CN102924670A

CN102924670A - 新型环糊精聚合物手性拆分剂的合成及应用

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Publication number: CN102924670A
Application number: CN2012104304312A
Authority: CN
Inventors: 包建民; 李优鑫; 贾菲菲; 梁清刚
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-11-01
Also published as: CN102924670B

Abstract

本发明公开了一种新型环糊精聚合物手性拆分剂的合成方法，以新型合成思路获得取代位置和取代度均一的衍生化环糊精手性拆分剂，这种新型手性拆分剂是由环糊精经过聚合和磺酸化反应制备得到，将取代不均一的衍生化环糊精连接成聚合物，此法不仅具有合成方法简单，步骤少，提纯和回收容易，合成成本低等优点，并且实现了环糊精衍生化取代在统计学意义上的均一化，提高了柱效和分离度，同时改善环糊精溶解度，减小了电泳分离时焦耳热。通过合成磺酸化β-环糊精聚合物并对其进行的表征结果证明本发明设计思想的优势，将此聚合物作为缓冲液添加剂可以用于毛细管电泳手性化合物分离中。

Description

新型环糊精聚合物手性拆分剂的合成及应用

技术领域

本发明涉及一类新型手性拆分剂——磺酸化环糊精聚合物的合成方法及应用，该类聚合物可作为手性拆分剂添加至毛细管电泳运行缓冲液中，用于毛细管电泳手性化合物的分离，具有合成方法简单，步骤少，提纯和回收容易，合成成本低等优点，并且实现了环糊精衍生化取代在统计学意义上的均一化，提高了柱效和分离度，同时改善环糊精溶解度，减小了电泳分离时焦耳热，有利于工业化大规模使用，具有较好的经济价值和应用前景。

背景技术

手性是自然界的一种普遍现象，构成生物体的基本物质，如氨基酸、糖类等都是手性分子。手性分离尤其是手性药物的拆分主要具有两方面的意义：药理毒理学意义和巨大的经济价值。

与高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）等技术相比，用毛细管电泳（CE，capillaryelectrophoresis）技术进行手性拆分具有费用低，分析速度快，手性衍生化简单，所需样品量少，灵敏度和柱效高等优点。

对于CE手性分离，利用手性选择剂来构建立体选择性环境是实现对映体区分的关键。手性选择剂的种类很多，其中，环糊精（CDs，cyclodextrins）及其衍生物是应用最为广泛的一类手性拆分剂，其对多种结构各异的手性化合物显示出优良的手性识别能力。环糊精的空间结构具有一个疏水的桶状空腔，空腔与对映体间的包合作用的差异，以及包合后迁移率的变化导致了对映体的分离。天然环糊精及其中性衍生物，如β-环糊精，虽已成功分离了一些手性化合物，但是其溶解度低和难以拆分中性对映体等缺点限制了其实际应用，参见Salvatore Fanali的文章“Fanali S.J.Chromatogr.A,1996,735:77~121.”。带电CDs衍生物因具有自身电泳淌度而能将中性对映体分离开。对环糊精进行衍生化不仅可以提高选择性，还可以扩大手性分离范围。

环糊精分子中有多个反应活性相似的羟基，以此环糊精为母体的衍生化产物也有其局限性：1）带电CDs衍生物通常是不同离子基团取代度和取代位置不同的混合物，会对手性化合物的分离产生不利影响，如重现性差、柱效低等；2）带电CDs衍生物对缓冲液的离子强度贡献高，随之产生较高的运行电流，增加了电泳中的焦耳热；3）难以实现对昂贵的带电CDs衍生物的回收。磺酸化的环糊精衍生物的手性选择能力很强，应用范围非常的广泛，大量文献记载了各种类型的磺酸化环糊精应用于手性毛细管电泳分离。使用混合取代的环糊精不可避免的造成手性选择性下降，柱效降低，批次重现性差的问题，分析学者们采用了各种各样的化学合成手段，以期待从化学结构的角度获得高纯度均一化的磺酸化环糊精带电衍生物。比较典型的是Vincent等构造的一系列的磺酸化环糊精对映体，参见“Vincent J B,Sokolowski A D,Nguyen T，Anal.Chem.1997,69:4226~4233”和“VincentJ B,Kirby D M,Nguyen T V，Vigh G，Anal.Chem.1997,69(21):4419~4428”等，他们使用了繁琐的化学合成过程，得到了单一的磺酸化对映体，并成功的实现了手性分离。但是，这类负电CDs衍生物的制备过程包括羟基的保护及脱保护，各步产物的色谱柱纯化等复杂步骤，产物不但价格昂贵且无法回收再利用，故在很大程度上限制了其广泛使用。

