CN102899393A - 可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片及其制备法和使用法 - Google Patents
可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片及其制备法和使用法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102899393A CN102899393A CN2012101677299A CN201210167729A CN102899393A CN 102899393 A CN102899393 A CN 102899393A CN 2012101677299 A CN2012101677299 A CN 2012101677299A CN 201210167729 A CN201210167729 A CN 201210167729A CN 102899393 A CN102899393 A CN 102899393A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- chip
- smoking
- wild
- hybridization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片，包括阴性探针、GAPDH阳性探针、9个SNP位点中的至少一个SNP位点的野生型探针和突变型探针。本发明还同时公开了该芯片的制备方法，包括如下步骤：1）在芯片上设置至少一个的亚矩阵，将每种探针设置成相应的浓度为65~70mM的探针溶液，与点样缓冲液等体积混合后，在每个亚矩阵内进行点样；2）所得芯片于50%的相对湿度下、室温下放置10~14小时；3）所得芯片于42℃预热的预杂交液中保温预杂交；4）所得芯片依次用不含核酸酶的18.2兆欧姆的水、异丙醇进行清洗，然后干燥，得可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片。本发明还公开了该芯片的使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术在医学卫生领域中的应用，特别涉及一种可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片。
背景技术
美国、英国、加拿大等国100万以上人群的大规模调查发现，吸烟者肺癌的发病率是不吸烟者的10.8倍。美国癌症协会调查证实，吸烟者患肺癌是不吸烟者的8倍～12倍。吸烟量越大，得肺癌的危险性越高。每天吸1支～9支者，他们的危险性是不吸烟者的3倍～15倍；每天吸40支以上者则是不吸烟者的19倍～30倍。从肺癌的年死亡率来看，吸烟者比不吸烟者高18.4倍。可见，吸烟是引起肺癌发生的最重要因素。
既然吸烟与肺癌有关，为什么有些人抽了一辈子烟，活了80多岁，仍然没有得肺癌呢？目前认为，主要与以下因素有关：
1、遗传个体差异：
吸烟引起肺癌的危险性还存在着遗传性个体差异，其中包括代谢酶的变异及获得的易感性。这类酶的遗传性变异将导致个体人群因吸烟而致肺癌的危险性上升50％，也就是说，如果吸烟者具有肺癌的遗传易感性，发生肺癌的机会将明显增高，开始吸烟年龄愈早，吸烟量愈大，吸烟年限愈长，则肺癌危险性愈高。反之，无遗传易感性的吸烟者肺癌危险性相对较小，吸烟者可能不会患肺癌。
2、家族高发性：
肺癌患者亲属中发生肺癌的危险度要比无肺癌家属者高出约2.4倍，肺癌患者的后代，年龄在40岁～59岁期间发生肺癌的危险性甚至可高达普通人的7.2倍。由于吸烟致癌并非短期形成，一般从开始吸烟到充分显示出吸烟的致肺癌效应，有10年～20年的潜伏期,因而易被人们所忽视。比较而言，吸烟年限长的人比吸烟量大的人更容易患癌。
3、吸烟与肺癌易感性基因：
易感性基因的特点是基因突变本身并不直接导致疾病的发生，而只造成机体患病的潜在危险性增加，一旦外界有害因素的介入，可导致疾病发生。另一种情况出现在药物治疗中，易感基因突变造成机体易感性改变，用药后可出现这些人治疗的疗效差或出现不良反应。
目前关于可能是吸烟者患肺癌风险影响因素的遗传多态性的研究主要集中在与外源性异物代谢I/II阶段、DNA修复和尼古丁成瘾效应相关的酶类研究。特别是DNA损伤修复基因、代谢酶基因多态性与肺癌易感性的关系已成为肿瘤分子流行病学的热点。已知大多数的化学致癌物在体内需要生物转化过程激活或解毒。在此过程中涉及的代谢酶分为两类: Ⅰ相代谢酶为代谢活化酶, 主要包括细胞色素P450 家族( cytochrome P450, CYP450)，可将前致癌物活化为终致癌物；Ⅱ相代谢酶为代谢解毒酶，主要包括谷胱甘肽- S- 转移酶( glutathione- S- transferase, GST) 和N- 乙酰化转移酶( arylamineN- acetyltransferase, NAT)，将化学致癌物的活性产物催化形成亲水物质排出。由于这些代谢酶控制和影响了致癌物的代谢，故其多态性在决定人群中个体的肿瘤易感性方面起着重要的作用。
对于与环境污染物及吸烟有密切关系的肺癌来说，个体易感性起着重要的作用。个体易感性的主要表现形式之一是基因多态性，包括外来化合物代谢酶基因多态性，DNA 损伤修复基因的单核苷酸多态性以及其他的一些基因多态性。检索到目前为止报道的所有与吸烟引起肺癌易感性相关基因，包括SNP、突变，基因缺失等。
因此人们期望制成SNP芯片，用于预测吸烟人群患肺癌风险的高低，从而能实现一定程度上减少肺癌的发病率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片，
设置阴性探针为GGGTGTATGGGTCGTAGCGAACTGAG，设置GAPDH阳性探针为GTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTAC；
还设置以下9个SNP位点中的至少一个SNP位点的野生型探针和突变型探针：
CDKAL1(rs7756992)：
野生型探针：TATTTTAGTTTTAGATCTACAGTTA
