CN103864931A - 一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法。用PRV灭活病毒液免疫家兔2次后，再用PRV病毒液免疫1次家兔，采集血清；往血清中加入保护剂氯化钠、海藻糖、谷氨酸单钠、L-精氨酸，充分溶解后过滤除菌、分装；将分装好的血清装入冻干机箱体内按1所示的冻干曲线冻干得到伪狂犬病标准阳性血清。通过本发明方法得到的伪狂犬病标准阳性血清PRV中和抗体效价在1:512以上，在2～8℃条件下保存60个月抗体效价保持不变，有很好的稳定性，在疫苗外源病毒及特异性检验中能够充分中和伪狂犬病毒，为伪狂犬病弱毒疫苗的质量检验提供了很好的技术支撑。

Description

一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法

技术领域

本发明涉及动物用病毒活疫苗检验领域，尤其涉及一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法。

背景技术

猪伪狂犬病（PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的一种急性传染病，其主要临床特征为成年猪呈隐性感染，妊娠母猪发生流产、死胎及呼吸道症状。低日龄仔猪感染后常出现发热、拉稀，并伴随明显的神经症状和呼吸困难。本病在猪群中传播快、仔猪死亡率高，是猪场面临的重大传染病之一。我国是伪狂犬病流行广泛的国家，目前已有多个省（市、区）报道本病发生，已经造成巨大的经济损失。

在猪伪狂犬病防制中，疫苗起着重要作用，由于弱毒活疫苗具有免疫剂量小、价格低廉的特点，所以使用范围较灭活疫苗广泛，尤其是用gE基因缺失毒株制备的活疫苗，猪群使用这种标记疫苗后，通过检测gI或gE的抗体水平，可以区分疫苗抗体和野毒抗体，从而为猪场净化伪狂犬病提供科学依据。保证疫苗的质量尤为重要，鉴别检验和外源病毒检验是动物活疫苗质量检验的重点之一，其目的是保证疫苗（或毒种）的纯粹性、特异性，伪狂犬病活疫苗也不例外。《中华人民共和国生物制品规程》（2000年版）和《中华人民共和国兽药典》（2010版3部）都要求对伪狂犬病活疫苗进行鉴别检验和外源病毒检验，但由于国内现有伪狂犬病标准阳性血清制备技术耗时长、成功率低、抗体效价低，导致在疫苗的鉴别检验和外源病毒检验中难以完全中和相对应的病毒，使疫苗的质量检验工作难以正常进行，给疫苗质量监管留下了隐患，国外的伪狂犬病标准阳性血清采购困难且价格昂贵，加上检验需求量较大，所有为解决生产、检验需要，研发高效价伪狂犬病标准阳性血清的制备方法势在必行。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高效价伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种伪狂犬病标准阳性血清的制备方法，包括以下步骤：

（1）抗原免疫：在隔离饲养的清洁级家兔左侧腹股沟皮下注射PRV灭活病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL）2mL，间隔14日后在家兔左侧腹股沟皮下加强免疫1次PRV灭活病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL）2mL，距第1次免疫28日后在家兔右侧腹股沟皮下注射PRV病毒液（10^5.0TCID₅₀/mL）2mL。

所述的清洁级家兔优选为体重1.5～2kg的日本大耳白兔，对伪狂犬病、轮状病毒病、猪瘟、细小病毒病、兔瘟抗原抗体呈阴性；所述的PRV优选为保藏编号为CCTCC NO：V201114的猪伪狂犬病弱毒C株。

（2）血清收获：距第3次免疫后14日，收集血清。

一种伪狂犬病标准阳性血清的冻干保存方法，包括以下步骤：

（1）保护剂的配制及血清保存：按血清体积的1%、1%、0.1%、0.05%于血清中分别加入氯化钠、海藻糖、谷氨酸单钠、L-精氨酸，充分溶解后，用滤膜除菌，然后分装；

所述的滤膜优选为0.22μm的滤膜。

（2）冻干（冻干曲线图如图1所示）：将分装好的血清装入冻干机箱体内，在2～3小时内样品由常温降温至-45℃，在此温度下维持3～4个小时后，开始抽真空至10～20Pa后，再开始升温，2小时内升至-10℃，之后以-10℃的升华温度维持10～12小时，然后在1小时内提温至0℃并维持2h，再在3小时内提温至28℃并维持4～6小时后真空状态下压塞出箱。

