CN102911872A - 栅藻藻株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种栅藻藻株(Scenedesmus sp.)及其应用，本发明的栅藻具有生长速度快、油脂积累快、含油量高、能够有效去除水中的含氮化合物等优点，并且含有适合部分有益的色素，可用于生物柴油生产，食品、保健品、饲料、水产品饵料、药物以及化妆品和色素的生产。

Description

栅藻藻株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种栅藻ENN33(Scenedesmus sp.)及其应用。
背景技术
随着世界化石燃料储备量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不断增加以及全球气候的日益趋暖，人类的生存和发展状况已经面临前所未有的挑战。因此，因此，世界各国都在积极寻找能够替代石油产品的可再生能源，其中，生物柴油就是一种重要的生物能源，然而，常见的油料作物例如玉米和大豆等培育周期较长，占用农田较多，会产生“与人争粮，与粮争地”问题，从而导致“解决了能源危机，却出现粮食危机”的尴尬结果。
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富，生长周期短，光合利用度高的以光合自养产生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最广、种类和数量最大的生物质资源。在一定条件下许多微藻能够在细胞中大量积累储藏性三酰甘油（微藻油）（类似于植物油），其最高含量可达到细胞干重的50%以上。与高等陆生油料作物相比，微藻的单位面积油产量是油料植物油产量的数十倍，经过生物冶炼可以生产生物柴油等多种生物燃料，被认为是最有可能最有潜力成为石油替代品的生物质资源。
除了油产量非常高之外，微藻还富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、各种氨基酸、维生素、抗生素、高不饱和脂肪酸以及其它多种生物活性物质，因此，在保健食品、医药和饲料等领域也同样具有很好的开发前景，例如，用于食料和医药业（人和动物的营养补充物：维生素、蛋白质、脂肪酸、多糖等）；提取化工产业如化妆品、精细化工产品等；作为能源产生沼气、燃料；用于饵料和饲料业（鱼虾、甲壳动物等水产动物的饵料、家禽饲料等）；农业上作为土壤调节剂、肥料等。
此外，微藻的环境适应能力非常强，对营养的要求也很简单，可在各种严苛环境下生长。例如，微藻可通过光合作用吸收污水中的硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐、磷酸盐等无机盐的氮磷合成氨基酸、蛋白质、磷脂等有机物，形成微藻细胞，从而降低水体中的氮磷含量，因此微藻可用于去除污水中的氮磷。微藻还可利用工业废气中的CO2，减少CO2的排放。因此微藻在无论是工业环境保护方面还是城市环境保护方面也都有很好的应用前景。还有一些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠等不适宜进行耕种的土地进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，被誉为可循环的“绿色油田”，因此发展微藻培养及其相关工业也非常适合土地尤其是耕地资源相对紧缺的我国。
目前国内外都积极开展了对于微藻的开发尤其是其在生物能源应用方面的开发，这其中以对小球藻的研究居多。CN101460609公开了一种新的小球藻属（CHLORELLA）物种及其应用CN101565675公开了一种小球藻及其培养方法和它在生物柴油生产中的应用；CN101824386公开了一株小球藻，及其在生产微藻油脂和固定CO2中的应用；CN102093955公开了一株小球藻及其在利用污水培养与生物柴油转化体系中的应用；CN102229889公开了一株小球藻及其培养方法和在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产应用。
栅藻是淡水中常见的浮游微藻，极喜在营养丰富的静水中繁殖。许多种类对有机污染物具有较强的耐性,在水质评价中可作为指示生物，并且在水体自净和污水净化中有一定作用，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上,形成胶质层,吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，如利用有机污水氧化塘养鱼，可获高产。大量繁殖的藻体也可作家禽的饲料。目前国内外对于栅藻的开发还不是很多，CN101565674公开了一株低营养栅藻及其在污水深度处理中的应用，该栅藻藻株可在低营养环境中生长，因此可将二级出水中的氮磷去除到很低水平；CN102083957公开了一种具有高效去除二氧化碳特征性的凸头状栅藻原变种微藻及其用途，尤其是二氧化碳固定率高的凸头状栅藻原变种微藻及其用途；CN102250773公开了一株栅藻及其培养方法和在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产等领域中的应用；季祥、王金荣等人（一株斜生栅藻的筛选及生长条件的优化[J]。水产科技情报，2010:37(6)）获得了一株含油相对较高、长势较好的藻种栅藻藻株。
尽管微藻具有非常良好的能源、环境保护甚至医药等开发前景，并且相关的研究工作也已经逐渐展开，但是目前已知的微藻，尤其是栅藻，含油量通常在40%以下、对CO2的处理能力、极端环境耐受等方面的性能上还普遍偏低。因此需要开发性能更好，更适于工业应用的藻种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对环境适应能力强，油脂含量高，对CO2的处理能力强的更加适于工业应用的栅藻。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种栅藻ENN33(Scenedesmus sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2012年07月13日，保藏号为CGMCC No.6347。