突变型探针：TATTTTAGTTTTGGATCTACAGTTA；
CYP2E1(rs 2031920)：
野生型探针：ATATAAAAGTACAAAATTGCAA
突变型探针：ATATAAAAGTATAAAATTGCAA；
IL-18(rs 360721)：
野生型探针：GCTGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG
突变型探针：GCTGAAACTTCTGGGATTTATTGAATG；
IL-8(rs 4073)：
野生型探针：TGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG
突变型探针：TGAAACTTCTGGGATTTATTGAATG；
IL1B(rs 16944)：
野生型探针：GTTCTCTGCCTCAGGAGCTCTCT
突变型探针：GTTCTCTGCCTCGGGAGCTCTCT；
ITGA11(rs 2306022)：
野生型探针：GTCACATCGGTCATGTCCTCCAG
突变型探针：GTCACATCGGTCGTGTCCTCCAG；
NAT2(rs 1799930)：
野生型探针：CTTGAACCTCAAACAATTGAAG
突变型探针：CTTGAACCTCGAACAATTGAAG；
XPD(ERCC2) (rs 13181)：
野生型探针：CTCTATCCTCTGCAGCGTCTCCTCT
突变型探针：CTCTATCCTCTTCAGCGTCTCCTCT；
Gln632Gln(rs3547)：
野生型探针：ACATACTTCAGGCCTGCGGCACCACC
突变型探针：ACATACTTCAGGCTTGCGGCACCACC。
本发明还同时提供了上述可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的制备方法，包括如下步骤：
1）、在芯片上设置至少一个的亚矩阵，对每个亚矩阵进行如下设置：
将每种探针设置成相应的浓度为65~70mM的探针溶液；每种探针溶液均分别进行如下操作：与点样缓冲液等体积混合后，在每个亚矩阵内进行点样；
2）、将步骤1）所得的芯片于50%的相对湿度下、室温下放置10~14小时；
3）、将步骤2）所得的芯片于42℃预热的预杂交液中保温预杂交35~45分钟；
42℃预热的预杂交液的制备方法为：在100ml的20×SSC缓冲液中，加入质量浓度10%的SDS 3.5~4.5ml、质量浓度10% 的BSA 38~42ml，用不含核酸酶的18.2兆欧姆的水定容至420ml；42℃预热2分钟；
4）、将步骤2）所得的芯片依次用不含核酸酶的18.2兆欧姆的水、异丙醇进行清洗，然后干燥，得可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片。
作为本发明的可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的制备方法的改进：
步骤1）中的点样为：用高通量芯片点样仪进行点制，点间距200~300um，点直径80~120um。
本发明还同时提供了上述可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的使用方法，对每种待测样品DNA依次进行如下步骤：
1）、靶基因的多重PCR扩增：
①、获取待测样品DNA的提取液；
②、将待测样品DNA的提取液针对每个SNP位点进行PCR扩增，从而获得相对应的扩增产物：
PCR反应体系为：
l0×PCR反应缓冲液（含15mM Mg离子，例如为MgCl2）2.5μl，含胺酰dUTP的dNTP (总浓度为10mM，含2mM胺酰标记的dUTP) 2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/ml) 0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl（正向引物和反向引物各0.5μl），待测样品的DNA提取液1μl，不含核酸酶的18.2兆欧姆的水补足到25μl；
上述含胺酰dUTP的dNTP (总浓度为10mM，含2mM胺酰标记的dUTP)的制备方法为：将dATP，dTTP, dGTP, dCTP, aa dUTP和不含核酸酶的18.2兆欧姆的水混合，得溶液；dATP，dTTP, dGTP, dCTP, aa dUTP在溶液中的浓度各分别为2mM；所述aa dUTP为含胺酰标记的dUTP；
PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环；得扩增产物；
引物具体如下：
CDKAL1(rs7756992)：
正向引物：CCTCAAGCAACCCTCCTCC
反向引物：GCAAATAAATTCAACTGGCATC；
CYP2E1(rs 2031920)：
正向引物：GACTTGCTTATGTGGCTAA
反向引物：TCATACAGACCCTCTTCCA；
IL-18(rs 360721)：
正向引物：GAAGCCAGTCCTTCCTAAA
反向引物：TCATTGCCACAAAGTTGAT；
IL-8(rs 4073)：
正向引物：GATTGGCTGGCTTATCTTC
反向引物：GTTTGTGCCTTATGGAGTG；
IL1B(rs 16944)：
正向引物：ATCGTTGTGCAGTTGATGT
反向引物：ATCTGGCATTGATCTGGTT；
ITGA11(rs 2306022)：
正向引物：CCCTGCGTGATTGAATCTGC
反向引物：TTTACTGCCCTCCCATTTGTC；
NAT2(rs 1799930)：
正向引物：TCGATGCTGGGTCTGGAAG
反向引物：CAGGTTTGGGCACGAGATT；
XPD(ERCC2) (rs 13181)：
正向引物：GATTAAAGGCTGTGGACATGA
反向引物：TCCGACTACCTAGCTGGCTC；
Gln632Gln(rs3547)：
正向引物：GAGGGTCAGATTCCCAGTT
