CN102920745A - 隐孔菌的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了隐孔菌的新用途。本发明所提供的隐孔菌的新用途是下述1）-4）中的至少一种：1）隐孔菌在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用；2）隐孔菌在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在寄主细胞中复制的产品（如药物）中的应用；3）隐孔菌提取物在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质；4）隐孔菌提取物在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在寄主细胞中复制的产品（如药物）中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。

Description

隐孔菌的新用途

技术领域

本发明涉及隐孔菌的新用途，特别涉及隐孔菌在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的猪的传染性疾病。各种年龄的猪均易感染该病毒，其主要症状是妊娠母猪感染后引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，感染仔猪可发生呼吸障碍和高病死率。该病于1987年在美国首次报道，上世纪九十年代中期传入我国。目前，该病发生于世界上几乎所有养猪国家，为我国和世界养猪业造成了极大的经济损失。2006年在我国爆发了由PRRSV变异株引起的高致病猪繁殖与呼吸综合征，其特点为急性高致死，仔猪发病率可达100%，死亡率高达50%，母猪流产率达35%以上，而且母猪和育肥猪死亡率高达30%。此次爆发高致病猪繁殖与呼吸综合征给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的病毒性传染病。PRRSV属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约15.4kb，病毒在细胞浆、内质网和高尔基体组装成熟，并以出芽形式释放聚集在细胞内囊泡中，然后转运到细胞膜释放到细胞外，完成病毒复制周期。

目前，预防和控制PRRS病毒感染和传播主要靠疫苗，然而却不成功。针对PRRS病毒的疫苗包括弱毒疫苗和灭活苗已经应用多年，然而和疫苗株几乎一致的毒株引起的繁殖与呼吸综合征仍然发生。非典型或急性繁殖与呼吸综合征在免疫猪群爆发，以及2006年在我国爆发的高致病繁殖与呼吸综合征更是对目前所用疫苗的保护性和安全性提出质疑。因此，开发特异、高效的抗PRRS病毒药物对预防和控制繁殖与呼吸综合征具有重要的现实意义。

隐孔菌（Cryptoporus volvatus(Peck)Shear是一种生于松林树干上的野生大型真菌，也有记载生于衰老的冷杉、云杉的树干或枯立木上，我国的云南、广东、广西、海南等多个省份都有分布。隐孔菌子实体较小，无柄或偶尔有柄，一般侧生于基物上，木栓质，扁球形或近球形，1.5-3.5cm×2-4.5cm，厚1-3cm，盖表面光滑，浅土黄色或深蛋壳色，老后淡红褐色。边缘纯滑而厚，与菌幕相连。菌幕白色至污白色，且与菌盖色调明显不同，厚约1mm。菌管层由菌幕所包盖，初期完全封闭，后逐渐在靠近基部出现一个圆形或近圆形的孔口，偶有两个，孔径2-4.5mm。菌肉纯白至污白色，软木栓质，厚2-8mm。菌管同菌肉色，长2-5mm，管口圆形至近多角形，管口面浅粉灰色或带褐色，每毫米3-5个，壁厚，口缘完整。孢子光滑、无色、长椭圆形，10-13μm×4-6μm。云南丽江民间曾作为小儿断奶时的***物，或水煎服治疗气管炎和哮喘。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供隐孔菌的新用途。

本发明所提供的隐孔菌的新用途是下述1）-4）中的至少一种：

1）隐孔菌在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用；

2）隐孔菌在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在寄主细胞中复制的产品（如药物）中的应用；

3）隐孔菌提取物在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质；

4）隐孔菌提取物在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在寄主细胞中复制的产品（如药物）中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。

上述1）-4）中，所述隐孔菌可为子实体和/或菌丝体和/或孢子。所述隐孔菌子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。

上述2）和4）中，所述寄主细胞可为猪细胞、CL2621细胞或MARC44细胞，所述猪细胞具体可为猪肺泡巨噬细胞。

上述3）和4）中，所述隐孔菌提取物可按照如下方法获得：将隐孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到所述隐孔菌提取物。