本发明提供的栅藻ENN33中脂肪酸在藻粉中的含量可以大于40%干重，优选地大于50%干重，更优选地为56%~60%干重，最优选地为58%。
本发明提供的栅藻ENN33含有虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和角黄素。
本发明提供的栅藻ENN33的耐受温度可以为-10℃至44℃，优选地6℃至40℃，更优选地8℃至30℃，还更优选地10℃至20℃，最优选地15℃。
本发明提供的栅藻ENN33可以在-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、46、43℃或44℃下生长。
在第二方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33的培养方法，所述方法包括将栅藻藻株ENN 33绿色细胞接种在BG11培养基中，其中光照强度50-500μmol/m2.s，优选100-450μmol/m2.s、更优选150-400μmol/m2.s、还更优选200-350μmol/m2.s、最优选250-300μmol/m2.s，pH值7-9、优选7.5-8.5，更优选8，温度15-35℃、优选20-30℃、更优选25℃。
在本发明的栅藻ENN33的培养方法中，光照强度可以为50μmol/m2.s、80μmol/m2.s、100μmol/m2.s、120μmol/m2.s、150μmol/m2.s、180μmol/m2.s、200μmol/m2.s、220μmol/m2.s、250μmol/m2.s、280μmol/m2.s、300μmol/m2.s、320μmol/m2.s、350μmol/m2.s、380μmol/m2.s、400μmol/m2.s、420μmol/m2.s、450μmol/m2.s、480μmol/m2.s或500μmol/m2.s；pH值可以为7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8或9；温度可以为15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。
在第三方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸和/或二十碳五烯酸。
在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
在第五方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33在环境保护中的应用，优选地所述环境保护为污水处理或CO2减排，所述污水处理包括污水的脱氮、除磷、有机物降解和/或重金属离子吸附。
在第六方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33在包含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、亚油酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、二十碳五烯酸、虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的药物的制备中的用途。
在第七方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33在包含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、亚油酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、二十碳五烯酸、虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的食品、保健品、饲料和/或水产品饵料生产中的用途。
在第八方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN33在包含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、亚油酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、二十碳五烯酸、虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的化妆品生产中的应用。
在本发明中，BG11培养基为本领域中最常用的藻类培养基，其具体组分见下文。
本发明的有益技术效果为：
1、本藻种生长速度快，CO2利用率高，且细胞沉降性好，便于收集，适宜于高密度养殖，适合产业化推广
2、本藻种油脂积累快，含油量高，适合用来生产生物柴油
3、本藻种能有效去除水中的氮，适宜用于废水处理
4、本藻种本藻种温度耐受范围广泛，适合全年养殖。
附图说明
图1是本发明的栅藻ENN33在显微镜下的镜检图片。
图2显示本发明的栅藻ENN33的ITS及5.8S部分核苷酸序列在GenBank数据库中进行BLAST比对的结果。
图3是采用邻位相连(Neighbor-joining)算法构建的栅藻ENN33的***发育进化树。
图4是本发明的栅藻ENN33的室内养殖生长曲线。
图5是本发明的栅藻ENN33在高温条件下的生长曲线。
图6是本发明的栅藻ENN33在低温条件下的生长曲线（一）。
图7是本发明的栅藻ENN33的低温条件下的生长曲线（二）。
图8是本发明的栅藻ENN33的废水废气养殖生长曲线。
图9是本发明的栅藻ENN33的色素百分含量图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1筛选产油栅藻藻株