反向引物：TGAGGAGGTGAGTACCAAAG；
③、将已知是健康人的DNA提取液针对GAPDH进行PCR扩增，从而获得相对应的扩增产物：
PCR反应体系为：
l0×PCR反应缓冲液（含15mM Mg离子）2.5μl，含胺酰dUTP的dNTP(总浓度为10mM，含2mM胺酰标记的dUTP)2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/ml) 0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl（正向引物和反向引物各0.5μl），已知是健康人的DNA提取液1μl，不含核酸酶的18.2兆欧姆的水补足到25μl；
PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环；得扩增产物；
所述GAPDH的引物为：
正向引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
反向引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA；
2）、芯片杂交检测：
①、荧光染料标记扩增产物：
将粉末状染料1 mg用70~75μl DMSO溶解，得染料溶液；
将上述步骤1）所得的每种扩增产物（包括上述步骤1）的②中针对SNP位点进行PCR扩增所得的扩增产物以及步骤1）的③中针对GAPDH进行PCR扩增所得的扩增产物）各取10μl进行混合，得扩增产物混合液；然后按2μl染料溶液/每10μl扩增产物混合液的量将上述2者混匀，在黑暗室温环境下放置0.5~1.5小时；然后进行纯化、洗脱、浓缩至扩增产物混合液体积的1/10~1/15；得杂交探针；
②、样品与芯片杂交：
将上述步骤①所得的杂交探针进行如下处理：
先将盖片盖到芯片上，再将得到的杂交探针与2×F杂交液（250μl的20×SSC、250μl去离子甲酰胺;10μl 质量浓度10% SDS组成）等体积量混合后进行如下处理：于98℃变性2分钟，然后迅速置于冰上；5分钟后取出，离心，得处理后的杂交探针与杂交液的混合液；然后用移液枪吸取上述处理后的杂交探针与杂交液的混合液后，从盖片上的小孔加入至一个亚矩阵内；接着在58℃杂交2h；所述2×F杂交液按照以下体积比的原料配制而得：250μl的 20×SSC缓冲液、250μl去离子甲酰胺和10μl 质量浓度10% SDS；
最后分别用洗脱液Ⅰ(2×SSC，0.1％ SDS， 42℃预热)、洗脱液Ⅱ(0.5×SSC，0.01％SDS， 42℃预热)、洗脱液Ⅲ(0.06×SSC)各洗5min；再用玻片离心机（例如为800rpm）甩干；
洗脱液Ⅰ的制备方法为：每1L的2×SSC缓冲液的基础上加入1g的SDS（十二烷基硫酸钠），42℃预热2分钟；
洗脱液Ⅱ的制备方法为：每1L的0.5×SSC缓冲液的基础上加入0.1 g的SDS，42℃预热2分钟；
洗脱液Ⅲ为0.06×SSC缓冲液；
3）、杂交结果的检测与分析：
采用Agilent G2505 B 扫描仪扫描芯片，并用生物信息学软件对结果进行分析，（平均信号值－平均背景信号）／平均背景信号，对所述每个SNP位点所对应的野生型探针和突变型探针进行判断，大于5倍的视为阳性，以此为判断依据；
当某个基因位点仅有野生型探针为阳性时，表明待测样品对应的该基因位点为野生型；
当某个基因位点仅有突变型探针为阳性时，表明待测样品对应的该基因位点为突变型；
当某个基因位点的野生型探针和突变型探针均为阳性时，表明待测样品对应的该基因位点为杂合型。
作为本发明的可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的使用方法的改进：还包括以下步骤：
吸烟后患肺癌风险的预测：
当待测样品对应的任意一个基因位点为突变型或杂合型时，表明该待测样品的当事人吸烟后患肺癌风险高；9个SNP位点，出现突变型或杂合型的越多，风险则越高；
当待测样品对应的所有基因位点均为野生型，表明该待测样品的当事人吸烟后患肺癌风险较普通人群低。
备注说明：本发明中所用到的水均为不含核酸酶的18.2兆欧姆的水，包括配制各种溶液时所用到的水。
本发明将目前研究的所有与肺癌易感性相关的基因收集并进行分析，选取显著性的候选基因，同时结合芯片技术，将筛选出的易感基因制作成芯片，从整体水平研究遗传多态性与肺癌易感性的关系，然后通过不断的优化，最终开发出一种针对吸烟人群患肺癌风险的SNP芯片,用于预测吸烟人群患肺癌风险的高低，针对性的开展个性化预防，对一些高危吸烟人群进行劝阻，从而减少肺癌的发病率。
本发明具有如下优点：
本发明首次通过批量检测吸烟人群的SNP突变情况，从而能轻易得知待测样品针对9个SNP位点为突变型还是杂合型；从而实现预测该人群患肺癌的风险，这在国内为首创，目前国内外均无类似的研究成果或相应的产品，本发明的芯片可以进一步开发成供家庭用的检测试剂盒，为那些吸烟人群提供参考，从而降低中国肺癌发病率做出贡献。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是每一个亚矩阵的示意图：
实线框为阳性探针，点线间隔框为野生型探针，虚线框为突变型探针，其他为阴性探针；
备注说明：每个SNP位点的野生型探针和突变型探针均分别设3个复孔。
图2是杂交后，用扫描仪扫描后的图片，见右图，两个白框中，分别为纯合突变型，以及杂合型；选取杂合型的基因，进行验序验证。
图3是测序验证结果显示为双峰，是个杂合型，而对其他基因位点的验证结果，也符合芯片的结果。说明本方法的结果较为可靠。
具体实施方式
实施例1、
1、SNP基因位点的寻找与确定：
从NCBI的SNP数据库搜索突变位点，总共包括，CDKAL1（rs7756992），CYP2E1 (rs 2031920), Interleukin-18 (rs 360721)，Interleukin-8 (rs 4073),Interleukin 1B (rs 16944),ITGA11 (rs 2306022)，NAT 2 (rs 1799930)，XPD (ERCC2) (rs 13181)，Gln632Gln(rs3547)这九个不同的位点。该九个位点在国内外文献中已被认为是跟吸烟后与肺癌发生有关，并达到显著水平。