上述隐孔菌提取物的制备方法中，所述隐孔菌子实体可粉碎至50-80目。

上述隐孔菌提取物的制备方法中，所述用水浸提可为在4-65℃（如4-10℃、50-65℃、4℃或50℃）用水浸提10-14小时。

上述隐孔菌提取物的制备方法中，可采用离心分离所述水溶性物质。所述离心采用的离心力可为8000-10000g，离心时间可为10-20分钟（如10-15分钟或15-20分钟）。

本发明的实验证明用隐孔菌制备的隐孔菌提取物能够显著抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肺泡巨噬细胞和非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）中复制，可以使病毒数量减少至原来的万分之一，隐孔菌提取物对仔猪没有明显的毒副作用，能够减轻PRRSV高致病毒株感染仔猪引起的高热，降低仔猪血清病毒滴度，提高感染仔猪的存活率。

附图说明

图1为MTT法测定0-0.7mg/L的隐孔菌提取物溶液对PAMs的细胞毒性结果。

图2为间接免疫荧光测定0-0.6mg/L的隐孔菌提取物培养液抑制PRRSV CH-1a株在MARC-145细胞内的复制结果。

Marc-145细胞感染PRRSV CH-1a株（MOI=0.1）2小时后，换含有或不含有隐孔菌提取物的培养液，24小时后进行间接免疫荧光，检测病毒在细胞内的复制。

图3为0-0.6mg/L的隐孔菌提取物培养液抑制PRRSV CH-1a株毒株在MARC-145细胞内的复制。

Marc-145细胞感染PRRSV CH-1a（MOI=0.1）2小时后，换含有或不含有隐孔菌提取物的培养液，24小时后收集上清测病毒滴度。

图4为间接免疫荧光测定0-0.6mg/L的隐孔菌提取物培养液抑制PRRSV高致病毒株JXwn06在PAMs细胞内的复制结果。

HPV表示PRRSV高致病毒株JXwn06。

PAMs细胞感染PRRSV高致病毒株JXwn06（MOI=0.1）2小时后，换含有或不含有隐孔菌提取物的培养液，24小时后进行间接免疫荧光检测病毒在细胞内的复制。

图5为0-0.6mg/L的隐孔菌提取物培养液抑制PRRSV VR2332株和PRRSV高致病毒株JXwn06在PAMs细胞内的复制。

PAMs分别感染PRRSV VR2332株和PRRSV高致病毒株JXwn06（MOI=0.1），2h后，换含有或不含有隐孔菌提取物的培养液，37℃培养24h后收上清测病毒滴度。

图6为隐孔菌提取物降低PRRSV高致病毒株JXwn06引起的高热症状。

图7为隐孔菌提取物降低PRRSV高致病毒株JXwn06感染仔猪的血清病毒滴度。

图8为隐孔菌提取物提高PRRSV高致病毒株JXwn06感染仔猪的存活率。

图9为用0-0.6mg/L的隐孔菌提取物培养液预处理Marc-145细胞，不抑制PRRSV感染。

图10为用0-0.6mg/L的隐孔菌提取物培养液与病毒共孵育，对病毒活性没有明显抑制作用。

图11为隐孔菌提取物抑制PRRSV RNA的合成。

图12为隐孔菌提取物对PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶活性的影响。

图13为隐孔菌提取物抑制PRRSV蛋白的合成。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的隐孔菌（Cryptoporus volvatus(Peck)Shear）（Kohmei KADOWAKI.Behavioral observation of two fungivorous beetles(Coleoptera:Tenebrionidae)on wood-decaying bracket fungus Cryptoporus volvatusens_.EntomologicalScience(2010)13,159-161）采自中国云南，公众可从野外采集，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的PRRSV高致病毒株JXwn06（Lei Zhou,et al.The30-Amino-AcidDeletion in the Nsp2of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus Emerging in China Is Not Related to Its Virulence.JOURNAL OF VIROLOGY，May2009,p.5156–5167)、PRRSV CH-1a株（谢丽基，等.广西高致病性PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位预测.动物医学进展。2008，29(1)：l-4）及PRRSVVR2332株（谢丽基等.广西高致病性PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位预测.动物医学进展。2008，29(1)：l-4）；在符合国家生物安全的有关规定的情况下公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。