取无菌水稀释溶解后的从乌兰察布取回的土壤，在400倍显微镜观察后，大约细胞浓度为800—1200个/ml，用毛细管取大约1μl的藻液，接种于48孔装有BG11培养基的培养板中，在25℃、光照强度为50μmol/m2.s情况下进行培养，当达到一定细胞浓度时，显微镜观察，选择只有单藻株的孔，稀释至细胞浓度为1000-3000个/ml后铺平板，得到单藻株。重复此过程，直到获得纯培养的藻株，本发明中对其编号称为“ENN33”。
实施例2鉴定藻种及其在进化树上的分类。
藻株鉴定采取形态鉴定和分子鉴定相结合的方法。
1.形状鉴定(见图1)：对上述分离出来的藻株ENN33在1000倍显微镜进行观察，藻体为单细胞或定型群体形态存在，定型群体由2个或4个细胞组成，群体细胞并列直线成一列或略作交互排列；细胞纺锤形，上下两端逐渐尖细，细胞壁平滑。4个细胞的群体宽12-34μm，细胞长10-20μm，宽3-9μm。色素体周生，片状，具蛋白核一枚。无性繁殖产生似亲孢子。检索《中国淡水藻类--***、分类及生态》，发现此藻在形态上分类相同的为绿藻门（Chlorophyta）、绿藻纲（Chlorophyceae）、绿球藻目（Chlorococcales）、栅藻科（Scenedesmaceae）、栅藻属（Scenedesmus）。
2.分子鉴定：
A，A，从分离的衣藻扩增其ITS及5.8S部分核苷酸序列
用CTAB法提取培养4天的ENN33藻基因组DNA。取一定量的细胞，研磨处理后加入适量CTAB缓冲液，匀浆，加入等体积的酚：氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。
ITS序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物（引物合成由上海生工生物工程公司合成）。
引物1 5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’
引物2 5’GCATATCAATAAGCGGAGGA 3’
取1μl总DNA为模板。扩增条件如下：94℃变性5min，然后94℃40s，56℃40s，72℃2min 30个循环，最后72℃10min。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，PCR扩增获得约750bp片断。序列如下（下划线部分为引物序列）：
GGAAGTAAAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGAATTATAAAAACCACAATGTGAACCTCAACGTTCCGTGCCTCTGCTGCCAGCGGGGCAACGGGCTTTCAGCTCGTTGCTACTTGCAGCTGGCATCGGCATTGCTGCCGTTGCCAGTGGCGCTTTGGCATGACCTTACACCAGTCTAACCACTGTAAAAACCAAAATCTGAAGCTCTGACTGCTATTAACTGGCGGTCTTAACCAAAGACAACTCTCAACAACGGATATCTTGGCTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAACCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCGAGCCCTCGGGCAAGAGCATGTCTGCCTCAGCGTCGGTTTACACCCTCACCCCTCCCTCCTTGTGTGGGTCGGTTGGCTTGCTAGCCAGCCTTAGGGGTGGATCTGGCTTCCCCAAACTGCTCCGGCAGGTTGGGTTGGCTGAAGTTTAGAGGCTTAAACAAGGACCCGATATGGGCTTCAACTGGATAGGTAGCACCGGCTTCTGCCGACTACACGAAGTTGTGGCTTGTGGACTTTGTTAGGGGCCAAGCAGGAAACATGCTCTGCATGTTCTAAACTTTCGACCTGAGCTCAGGCAAGGCTACCCGCTGAACTTAAACATATCAAAAACCGGAGGAAAGAGAATCCTCCGCTTATTGATATGC。
B，所克隆的核苷酸序列同源性搜索
将获得的ENN33的ITS序列及5.8S部分序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与ACCESSION号为AM419228.1的Scenedesmus.sp的内转录间隔区1、5.8S核糖体RNA基因和内转录间隔区2的序列具有较高的相似性达93%(图2)。
C，根据上述序列作出进化树。
利用NCBI数据库中的BLAST工具对藻株ENN33的ITS部分序列进行序列相似性分析。选取部分同源序列和该藻株的ITS部分序列利用clustaLx软件包进行序列同源进化比对,形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后,运用Mega4.0软件，采用邻位相连算法,自展数据集bootstraps值为1000构建***发育进化树。见图3。
根据形态和ITS blast的结果，限定ENN33为栅藻属（Scenedesmus）。
发明人已将所述藻株于2012年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，简称CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.6347。
实施例3 ENN 33藻的室内养殖及油脂积累
将处在对数生长期的栅藻藻株ENN 33绿色游动细胞接种在配制好的BG11培养基（配方见表1）中，使细胞密度达到OD750为0.2-0.8之间。培养过程光照强度控制在50-500μmol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间，温度调控在15-35℃范围内。培养所使用的反应器为40mm内径、长度600mm的柱式反应器。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图4。培养进行到第16天，藻液颜色变黄时，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥。
