该贴片下注射并填充该缺陷。
如上所述,可给予软骨细胞谱系细胞制品而没有通常与细胞移植物一起给予的免疫调节化合物如免疫抑制剂。或者,该化合物可适当地使用。免疫抑制剂的示例包括环孢菌素、FK-506,且免疫调节剂化合物的示例为抗炎剂如甾族化合物如强的松等。
给予的细胞组合物可与所述对象同种异体。给予的细胞组合物可与所述对象异种异体。因此在一些实施方式中,所述细胞组合物与主要组织相同性复合物如MHC I和/或MHC II的一种或多种等位基因具有完全或部分错配。在一些实施方式中,所述细胞组合物可与所述对象同系。合适的对象包括任何哺乳动物,如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、羊、猪、非人灵长类、人。
所述细胞组合物可手术给予所述位置。或者所述细胞组合物可通过注射或通过使用关节镜技术给予所述位置。
在某些实施方式中,所述细胞组合物可为约1x104细胞-约1x108细胞。在一些实施方式中,将约1x104细胞给予所述对象。在一些实施方式中,将约1x105细胞给予所述对象。在一些实施方式中,将约1x106细胞给予所述对象。在其他实施方式中,将约1x107细胞给予所述对象。在一些实施方式中,将约1x108细胞给予所述对象。
本发明的第二和后续方面的优选特性如第一方面所述,加以必要的变更。
后续实施例旨在说明而不意在限制所要求的发明
实施例
材料和方法
流式细胞术方法:
从底物中升起单层细胞并用胰蛋白酶(吉布可公司(Gibco))分解。移除胰蛋白酶并在PBS中清洗细胞,最后在含1%FBS的PBS(吉布可公司)中重悬。将样品等分到含有1:50稀释的下述抗体的5个试管中。
表3
细胞4°C孵育30分钟,然后在PBS中清洗所述细胞。然后用BD FACSFlowTM鞘液在BD公司(Becton Dickinson)的FACSCaliburTM流式细胞仪上运行细胞。
免疫细胞化学方法:
观察Tra-1-60表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。含10%正常羊血清和1%BSA(西格玛公司(Sigma))的封闭液室温应用1小时。在含1%BSA和1%正常羊血清的PBS中1:100稀释的Tra-1-60小鼠抗体(阿柏堪穆公司(Abcam)ab16288)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用含1%BSA、1%正常羊血清的PBS中1:200稀释的抗小鼠二抗(羊抗小鼠Alexa488(分子探针公司(Molecular Probes))室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针公司)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司(Dako))中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察Nanog表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。细胞用0.4%曲通X-100室温渗透15分钟。含10%正常羊血清(西格玛公司(Sigma))的封闭液室温应用1小时。在含2.5%BSA和10%正常羊血清的PBST中1:100稀释的nanog兔抗体(阿柏堪穆公司(Abcam)ab16288)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用含0.1%BSA、1%正常羊血清的PBS中1:200稀释的抗兔二抗(羊抗兔Alexa488(分子探针公司))室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针公司)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察Oct4表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。