实施例1、用隐孔菌制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂

一、隐孔菌提取物的制备

用蒸馏水浸泡隐孔菌干子实体，水与隐孔菌干子实体的重量比为6:1，4℃浸泡2-4小时，匀浆器充分搅碎至60目，4℃浸提10小时，8000g离心20分钟，收集上清液，冻干，得到隐孔菌提取物。该隐孔菌干子实体是将新鲜的隐孔菌子实体在常温下干燥得到的。

下述步骤二的实验中所用的隐孔菌提取物，均用生理盐水溶解并通过0.22微米的过滤器过滤除菌后使用。

二、隐孔菌提取物抑制猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒在猪肺泡巨噬细胞和非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）中复制

实验证明，步骤1的隐孔菌水提取物能够显著抑制猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒在猪肺泡巨噬细胞和非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）中复制，滴度可以低10⁴，即病毒数量减少至原来的万分之一，表明该提取物具有很强的抑制PRRS病毒的能力。具体的实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

1.1猪肺泡巨噬细胞的分离和病毒液的制备

将8周龄的无特定病原（SPF）的仔猪放血，无菌摘取其肺脏，先用0.9%的无菌生理盐水洗涤外表面，然后将pH7.2的Hanks平衡盐溶液（HBSS）30.0ml从气管灌入肺脏，轻轻按摩肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液300g离心10min，收集的细胞即为猪肺泡巨噬细胞（PAMs）。用RPMI1640洗涤两次后加入适量RPMI1640（10%胎牛血清FBS）培养液吹散细胞，置培养瓶中于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用RPMI1640（10%FBS）培养液培养。

PRRSV高致病毒株JXwn06从发病猪场分离得到，在猪肺泡巨噬细胞上繁殖。将猪肺泡巨噬细胞接种到75cm²的细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，吸去上清液，接入稀释好的病毒液3ml（病毒感染复数MOI=0.5，即感染时病毒与细胞数量的比值为0.5）；37℃吸附60min，期间每隔15min轻轻晃动培养瓶，以使病毒液与细胞充分接触；60min后，补加培养液，置于37℃培养；36h后在-80℃和室温之间冻融细胞三次,以裂解细胞；将细胞裂解液转移至50ml离心管，4℃、5000g离心10min，上清液即为病毒液，将上清液分装至1.5ml EP管，保存于-80℃备用。

1.2细胞被病毒半数感染量（TCID₅₀）的测定

在96孔细胞培养板中接种猪肺泡巨噬细胞，37℃、5%CO₂培养箱中培养24h；在1.5ml EP管中用细胞培养液将病毒液作连续10倍的梯度稀释，从10^-1至10^-7；将稀释好的病毒液接种到猪肺泡巨噬细胞培养板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种100μl；设正常细胞对照8孔；接毒后第四天，观察并记录每个稀释度病毒阳性孔的数量，计算病毒TCID₅₀。得到病毒的TCID₅₀可用于计算病毒的感染复数（MOI），即感染时病毒与细胞数量的比值。

1.3间接免疫荧光（IFA）法检测病毒间接免疫荧光法以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗原或抗体的存在。

用甲醇：丙酮（1:1）固定液4℃固定细胞10min；PBS洗两次，5％羊血清37℃封闭30min；吸去上清，加抗PRRS病毒N蛋白的一抗SDOW17（1:10,000RuralTechnologies），4℃过夜；PBS洗3次，每次5min，加绿色荧光FITC标记的兔抗鼠IgG二抗（1:2000,Jackson Immuno Research）,，37℃避光1h；PBS洗3次，每次5min；荧光显微镜下观察绿色荧光，绿色荧光表示在细胞内复制的病毒。

