CN102890126B - 一种同时测定杜仲中多种活性成分含量的方法 - Google Patents

一种同时测定杜仲中多种活性成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时测定杜仲中多种活性成分含量的方法，采用高效液相色谱法分析，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相梯度洗脱程序为：流动相A为甲醇，流动相B为质量浓度为0.1％的磷酸水溶液；从0.01min-30.00min内流动相B的质量百分含量从30％按照一阶线性梯度增加到70％；在30.00min-30.01min时降低至30％，并在30.01min-40.00min内保持30％不变；流速：0.8ml.min-1；柱温：30℃；进样容积为5μl；检测波长选择程序为：0.01min-7.00min选择254nm，7.00min-12.50min选择277nm，12.50min-40.00min选择254nm；其中所述的多种活性成分为京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和芦丁。本发明分别开展了线性关系考察，稳定性试验，精密度试验，重现性试验和加样回收试验对方法进行验证，证明本分析方法准确，可靠。

Description

一种同时测定杜仲中多种活性成分含量的方法
技术领域
本发明涉及一种杜仲中多种活性成分的含量测定方法，特别是同时测定京尼平苷酸(GPA)、绿原酸(CA)、松脂醇二葡萄糖苷(PDG)和芦丁(Rutin)含量的测定方法。
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides OLiv)为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，是我国的传统经济作物，有第四纪冰川“活化石”之称，分布长江中游及南部各省，河南、陕西、甘肃等地均有栽培。杜仲具有补肝肾、强筋骨、安胎、降血压之功效。其主要的活性成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类等。主要的代表性成分分别是松脂醇二葡萄糖苷(木脂素类)、京尼平苷酸(环烯醚萜类)、绿原酸(苯丙素类)、芦丁(黄酮类)
以上活性成分质量控制，一般采用紫外-可见分光光度法(UV)，薄层扫描法(TLCS)及高效液相色谱法(HPLC)。
2010版中国药典规定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量测定方法为高效液相色谱法，用十八烷基基硅烷键合硅胶为固定相，以甲醇-水(25∶75)为流动相，检测波长277nm。规定杜仲叶中绿原酸的含量测定方法为为高效液相色谱法，用十八烷基基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈-0.4％磷酸水溶液(13∶87)为流动相，检测波长327nm。
现有技术中，检测杜仲中活性成分HPLC法为较常使用的分析手段。但目前文献及国家标准报道中只能同时控制1～3种成分。在实际操作中我们发现，松脂醇二葡萄糖苷在277nm处有最大吸收，而在254nm处吸收峰强度大幅减弱；京尼平苷酸则在254nm处有最大吸收，而在277nm处吸收峰强度大幅减弱，因此二者很难同时测定；而绿原酸与松脂醇二葡萄糖苷的极性相近，使用常规的等度洗脱方法色谱峰的分离效果不佳。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明采用了改变波长与梯度洗脱法相结合的方法，提出了一种同时测定杜仲及其产品中的松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸和芦丁含量的方法，且采用的色谱条件与目前已报道的相关文献中的方法完全不相同。本发明分别开展了线性关系考察，稳定性试验，精密度试验，重现性试验和加样回收试验对方法进行验证，证明本分析方法准确，可靠。
本发明的技术方案是：一种同时测定杜仲中多种活性成分含量的方法，采用高效液相色谱法分析，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相梯度洗脱程序(见表1)为：流动相A为甲醇，流动相B为质量浓度为0.1％的磷酸水溶液；从0.01min-30.00min内流动相B的体积百分含量从30％按照一阶线性梯度增加到70％；在30.00min-30.01min时降低至30％，并在30.01min-40.00min内保持30％不变；流速：0.8ml.min-1；柱温：30℃；进样容积为5μl；
检测波长选择程序(见表2)为：0.01min-7.00min选择254nm，7.00min-12.50min选择277nm，12.50min-40.00min选择254nm；
其中所述的多种活性成分为京尼平苷酸(保留时间4.7～5.0min，检测波长254nm)；绿原酸(保留时间8.0～9.0min，检测波长277nm)；松脂醇二葡萄糖苷(保留时间9.5～10.5min，检测波长277nm)；和芦丁(保留时间20.0～21.0min，检测波长254nm)。
流动相梯度洗脱程序见表1，检测波长程序见表2：
表1流动相程序
Figure BDA0000077908370000021
表2检测波长程序
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明所提供的测定方法可以同时测定杜仲中多种活性成分含量，可同时测定杜仲及其产品中代表性有效成分松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸和芦丁，提高了检测效率。
2、本发明做了大量方法学验证试验，分别开展了线性关系考察，稳定性试验，精密度试验，重现性试验和加样回收试验对方法进行验证，证明本测定方法准确，可靠。
附图说明：
图1混合对照样品在本发明的色谱条件下的HPLC图；
图2采用本发明方法分离杜仲叶中有效成分的HPLC效果图；
图3采用本发明方法分离杜仲皮中有效成分的HPLC效果图；
图4采用本发明方法分离杜仲叶提取物中有效成分的HPLC效果图；
其中，图中各峰标识：1号峰为京尼平苷酸；2号峰为绿原酸；3号峰为松脂醇二葡萄糖苷；4号峰为芦丁。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1方法验证学实验
1线性关系考察
