CN102901824A - 用于检测尿液纤维连接蛋白的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测尿液纤维连接蛋白的方法及其试剂盒，其方法包括标本采集，实验准备，加样，温育，洗板，加酶，温育，洗涤，显色和终止的步骤。本发明建立了一种简便、快速、无创、低价、高灵敏度、特异性强的膀胱癌诊断技术，可以测定不同病理阶段膀胱癌患者尿液纤维连接蛋白浓度，并通过尿液纤维连接蛋白浓度不同，可以鉴别膀胱癌浸润程度的指标。

Description

用于检测尿液纤维连接蛋白的方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于一种医疗检测方法领域，更特别地，涉及一种用于检测尿液纤维连接蛋白的方法及其制备的试剂盒。

背景技术

膀胱移行细胞癌(Bladder transitional cell carcinoma，BTCC.以下简称“膀胱癌”。)是泌尿***最常见的恶性肿瘤，也是全身常见恶性肿瘤之一。但近年来，我国城市膀胱癌发病率有逐年增高趋势。目前膀胱癌诊断和术后随访的主要手段为膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查。膀胱镜检查是一种有创性的检查，受检者往往有畏惧心理；且膀胱镜检查有一定的盲区，其对扁平的低级别膀胱癌和原位癌诊断比较困难。即使是最先进的软镜，也有高达8.7％的假阴性率和7.5％的感染率。同时膀胱癌术后复发率高达50％-80％，每次复发后频繁的膀胱镜检查对病人而言是一种无休止的折磨，更造成了沉重的精神负担和经济压力。

自上世纪九十年代开始，以检测尿液中生物学标记物作为膀胱癌诊断和监测复发的研究蔚然成风。迄今已研究的生物学标记物包括：***抗原(BTA)、尿血红蛋白、核基质蛋白22(NMP22)、尿液纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)、荧光原位杂交(FISH)、ImmunoCyt、纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物等等。

一方面，目前其他常用的尿膀胱癌生物学标记物敏感度虽较脱落细胞学增高，但仍达不到诊断要求；而且特异度普遍明显偏低，目前尚不能取代尿脱落细胞学检查。只有FN达到了较高的灵敏度和特异度。迄今为止，美国食品药物监督局(FDA)批准了BTA stat、BTA trak、UroVysion？？、ImmunoCyt等非试纸法的尿生物学标记物检测方法作为膀胱癌诊断和监测的辅助手段。2008年上市的“NMP22BladderChek Test”试纸是英维利斯医疗诊断集团研制成功的产品，为国外专利保护产品，价格昂贵，不适合我国人群的广泛应用。

另一方面，作为一种理想的膀胱癌监测诊断方法，不仅要求能够做出定性诊断，最好还能够同时判断出发展为浸润性膀胱癌的风险。如前所述，NMIBC术后的复发率高达50-80％，但最终真正进展为浸润性和转移性癌的比例不超过15％。有研究表明，对于直径小于10mm的分化良好的Ta期膀胱癌，在密切观察的前提下，平均延迟13.5月手术对其生存期和肿瘤进展没有影响。另有研究表明，肌层浸润性膀胱癌延误3个月行膀胱切除术将明显降低生存率。由此我们认为，膀胱癌的随访，不仅在于早期发现复发，更重要的是早期发现肌层浸润的膀胱癌。理想的膀胱癌尿液生物学标记物应该既能满足定性诊断的需要，又能够反映肿瘤进展的风险程度，以利于指导临床决策。

FN是一种大分子非胶原糖蛋白，分子量约为440KD，在泌尿***它只存在于尿路上皮的基底膜及粘膜下层。膀胱癌中基底膜FN均有不同程度的丧失，肿瘤侵犯基底膜以及诱导产生的蛋白酶增加了FN从基底膜中的释放而使尿中FN含量上升。自1992年(中日医学大会)沈周俊教授首先报道用尿FN诊断膀胱癌以来，许多研究结果都支持尿液FN可作为BTCC的诊断指标，FN成为了一种广为研究的膀胱癌肿瘤标志物；2005年的研究发现，尿FN与***的分期、分级、肿瘤大小、数目、生长方式等密切相关，表明尿FN对预测膀胱癌复发和预后判断有很好的应用价值。

虽然尿FN作为理想的膀胱癌诊断和监测生物学标记物得到了一致的肯定，但各家的检测方法和结果尚未统一。目前，FN的临床检测尚存在以下问题：1、使用方法尚未标准化。2、步骤比较繁琐，结果易受操作者技术水平等的影响，不确定性因素较多。3、取血、采样既需要专业人员，增加了检查费用；患者又痛苦，自律检查的的意愿不高。

发明内容

针对上述缺陷，本发明目的在于克服或改善现有的问题，提供用于检测尿液纤维连接蛋白的方法。

本发明另一目的在于提供了一种用于检测尿液纤维连接蛋白的方法的试剂盒。

为实现上述目的，本发明技术方案为：

一种用于检测尿液纤维连接蛋白的方法，其操作步骤如下：

1)标本采集：

取膀胱癌患者尿液，尿液2,000-3,000r/min离心15-30分钟后，收集上清液，所得待测尿液标本；

2)实验准备：

稀释液于37℃水浴15-30分钟，然后用蒸馏水做10倍稀释；

洗涤液于37℃水浴15-30分钟，然后用蒸馏水做20倍稀释；

将每支标准品(512ng/ml)用1.0ml稀释液准确复溶。取250ul，用稀释液作六次倍比稀释，并稀释成一组标准品；

3)加样：分别设空白对照孔、标准孔、待测样品孔，标准孔和待测样品孔分别加不同浓度标准品或待测尿液标本100ul，空白对照孔中加稀释液100ul；

4)温育：在37℃温育90-120分钟；

5)洗板：弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置，甩干，反复3-5次后拍干；

6)加酶：所述标准孔和待测样品孔加100ul酶联物，轻轻混匀；

7)温育：在37℃温育60-90分钟；

8)洗板：弃去反应孔内液体，用所述洗涤液注满各孔，静置，甩干，反复3-5次后拍干；

9)显色：临用前每片底物片用5ml底物缓冲液溶解，每孔加底物液100ul，37℃温育15-20分钟；

10)终止：每孔加入50ul终止液，轻轻混匀，在酶标仪492nm处，以空白对照孔调零，测定各孔OD值。

本发明的另一方面，其中所述待测尿液标本的浓度范围是1∶1000-1∶6000。优先地，其中所述待测尿液标本的浓度范围是1∶2000-1∶4000。

本发明的另一方面，所述方法测定尿液纤维连接蛋白的灵敏度为77％-100％。

本发明另一实施方式为：一种检测尿液纤维连接蛋白的试剂盒。

本发明的稀释液和洗涤液为酶联免疫吸附竞争法(ELISA)常用试剂。

本发明尿FN诊断膀胱癌的特异度为87％，阳性预测率为87％。

FN是一种大分子非胶原糖蛋白，分子量约为440KD，在泌尿***它只存在于尿路上皮的基底膜及粘膜下层。膀胱癌中基底膜FN均有不同程度的丧失，肿瘤侵犯基底膜以及诱导产生的蛋白酶增加了FN从基底膜中的释放而使尿中FN含量上升。自1992年(中日医学大会)沈周俊教授首先报道用尿FN诊断膀胱癌以来，许多研究结果都支持尿液FN可作为BTCC的诊断指标，FN成为了一种广为研究的膀胱癌肿瘤标志物。

尿FN不仅可作为膀胱癌的诊断和监测的生物学标记物，与***的分期、分级、肿瘤大小、数目、生长方式等密切相关，还可以作为评价治疗效果的客观指标。本发明旨在通过利用Elisa法确定尿FN最佳检测方法(双抗体夹心法)、最佳酶标记浓度和最佳实验条件。

膀胱移行细胞癌是我国最常见恶性肿瘤之一，而膀胱癌快速检测方法尤其是尿用的检测方法目前却正处在市场空白期，目前尚没有类似的试纸、试剂类诊断方法应用于临床。

本发明建立了一种简便、快速、无创、低价、高灵敏度、特异性强的膀胱癌诊断技术，可以测定不同病理阶段膀胱癌患者尿液FN浓度，并通过FN浓度不同，可以鉴别膀胱癌浸润程度的指标。本发明可以弥补现有诊断方法的不足，可以大大减轻病人的痛苦，具有很高的临床应用价值，同时还能减轻病人的经济负担，具有良好的经济效益。本发明若能成功开发将非常有利于膀胱癌的筛查、诊断以及术后病人的复查，并能为其他泌尿上皮性肿瘤如肾盂、输尿管肿瘤以及***肿瘤的快速、简便诊断方法提供有益的借鉴作用。

上述技术方案的有益之处在于：

(1)本发明可以同时、分别地分析多个样本，

(2)本发明检测尿液中的FN具有简便、无创、价廉，且尿中FN测定比血中的FN特异性更强、敏感性更高，

(3)应用Elisa方法作为一种同时检测不同抗原的方法具有敏感度和特异度高的特点，

(4)结合B超的应用能有效地减少膀胱镜检的次数，取得良好的社会和经济效益。

(5)可以鉴别不同病期阶段的膀胱移行上皮癌。

附图说明

图1为用于检测尿液纤维连接蛋白的方法的操作步骤。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明也可通过其他不同的具体实例加以实施或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本发明的目的下进行各种修饰与变更。

实施例1

如图1所示：

一种用于检测尿液纤维连接蛋白的方法，其操作步骤如下：

检测原理：

采用酶联免疫吸附竞争法，测定人尿液中纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)的含量。酶标板中预先包被的FN和尿液中的FN与FN抗体竞争性结合，加入酶标记抗体后形成抗原抗体复合物，在492nm波长处比色，待测定尿液中FN含量与OD值(492nm)成正比。

标本采集：

留取第一次晨尿，留取尿液时嘱病人前一天晚上10时后禁水，尿标本3,000r/min离心10min后，收集上清液，置于干净容器中，2-8℃，可保存48小时，-20℃可保存1个月。

实验准备：

1.浓稀释液用前置于37℃水浴15min(因母液盐浓度高，冰箱保存易结晶析出)，然后用蒸馏水做10倍稀释(1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。

2.浓洗涤液用前置于37℃水浴15min(因母液盐浓度高，冰箱保存易结晶析出)，然后用蒸馏水做20倍稀释(1ml浓稀释液+19ml蒸馏水)。

3.将每支标准品(512ng/ml)用1.0ml稀释液准确复溶。取250ul，用稀释液作六次倍比稀释，并稀释成一组标准品，如：512，256，128，64，32，16，8ng/ml。

操作步骤：

试剂盒应平衡至室温(18-25℃)再实验。

取出所需反应板。

1.每孔加不同浓度标准品或待测尿液标本100ul，空白对照孔中加稀释液100ul，37℃温育90分钟。

2.洗板：弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒，甩干，反复3次后拍干。

3.每孔加100ul酶联物，轻轻混匀30秒，37℃温育60分钟。

4.洗板：弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒，甩干，反复3次后拍干。

5.显色：临用前每片底物片用5ml底物缓冲液溶解，每孔加底物液100ul，37℃温育15-20分钟。

6.终止比色：每孔加入50ul终止液(stop solution)，轻轻混匀30秒，15分钟内在酶标仪492nm处，以空白对照孔调零，测定各孔OD值。

结果判读：

以OD值为横坐标，以标准品为纵坐标，在对数坐标纸上做标准曲线，根据样品的OD值可从标准曲线上查出其浓度。注：注意坐标系的选择(半对数坐标)！如果样品稀释则结果要乘以稀释倍数。

实施例2

测定不同病期膀胱移行上皮癌患者、良性泌尿系疾病患者(不伴***为A组、伴***为B组)、肾细胞癌、错构瘤和肾上腺皮质肿瘤(c组)患者、非泌尿系恶性肿瘤(D组)患者及正常对照组尿渡、血清纤维连接蛋白FN浓度。

除5例BTCC患者术前和术后10-16天均采集标本外，其他患者术前采集标本。患者和正常对照者留取晨尿或膀胱内保留2小对以上的尿液，2,000r/min离心10min，吸取上清液置-20℃冰箱中。留取尿波的同时，抽取空腹周围静脉血，3小时内分离血清，置-20℃冰箱中备用。

实验方法

按照实施例1的实验方法，提纯羊抗人FN特异性抗体；改良过碘酸钠法制备酶标抗体，ELISA法测定尿液FN浓度(g/L)，双向琼脂扩散法测定血清FN浓度(mg/L)。

实验结果

一、尿液FN的测定结果：

1.BTCC患者初发和复发尿FN浓度无显著性差异(P＞0.05)。

2.BTCC患者男、女性别间尿FN浓度无显著性差异(P＞0.05)。

3.BTCC患者各年龄组间屎FN浓度无显著性差异(P＞0.05)。

4.第I、II和III组BTCC患者尿FN浓度分别为57.54±5.25ug/L、284.45±8.13ug/L和1786.40±7.41ug/L。第III组浓度显著高于第I组(P＜0.01)，且显著高于第II组(P＜0.05)，第II组显著高于第I组(P＜0.05)。

5.A、B、C、D各组和正常对照组尿FN浓度分别为：56.23±2.75、75.16±2.82、40.83±8.67、55.21±5.13和70.30±1.99ug/L它们之间均无显著性差异(P＞0.05)。

6.第III组BTCC患者尿FN浓度显著高于A、B、C、D和正常对照组(P＜0.01)，第II组BTCC患者尿FN显著高于A、B、C、D和正常对照组(P＜0.05)，第I组BTCC病人尿FN A、B、C，D组和正常对照组无显著性差异(P＞0.05)

7.手术前和手术后10-16天有对照资料的5例BTCC患者尿FN浓度分别为825.68±344.24和78.05±15.80ug/L，呈下降趋势。

二、血清FN的测定结果

1.BTCC患者初发与复发血清FN无显著性差异(P＞0.05)

2.男、女性别血清FN无显著性差异(P＞0.05)

3.各年龄组阀血清FN无显著性差异(P＞0.05)。

4.BTCC三组患者间血清FN浓度无显著性差异(P＞0.05)

5.BTCC患者血清Fn与A、B、C，D备组血清FN均无显著性差异(P＞0.05)。

6.BTCC患者血清FN为I150.63土2.28mg/L，正常对照组血清FN为244.00土3.28mg/L，BTCC患者血清FN显著低于正常对照组(P＜0.05)。

三、BTCC患者尿FN与血清FN的直线相关

回归和单相关分析表明，其相关性很小，相关系数r＝0.0377，P＞0.05。

实施例3

1.材料和方法

一、临床资料

1)膀胱癌组：50例。男34例，女16例。年龄26-82岁，平均62岁。病理类型均为膀胱移行细胞癌。根据国际联合抗癌协会(UICC)分期：T₁29例，T₂17例，T₃4例。病理分级：G₁18例，G₂24例，G₃8例。50例膀胱癌患者行膀胱部分切除术42例，激光治疗5例，全膀胱切除术3例，均全部切除肿瘤。每一患者术前及术后1个月均留取尿液标本。

2)非膀胱癌组：其它泌尿生殖系疾病患者共30例。男18例，女12例。年龄34-76岁，平均60岁。其中(1)良性泌尿生殖系疾病组20例，男12例，女8例年龄34-76岁，平均65岁。其中良性***增生症9例，肾结石4例，肾积水3例，肾囊肿2例，***1例，肾脏脓肿1例。(2)其他泌尿生殖系肿瘤10例，男6例，女4例。年龄43-64岁，平均55岁。其中肾癌6例，***癌1例，***癌1例，肾盂癌2例

3)正常对照组：共20例。男12倒，女8例。年龄27-80岁，平均60岁。

二、方法

按照实施例1的实验方法，提纯羊抗人FN特异性抗体；尿液标本取自三组人清晨第一次全程尿液，-80℃低温保存备用。

用ELISA法测定尿Fn，单位为ug/L，Fn标准品为上海生物制品所产品。兔抗人Fn多克隆抗体，抗Fn-HRP为Dakopatts公司产品，同时测尿肌酐，单位为umol/L。以Fn与尿肌酐之比作为尿Fn的含量，比活性单位为ug/umol Cr，结果经t检验处理。

以Fn标准浓度为横坐标，以测得的吸光度为纵坐标，绘制出Fn标准曲线，以被测得的经稀释的尿液标本吸光度查出被测标本浓度乘以稀释倍数，再除以尿肌酐即为尿Fn含量。尿液成分因尿液的浓缩与稀释而有很大的变化，因24小时尿肌酐排出量基本恒定，故测定一次尿标本含量与尿肌酐之比作为尿Fn测定结果，方法较为可靠。