细胞用100%乙醇室温孵育2分钟。含10%正常羊血清和1%BSA(西格玛公司(Sigma))和0.1%曲通X-100的封闭液室温应用1小时。在1%封闭液中1:50稀释的Oct4小鼠抗体(圣克鲁兹(Santa Cruz)SC-5279)4℃应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用PBS中1:400稀释的抗小鼠二抗(羊抗小鼠Alexa488分子探针公司))室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察I型胶原表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。大科细胞公司(Dako cytomation)的蛋白封闭物室温应用1小时。在大科REAL抗体稀释液中1:200稀释的I型胶原小鼠抗体(西格玛公司)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用PBS中1:1000稀释的抗小鼠二抗(羊抗小鼠Alexa488(分子探针公司))室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察II型胶原表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。大科细胞公司(Dako cytomation)的蛋白封闭物室温应用1小时。在大科REAL抗体稀释液中1:20稀释的II型胶原小鼠抗体(CII-C1克隆,爱荷华大学杂交瘤库)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用PBS中1:1000稀释的抗小鼠二抗(羊抗小鼠Alexa488(分子探针公司))室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察X型胶原表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。大科细胞公司(Dako cytomation)的蛋白封闭物室温应用1小时。在大科REAL抗体稀释液中1:20稀释的X型胶原小鼠抗体(西格玛公司)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用PBS中1:1000稀释的抗小鼠二抗(羊抗小鼠Alexa488(分子探针公司))室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察Cbfa1/RunX2表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBST清洗。含10%正常羊血清和1%BSA(西格玛公司(Sigma))和0.1%曲通X-100的封闭液室温应用1小时。1%封闭缓冲液中1:200稀释的Cbfa1大鼠抗体(R&D MAB2006)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBST清洗并用PBS中1:400稀释的抗大鼠二抗(羊抗大鼠Alexa488(分子探针公司)室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针)染色细胞10分钟。然后用盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
观察Ki67表达
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。细胞用0.25%曲通X-100室温渗透10分钟。含PBST中10%正常羊血清(西格玛公司)和1%BSA的封闭液室温应用1小时。含1%BSA的PBST中1:100稀释的Ki67兔抗体(阿柏堪穆公司ab15580)4°C应用过夜。移除抗体后,所述细胞用PBS清洗并用含0.1%BSA、1%正常羊血清的PBS中1:200稀释的抗兔二抗(羊抗兔Alexa488(分子探针公司)室温孵育1小时。进一步PBS清洗后,用PBS中1:1000的DAPI(分子探针公司)染色细胞10分钟。然后盖玻片将细胞置于荧光封固剂(大科公司)中并用蔡司荧光显微镜观察。