1.4噻唑蓝(MTT)法测定隐孔菌提取物的细胞毒性

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

将猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）分别用RPMI1640（10%胎牛血清FBS）或DMEM（10%胎牛血清FBS）培养液配成细胞悬液，接种到96孔板，37℃、5%CO₂环境下培养24h。用培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以等体积的生理盐水做对照。吸弃细胞培养液，加入等体积的上述浓度的隐孔菌提取物培养液或生理盐水，每一浓度的隐孔菌提取物培养液8孔，生理盐水8孔；37℃、5%CO₂环境下培养48h，每孔加入MTT溶液（5mg/ml，用pH=7.4的PBS配制)20μl，继续培养4h，小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加150μl DMSO（二甲基亚砜），37℃孵育10min，使结晶物充分融解。用酶标仪在550nm波长处测吸光度，以对照组细胞存活率为100%，计算实验组细胞的存活率：

实验组细胞存活率=OD（实验组）/OD（对照组）%。

1.5隐孔菌提取物抑制PRRSV不同毒株在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）上的复制

将PAMs和MARC-145分别用RPMI1640培养液（10%胎牛血清FBS）或DMEM（10%胎牛血清FBS）培养液配成细胞悬液，接种到96孔板，37℃、5%CO₂环境下培养24h。分别接种PRRSV CH-1a株（MOI=0.1）、PRRSV高致病毒株JXwn06（MOI=0.1）及PRRSV CH-1a株（MOI=0.1），病毒感染后2小时弃掉上清液，分别加入等体积的含有0、0.2、0.4、0.6mg/ml隐孔菌提取物的新鲜RPMI1640培养液（用新鲜RPMI1640培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为0.2、0.4和0.6mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以加入等体积的新鲜RPMI1640培养液（0mg/ml隐孔菌提取物的新鲜RPMI1640培养液）作为对照），每一浓度的隐孔菌提取物培养液8孔，37℃、5%CO₂环境下培养24h，收集上清测定病毒TCID50，检测上清中病毒的下降水平；同时固定细胞，做间接免疫荧光，检测提取物对细胞内病毒复制的抑制水平。

1.6数据分析

所有数据都是独立重复三次得到的平均值，用双尾T-test（成对）分析差异显著性，P≤0.05被认为差异显著，0.01<P≤0.05（*），0.001<P≤0.01（**），P≤0.001（***）。

2、实验结果

结果表明隐孔菌提取物的浓度在0.1-0.7mg/ml的范围内对猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和非洲绿猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）都没有毒性（图1）；隐孔菌提取物的浓度在0.2-0.6mg/ml范围内显著抑制PRRSV CH-1a株在MARC-145中的复制（图2，图3），其中，加入0.6mg/ml隐孔菌提取物培养液的Marc-145细胞培养上清中的PRRSV CH-1a株对猪肺泡巨噬细胞的滴度为10^3.1±0.15TCID₅₀/ml，是加入0mg/ml隐孔菌提取物培养液的Marc-145细胞培养上清中的PRRSV CH-1a株对猪肺泡巨噬细胞的滴度（为10^7.0±0.05TCID₅₀/ml）的万分之一。猪肺泡巨噬细胞（PAMs）分别感染PRRSVVR2332株和PRRSV高致病毒株JXwn06后，隐孔菌提取物能显著抑制PRRSV的复制(图4，图5)。其中，加入0.6mg/ml隐孔菌提取物培养液的PAMs细胞培养上清中的PRRSV高致病毒株JXwn06对猪肺泡巨噬细胞的滴度为10^4.56±0.08TCID₅₀/ml，是加入0mg/ml隐孔菌提取物培养液的PAMs细胞培养上清中的PRRSV高致病毒株JXwn06对猪肺泡巨噬细胞的滴度（为10^7.5±0.02TCID₅₀/ml）的千分之一；加入0.6mg/ml隐孔菌提取物培养液的PAMs细胞培养上清中的PRRSV VR2332株对猪肺泡巨噬细胞的滴度为10^2.5±0.04TCID₅₀/ml，是加入0mg/ml隐孔菌提取物培养液的PAMs细胞培养上清中的PRRSV VR2332株对猪肺泡巨噬细胞的滴度（为10^5.5±0.03TCID₅₀/ml）的千分之一。