2、探针与引物的设计
所有位点通过多重PCR扩增后，通过芯片鉴定。所设计的引物和探针分别如下：
表1
3、芯片制备
共计20条探针（如表1所示）。每条探针重复点样三次。阴性探针三个点，点在每个亚矩阵的右上角，GAPDH阳性探针，分别点在每个亚矩阵的另外的三个角；每个SNP位点的野生型探针和突变型探针均分别设3个复孔。
每张芯片点12个亚矩阵，每个亚矩阵为9×9个点阵。浓度67mM的探针与点样缓冲液按照1：1体积（即各取2.5μl）混合后进行点样。用高通量芯片点样仪点制芯片（点间距250um，点直径100um）。保持50%的相对湿度过夜（12小时，为室温），然后将芯片再于42度预热的预杂交液（42℃预热的预杂交液的制备方法为：在100ml的20×SSC缓冲液中，加入质量浓度10%的SDS 4ml、质量浓度10% 的BSA 40ml，用不含核酸酶的18.2兆欧姆的水定容至420ml；42℃预热2分钟）中保温预杂交40分钟，再立即用水（不含核酸酶的18.2兆欧姆的水）洗2分钟，异丙醇清洗2min，再用玻片离心机800rpm甩干，得检测芯片（可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片），备用。
点样缓冲液为常规的市售产品，例如可选用上海百傲公司生产的（货号BST02010 ）的点样缓冲液。
4、靶基因的多重PCR扩增
一、EDTA抗凝取血，然后利用Qiagen的全血中基因组提取试剂盒（例如货号51104）提取待测样品中的基因组DNA（待测样品DNA的提取液），该方法为常规技术。
然后将每种待测样品DNA的提取液分别利用所有引物（如表1所示9个SNP位点所一一对应的9对引物）分别进行多重PCR扩增，从而获得9种扩增产物；具体步骤如下：
25μl PCR反应体系中，含有l0×PCR反应缓冲液（含15mM Mg离子，例如为MgCl2）2.5μl，含胺酰dUTP的dNTP(总浓度为10mM,含2mM胺酰标记的dUTP) 2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/μl) 0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl（正向引物和反向引物各0.5μl），待测样品的DNA提取液1μl，不含核酸酶的18.2兆欧姆的水补足到25μl。
PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环。得扩增产物。
上述含胺酰dUTP的dNTP(总浓度为10mM,含2mM胺酰标记的dUTP)的制备方法为：将dATP，dTTP, dGTP, dCTP, aa dUTP和不含核酸酶的18.2兆欧姆的水混合，得溶液；dATP，dTTP, dGTP, dCTP, aa dUTP在溶液中的浓度各分别为2mM； aa dUTP为含胺酰标记的dUTP。
二、EDTA抗凝取血，然后利用Qiagen的全血中基因组提取试剂盒（货号51104）提取已知是健康人的基因组DNA（已知是健康人的DNA提取液），该方法为常规技术。
说明：上述已知是健康人是指经现有的医学手段进行检查为无肺癌及肺部疾病的健康人。
将已知是健康人的DNA提取液针对GAPDH进行PCR扩增，从而获得相对应的扩增产物：
PCR反应体系为：
l0×PCR反应缓冲液（含15mM Mg离子，例如为MgCl2）2.5μl，含胺酰dUTP的dNTP(总浓度为10mM,含2mM胺酰标记的dUTP)2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/ml) 0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl（正向引物和反向引物各0.5μl），已知是健康人的DNA提取液1μl，不含核酸酶的18.2兆欧姆的水补足到25μl；
PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环；得扩增产物；
GAPDH：
正向引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
反向引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。
即，如表1所述。
设置GAPDH为阳性的目的是做质控。
5、芯片杂交检测
①、荧光染料标记扩增产物：
将粉末状染料每包（1mg）用72μl DMSO溶解，得染料溶液；然后分装，-20℃暗处存放。该粉末状染料的名称为Cy5染料，GE公司，货号为PA25001。
对每种待测样品分别进行如下工作：
将上述步骤所得的10种扩增产物（为9个SNP位点所分别对应的9种扩增产物和针对GAPDH进行扩增所得的扩增产物）的每种中各取10μl进行混合（即，总量为100ul），得扩增产物混合液。然后按2μl染料溶液/每10μl得扩增产物混合液的量比关系加入荧光染料混匀，在黑暗室温环境下放置1小时。并利用Qiagen的纯化试剂盒（货号28104）进行纯化、洗脱，并用真空浓缩仪浓缩至7μl；得杂交探针。
②、样品与芯片杂交：
将上述步骤①所得的每种待测样品的杂交探针分别进行如下处理：
先将盖片盖到芯片上，再将得到的杂交探针7μl与2×F杂交液（250μl 的20×SSC缓冲液;250μl去离子甲酰胺;10μl 质量浓度10% 的SDS组成）7μl进行等量混合后进行如下处理：在98℃变性2分钟，然后迅速置于冰上；5分钟后取出，1000rcf离心3秒钟，得处理后的杂交探针与杂交液的混合液，然后用移液枪吸取（全部吸取）。从盖片上的小孔加入上述处理后的杂交探针与杂交液的混合液（约14μl），液体会随着张力，扩散到探针阵列区域。
每个样品加到一个亚矩阵，在58℃杂交2h。
然后分别用洗脱液Ⅰ(2×SSC，0.1％ SDS，需42℃预热)、洗脱液Ⅱ(0.5×SSC，0.01％SDS，需42℃预热)、洗脱液Ⅲ(0.06×SSC)各洗5min。再用玻片离心机800rpm甩干。