一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法，为分别使用上述方法制备伪狂犬病标准阳性血清并冻干保存。

通过本发明的方法得到的伪狂犬病标准阳性血清PRV中和抗体效价在1:512以上，在2～8℃条件下保存60个月抗体效价保持不变。

本发明采用血清制备、血清冻干、抗体标定、疫苗外源病毒及特异性检验等一系列手段研究了标准阳性血清的制备方法、冻干保存方法，试验结果表明，该免疫途径及方式可以使家兔产生很高的伪狂犬抗体，并经过冻干保存后保存时间长，有很好的稳定性，在疫苗外源病毒及特异性检验中能够充分中和伪狂犬病毒，为伪狂犬病弱毒疫苗的检验提供了很好的资源。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）研究了标准阳性血清的制备方法、冻干保存方法，试验结果表明，先免疫灭活病毒后再免疫活病毒的免疫方法和免疫途径，能使家兔在免疫灭活病毒产生抗体保护后，在活病毒的刺激下而产生很高的伪狂犬病中和抗体效价，达到1:512。经过冻干保存抗体效价没有任何损失，伪狂犬病中和抗体效价依然维持在1:512，保存时间长，有很好的稳定性。在疫苗外源病毒及特异性检验中能够充分中和伪狂犬病毒，为伪狂犬病弱毒疫苗的质量检验提供了很好的技术支撑。

（2）按血清比例将1%氯化钠、1%海藻糖、0.1%谷氨酸单钠、0.05%L-精氨酸溶于阳性血清中，用0.22μm的滤膜除菌，然后采用相应的冻干曲线进行冻干；在2～8℃条件下保存60个月抗体效价保持不变。

附图说明

图1是伪狂犬病标准阳性血清的冻干曲线图；

图2是伪狂犬病标准阳性血清制备工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明伪狂犬病标准阳性血清制备工艺流程图如图2所示。

实施例1

1、血清的制备

筛选体重1.5～2kg日本大耳白兔5只（清洁级），经PCR和ELISA检测伪狂犬病、轮状病毒病、猪瘟、细小病毒病、兔瘟抗原抗体均为阴性。每只家兔左侧腹股沟皮下注射PRV（C株）灭活病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL）2mL，间隔14日后每只家兔左侧腹股沟皮下加强免疫1次PRV（C株）灭活病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL）2mL，距第1次免疫28日后每只家兔右侧腹股沟皮下注射PRV（C株）病毒液（10^5.0TCID₅₀/mL）2mL，距第3次免疫后14日，即可将家兔颈动脉放血采血分离血清备用。其中，PRV（C株）为一株天然弱毒的猪伪狂犬病弱毒C株，保藏编号为：CCTCC NO：V201114；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，CHINA CENTERFOR TYPE CULTURE COLLECTION（CCTCC）；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

2、血清中和抗体效价检测试验

将采集到的兔血清用0.22μm的滤膜除菌，置56℃水浴灭活30分钟。在细胞培养板各孔中加入50μL DMEM培养液，随后在第1孔中加入待检血清50μL，混合后，用微量移液器取出50μL，加入第2孔中，混匀后取出50μL再加入第3孔中，依次类推，直至第10孔，血清稀释度即为1:2、1:4、1:8……1:1024，每份待检血清稀释度作3个重复。将50μL含200个TCID₅₀/0.1mLPRV病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃中和1小时。每血清孔中加入100μL经胰酶消化分散的PK15细胞。每次试验的每一块板上设立病毒对照，先将200TCID₅₀/0.1mL病毒液作10倍系列稀释，取10⁰、10^-1、10^-2、10^-34个稀释度，每个稀释度接种4孔，每孔100μL，然后每孔加入100μL细胞悬液。逐日观察，记录细胞病变和非病变孔数，观察5日。病毒对照中0.2TCID₅₀不引起细胞病变，阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，测定结果有效，试验条件成立。观察后确定对细胞培养50%保护的血清最大稀释度，计算中和抗体效价，采集到的兔血清的中和抗体效价为1:512。