实施例2、用隐孔菌制备猪繁殖与呼吸综合征药物

一、隐孔菌提取物的制备

用蒸馏水浸泡隐孔菌干子实体，水与隐孔菌干子实体的重量比为7:1，4℃浸泡2-4小时，匀浆器充分搅碎至80目，50℃浸提10小时，8000g离心10分钟，收集上清液，冻干，得到隐孔菌提取物。该隐孔菌干子实体是将新鲜的隐孔菌子实体在常温下干燥得到的。用生理盐水溶解隐孔菌提取物并通过0.22微米的过滤器过滤除菌，得到隐孔菌提取物注射液。

二、隐孔菌提取物在猪体内抑制PRRS病毒的繁殖

1、实验方法

将10头体重为6-8kg的4周龄SPF猪随机分为2组（每组5头），分别为对照组（只感染PRRS病毒不给隐孔菌提取物）、给药组(感染PRRS病毒，同时给予隐孔菌提取物)。用1ml（TCID50=10⁵）PRRSV高致病毒株JXwn06滴鼻感染SPF猪，给药组的每头猪腹腔和肌肉注射上述隐孔菌提取物注射液各5ml（12mg/ml）,连续7天，每天两次，对照组的每头猪注射等体积的生理盐水。在感染前和感染后第3、7、10、16和45天采血，收集血清，用real-time PCR方法对PRRS病毒做定量检测；每天测体温，观察记录临床症状。对发病死亡猪只随时进行尸体剖检，在第42天对所有存活猪进行尸体剖检。

1.1猪前腔静脉采血及分离血清的步骤如下：

对小猪采用仰卧保定法，一人抓握两后肢，尽量向后牵引；另一人用手将下颌骨下压，使头部贴地，并使两前肢与体中线基本垂直。此时，两侧第一对肋骨与胸骨结合处的前侧方呈两个明显的凹窝。用碘酒和酒精棉球消毒皮肤后，手持真空采血器配套用针（0.7×25mm）向右侧凹窝处由上而下,稍偏向中央及胸腔方向刺入，见有回血，即将真空采血器配套用针的另一端***真空采血管，开始采血，每头小猪采4-5ml血。采血完毕，左手拿酒精棉球紧压针孔处，右手迅速拔出采血针管，稍压片刻止血后，解除保定。

将采血管置于37℃2h，然后4℃过夜，血清即可析出，将析出的血清收集至1.5mlEP管中，4000g、4℃离心10min，弃掉沉淀，将血清保存于-80℃，用于检测病毒RNA。

1.2Real-Time PCR法定量血清中的病毒滴度

用OMEGA Viral RNA Kit公司生产的试剂盒提取血清中的病毒RNA。按试剂盒说明书的要求进行操作。将560μl QVL裂解液，5.6μl carrier RNA和10μl2-巯基乙醇加入到1.5ml EP管中。取140μl血清加入到含有裂解液的EP管中。室温孵育5-10min。向样品中加入560μl无水乙醇，震荡混匀30s。将试剂盒中的

吸附柱装入2ml的收集管中，取上步的混合液650μl加入吸附柱中，10,000g离心30s，弃去收集管中的液体，将吸附柱***新的收集管中，重复上一步骤直至将所有的混合液都转移至吸附柱。向吸附柱中加入500μl RWA洗液，10,000g离心30s，弃去收集管中的液体，将吸附柱***新的收集管中。向吸附柱中加入500μl RWB洗液，10,000g离心30s，弃去收集管中的液体，将吸附柱***收集管中，12,000g离心3min。将吸附柱置于新的1.5ml EP管中，向吸附柱的中央加入50μl DEPC处理的H₂O。室温孵育5min,10,000g离心1min洗脱吸附柱上吸附的RNA，将RNA保存于-80℃用于定量。

取2μl RNA做RT-PCR。于250μl PCR管中加入2μl RNA与1μl Random Primer（10μm,TaKaRa），混匀；70℃5min，迅速置冰上冷却2min；向上述混合物中加入以下组分：M-MLV5×Reaction Buffer5μl，dNTP（2.5mM each)5μl，RecombinantRNasin Ribonuclease Inhibitor25units,M-MLV RT(Promega)200units，最后加DEPC水补齐体积到25μl；轻轻混匀，37℃60min；将PCR管转移至70℃，15min；置于冰上冷却，cDNA产物保存于-20℃。