上述洗脱液Ⅰ的制备方法为：每1L的2×SSC缓冲液的基础上加入1g的SDS（十二烷基硫酸钠），42℃预热2分钟。
上述洗脱液Ⅱ的制备方法为：每1L的0.5×SSC缓冲液的基础上加入0.1 g的SDS，42℃预热2分钟。
上述洗脱液3为0.06×SSC缓冲液。
6、杂交结果的检测与分析
采用Agilent G2505 B 扫描仪扫描芯片，并用genepix等生物信息学软件对结果进行分析，（平均信号值－平均背景信号）／平均背景信号，对每个SNP位点所对应的野生型探针和突变型探针进行判断，大于5倍的视为阳性，以此为判断依据。
备注说明：一张芯片可以检测12种不同的样品。并且可以对每种样品，都检测那9个SNP位点。
7、随机挑选芯片结果，用sanger法测序验证
统计学分析：以χ2检验分析两组人群基因型频率分布差异的显著性。以非条件性logistic回归法计算的比值比(OR)与95％可信限(CI)表示相对风险度。统计分析均通过SPSS 13.0软件进行计算。
杂交结果的检测与分析：
采用Agilent G2505 B 扫描仪扫描芯片，并用genepix等生物信息学软件对结果进行分析，（平均信号值－平均背景信号）／平均背景信号，大于5倍的视为阳性，其中：只有野生型探针阳性的表示检测样本该基因位点为野生型；只有突变型探针阳性的表示检测样本该基因位点为突变型，两种探针都阳性的表示检测样本该基因位点为杂合型。
在每个亚矩阵中，阳性探针的作用是定位及质控 ；当阳性探针出现无信号状态时，则表明实验失败，需要重新进行实验；阴性探针的作用是定位及质控；当阴性探针出现信号状态时，则表明实验失败，需要重新进行实验。
备注说明：目前本行业所认可的理论是：当待测样品对应的9个SNP位点中的任意一个为突变型或杂合型时，表明该待测样品的当事人吸烟后患肺癌风险高；9个SNP位点，出现突变型或杂合型的越多，风险则越高。当待测样品对应的9个SNP位点中的所有基因位点均为野生型，表明该待测样品的当事人吸烟后患肺癌风险较普通人群低。
上述理论依据例如为《CYP1A1、CYP2E1基因多态性与癌症易感性的研究进展》、《代谢酶CYP2D6、GSTP1、NAT2基因多态性与肺癌易感性关系的研究》。
实例一
研究对象:126例肺癌患者来自2006年1月至2010年6月在长兴县人民医院接受穿刺或手术的病人，均经术后组织病理学确诊。另选126例无肺癌及肺部疾病的门诊健康体检者对照，对照人群的性别、年龄(±5岁)与肺癌患者的频数配对。收集患者及对照者的血液标本，存于-70℃冰箱待测。通过问卷调查了解研究人群的吸烟史、人口特征、油烟接触史、职业接触史、肿瘤家族史等。吸烟的定义为：平均每日吸烟1支或以上，连续吸烟至少1年。
肺癌组患者男性82例，女性44例，年龄25岁至81岁，平均52.3岁。对照组男84例，女42岁，年龄22至80岁，平均51.9岁。两组患者性别构成、年龄组成均无统计学差异。
EDTA抗凝取血，然后利用Qiagen的血液DNA提取试剂盒（货号51104）提取全血的基因组DNA，得每种待测样品DNA的提取液；-20℃备用。
检测方法同实施例1。
杂交结果的检测与分析：
采用Agilent G2505 B 扫描仪扫描芯片，并用genepix等生物信息学软件对结果进行分析，（平均信号值－平均背景信号）／平均背景信号，大于5倍的视为阳性，其中：只有野生型探针阳性的表示检测样本该基因位点为野生型；只有突变型探针阳性的表示检测样本该基因位点为突变型，两种探针都阳性的表示检测样本该基因位点为杂合型。
结果如图2所示：
图2是杂交后，用扫描仪扫描后的图片，见右图，两个白框中，分别为纯合突变型，以及杂合型；选取杂合型的基因，进行验序验证。结果如图3所示：测序验证结果显示为双峰，是个杂合型，而对其他基因位点的验证结果，也符合芯片的结果。说明本方法的结果较为可靠。
上述具体检查结论如下：
表2、
备注说明：上述每个“杂合型”均进行过测序验证，结果均显示为双峰。
结果显示，肺癌患者中，9个SNP位点，发现突变型＋杂合型的概率要高于健康人群，通过统计分析，P值达到显著状态。
另：XPD基因多态性与肺癌发生风险的关系：表3中列出了肺癌患者中XPD 751Lys/Gln基因型的调整比值比，以携带XPD 751Lys/Lys的基因型为参考人群，调整年龄、经济收入、受教育程度等因素后，Lys/Lys缺失后(即Lys/Gln或Gln/Gln)的个体患肺癌的风险明显升高(调整的OR=2.83, 95%CI为1.22-6.54)，见表所述。
XPD基因型与吸烟交互作用对肺癌发生风险的影响:XPD 751Lys/Gln基因型与吸烟可能对肺癌的发生存在一定交互作用，分层分析显示，在表型为Lys/Gln或Gln/Gln且吸烟的个体发生肺癌的风险大大增加，校正的OR值为6.92(95%CI为1.72-20.36，P=0.003)，见表4。
表3. XPD基因多态性与肺癌的相对危险性分析
表4. XPD基因型与吸烟交互作用对肺癌发生风险的影响 肺癌/对照(例数)
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片，其特征是：
设置阴性探针为GGGTGTATGGGTCGTAGCGAACTGAG，设置GAPDH阳性探针为GTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTAC；
还设置以下9个SNP位点中的至少一个SNP位点的野生型探针和突变型探针：
CDKAL1：
野生型探针：TATTTTAGTTTTAGATCTACAGTTA
突变型探针：TATTTTAGTTTTGGATCTACAGTTA；
CYP2E1：
野生型探针：ATATAAAAGTACAAAATTGCAA
突变型探针：ATATAAAAGTATAAAATTGCAA；
IL-18：
野生型探针：GCTGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG
突变型探针：GCTGAAACTTCTGGGATTTATTGAATG；
IL-8：
野生型探针：TGAAACTTCTGGCATTTATTGAATG
突变型探针：TGAAACTTCTGGGATTTATTGAATG；