另外，Fu-Tai A.Chen等人更早的高磺化环糊精也是一类，参见“Chen F T,Shen G，Evangelista R A,J.Chromatogr.A,2001,924:523~532”和“Chen F T，Evangelista R,Americanlavoratory,2002,8:30~37”等，他们通过空间上的球形对称，从而达到了获得均一化环糊精的目的。环糊精本身化学结构的特点造成制备和回收这些化学结构上均一的环糊精非常困难，使得价格非常昂贵。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种新型环糊精聚合物手性拆分剂的合成方法，以新型合成思路获得取代位置和取代度均一的衍生化环糊精手性拆分剂，将取代不均一的衍生化环糊精连接成聚合物，此法不仅具有合成方法简单，步骤少，提纯和回收容易，合成成本低等优点，并且实现了环糊精衍生化取代在统计学意义上的均一化，提高了柱效和分离度，同时改善环糊精溶解度，减小了电泳分离时焦耳热。通过合成磺酸化β-环糊精聚合物并对其进行的表征结果证明本发明设计思想的优势，并将此聚合物作为缓冲液添加剂分别用于CE手性化合物分离中。

本发明的主要目的如下：

1.以制备带电环糊精聚合物为例阐述一种新型手性拆分剂设计思想以解决天然环糊精（如β-环糊精）水溶性低，带电CDs衍生物离子强度高、取代度和取代位置难以控制、价格昂贵等难题；

2.通过自由基聚合反应制备新型、高效、价廉、可回收再利用的手性拆分剂——磺酸化β-环糊精聚合物。

3.将磺酸化环糊精聚合物添加至CE缓冲液中用于手性化合物拆分。

为了解决上述技术问题，本发明新型磺酸化环糊精聚合物的化学结构是：

其中：

代表β-环糊精，m，n均为自然数且均≥1。

本发明新型磺酸化环糊精聚合物的合成方法是：由环糊精经过聚合和磺酸化反应制备得到，其制备的反应路线如下：

其中：

代表β-环糊精，m，n均为自然数且均≥1。

按照上述反应路线合成磺酸化β-环糊精聚合物（SA-β-CDP，Sulfated acrylamideβ-CDpolymer）的步骤如下：

1）室温下将纯化的β-环糊精溶解在2%~5%的氢氧化钠溶液中，搅拌至完全溶解，氮气保护下缓慢滴加1~5倍当量的烯丙基缩水甘油醚（AGE），维持温度在40~65℃，反应36~60h小时结束，稀盐酸调节反应液至中性，并加入丙酮沉淀产物，过滤，烘干得白色固体烯丙基环糊精，研细备用。

2）将浓硫酸于冰盐浴中冷却至0℃后，缓慢加入烯丙基环糊精细粉，控制温度<5℃，磁力搅拌反应1.5~3h后将反应液倒至大量水中，加碳酸钙中和，滤去硫酸钙沉淀，滤液中加入乙醇，低温过夜，过滤，用碳酸钠调节滤液pH至10.50，过滤，滤液减压浓缩。浓缩液倒入大量无水乙醇中，得到沉淀，沉淀干燥得浅黄色固体即为磺酸化烯丙基环糊精。