Real-Time PCR使用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)反应体系。Premix Ex TaqTM（2×）10μl,PCR引物ORF7F（AATAACAACGGCAAGCAGCA）、ORF7R（GCACAGTATGATGCGTCGGC）（10μm）各0.8μl,ROX Reference Dye II（50×）0.4μl，cDNA模板2μl，无菌双蒸水6μl，总体积20μl。在ABI7900Real-Time PCR System上反应，采取两步法PCR扩增标准程序：95℃30s；95℃5s、60℃30s(40个循环)。用SDS2.2.2for7900软件分析处理数据。用已知拷贝数的PRRSV ORF7的质粒做标准品（将序列1所示的PRRSVORF7DNA片段与pcDNA3.1载体（Invitrogen，目录号K480001）连接得到的重组质粒作为PRRSV ORF7的标准品），10倍梯度稀释后做Real-Time PCR，以Ct值对质粒拷贝数的对数做标准曲线，根据标准曲线对病毒RNA定量。

2、实验结果

实验结果表明，隐孔菌提取物对仔猪没有明显的毒副作用，能够减轻PRRSV高致病毒株感染仔猪引起的高热（图6），降低仔猪血清病毒滴度（图7），提高感染仔猪的存活率（图8）。其中，给药组在攻毒后第10天的血清病毒滴度是对照组的五分之一，给药组在攻毒后第45天的血清中已经检测不到病毒滴度，而对照组在在攻毒后第12天已全部死亡，给药组在攻毒后第16天的存活率是80%，给药组在攻毒后第45天的存活率是60%。

实施例3、隐孔菌提取物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的机制

一、隐孔菌提取物的制备

用蒸馏水浸泡隐孔菌干子实体，水与隐孔菌干子实体的重量比为6:1，4℃浸泡2-4小时，匀浆器充分搅碎至50目，4℃浸提10小时，8000g离心15分钟，收集上清液，冻干，得到隐孔菌提取物。该隐孔菌干子实体是将新鲜的隐孔菌子实体在常温下干燥得到的。下述步骤二的实验中所用的隐孔菌提取物，均用生理盐水溶解并通过0.22微米的过滤器过滤除菌后使用。

二、隐孔菌提取物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的机制

1、试验方法

1.1、隐孔菌提取物预处理Marc-145(非洲绿猴胚胎肾上皮细胞)对PRRSV感染的影响

将Marc-145用DMEM培养液（10%FBS）吹散，配成细胞悬液，接种到96孔板，37℃、5%CO₂环境下培养24h。除去培养液，换含有不同浓度隐孔菌提取物的新鲜培养液，37℃、5%CO₂环境下孵育2h，除去含隐孔菌提取物的培养液，感染PRRSV CH-1a株(MOI=0.1),继续培养24h，收细胞培养上清按照实施例1的方法测定病毒滴度。

其中，含有不同浓度隐孔菌提取物的新鲜培养液是含有0、0.2、0.42、0.6mg/ml隐孔菌提取物的新鲜DMEM培养液（用新鲜DMEM培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为0.2、0.4、0.6mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以等体积的新鲜DMEM培养液（0mg/ml隐孔菌提取物的新鲜DMEM培养液）做对照）。

1.2、测定隐孔菌提取物对PRRSV的直接杀伤作用

将含有0、0.2、0.4、0.6mg/ml隐孔菌提取物的新鲜DMEM培养液与等量的PRRSV（105TCID50）在37℃共孵育1h和3h,孵育完成后按照实施例1的方法测定病毒滴度。

1.3、测定隐孔菌提取物抑制PRRSV在Marc-145细胞中RNA的合成

抑制PRRSV在Marc-145中RNA的合成将Marc-145用DMEM培养液（10%FBS）吹散，配成细胞悬液，接种到六孔板，37℃、5%CO₂环境下培养24h。接种PRRSVCH-1a株（MOI=0.01），病毒感染后24h弃掉上清，分别加入含有0、0.2、0.5mg/ml隐孔菌提取物的新鲜DMEM培养液（用新鲜DMEM培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为0.2和0.5mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以加入等体积的新鲜DMEM培养液（0mg/ml隐孔菌提取物的新鲜DMEM培养液）作为对照），分别于换液后6、12、24、48、72h收细胞，提取细胞总RNA做Real-Time PCR。用已知拷贝数的PRRSV ORF7的质粒（同实施例2）做标准品，10倍梯度稀释后做Real-TimePCR，以Ct值对质粒拷贝数的对数做标准曲线，根据标准曲线对病毒RNA定量。