3、血清的冻干

按血清体积的1%、1%、0.1%、0.05%于血清中分别加入氯化钠、海藻糖、谷氨酸单钠、L-精氨酸，充分溶解后，用0.22μm的滤膜除菌，每瓶分装2mL。将分装好的血清装入冻干机箱体内，在2小时内样品由常温缓慢降温至-45℃，在此温度下维持3个小时后，开始抽真空至18Pa后，开始升温，2小时内升至-10℃，之后以-10℃的升华温度维持11小时，然后在1小时内提温至0℃并维持2h，再在3小时内提温至28℃并维持5小时后真空状态下压塞出箱，冻干全程为29个小时。

4、血清冻干后中和抗体效价检测试验

将无菌冻干待检兔血清用不含血清的DMEM培养液还原至2mL，置56℃水浴灭活30分钟。在细胞培养板各孔中加入50μL DMEM培养液，随后在第1孔中加入待检血清50μL，混合后，用微量移液器取出50μL，加入第2孔中，混匀后取出50μL再加入第3孔中，依次类推，直至第10孔，血清稀释度即为1:2、1:4、1:8……1:1024，每份待检血清稀释度作3个重复。将50μL含200个TCID₅₀/0.1mLPRV病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃中和1小时。每血清孔中加入100μL经胰酶消化分散的PK15细胞。每次试验的每一块板上设立病毒对照，先将200TCID₅₀/0.1mL病毒液作10倍系列稀释，取10⁰、10^-1、10^-2、10^-34个稀释度，每个稀释度接种4孔，每孔100μL，然后每孔加入100μL细胞悬液。逐日观察，记录细胞病变和非病变孔数，观察5日。病毒对照中0.2TCID₅₀不引起细胞病变，阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，测定结果有效，试验条件成立。观察后确定对细胞培养50%保护的血清最大稀释度，计算中和抗体效价，冻干兔血清的中和抗体效价为1:512。

5、鉴别检验试验

将武汉中博生物股份有限公司所生产伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株），用含2%的新生牛血清DMEM细胞培养液稀释成200TCID₅₀/0.1mL。取病毒稀释液与阳性兔血清等量混匀，置37℃水浴中和作用1小时后，接种于已长成良好单层（弃去细胞培养液）的96孔ST细胞培养板，接种6孔，每孔0.2mL，同时设正常细胞对照和病毒对照各2孔。置37℃、含5%CO₂培养箱中培养并观察5日。病毒对照孔出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均没有产生CPE，说明制备的兔阳性血清可以用于伪狂犬病活疫苗的鉴别检验。

6、外源病毒检验试验

取将武汉中博生物股份有限公司所生产伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株），每瓶冻干疫苗加入无血清DMEM细胞培养液，稀释成每1.0mL含10头份，混合后与等量阳性兔血清37℃中和1小时后作为被检检品，用疫苗与兔血清混合液接种已长成良好单层Vero、ST、MDBK细胞的细胞培养瓶各2瓶，每瓶至少1.0mL（含待检疫苗制品至少1头份）。接种细胞单层时，需37℃吸附1h，然后弃去接种物，用PBS洗涤细胞表面2次，再补加10mL细胞维持液继续培养；处理的样品同步接种ST细胞，接种瓶数、接种剂量、培养时间均同Vero、ST、MDBK细胞。另设1瓶ST正常细胞对照。将上述Vero、ST、MDBK细胞培养物冻融3次后，3000g/m离心10分钟，分别再接种于相应的Vero、ST、MDBK细胞单层各2瓶用于继代，每瓶接种至少1mL，置37℃吸附1h后，加入细胞维持液，置37℃培养箱中培养观察。ST细胞冻融后3000g/m离心10分钟同步接种ST细胞，接种瓶数、接种剂量、培养时间均同Vero、ST、MDBK细胞。每次继代均设立正常细胞对照。被检样品在每种细胞上的总培养时间应不少于14日。培养期间细胞培养物应至少继代1次。最后一次继代的细胞单层数量和面积、培养时间应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。培养期内，对细胞培养物进行常规检查，培养物无细胞病变，培养结束时，将上述经继代细胞培养物冻融3次后按下述方法继续检验。BVDV荧光抗体检查选用MDBK细胞，PPV荧光抗体检查选用Vero细胞，CSFV荧光抗体检查选用ST细胞。对每一种特定外源病毒的检验应包含三组细胞：（1）被检样品最后一次继代细胞培养物；（2）被检样品最后一次继代时设立的特定病毒阳性对照（BVDV Oregon C24V株接种MDBK细胞作为BVDV荧光抗体检查的阳性对照，PPV NADL-2株同步接种ST细胞作为PPV荧光抗体检查的阳性对照，CSFV Thiverval株接种ST细胞作为CSFV荧光抗体检查的阳性对照）；（3）正常细胞对照。每组细胞单层（或同步接种）选择24孔细胞培养板，每个样品接种4孔，每孔接种0.5mL。以上细胞培养5～7日后，弃掉营养液，用PBS（pH7.2）洗涤2～3遍，晾干后用80%冷丙酮置2～8℃固定30分钟，弃去固定液，自然干燥后以适宜的荧光抗体进行染色、镜检。检查BVDV外源病毒时可选直接免疫荧光检查法或间接免疫荧光检查法，检查PPV外源病毒时选择间接免疫荧光检查法，检查CSFV外源病毒时选择间接免疫荧光检查法。阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光，被检样品无荧光。结果显示，试验条件均成立，说明制备的兔阳性血清可以用于伪狂犬病活疫苗的外源病毒检验。