2.实验结果

一、三组尿液Fn含量比较

膀胱癌患者尿液Fn含量最高为2.10ug/umol Cr，最低为0.09ug/umol Cr，平均0.68±0.49ug/umol Cr；正常对照组最高为0.15ug/umol Cr，最低为0.07ug/umol Cr，平均0.10±0.04ug/umol Cr：两组间有显著性差异(P＜0.01)，表明尿Fn含量在膀胱癌患者中明显高于正常人。30例非膀胱癌组患者尿液Fn含量平均为：0.20±0.10ug/umol Cr。其中20例良性泌尿生殖系疾病组中尿Fn最高为0.34ug/umol Cr，最低0.07ug/umol Cr，平均0.19±0.06ug/umol Cr，与膀胱癌组之间差异有显著性(P＜0.01)，表明尿Fn含量在膀胱癌患者中明显高于良性泌尿生殖系疾病患者。10例其他泌尿生殖系肿瘤中尿Fn最高0.53ug/umol Cr，最低0.08ug/umol Cr，平均0.21±0.14ug/umol Cr，与膀胱癌组之间差异有显著性(P＜0.01)。其中2例肾盂癌尿Fn分别为0.53ug/umol Cr，0.31ug/umol Cr。

二、各组Fn阳性率的比较50例膀胱癌患者尿Fn阳性者40例(80％)，50例非膀胱癌患者及正常人的尿Fn阴性者42例(84％)，尿Fn诊断膀胱癌的敏感性为80％，特异性为84％假阴性率为20％，假阳性率为16％。

三、膀胱癌尿液Fn与肿瘤浸润程度关系

21例浸润型膀胱癌患者尿Fn平均0.87±0.50ug/umol Cr，29例浅表型膀胱癌患者尿Fn平均0.55±0.45ug/umol Cr。表明尿Fn含量在浸润性膀胱癌的患者中显著高于浅表型膀胱癌(P＜0.01)，Fn与肿瘤分期有关。

四、膀胱癌尿液Fn与肿瘤的病理分级关系

本组50例膀胱癌按病理分级其平均尿Fn含量分别为：G₁ 18例，Fn为0.40±0.20ug/umolCr；G₂ 24例，Fn为0.78±0.50ug/umol Cr；G₃ 8例，Fn为1.02±0.64ug/umol Cr，P＜0.01。

五、膀胱癌患者手术前后尿Fn含量比较

比较50例膀胱癌患者手术前后尿液Fn含量，术前为0.68±0.50ug/umol Cr，术后为0.21±0.11ug/umol Cr，术后较术前明显降低(P＜0.01)。

至此已结合实施例对本发明进行了描述。熟悉本领域的人员应当理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以容易地对所述实施例作出各种其它修改。因此，附属权利要求的范围并不限于上述说明，而是要广义地解释权利要求。

Claims (5)

1.一种用于检测尿液纤维连接蛋白的方法，其特征在于：其操作步骤如下：

1)标本采集：

取膀胱癌患者尿液，尿液2,000-3,000r/min离心15-30分钟后，收集上清液，所得待测尿液标本；

2)实验准备：

稀释液于37℃水浴15-30分钟，然后用蒸馏水做10倍稀释；

洗涤液于37℃水浴15-30分钟，然后用蒸馏水做20倍稀释；

将每支标准品512ng/ml用1.0ml稀释液准确复溶。取250ul，用稀释液作六次倍比稀释，并

稀释成一组标准品；

3)加样：分别设空白对照孔、标准孔、待测样品孔，标准孔和待测样品孔分别加不同浓度标准品或待测尿液标本100ul，空白对照孔中加稀释液100ul；

4)温育：在37℃温育90-120分钟；

5)洗板：弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置，甩干，反复3-5次后拍干；

6)加酶：所述标准孔和待测样品孔加100ul酶联物，轻轻混匀；

7)温育：在37℃温育60-90分钟；

8)洗板：弃去反应孔内液体，用所述洗涤液注满各孔，静置，甩干，反复3-5次后拍干；

9)显色：临用前每片底物片用5ml底物缓冲液溶解，每孔加底物液100ul，37℃温育15-20分钟；

10)终止：每孔加入50ul终止液，轻轻混匀，在酶标仪492nm处，以空白对照孔调零，测定各孔OD值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述待测尿液标本的浓度范围是1∶1000-1∶6000。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：其中所述待测尿液标本的浓度范围是1∶2000-1∶4000。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法测定尿液纤维连接蛋白的灵敏度为77％-100％。

5.一种根据权利要求1-4任一所述的方法检测尿液纤维连接蛋白的试剂盒。

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