冯库萨试验
用4%PFA固定单层细胞10分钟,然后用PBS(吉布可公司)清洗。用ddH2O进一步清洗后,所述样品在强光下用含5%硝酸银的ddH2O孵育1小时。用ddH2O进一步清洗后,所述样品用5%硫代硫酸钠孵育5分钟。用ddH2O进一步清洗后,所述样品可在明视野显微镜中成像。
观察LDH活性
组织切片在低温恒温器上制成10μm厚并维持于-20°C直到使用。PolypepTM储液:ddH2O中的4%PolypepTM、0.05M gly-gly、0.017M NaOH。反应混合物:PolypepTM母液中的60mM乳酸、1.75mg/ml烟酰胺腺嘌呤核苷酸、3mg/ml硝基氮蓝四唑(所有化学物来自西格玛))。向所述样品中加入反应混合物并在37°C孵育3小时。然后样品在ddH2O、随后丙酮、最后PBS中冲洗,然后安装并在明视野显微镜上成像。
培养基
软骨生成培养基:DMEM(西格玛D5671)、1%胰岛素、转铁蛋白、硒(6.25ng/ml胰岛素、6.25mg转铁蛋白,6.25ng/ml***、1.25mg/ml牛血清蛋白和5.35mg/ml亚油酸)(BD生物科学公司354352)、1%L-谷氨酰胺(吉布可25036)、1%非必需氨基酸(吉布可11140)、1%丙酮酸钠(西格玛S8636)、350μM L-脯氨酸(西格玛P5607)、0.1μM***(卡巴开265005)、172.7μM抗坏血酸(西格玛A8960)、10ng/ml TGF-β3
去分化培养基:DMEM(西格玛D5671)、10%FBS(吉布可10500-064)
成骨培养基:敲除DMEM(吉布可10829)、10%FBS(吉布可10500-064)、1%L-谷氨酰胺(吉布可25036)、1%非必须氨基酸(吉布可11140)、β巯基乙醇(吉布可31350-010)、0.1μM***(卡巴开265005)、50μM抗坏血酸(西格玛A8960)、10mM β-磷酸甘油(卡巴开35675)。
实施例1:生产软骨祖细胞
DCCPC用下述方案生产。初始H7ES细胞用包被的烧瓶和标准ES培养条件生长至80%融合。此时将培养基替换为软骨生成培养基。细胞维持在其原始烧瓶中并仍在上从而减少成本和操作。细胞在这些条件中再培养14天,一周替换软骨生成培养基3次。在第14天所述细胞层用PBS清洗且用去分化培养基替换软骨生成培养基。细胞仍留在其原始烧瓶中。再培养5天后,所述细胞显示出去分化迹象且被胰蛋白酶传代为单个细胞。
材料
方案
在标准无饲细胞的hESC培养条件下,hESC于T25或T75烧瓶中培养至在上融合,条件培养基补充有10ng/ml bFGF。然后抽出所述培养基并用PBS清洗细胞。然后,对细胞应用完全软骨生成培养基(DMEM(吉布可公司)、10-7M***(卡巴开公司)、ITS+预混物(6.25ng/ml胰岛素、6.25mg转铁蛋白、6.25ng/ml***、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35mg/ml亚油酸,BD生物科学公司),40μg/ml L-脯氨酸(西格玛公司)、50μg/ml抗坏血酸(西格玛公司)、100μg/ml丙酮酸钠(西格玛公司)和10ng/ml TGF-β3(派普罗泰克公司))。使用体积与常规培养中所用的相当,即T257ml和T7515ml。
然后所述细胞在软骨生成培养基中培养14天,一周更换培养基3次。第14天所述细胞显示凝聚成被死亡和漂浮细胞的团块围绕的集落。抽出所述培养基并用PBS清洗细胞。
然后用含10%FBS的DMEM(吉布可公司)(“去分化培养基”)替代培养基,并再培养5天,一周更换培养基3次。这5天中细胞增殖并迁移出所述集落,从而所述烧瓶在第5天>80%融合。此阶段的所述细胞为本发明的DCCPC。
在第5天所述细胞通过标准方法用胰蛋白酶传代。大多数细胞在5分钟内作为单细胞升起。较大的集落团块通过敲击烧瓶或吸移所述培养基而从表面升起。加入含FBS的DMEM以终止胰蛋白酶作用。将细胞从悬液中离心出并移除胰蛋白酶上清。细胞经过50μm孔径滤器从而获得去分化培养基中的单一细胞悬液。
然后将细胞接种于在塑料或上。或者使用hESC所用的标准方法将细胞制备到构建体中(含250,000细胞的1ml软骨生成培养基在15ml试管中800rpm旋转5分钟并以此形式培养7-21天,每3天更换培养基并离心)。使用构建体方法时,所述细胞在软骨生成培养基中于16-48小时内形成构建体。使用接种方法时,细胞在去分化培养基中24小时以附着表面,然后更换成软骨生成培养基。
发现使用这些条件时,接种于塑料上的DCCPC会保持细胞数量但不增殖到去分化培养基中的任何程度,即其不会在这些条件下增加。还发现塑料粘附细胞不表达ES或MSC标记。当用作底物时,观察到更高的接种效率。细胞维持在去分化培养基中时,表面上的DCCPC显示出增殖的迹象。DCCPC接种在底物上并维持在EB培养基(KnockoutTM D-MEM(吉布可公司)、10%FBS(吉布可公司)、1%L-谷氨酰胺(吉布可公司)1%非必须氨基酸(吉布可公司)和0.1mM β巯基乙醇(吉布可公司))中时,所述细胞显示出高速率的增殖且没有丧失软骨生成能力。
实施例2:形态
所述细胞的形态在所述方案中显著变化。14天后我们的软骨生成培养基中的细胞显示出典型的软骨细胞形态,细胞体聚拢且细胞簇集为致密集落(图1)。第14天,所述培养基换为去分化培养基且第15-19天在去分化培养基中所述细胞显示出呈成纤维细胞样形态并开始在培养物表面重建。
高比例的原始ES细胞死亡并形成大量死亡细胞,表现为紧邻细胞层上方的相明亮团块。这些团块可洗去但不能显著搅动。14天后所述融合低至20%。然而,集落密度的增加表明融合降低不与细胞数量降低直接相关。
用去分化培养基替代软骨生成培养基后,细胞形态显著改变。细胞迁移出集落(用定时显微摄影术观察)并具有更类似成纤维细胞的形态。细胞增殖并在接下来的5天中开始在烧瓶中重建。大量死亡细胞在此去分化阶段也洗去,从而第19天时没有死亡细胞残留。此时,所述细胞仍留在其原始烧瓶中并因此在原始包被上。该状态中细胞增殖。这仅在胰蛋白酶处理并接种于DCCPC停止增殖的塑料后发生。
DCCPC细胞具有与分离的初级软骨细胞不同的形态。DCCPC生长为单游动细胞,并从致密细胞簇中移出。这与更圆的初级软骨细胞非常不同,后者活跃地形成凝聚的三维集落。
实施例3:DCCPC的表征
塑料粘附细胞:
维持在去分化培养基中的塑料粘附DCCPC用流式细胞仪分析显示没有ES多潜能标记或MSC标记。
与流式数据相同,使用不同Tra-1-60抗体的免疫细胞化学在DCCPC中未显示TRA-1-60蛋白表达的迹象。Tra-1-60染色没有在塑料粘附DCCPC上出现。未分化的H7ES细胞用作抗体的对照且显示亮膜相关的染色。计数1053细胞后,在DCCPC群中没有观察到TRA-1-60阳性细胞。因此,TRA-1-60蛋白表达在该群中不可检测。
如ICC所测,所述DCCPC不表达多潜能标记Oct4。DCCPC中没有观察到Oct4核染色的证据。用作抗体阳性对照的H7ES细胞显示明亮的核染色。没有一抗时孵育的细胞用作染色的阴性对照。计数的1537个细胞中没有显示出核Oct4染色。
如ICC所测,所述DCCPC不表达多潜能标记Nanog。用作抗体阳性对照的H7ES细胞显示明亮的核染色。没有一抗时孵育的细胞用作染色的阴性对照。计数的479个细胞中没有显示出核Nanog染色,表明Nanog蛋白表达在该群中不可检测。
还通过ICC分析塑料粘附DCCPC的II型胶原(软骨生成标记)表达和CBFA1/RunX2核标记表达,其用于成骨和肥大软骨细胞—尽管其不限于这些细胞类型。大多数DCCPC就CBFA1/RunX2为阳性(图2),不同于缺少CBFA1/RunX2蛋白表达的初级(非肥大)软骨细胞。1482个计数细胞中99个(~7%)未显示II型胶原表达。剩余细胞显示出低水平的胞内II型胶原蛋白表达。