IL1B：
野生型探针：GTTCTCTGCCTCAGGAGCTCTCT
突变型探针：GTTCTCTGCCTCGGGAGCTCTCT；
ITGA11：
野生型探针：GTCACATCGGTCATGTCCTCCAG
突变型探针：GTCACATCGGTCGTGTCCTCCAG；
NAT2：
野生型探针：CTTGAACCTCAAACAATTGAAG
突变型探针：CTTGAACCTCGAACAATTGAAG；
XPD：
野生型探针：CTCTATCCTCTGCAGCGTCTCCTCT
突变型探针：CTCTATCCTCTTCAGCGTCTCCTCT；
Gln632Gln：
野生型探针：ACATACTTCAGGCCTGCGGCACCACC
突变型探针：ACATACTTCAGGCTTGCGGCACCACC。
2.如权利要求1所述的可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1）、在芯片上设置至少一个的亚矩阵，对每个亚矩阵进行如下设置：
将每种探针设置成相应的浓度为65~70mM的探针溶液；每种探针溶液均分别进行如下操作：与点样缓冲液等体积混合后，在每个亚矩阵内进行点样；
2）、将步骤1）所得的芯片于50%的相对湿度下、室温下放置10~14小时；
3）、将步骤2）所得的芯片于42℃预热的预杂交液中保温预杂交35~45分钟；
所述42℃预热的预杂交液的制备方法为：在100ml的20×SSC缓冲液中，加入质量浓度10%的SDS 3.5~4.5ml、质量浓度10% 的BSA 38~42ml，用不含核酸酶的18.2兆欧姆的水定容至420ml；42℃预热2分钟；
4）、将步骤2）所得的芯片依次用不含核酸酶的18.2兆欧姆的水、异丙醇进行清洗，然后干燥，得可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片。
3.根据权利要求2所述的可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的制备方法，其特征是：
所述步骤1）中的点样为：用高通量芯片点样仪进行点制，点间距200~300um，点直径80~120um。
4.如权利要求1所述的可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的使用方法，其特征是对每种待测样品DNA依次进行如下步骤：
1）、靶基因的多重PCR扩增：
①、获取待测样品DNA的提取液；
②、将待测样品DNA的提取液针对每个SNP位点进行PCR扩增，从而获得相对应的扩增产物：
PCR反应体系为：
l0×PCR反应缓冲液（含15mM Mg离子）2.5μl，含胺酰dUTP的dNTP(总浓度为10mM,含2mM胺酰标记的dUTP) 2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/ml) 0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl，待测样品的DNA提取液1μl，不含核酸酶的18.2兆欧姆的水补足到25μl；
PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环；得扩增产物；
CDKAL1：
正向引物：CCTCAAGCAACCCTCCTCC
反向引物：GCAAATAAATTCAACTGGCATC；
CYP2E1：
正向引物：GACTTGCTTATGTGGCTAA
反向引物：TCATACAGACCCTCTTCCA；
IL-18：
正向引物：GAAGCCAGTCCTTCCTAAA
反向引物：TCATTGCCACAAAGTTGAT；
IL-8：
正向引物：GATTGGCTGGCTTATCTTC
反向引物：GTTTGTGCCTTATGGAGTG；
IL1B：
正向引物：ATCGTTGTGCAGTTGATGT
反向引物：ATCTGGCATTGATCTGGTT；
ITGA11：
正向引物：CCCTGCGTGATTGAATCTGC
反向引物：TTTACTGCCCTCCCATTTGTC；
NAT2：
正向引物：TCGATGCTGGGTCTGGAAG
反向引物：CAGGTTTGGGCACGAGATT；
XPD(ERCC2)：
正向引物：GATTAAAGGCTGTGGACATGA
反向引物：TCCGACTACCTAGCTGGCTC；
Gln632Gln：
正向引物：GAGGGTCAGATTCCCAGTT
反向引物：TGAGGAGGTGAGTACCAAAG；
③、将已知是健康人的DNA提取液针对GAPDH进行PCR扩增，从而获得相对应的扩增产物：
PCR反应体系为：
l0×PCR反应缓冲液（含15mM Mg离子）2.5μl，含胺酰dUTP的dNTP(总浓度为10mM，含2mM胺酰标记的dUTP)2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/ml) 0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl（正向引物和反向引物各0.5μl），已知是健康人的DNA提取液1μl，不含核酸酶的18.2兆欧姆的水补足到25μl；
PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环；得扩增产物；
所述GAPDH：
正向引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
反向引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA；
2）、芯片杂交检测：
①、荧光染料标记扩增产物：
将粉末状染料1 mg用70~75μl DMSO溶解，得染料溶液；
将上述步骤1）所得的每种扩增产物（包括上述步骤1）的②中针对SNP位点进行PCR扩增所得的扩增产物以及步骤1）的③中针对GAPDH进行PCR扩增所得的扩增产物）各取10μl进行混合，得扩增产物混合液；然后按2μl染料溶液/每10μl扩增产物混合液的量将上述2者混匀，在黑暗室温环境下放置0.5~1.5小时；然后进行纯化、洗脱、浓缩至扩增产物混合液体积的1/10~1/15；得杂交探针；