精密称取松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸、芦丁对照品适量，用甲醇溶解配制成浓度为0.11mg·mL-1，0.11mg·mL-1，0.2mg·mL-1，0.1mg·mL-1，混合对照品溶液，并配制成不同系列浓度的溶液注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积(色谱图见图1)，以各对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表3，结果显示各对照品峰面积与浓度呈良好线性关系
表3线性关系考察结果
Figure BDA0000077908370000031
Figure BDA0000077908370000041
3.精密度实验
精密吸取上述同一对照品溶液5μL，重复进样6次，记录各成分峰面积，RSD均未超过3％，显示精密度良好。结果见表4：
表4精密度实验结果
  混标进样体积(ul)   GPA峰面积   CA峰面积   PDG峰面积   Rutin峰面积
  5   627264   882242   837693   1254052
  5   648236   890531   859230   1287373
  5   620999   872635   829345   1245458
  5   623683   872371   824917   1255959
  5   609339   867938   854052   1213190
  5   619346   871132   866713   1269238
  平均值   624811.1667   876141.5   845325   1254211.67
  标准偏差   12959.94268   8522.6583   17070.7375   24851.3469
  RSD(％)   2.074217518   0.9727491   2.01942891   1.98143165
4.准确性试验
方法准确性通过加标回收率实验进行验证，RSD％均小于5％，证明方法准确性高。结果见表5：
表5加标回收率实验结果
Figure BDA0000077908370000051
Figure BDA0000077908370000061
实施例2杜仲皮中活性成分的测试
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇，流动相B为质量浓度0.1％磷酸水溶液。流动相梯度洗脱程序和检测波长程序见表1及表2：流速：0.8ml.min-1；柱温：30℃；进样容积为5μl。
对照品溶液的配制：精密称取松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸、芦丁对照品适量，用甲醇溶解配制成浓度为0.11mg·mL-1，0.11mg·mL-1，0.2mg·mL-1，0.1mg·mL-1的混合对照品溶液进样，分离度不低于1.5，理论塔板不低于5000。
供试品溶液的制备：精密称取过40目筛后杜仲生皮5g，置圆底烧瓶中加甲醇50mL于微波提取器中提取30min，提取温度为60℃，抽滤，浓缩并定容至25mL，HPLC测定。结果测得为GPA、CA、PDG、和Rutin含量分别为0.112％、0.048％、0.076％和0.01％，色图谱见图3。
实施例3杜仲叶中活性成分的测试
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液。流动相梯度洗脱程序检测波长程序见表1及表2：流速：0.8ml.min-1；柱温：30℃；进样容积为5μl。柱温为30℃。
对照品溶液的配制：精密称取松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸、芦丁对照品适量，用甲醇溶解配制成浓度为0.11mg·mL-1，0.11mg·mL-1，0.2mg·mL-1，0.1mg·mL-1的混合对照品溶液进样，分离度不低于1.5，理论塔板不低于5000。
供试品溶液的制备：精密称取过40目筛后杜仲叶2g  ，置圆底烧瓶中加甲醇30mL于微波提取器中提取10min，提取温度为60℃，抽滤，浓缩并定容至50mL，HPLC测定。结果测得为GPA、CA、PDG和Rutin含量分别为0.315、1.415％、0.023％和0.223％，色图谱见图2。
实施例4杜仲叶提取物中活性成分的测试
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液。流动相梯度洗脱程序检测波长程序见表1及表2：流速：0.8ml.min-1；柱温：30℃；进样容积为5μl。柱温为30℃。
对照品溶液的配制：精密称取松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、绿原酸、芦丁对照品适量，用甲醇溶解配制成浓度为0.11mg·mL-1，0.11mg·mL-1，0.2mg·mL-1，0.1mg·mL-1的混合对照品溶液进样，分离度不低于1.5，理论塔板不低于5000。
供试品溶液的制备：精密称取杜仲叶提取物2g  ，置圆底烧瓶中加甲醇50mL回流60min，过滤并定容至50mL，再稀释50倍，HPLC测定。结果测得为GPA、CA、PDG和Rutin含量分别为7.85％、8.9％、0.16％和0.257％，色图谱见图4。

Claims (1)

1.一种同时测定杜仲中多种活性成分含量的方法，采用高效液相色谱法分析，其特征在于，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相梯度洗脱程序为：流动相A为甲醇，流动相B为质量浓度为0.1％的磷酸水溶液；从0.01min-30.00min内流动相B的体积百分含量从30％按照一阶线性梯度增加到70％；在30.00min-30.01min时降低至30％，并在30.01min-40.00min内保持30％不变；流速：0.8ml.min-1；柱温：30℃；进样容积为5μl；
检测波长选择程序为：0.01min-7.00min选择254nm，7.00min-12.50min选择277nm，12.50min-40.00min选择254nm；
其中所述的多种活性成分为京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和芦丁。
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杜仲中环烯醚萜类化合物的快速制备色谱制备及反相高效液相色谱/核磁共振鉴定;柳娜等;《精细化工》;20060331;第23卷(第3期);第261-263页 *
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