实施例2

1、血清的制备

筛选体重1.5～2kg日本大耳白兔10只（清洁级），经PCR和ELISA检测伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪细小病毒病、兔瘟抗原抗体均为阴性。每只家兔左侧腹股沟皮下注射PRV（C株）灭活病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL）2mL，间隔14日后每只家兔左侧腹股沟皮下加强免疫1次PRV（C株）灭活病毒液（10^7.0TCID₅₀/mL）2mL，距第1次免疫28日后每只家兔右侧腹股沟皮下注射PRV（C株）病毒液（10^5.0TCID₅₀/mL）2mL。距第3次免疫后15日，即可将家兔颈动脉放血采血分离血清备用。

2、血清中和抗体效价检测试验

将采集到的兔血清用0.22μm的滤膜除菌，置56℃水浴灭活30分钟。在细胞培养板各孔中加入50μL DMEM培养液，随后在第1孔中加入待检血清50μL，混合后，用微量移液器取出50μL，加入第2孔中，混匀后取出50μL再加入第3孔中，依次类推，直至第10孔，血清稀释度即为1:2、1:4、1:8……1:1024，每份待检血清稀释度作3个重复。将50μL含200个TCID₅₀/0.1mLPRV病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃中和1小时。每血清孔中加入100μL经胰酶消化分散的PK15细胞。每次试验的每一块板上设立病毒对照，先将200TCID₅₀/0.1mL病毒液作10倍系列稀释，取10⁰、10^-1、10^-2、10^-34个稀释度，每个稀释度接种4孔，每孔100μL，然后每孔加入100μL细胞悬液。逐日观察，记录细胞病变和非病变孔数，观察5日。病毒对照中0.2TCID₅₀不引起细胞病变，阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，测定结果有效，试验条件成立。观察后确定对细胞培养50%保护的血清最大稀释度，计算中和抗体效价，采集到的兔血清的中和抗体效价为1:512。

3、血清的冻干

按血清体积比例将1%氯化钠、1%海藻糖、0.1%谷氨酸单钠、0.05%L-精氨酸溶于阳性血清中，用0.22μm的滤膜除菌，每瓶分装2mL，将分装好的血清装入冻干机箱体内，在3小时内样品由常温缓慢降温至-45℃，在此温度下维持4个小时后，开始抽真空至15Pa后，在开始升温，2小时内升至-10℃，之后以-10℃的升华温度维持10小时，然后在1小时内提温至0℃并维持2h，再在3小时内提温至28℃并维持5小时后真空状态下压塞出箱，冻干全程为30个小时。