3）将合成的磺酸化烯丙基环糊精溶解于水中，真空脱气30-60min，加入1~5倍当量的丙烯酰胺（AM），氮气下搅拌20-60min，加入过硫酸钾引发反应，40~65℃下搅拌反应24~48小时。反应完全后，将反应液稍加稀释后倒入截留分子量为14,000的透析袋中透析，透析液过滤后冻干得到磺酸化环糊精聚合物产品。

本发明中所得磺酸化环糊精聚合物，通过薄层层色谱法，红外光谱法，元素分析法、间接紫外法等手段进行表征，具体实施方案原理如下：

1)薄层色谱法

薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。实验时将样品用毛细管滴加于薄层板的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。

2)红外光谱法

红外光谱（IR）常被用于化学合成反应中产物特征基团的检测，试验中我们也通过IR对磺酸化β-环糊精聚合物进行了表征。

3)元素分析法

通过测定不同磺丙基醚环糊精单体的C元素、S元素含量，即可通过元素含量比例计算产物中磺酸根的含量，继而得到产物的平均取代度。

4)间接紫外法

间接紫外法可用于毛细管电泳中以检测分析那些没有足够强的紫外吸收的物质。这里用间接紫外法对比了磺酸化环糊精和磺酸化环糊精聚合物的取代度均一性。背景缓冲液选用具有紫外吸收的对甲苯磺酸-三（羟甲基）氨基甲烷(Tris)缓冲液，其中的对甲苯磺酸提供了背景吸收，紫外吸收较弱的磺丙基醚环糊精和磺丙基醚环糊精聚合物经过检测窗口时就会出现倒峰。为了更好的证明待检测分子的电性，我们在样品溶液中加入了DMF作为中性标记物。通过峰面积大小以及出峰时间和个数等信息验证聚合物取代均一性。

本发明所合成的新型磺酸化环糊精聚合物作为缓冲液添加剂，在毛细管电泳中对手性化合物对映体进行分离，具体技术方案如下：

配制不同pH值的基质缓冲液，经0.45μm水系滤膜过滤后，向其中加入磺酸化环糊精聚合物得电泳运行缓冲液；使用毛细管电泳仪设备，将毛细管活化冲洗后，向毛细管中充满不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液，在毛细管中推入一段含有聚合物的缓冲液，使其未到检测窗口处，进样，将毛细管两端放入不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳。开启电泳电压，电泳场强为50-1000V/cm，根据不同手性药物的性质选择检测方法测试手性化合物；分离条件为：所述磺酸化环糊精聚合物添加浓度为0.1%-6.0%；电泳运行缓冲液pH1.50-12.50；电泳运行缓冲液浓度为5-200mmol/L；运行电压1-11kV；温度17-37℃；有机添加剂含量0-50%。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过自由基聚合法合成了磺酸化环糊精和磺酸化环糊精聚合物，所用合成方法简单，步骤少，所用试剂经济，在合成成本上要远远优于其他单一取代的衍生化环糊精手性拆分剂。更重要的是，本专利提出的制备环糊精聚合物以获得环糊精衍生物取代位置和取代度均一的思想通过手性拆分获得了证实，此外，该聚合物在CE手性分离中还表现出以下优势：a.相对于小分子环糊精衍生物而言，衍生化的环糊精聚合物对CE运行电流的贡献较小；b.合成的衍生化环糊精聚合物可以通过透析等简单方法进行回收再利用。