图2中,发现1575个细胞中的1336个中存在所述核cbfa1/RunX2染色。因此,85%的塑料粘附DCCPC显示核CBFA1/RunX2蛋白表达。
构建体形式中的DCCPC
如前所述,DCCPC可作为构建体培养从而将所述细胞再分化为软骨细胞。将含250,000细胞的1ml软骨生成培养基置于15ml试管中并800rpm旋转5分钟,以此形式培养7–21天,每3天更换培养基并离心。使用该方法时,所述细胞在软骨生成培养基中于16-48小时内形成三维构建体。用塑料粘附细胞时,还分析所述构建体形式内的细胞。分析的细胞已在构建体形式中7、14和21天。
生成DCCPC的构建体的生长状态与针对Ki67产生的抗体一起研究。针对该抗原产生的抗体会在细胞周期的所有阶段选择细胞且仅处于G0中的那些细胞不被染色。没有迹象表明任何DCCPC构建体中的核Ki67染色,表明所述细胞不再周期性变化(静止),不再增殖。
通过ICC在构建体形式内研究多潜能标记。第7、14或21天,Oct4、TRA-1-60或Nanog蛋白表达在任何细胞构建体中均未发现。压团的ES细胞用作这些试验的阳性对照。
实施例4:塑料粘附DCCPC的成软骨重分化:
成软骨重分化:
DCCPC在塑料上通过施用软骨生成培养基进一步重分化21天。研究胶原蛋白表达以测定所述细胞是否变为软骨细胞样。如上所述,DCCPC通过ICC分析时显示出较低II型胶原蛋白表达。然而,当用软骨生成培养基处理所述塑料粘附DCCPC时,II型胶原蛋白表达增加。相反,X型胶原表达在整个DCCPC方案中都不存在且在重分化后不增加。这些数据一起表明用软骨生成培养基处理后DCCPC向软骨细胞谱系分化但不变为肥大软骨细胞。
成骨重分化:
分析DCCPC以观察在成骨培养基中培养时其是否分化为成骨细胞。尽管并非成骨细胞特异性,I型胶原对骨形成关键。在成骨培养基中培养21后,ICC试验中检测产生胞外I型胶原的细胞(图3)。已知I型胶原的形成被初级软骨细胞下调,所述细胞在塑料上以单层形式培养时分化,从而这里出现所述蛋白并不是骨生成的决定性标记。用冯库萨反应分析时,分化的DCCPC不能矿化分泌的基质。冯库萨反应被视作矿化组织中发现的钙离子标记。矿化为骨生成所必需,缺少其表明所述细胞不是功能性的成骨细胞。H1hESC用相同的成骨培养基直接处理作为对照,显示其产生矿化的基质。因此该数据说明DCCPC方案有有限的分化能力,表明谱系定向程度。所述方案似乎限制所述细胞分化为软骨细胞谱系的能力。
实施例5:构建体形式中的DCCPC的成软骨重分化:
用乳酸脱氢酶(LDH)试验就细胞活力分析制备到构建体形式中的DCCPC。在该试验中,所有细胞显示出指示活性LDH的深染色。该数据说明完整三维构建体在第7、14和21天存活。
初级人关节软骨组织由大量胞外基质构成,如少于2%体积的成熟组织被软骨细胞占据(Hunziker,Quinn等2002)。所述软骨细胞产生的基质组合物对其功能很重要,且还用作成软骨分化的标记。
pH1时的阿辛蓝用于观察粘多糖(GAG)而不是透明质酸。DCCPC构建体显示相对较低的染色,除了第14天。番红O染色还用于分析DCCPC所产生基质的GAG含量。番红O染色(统一染色GAG)在第7天的样品中最低且到第14天稍稍增加。然后在第21天有非常显著的增加。这些数据一起说明DCCPC构建体的GAG含量在整个培养中增加,以及透明质酸和其他酸性GAG显著增加。
胶原占关节软骨干重的约60%。II型胶原占该胶原成分的90-95%。DCCPC构建体在第7天显示低水平的II型胶原染色。第14天-第21天整个构建体的染色水平提高,与观察到的基质的GAG含量增加有关。第7天DCCPC构建体还就I型和X型胶原进行分析。在该早期时间点没有观察到胶原。
第14天-第21天DCCPC生成的构建体的尺寸快速增长。由于Ki67试验显示没有细胞处于细胞周期中,所以这种尺寸增加看来是由于基质产生而不是细胞增殖。DAPI染色显示第21天切片中构建体体积中含非常少的细胞。
实施例6:软骨细胞构建体移植入体内模型
成年3月龄雄性Sprague-dawley大鼠(免疫活性野生型;WT)(哈伦英国有限公司(Harlan UK limited))用于本研究。所有动物在爱丁堡大学的动物保护和伦理委员会指导原则下饲养,且所述过程由英国内政部许可批准。所有操作在全身麻醉下进行(2-3.5%异氟烷)。术后镇痛由手术后24小时两次丁丙诺啡注射诱导(0.05%mg/Kg)。标准内侧髌骨旁入路(medial parapatellar)法用于暴露膝盖。在大鼠膝盖股滑车的承重区域的关节软骨中产生1mm直径的软骨缺损。第14天将老DCCPC构建体植入所述缺损并用纤维蛋白胶密封(英国纽柏里的巴克斯特健康有限公司(Baxter Healthcare Ltd,Newbury,UK))。进行分层闭合。不使用免疫调节药物。术后用合适镇痛法使动物能自由移动。3周后收集样品。通过吸入CO2处死动物(1986年动物(科学程序)法案(the Animals(Scientific Procedures)Act)第1部分批准)且切开的膝盖短暂浸入5%聚乙烯醇中(PVA,西格玛-艾尔德里奇公司)并立即在保持-80°C的己烷(西格玛-艾尔德里奇公司)中速冻。
为了组织学检测,冷冻的膝盖相对所述缺损径向垂直低温切割(10μm)并置于组织学超薄带上以维持所述组织的形态。冷冻切片在4%(w/v)多聚甲醛中固定并在PBS中清洗。苏木精和伊红染色用于组织学分析。结果见图4。
技术人员应理解,可按常见优化修改本发明而不背离本发明的精神或所附权利要求的范围。
Claims (10)
1.一种软骨前体细胞分离群,其中1%或更少的细胞表达Oct4、Nanog和/或TRA-1-60,7%或更少的细胞不表达II型胶原、X型胶原、CD105或Stro-1和85%或更多的细胞表达CBFA1。
2.一种软骨前体细胞分离群,所述细胞群特征为丧失转分化能力。
3.一种制备软骨前体细胞的方法,所述方法包括步骤:
(a)在软骨发生培养基中分化灵长类多潜能干细胞(pPS)群直到所述细胞大于75%融合;
(b)清洗细胞并在定义的最小生长培养基中重悬;
(c)将获自(b)的细胞再培养一段时间,直到所述细胞分化为软骨前体细胞群,所述细胞群特征为丧失转分化能力。
4.一种制备软骨前体细胞的方法,所述方法包括步骤:
(a)在软骨发生培养基中分化灵长类多潜能干细胞(pPS)群直到所述细胞大于75%融合;
(b)清洗细胞并在定义的最小生长培养基中重悬;
(c)将获自(b)的细胞再培养一段时间,直到所述细胞分化为软骨前体细胞群,所述细胞群特征为1%或更少的细胞表达Oct4、Nanog和/或tra-1-60,7%或更少的细胞不表达II型胶原、X型胶原、CD105或Stro-1和85%或更多的细胞表达CBFA1。
5.一种制备分离的软骨细胞群的方法,所述方法包括步骤:
(a)在软骨发生培养基中重悬如权利要求2或权利要求3所述的方法获得的细胞群;
(b)培养步骤(a)中获得的细胞悬液。
6.一种权利要求1或权利要求2中所述的软骨前体细胞分离群在制备用于移植的软骨细胞中的用途。
7.一种治疗退行性软骨疾病或软骨损伤的方法,所述方法包括将如权利要求1或权利要求2中所述的分离软骨前体细胞群制备的软骨前体细胞群移植到需要的对象中。
8.一种就调节软骨细胞生长、分化或合成软骨组分的能力筛选化合物的方法,所述方法通过将所述化合物与权利要求1或权利要求2中所述的软骨前体细胞群混合并检测其效果。
9.一种体内产生、修复或维持软骨的药物组合物,所述组合物包含从权利要求1或权利要求2中所述的软骨前体细胞群制备的软骨细胞。
10.一种将含软骨细胞谱系细胞的细胞组合物给予对象的方法,从而所述细胞组合物移植入所述对象而不对所述细胞组合物产生排斥所述移植细胞组合物的免疫响应,所述方法包括1)获得含软骨细胞谱系细胞的细胞组合物和2)将所述软骨细胞谱系细胞给予所述对象而不给予所述对象免疫调节化合物。
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