②、样品与芯片杂交：
将上述步骤①所得的杂交探针进行如下处理：
先将盖片盖到芯片上，再将得到的杂交探针与2×F杂交液等体积量混合后进行如下处理：于98℃变性2分钟，然后迅速置于冰上；5分钟后取出，离心，得处理后的杂交探针与杂交液的混合液；然后用移液枪吸取上述处理后的杂交探针与杂交液的混合液后，从盖片上的小孔加入至一个亚矩阵内；接着在58℃杂交2h；
所述2×F杂交液按照以下体积比的原料配制而得：250μl的 20×SSC缓冲液、250μl去离子甲酰胺和10μl 质量浓度10% SDS；
最后分别用洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ、洗脱液Ⅲ各洗5 min；再用玻片离心机甩干；
洗脱液Ⅰ的制备方法为：每1L的2×SSC缓冲液的基础上加入1g的SDS，42℃预热2分钟；
洗脱液Ⅱ的制备方法为：每1L的0.5×SSC缓冲液的基础上加入0.1 g的SDS，42℃预热2分钟；
洗脱液Ⅲ为0.06×SSC缓冲液；
3）、杂交结果的检测与分析：
采用Agilent G2505 B 扫描仪扫描芯片，并用生物信息学软件对结果进行分析，（平均信号值－平均背景信号）／平均背景信号，对所述每个SNP位点所对应的野生型探针和突变型探针进行判断，大于5倍的视为阳性，以此为判断依据；
当某个基因位点仅有野生型探针为阳性时，表明待测样品对应的该基因位点为野生型；
当某个基因位点仅有突变型探针为阳性时，表明待测样品对应的该基因位点为突变型；
当某个基因位点的野生型探针和突变型探针均为阳性时，表明待测样品对应的该基因位点为杂合型。
5.根据权利要求4所述的可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片的使用方法，其特征是：还包括以下步骤：
吸烟后患肺癌风险的预测：
当待测样品对应的任意一个基因位点为突变型或杂合型时，表明该待测样品的当事人吸烟后患肺癌风险高；9个SNP位点，出现突变型或杂合型的越多，风险则越高；
当待测样品对应的所有基因位点均为野生型，表明该待测样品的当事人吸烟后患肺癌风险较普通人群低。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210167729.9A CN102899393B (zh) | 2012-05-23 | 2012-05-23 | 可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片及其制备法和使用法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210167729.9A CN102899393B (zh) | 2012-05-23 | 2012-05-23 | 可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片及其制备法和使用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102899393A true CN102899393A (zh) | 2013-01-30 |
| CN102899393B CN102899393B (zh) | 2014-04-02 |
Family
ID=47571880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210167729.9A Expired - Fee Related CN102899393B (zh) | 2012-05-23 | 2012-05-23 | 可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片及其制备法和使用法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102899393B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107034287A (zh) * | 2017-05-22 | 2017-08-11 | 中南大学 | 用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的Sanger测序法 |
| CN113234830A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-08-10 | 浙江医院 | 用于肺癌诊断的产品及用途 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI617668B (zh) * | 2017-03-15 | 2018-03-11 | Carcinoma risk assessment method |
-
2012
- 2012-05-23 CN CN201210167729.9A patent/CN102899393B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HC ERICHSEN等: "SNPs in cancer research and treatment", 《BRITISH JOURNAL OF CANCER》 * |
| JIAOYANG YIN等: "The DNA repair gene XRCC1 and genetic susceptibility of lung cancer in a northeastern Chinese population", 《LUNG CANCER》 * |
| 胡彬等: "利用单核苷酸多态性芯片全基因组检测人大细胞肺癌细胞株的杂合性缺失和拷贝数变异", 《中国肺癌杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107034287A (zh) * | 2017-05-22 | 2017-08-11 | 中南大学 | 用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的Sanger测序法 |