附图说明

图1是实施例1获得的磺酸化β-环糊精聚合物（SA-β-CDP）的红外表征谱图；

图2A间接紫外法测定磺酸化β-环糊精（SA-β-CD）的电泳图；

图2B间接紫外法测定SA-β-CDP的电泳图；

图3A优化条件下SA-β-CDP分离***的电泳图；

图3B优化条件下SA-β-CDP分离特布他林的电泳图；

图3C优化条件下SA-β-CDP分离华法林的电泳图；

图3D优化条件下SA-β-CDP分离异丙嗪的电泳图；

图4A是不同浓度的SA-β-CDP分离特布他林的电泳图；

图4B是不同浓度的SA-β-CDP分离***的电泳图；

图5-1至图5-3是运行缓冲液pH对异丙嗪迁移时间及分离度的影响的电泳图。

具体实施方式

本发明提出环糊精聚合物衍生化后取代度和取代位置易达到统计学意义上的均一的设计思想，从而在手性拆分中获得较高的拆分效果，且衍生化环糊精聚合物具有水溶性高、经济、电泳时产生电流低、可回收再利用等优点，在此基础上本专利开发了磺酸化环糊精聚合物的合成方法及其在毛细管电泳手性化合物拆分中的应用，以下通过实施例讲述本发明的详细过程，提供实施例是为了理解的方便，绝不是限制本发明。

实施例1：SA-β-CDP的合成

8.00g（7.05mmol）纯化的β-CD溶解在20mL3%（w/v）NaOH溶液中，搅拌至完全溶解，氮气保护下缓慢滴加0.84mL（7.05mmol）AGE，维持温度在50℃，反应48h。反应结束后，用盐酸中和反应液至中性，并倒入等体积的丙酮中沉淀出产物，过滤，烘干得白色固体5.02g，产率为56.82%。

取13mL80%浓硫酸，冰盐浴中冷却至0℃。将5.02g研成细粉的ACD缓慢加入到上述浓硫酸中，保持温度<5℃以下，磁力搅拌反应2h。反应完成后将反应液倒入225mL水中，加入25g CaCO₃中和硫酸，滤去CaSO₄沉淀，滤液中加入50mL乙醇，低温过夜。滤去沉淀，滤液用Na₂CO₃调节pH至10.50。滤去沉淀，滤液减压浓缩。浓缩液倒入150mL无水乙醇中，得到大量沉淀，沉淀干燥得浅黄色固体4.20g，产率为72.16%。

将上面合成的磺化ACD4.20g溶解于8mL水中，真空脱气30min，再加入0.32g AM，氮气下搅拌30min，加入0.03g K₂S₂O₈，50℃下搅拌反应24h。反应完全后，将反应液稍加稀释后倒入截留分子量为14,000的透析袋中透析以除去未反应的单体，透析液过滤后冻干得到聚合物0.38g，产率为8.41%。

实施例2：分别利用薄层色谱法、红外色谱法和元素分析法对实施例1合成得到的产物进行表征

（1）薄层色谱法表征

用毛细管将ACD样品滴加于薄层板的起点线上，吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，TLC分析，展开剂为：异丙醇：水：氨水=5:2:2，ACD的比移值Rf=0.63，β-CD的Rf=0.43。

（2）红外色谱法

图1中对比了S-ACD/AM共聚物（SA-β-CDP）与聚S-ACD及聚丙烯酰胺（PAM）的红外吸收谱图，可以看出，共聚物的吸收特征综合了聚S-ACD和聚丙烯酰胺两者的特征吸收。1030cm^-1处C-O伸缩振动吸收峰来自ACD的环糊精分子及侧链中醚键，3418cm^-1处为环糊精分子中O-H的伸缩振动吸收峰，而1657cm^-1及3192cm^-1处的吸收峰分别来自丙烯酰胺骨架中C=O及N-H的伸缩振动。磺酸化β-CD聚合物同时具有上述几个特征吸收峰，这表明合成的聚合物中含有β-CD侧链以及聚丙烯酰胺骨架。

（3）利用元素分析法对SA-β-CD表征

使用Vario Micro元素分析仪测定SA-β-CD的各元素含量，元素分析结果碳元素含量为33.37%，硫元素含量为5.01%，碳与硫含量比为6.66，计算得磺酸根取代度平均值为2.0。