表1BG11培养基配方
  NaNO3   1.5g/l
  K2HPO4·3H2O   0.04g/l
  MgSO4·7H2O   0.075g/l
  CaCl2·2H2O   0.036g/l
  柠檬酸   0.006g/l
  FeCl3·6H2O   0.00315g/l
  Na2EDTA·2H2O   0.00436g/l
  Na2CO3   0.02g/l
  A5微量元素*   1ml
*A5微量元素的组成成分
加到1000ml去离子水中
  H3BO3   2.86g
  MnCl2·H2O   1.81g
  ZnSO4·7H2O   0.222g
  CuSO4·5H2O   0.079g
  Na2MoO4·2H2O   0.390g
  Co(NO3)2·6H2O   0.0494g
干燥完成后，测定其油脂组分含量如下表2，分析方法如下：
1）脂肪酸提取：
取50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中,再放置一小磁力棒，加入2-4ml 10%DMSO-甲醇溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟,3500转离心,转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1:1的***、正己烷4-8ml 4℃下磁力搅拌抽提1小时,3500转离心,转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-Methanol、***、正己烷)体积比例为1:1:1:1,震荡分相,移取有机相转移到另一小玻璃瓶中,在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中,再用氮气吹干至恒重。
2）脂肪酸分析：
照上面方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820气相色谱仪进行气相色谱分析（色谱条件为载气：氮气流量1ml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm），分流比：4：1。分析方法：内标法（气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相）。
表2气相色谱测定的样品总脂组分表
Figure BDA00002087663500121
Figure BDA00002087663500131
将栅藻藻株ENN33进行了多次生长培养和脂肪酸分析实验测定，其脂肪酸含量可达56%~60%干重。
实施例4ENN 33高温耐受性
将处在对数生长期的栅藻藻株ENN33绿色游动细胞接种在配制好的BG11培养基（配方见表1）中，使细胞密度达到OD750为1.2-2.0之间。培养过程光照强度控制在400-1200μmol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为600*5cm柱式反应器。培养第4天开始进行升温处理，处理的第1天为40-43℃2h，之后为40-44℃6h，其余时间恒温25℃左右。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图5。
ENN33在高温条件下能保持一定速度生长，最终15天时干重达3.7g/L左右，40-44℃6h高温对ENN33的生长几乎没有太大影响。但40℃高温对于其他藻株来说，是可能导致死亡的温度。
实施例5 ENN33低温耐受性
（一）将处在对数生长期的栅藻藻株ENN33绿色游动细胞接种在配制好的BG11培养基（配方见表1）中，使细胞密度达到OD750为1.2-2.0之间。培养过程光照强度控制在600-1500μmol/m2/s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在6.5-8之间。培养所使用的反应器为0.5*0.03*0.5m板式反应器。设置两个实验组：第一组在室内常温（藻液温度变化范围为15-30℃）进行养殖，第二组白天在室外低温（室外藻液温度变化范围为6-20℃，多数时间维持在10-15℃之间，室外环境温度多在-10℃到8℃之间）、夜间搬入室内进行养殖。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图6。
ENN33低温组生长与常温组相比虽然有一定差距，但在低温条件下也能保持一定速度生长，且在培养到后期与常温组干重基本相同，最终20天时干重达3.8g/L左右。
（二）将处在对数生长期的栅藻藻株ENN33绿色游动细胞接种在配制好的BG11培养基（配方见表1）中，使细胞密度达到OD750为1.2-2.0之间。培养过程光照强度控制在600-1500μmol/m2/s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在6.5-8之间。培养所使用的反应器为0.5*0.03*0.5m板式反应器。设置两个实验组：第一组24h在室内常温（藻液温度变化范围为15-30℃）进行养殖，第二组24h在室外低温（藻液温度变化范围为白天6-20℃，多数时间维持在10-15℃之间，夜间出现冰冻）进行养殖。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图7。
ENN33低温组生长与常温组相比差距不大，在整个培养过程中与常温组干重基本相同，最终19天时干重达3.8g/L左右。
实施例6 ENN33的沉降性
将实施例5中培养19天的ENN33静置过夜，到第二天观察，上清较为清澈，几乎所有藻细胞都沉降到反应器底部，说明ENN33经过夜沉降，收集效果良好。
实施例7 ENN 33的废水废气养殖
将处在对数生长期的藻种接种在50*10*50cm板式反应器中，设置两个实验组：第一组使用自来水按照表1配制BG11培养基进行养殖，第二组使用化工厂废水添加1.5g/L NaNO3、0.04g/L K2HPO4·3H2O配制培养基进行养殖，两组培养基的离子浓度见表3。
表3两种培养基的离子浓度测定结果
Figure BDA00002087663500151
Figure BDA00002087663500161
注：化工厂废水中各离子成分为离子色谱测量结果，BG11培养基各成分浓度为理论计算值
利用自然条件进行生长培养，培养期间自然条件如下：培养周期为11天，9:00-17:00的温度变化范围主要在20-45℃之间，白天持续高温时间为3-5h。白天双面总光照量晴天达到10000μmol/m2/s以上，阴天总光照量不到5000μmol/m2/s，整个培养过程仅有两天阴天。通入一定比例的CO2(CO2来源于化工厂，纯度95%以上)，控制PH值在7.5-8.5之间。培养过程中间断取样测定干重（结果见图8）。
培养至第5天藻株出现一定死亡，但随后有全部长起。与自来水养殖相比，废水养殖在培养中期稍有下降，但后期有长起，与自来水养殖差别不大。培养11天干重达到2g/L左右。
实施例8 ENN 33色素含量测定
1、藻细胞中色素的提取：取一定离心收集的藻细胞，用甲醇浸泡提取数次，合并甲醇提取液，用旋转真空蒸发器去除甲醇，浓缩物再用CCl4溶解，待测。
2、色素标准溶液的配制：称取一定量的虾青素、叶黄素、玉米黄质、角黄素、β-胡萝卜素标准品，用甲醇配制不同质量浓度的标准工作液。
3、上液相色谱，绘制色素的色谱图及标准曲线
4、通过外标法，以色素标准品，定量计算出色素的含量（见表4、图9）
表4液相色谱测定的样品色素组分表
 色素名称   占藻粉百分含量
 虾青素   0.0039%
 叶黄素   0.0021%
 玉米黄质   0.0366%
 角黄素   0.0106%
 β-胡萝卜素   0.0548%
虾青素化学名称是3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，在体内可与蛋白质结合而呈青、蓝色。有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病作用；
叶黄素又名“植物黄体素”，是构成人眼视网膜黄斑区域的主要色素，有保护眼睛，延缓眼睛老化及防止病变和抗氧化作用；
玉米黄质是叶黄素的异构体，对维持眼睛健康具有特别重要的作用；
角黄素(食物添加剂国际编号：INS161g)主要用作动物饲料添加剂，也可用于果酱、糖果、糖浆、调味汁、含二氧化碳饮料等食物，作为着色剂。
B-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细结构特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Figure IDA00002087664400011

Claims (10)

1.一种栅藻ENN33(Scenedesmus sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2012年07月13日，保藏编号为CGMCC No.6347。
2.根据权利要求1所述的栅藻ENN33，其特征在于，所述栅藻ENN33中脂肪酸的含量为大于40%干重，优选地大于50%干重，更优选地为56%~60%干重，最优选地为58%。
3.根据权利要求1所述的栅藻ENN33，其特征在于，所述栅藻ENN33的耐受温度为-10℃至44℃，优选地6℃至40℃，更优选地8℃至30℃，还更优选地10℃至20℃，最优选地15℃。
4.根据权利要求1所述的栅藻ENN33，其特征在于，所述栅藻ENN33含有虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和角黄素。
5.如权利要求1至4中任一项所述的栅藻ENN33的培养方法，所述方法包括将栅藻藻株ENN33绿色细胞接种在BG11培养基中，其中光照强度50-500μmol/m2.s，优选100-450μmol/m2.s、更优选150-400μmol/m2.s、还更优选200-350μmol/m2.s、最优选250-300μmol/m2.s，pH值7-9、优选7.5-8.5，更优选8，温度15-35℃、优选20-30℃、更优选25℃。
6.如权利要求1至4中任一项所述的栅藻ENN33在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、亚油酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生酸、山嵛酸和/或二十碳五烯酸。
7.如权利要求1至4中任一项所述的栅藻ENN33在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
8.如权利要求1至4中任一项所述的栅藻ENN33在环境保护中的应用，优选地所述环境保护为污水处理或CO2减排，所述污水处理包括污水的脱氮、除磷、有机物降解和/或重金属离子吸附。
9.如权利要求1至4中任一项所述的栅藻ENN33在制备包含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、亚油酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、二十碳五烯酸、虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的药物中的应用。
10.如权利要求1至4中任一项所述的栅藻ENN33在包含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、亚油酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、二十碳五烯酸、虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的食品、保健品、饲料、水产品饵料、化妆品和/或色素生产中的用途。
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