其中，RNA提取、反转录以及Real-Time PCR方法如下：每5-10×10⁶个细胞加1ml Trizol(invitrogen)，反复用移液器吹打混匀，室温静置5min；在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，室温静置10min；4℃、12000g离心15min；取上层水相置于新的EP管中,加入0.5ml异丙醇，室温静置10min；4℃、12000g离心10min；小心弃上清，加1ml75%乙醇进行洗涤，4℃、7500g离心5min，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥，最后加入20l DEPC水溶解RNA，用Nanodrop1000（Thermo scientific）定量RNA。

取500ng RNA做RT-PCR。于250l PCR管中加入500ng RNA与1μl RandomPrimer（10μM,TaKaRa），混匀；70℃5min，迅速置冰上冷却2min；向上述混合物中加入以下组分：M-MLV5×Reaction Buffer5μl，dNTP（2.5mM each)5μl，RecombinantRNasinRibonuclease Inhibitor25units,M-MLV RT(Promega)200units，最后加DEPC水补齐体积到25μl；轻轻混匀，37℃60min；将PCR管转移至70℃，15min；置于冰上冷却，cDNA产物保存于-20℃。Real-Time PCR使用TaKaRa的SYBR Premix ExTaqTM II(Perfect Real Time)反应体系。

Premix Ex TaqTM（2×）10μl,PCR引物ORF7F（AATAACAACGGCAAGCAGCA）、ORF7R（GCACAGTATGATGCGTCGGC）（10μm）各0.8μl,ROX Reference Dye II（50×）0.4μl，cDNA模板2μl，无菌双蒸水6μl，总体积20μl。在ABI7900Real-Time PCR System上反应，采取两步法PCR扩增标准程序：95℃30s；95℃5s、60℃30s(40个循环)。用SDS2.2.2for7900软件分析处理数据。

1.4、测定隐孔菌提取物对PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶活性的影响

PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶（按照下述文献中的方法制备:De Novo Initiationof RNA Synthesis by the Arterivirus RNA-Dependent RNA Polymerase.JOURNAL OFVIROLOGY，Aug.2007,p.8384–8395），在体外反应体系中，RNA依赖的RNA聚合酶能够以poly（U）18为模板，以ATP为底物，从5，到3，合成poly（A）18，用滤纸结合实验（filter-binding assays）来吸附poly（A）18，反应RNA聚合酶活性。离子交换纤维素层析纸DE81-纸（DE81-filer），带有二乙氨乙基功能团的弱碱性阴离子交换剂，能够结合放射性同位素标记的RNA链，将反应液通过滤纸后，通过检测滤纸上的同位素信号定量滤纸上吸附的RNA链的量，从而反应RNA聚合酶的活性。

在1.5ml EP管中配置下列反应液：5x反应缓冲液(250mM HEPES(pH8.0),50mMKCl,5mM DTT,10mM MnCl₂，4mM MgCl₂)10μl,PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶nsp92μM,polyU(18)400nM，【³²P】ATP0.5-2.5μCi，ATP100μM，RRI50unit，不同体积的隐孔菌提取物生理盐水溶液，使隐孔菌提取物终浓度分别为0、0.01、0.05、0.1mg/ml；用DEPC H₂O补齐体积至50μl。30度反应60min，加入等体积的50mM EDTA终止反应。将50μl反应液滴在DE-81（whatman）滤膜上，干燥。用0.3M甲酸铵（PH8.0）洗三次，每次2min，干燥。加入液体闪烁计数反应液，用仪器计数counts per minute。以不加隐孔菌提取物时RNA聚合酶的活性为100%，分析隐孔菌提取物对PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶活性的影响。

1.5、测定隐孔菌提取物抑制PRRSV在Marc-145细胞中蛋白质的合成

抑制PRRSV在Marc-145细胞中蛋白质的合成将Marc-145细胞用DMEM培养液（10%FBS）吹散，配成细胞悬液，接种到六孔板，37℃、5%CO₂环境下培养24h。接种PRRSV CH-1a株（MOI=0.5），病毒感染后2h弃掉上清，分别加入含有0、0.2、0.6mg/ml隐孔菌提取物的新鲜培养液（用新鲜DMEM培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为0.2和0.6mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以等体积的新鲜DMEM培养液（0mg/ml隐孔菌提取物的新鲜DMEM培养液）做对照），继续培养24h，去除细胞培养液，用PBS洗一遍。在6孔板中，每孔细胞加入200μl含1mM蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液（博迈德），用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。充***解后，14,000g离心5min，取上清，即为裂解细胞得到的总蛋白，做Western-blot。Western-blot即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

对总蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（碧云天）定量。取适量25mg/ml蛋白标准BSA，用PBS稀释至终浓度为0.5mg/ml；根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl；加2μl样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20μl；各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置30min；测定A562，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离15μg蛋白样品，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，当溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳；然后将蛋白样品在4℃从凝胶转移到PVDF膜（Millipore），电流40mA，2h；转膜结束后，将PVDF膜从电转槽中取出，用5%脱脂奶粉（溶于1╳PBST）在37℃封闭1h；用5%脱脂奶粉稀释一抗anti-PRRSV N proteinSDOW17（1:5，000；Rural Technologies）或者anti--actin(1:5，000；cloneAC-15；Sigma,St.Louis，MO)，4℃孵育过夜，用1X PBST洗3次，每次5min；用5%脱脂奶粉稀释二抗HRP-兔抗鼠二抗（1:10，000，康为世纪），37℃孵育1h，1X PBST洗3次，每次5min；最后用高灵敏度化学发光检测试剂盒（康为世纪）显影。

其中，β-actin（β-肌动蛋白）是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能，分布广泛，在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物，本实验也用β-actin作为对照。

1.6、数据分析

所有数据都是独立重复三次得到的平均值，用双尾T-test（成对）分析差异显著性，P≤0.05被认为差异显著，0.01<P≤0.05（*），0.001<P≤0.01（**），P≤0.001（***）。

2、实验结果

所有浓度（0.2-0.6mg/ml）隐孔菌提取物培养液预处理Marc-145(非洲绿猴胚胎肾上皮细胞)，不抑制PRRSV的感染（图9）。隐孔菌提取物直接处理PRRSV，孵育1h，所有浓度（0.2-0.6mg/ml）隐孔菌提取物培养液处理对病毒都没有杀伤作用；孵育3h，浓度为0.2mg/ml的处理对病毒没有杀伤作用，0.4mg/ml和0.6mg/ml的处理对病毒有轻微的杀伤作用（图10）。在PRRSV感染细胞后24h加入隐孔菌提取物，病毒RNA的合成会受到抑制，0.5mg/ml的隐孔菌提取物培养液在加入后6h即能明显抑制病毒RNA的合成，在加入后48h,提取物对于病毒RNA的抑制作用最明显，到72h时，对照组的细胞会因为病毒的感染而死亡，所以对照组细胞内病毒RNA的量也会下降（图11）。隐孔菌提取物在较低浓度就能明显抑制PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶的活性，当浓度为0.01mg/ml时，PRRSV RNA依赖的RNA聚合酶的活性下降至60%（图12）。隐孔菌提取物能够抑制PRRSV在细胞内合成蛋白，病毒感染细胞后2h加入隐孔菌提取物，24h后检测病毒N蛋白的表达水平，与对照相比，隐孔菌提取物能够剂量依赖性的抑制病毒N蛋白的合成，0.6mg/ml隐孔菌提取物培养液已经检测不到病毒N蛋白的表达（图13）。

Claims (4)

1.隐孔菌提取物在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。

2.隐孔菌提取物在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在寄主细胞中复制的产品中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。

3.隐孔菌在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒抑制剂中的应用。

4.隐孔菌在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在寄主细胞中复制的产品中的应用。

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