4、冻干后的血清中和抗体效价检测试验

将无菌冻干待检兔血清用不含血清的DMEM培养液还原至2mL，置56℃水浴灭活30分钟。在细胞培养板各孔中加入50μL DMEM培养液，随后在第1孔中加入待检血清50μL，混合后，用微量移液器取出50μL，加入第2孔中，混匀后取出50μL再加入第3孔中，依次类推，直至第10孔（将混合液50μL），血清稀释度即为1:2、1:4、1:8……1:1024，每份待检血清稀释度作3个重复。将50μL含200个TCID₅₀/0.1mLPRV病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃中和1小时。每血清孔中加入100μL经胰酶消化分散的PK15细胞。每次试验的每一块板上设立病毒对照，先将200TCID₅₀/0.1mL病毒液作10倍系列稀释，取10⁰、10^-1、10^-2、10^-34稀释度，每个稀释度接种4孔，每孔100μL，然后每孔加入100μL细胞悬液。逐日观察，记录细胞病变和非病变孔数，观察5日。病毒对照中0.2TCID₅₀不引起细胞病变，阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，测定结果有效，试验条件成立。观察后确定对细胞培养50%保护的血清最大稀释度，计算中和抗体效价，冻干兔血清的中和抗体效价为1:512。

5、鉴别检验试验

将武汉中博生物股份有限公司所生产伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株），用含2%的新生牛血清DMEM细胞培养液稀释成200TCID₅₀/0.1mL。取病毒稀释液与阳性兔血清等量混匀，置37℃水浴中和作用1小时后，接种于已长成良好单层（弃去细胞培养液）的96孔ST细胞培养板，接种6孔，每孔0.2mL，同时设正常细胞对照和病毒对照各2孔。置37℃、含5%CO₂培养箱中培养并观察5日。病毒对照孔出现CPE，正常细胞对照孔和病毒中和孔均没有产生CPE，说明制备的兔阳性血清可以用于伪狂犬病活疫苗的鉴别检验。

6、冻干血清的测试

将实施案例1、2冻干的血清、常规冻干的血清（将实施例1采集的血清定量分装于中性玻璃瓶中，密封瓶口，贴上瓶签用常温进冻干机箱体内，1小时内将制品降至-42℃并维持2小时。1小时将制品从-42℃升至-5℃并维持10小时。1小时将制品从-5℃升至10℃并维持2小时；1小时将制品从10℃升至28℃并维持6小时，冻干结束）及未冻干的血清，置于2～8℃条件下保存，不同时间取样，测定抗体效价及其物理性状，检测结果见表1。

表1.冻干后血清于2～8℃保存不同时间的抗体效价

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种伪狂犬病标准阳性血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）抗原免疫：在隔离饲养的清洁级家兔左侧腹股沟皮下注射2mL 10^7.0TCID₅₀/mL PRV灭活病毒液，间隔14日后在家兔左侧腹股沟皮下加强免疫1次2mL 10^7.0TCID₅₀/mL PRV灭活病毒液，距第1次免疫28日后在家兔右侧腹股沟皮下注射2mL 10^5.0TCID₅₀/mL PRV病毒液；

（2）血清收获：距第3次免疫后14日，收集血清。

2.根据权利要求1所述的伪狂犬病标准阳性血清的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的清洁级家兔为体重1.5～2kg的日本大耳白兔，对伪狂犬病、轮状病毒病、猪瘟、细小病毒病、兔瘟抗原抗体呈阴性。

3.根据权利要求1所述的伪狂犬病标准阳性血清的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PRV为保藏编号为CCTCC NO：V201114的猪伪狂犬病弱毒C株。

4.一种伪狂犬病标准阳性血清的冻干保存方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）保护剂的配制及血清保存：按血清体积的1%、1%、0.1%、0.05%于血清中分别加入氯化钠、海藻糖、谷氨酸单钠、L-精氨酸，充分溶解后，用滤膜除菌，然后分装；

（2）冻干：将分装好的血清装入冻干机箱体内，在2～3小时内样品由常温降温至-45℃，在此温度下维持3～4个小时后，开始抽真空至10～20Pa后，再开始升温，2小时内升至-10℃，之后以-10℃的升华温度维持10～12小时，然后在1小时内提温至0℃并维持2h，再在3小时内提温至28℃并维持4～6小时后真空状态下压塞出箱。

5.根据权利要求4所述的伪狂犬病标准阳性血清的冻干保存方法，其特征在于：步骤（1）中所述的滤膜为0.22μm的滤膜。

6.一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法，其特征在于：使用权利要求1～3任一项所述的方法制备得到伪狂犬病标准阳性血清，再使用权利要求4或5所述的方法进行冻干保存。

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