（4）间接紫外法验证聚合物取代均一性

配制20mmol/L pH8.0的对甲苯磺酸-Tris背景缓冲液，并用0.45μm水系滤膜过滤，备用。取SA-β-CD、SA-β-CDP样品各20mg溶解在990uL去离子水中，各加入10uL中性标记物DMF，涡旋溶解混匀，即得到20mg/mL、含中性标记物1%的样品溶液。使用Bio-radHPE100毛细管电泳仪进行测定，毛细管总长度为27cm，有效长度为20cm，内径为75μm，未涂层，将毛细管依次用NaOH溶液和H₂O冲洗，然后向毛细管中充满缓冲液，开启电泳电压，8kV进样5s，10kV进行电泳，于214nm下室温检测样品出峰情况。从图2A和图2B中可以看到，最早出峰的是带正电的钠离子，其后是中性标记物的峰，带负电的磺酸化环糊精（图2A）和磺酸化环糊精聚合物（图2B）最后出峰。通过图2A和图2B的对比可以看到，形成聚合物以后整个聚合物分子的取代度相对均一了许多。聚合物由于自身分子量大且为混合物，故峰形较宽，但是这说明聚合物分子之间的质核比差异比较小，在电场中分布相对均匀。而对于小分子磺酸化环糊精来说，其磺酸化取代度可分为几个带，其在电场中由于泳动速度不同会出现分布不均的情况，对手性分离过程产生不利影响。形成聚合物以后，取代度均一性明显增加，取代度的对比结果也间接证明了聚合物的合成是成功的。

实施例3：手性药物分离

配制25mmol/L pH2.60的磷酸-三乙胺缓冲液，经0.45μm水系滤膜过滤后，在1mL磷酸-三乙胺缓冲液中加入合成的SA-β-CDP，得到含SA-β-CDP的电泳运行缓冲液。使用Beckman5000P/ACE毛细管电泳仪，毛细管总长度为37cm，有效长度为30cm，内径为50μm，未涂层，将毛细管依次用NaOH溶液和H₂O冲洗，然后向毛细管中充满不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液，在毛细管中先推入一段含有磺酸化环糊精聚合物的缓冲液0.8min，0.5psi压力进样5s，将毛细管两端放入不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳，场强为+300V/cm，于37℃、214nm下拆分***（图3A）和特布他林（图3B）。

配制25mmol/L pH5.50的磷酸-三乙胺缓冲液，经0.45μm水系滤膜过滤后，在1mL磷酸-三乙胺缓冲液中加入合成的SA-β-CDP，得到含SA-β-CDP的电泳运行缓冲液。仪器和毛细管前处理同上，0.5psi压力进样5s，将毛细管两端放入不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳，场强为+300V/cm，于37℃、214nm下拆分华法林（图3C）。

仪器和缓冲液条件、毛细管前处理同分离***，0.5psi压力进样5s，将毛细管两端放入不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳，场强为+189V/cm，于37℃、214nm下拆分异丙嗪（图3D）。

实施例4：比较不同SA-β-CDP浓度的缓冲液分离手性化合物

配制25mmol/L pH2.6的磷酸-三乙胺缓冲液，经0.45μm水系滤膜过滤后，在1mL磷酸-三乙胺缓冲液中加入不同量的SA-β-CDP，得到含不同浓度SA-β-CDP的电泳运行缓冲液。仪器和毛细管前处理同上，0.5psi压力进样5s，将毛细管两端放入不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳，场强为+300V/cm，于37℃、214nm下拆分特布他林（图4A）和***（图4B）。

实施例5：比较含SA-β-CDP的不同pH缓冲液分离手性化合物

分别配制25mmol/L pH2.5,3.5,4.5的磷酸-三乙胺缓冲液，经0.45μm水系滤膜过滤后，在1mL磷酸-三乙胺缓冲液中加入合成的SA-β-CDP，得到含SA-β-CDP的电泳运行缓冲液。仪器和毛细管前处理同上，0.5psi压力进样5s，将毛细管两端放入不含磺酸化环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳，场强为+300V/cm，于37℃、214nm下拆分异丙嗪,图5-1、图5-2和图5-3分别示出了pH为2.5、pH为3.5和pH为4.5时运行缓冲液对异丙嗪迁移时间及分离度的影响。

以上的实施例适合于本发明提及的所有磺酸化环糊精聚合物的合成、表征及应用，当然，亦可用于其余环糊精聚合物，所有磺酸化环糊精聚合物合成条件，分离能力略有不同，但总体趋势相同。以上所述，仅是本发明的部分实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对上述实施例作的任何简单的修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案范围内。

Claims

1.一种新型合成思路以获得取代位置和取代度均一的衍生化环糊精手性拆分剂，其特征在于，将取代不均一的衍生化环糊精连接成聚合物。

2.一种新型磺酸化环糊精聚合物，其化学结构为：

其中：

表示β-环糊精，m，n均为自然数且均≥1。

3.一种根据权利要求2所述新型磺酸化环糊精聚合物的合成方法，其特征在于，由β-环糊精经过聚合和磺酸化反应制备得到，制备的反应路线如下：

其中：

代表β-环糊精，m，n均为自然数且均≥1。

4.根据权利要求3所述新型磺酸化环糊精聚合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）室温下将纯化的β-环糊精溶解在2%~5%的氢氧化钠溶液中，搅拌至完全溶解，氮气保护下缓慢滴加1~5倍当量的烯丙基缩水甘油醚，维持温度在40~65℃，反应36~60h小时结束，稀盐酸调节反应液至中性，并加入丙酮沉淀产物，过滤，烘干得白色固体烯丙基β-环糊精，研细备用；

2）将浓硫酸于冰盐浴中冷却至0℃后，缓慢加入烯丙基β-环糊精细粉，控制温度<5℃，磁力搅拌反应1.5~3h后将反应液倒至大量水中，加碳酸钙中和，滤去硫酸钙沉淀，滤液中加入乙醇，低温过夜，过滤，用碳酸钠调节滤液pH至10.50，过滤，滤液减压浓缩；浓缩液倒入大量无水乙醇中，得到沉淀，沉淀干燥得浅黄色固体即为磺酸化烯丙基β-环糊精；

3）将合成的磺酸化烯丙基β-环糊精溶解于水中，真空脱气30-60min，加入1~5倍当量的丙烯酰胺，氮气下搅拌20-60min，加入过硫酸钾引发反应，40~65℃下搅拌反应24~48小时；反应完全后，将反应液稍加稀释后倒入截留分子量为14,000的透析袋中透析，透析液过滤后冻干得到磺酸化β-环糊精聚合物产品。

5.一种根据权利要求2新型磺酸化环糊精聚合物在毛细管电泳手性化合物拆分中的应用。

6.根据权利要求5所述新型磺酸化环糊精聚合物在毛细管电泳手性化合物拆分中的应用，是将磺酸化β-环糊精聚合物作为缓冲液添加剂，在毛细管电泳中对手性化合物对映体进行分离。

7.根据权利要求6所述新型磺酸化环糊精聚合物在毛细管电泳手性化合物拆分中的应用，其具体步骤包括：

配制不同pH值的基质缓冲液，经0.45μm水系滤膜过滤后，向其中加入磺酸化β-环糊精聚合物得电泳运行缓冲液；

使用毛细管电泳仪设备，将毛细管活化冲洗后，向毛细管中充满不含磺酸化β-环糊精聚合物的缓冲液，在毛细管中推入一段含有磺酸化β-环糊精聚合物的缓冲液，使其未到检测窗口处，进样，将毛细管两端放入不含磺酸化β-环糊精聚合物的缓冲液中加电压电泳；开启电泳电压，电泳场强为50-1000V/cm，根据不同手性药物的性质选择检测方法测试手性化合物；

分离条件为：所述磺酸化β-环糊精聚合物添加浓度为0.1%-6.0%；电泳运行缓冲液pH1.50-12.50；电泳运行缓冲液浓度为5-200mmol/L；运行电压1-11kV；温度17-37℃；有机添加剂含量0-50%。