| CN113234830A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-08-10 | 浙江医院 | 用于肺癌诊断的产品及用途 |
| CN113234830B (zh) * | 2021-06-29 | 2022-03-08 | 浙江医院 | 用于肺癌诊断的产品及用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102899393B (zh) | 2014-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rafehi et al. | Bioinformatics-based identification of expanded repeats: a non-reference intronic pentamer expansion in RFC1 causes CANVAS | |
| Kinnally et al. | Epigenetic regulation of serotonin transporter expression and behavior in infant rhesus macaques | |
| Nisoli et al. | D2 dopamine receptor (DRD2) gene Taq1A polymorphism and the eatingrelated psychological traits in eating disorders (anorexia nervosa and bulimia) and obesity | |
| CN107254531B (zh) | 早发性结直肠癌辅助诊断的遗传生物标志物及其应用 | |
| CN103184268A (zh) | 检测乙醛脱氢酶2基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法 | |
| Fudalej et al. | Association between tryptophan hydroxylase 2 gene polymorphism and completed suicide | |
| CN114292909B (zh) | SNP rs241970作为靶标在开发用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒中的应用 | |
| CN111676283B (zh) | 与高原肺水肿发生相关的线粒体dna单核苷酸多态性的应用 | |
| CN111560428B (zh) | 检测线粒体DNA rs3937033单核苷酸多态性的物质的用途 | |
| CN102899393B (zh) | 可以预测吸烟后患肺癌风险的芯片及其制备法和使用法 | |
| Valenta et al. | Determinants of excess genetic risk of acute myocardial infarction-a matched case-control study | |
| CN106834501A (zh) | 与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用 | |
| Hamilton | Linkage and association studies of anxiety disorders. | |
| CN107557468B (zh) | 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的癌-睾丸基因遗传标志物及其应用 | |
| CN114381516B (zh) | 一种用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用 | |
| Haberstick et al. | Between-and within-family association test of the dopamine receptor D2 TaqIA polymorphism and alcohol abuse and dependence in a general population sample of adults | |
| JP5360853B2 (ja) | メタボリック症候群に関する遺伝子検出方法 | |
| JP2006254735A (ja) | 糖尿病疾患感受性遺伝子、及び糖尿病罹患の難易を検出する方法 | |
| CN114292910B (zh) | 基于SNP rs11620394开发的用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用 | |
| KR102562955B1 (ko) | 폐 기능 저하 위험 예측용 단일염기다형성 및 이의 용도 | |
| CN111041086B (zh) | Rpl13基因先天性心脏病易感snp位点及其应用 | |
| JP5489146B2 (ja) | 肥満の遺伝的リスク検出法 | |
| CN106399571A (zh) | 单核苷酸多态性rs181206在筛查麻风患者中的应用 | |
| JP2006254739A (ja) | 糖尿病疾患感受性遺伝子、及び糖尿病罹患の難易を検出する方法 | |
| CN106399572A (zh) | 单核苷酸多态性rs149308743在筛查麻风患者中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140402 Termination date: 20150523 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |