CN102876672A - 一种对安氏军团菌的its特异的核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸及其应用。具体地说是一种对安氏军团菌(Legionellaanisa)中16SrRNA-23SrRNA基因的间区（Internaltranscribedspacer,以下简称ITS）特异的核苷酸，特别是涉及对安氏军团菌中的ITS特异的寡核苷酸及其应用，并提供了一种用本发明的寡核苷酸对为引物的PCR检测试剂盒及检测方法，利用该PCR试剂盒对人体及环境中的安氏军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有一定的社会效益和较大的经济效益。

Description

一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及一种对安氏军团菌(Legionella anisa)中16S rRNA-23S rRNA基因的间区（Internal transcribed spacer, 以下简称ITS）特异的的核苷酸，特别是涉及对安氏军团菌中的ITS特异的寡核苷酸及其应用。

背景技术

经研究发现，安氏军团菌感染的主要途径是经呼吸道感染，含有军团菌的直径小于5 μm的颗粒最适进入肺泡引起感染。人感染军团菌主要是吸入通过气泡喷出和蒸发作用而产生的气溶胶，而气溶胶是军团菌传播、传染的重要载体。军团菌是引起军团病和庞蒂亚克热的主要病原体，前者为严重的呼吸道疾病，潜伏期2-10天，初发症状表现为全身不适、疲乏、头痛、肌肉酸痛、咳嗽、发热、胸痛、呼吸困难、咳血等，还会影响中枢神经***、消化***，重症病人会出现肝功能变化及肾功能衰竭，并出现精神紊乱等脏器损害。后者病情较轻，潜伏期1-2天，症状似普通感冒，伴随发热、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等症状，约1-2周可自愈。

目前，对安氏军团菌主要采用常规生物化学检测方法为主，该检测方法容易出现过多的假阳性、假阴性现象，通常需要将待测菌株经较长时间的培养才能进行检测，检测操作过程复杂，检测周期长，通常需要两到三天才能检测完一次待测样品，而且需要较高的技术和设备条件，检测成本高。因而需要发展灵敏度高、快速、简便的检测方法。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括转录间隔区（ITS）序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD）分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应（PCR）的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

核糖体内转录间隔区（ITS）,是介于16S rRNA和23S rRNA之间的区域，在几乎所有细菌的基因组中都以单拷贝或多拷贝的形式存在，相对较短（200bp－1000bp）。该区域进化速率较快，具有超变位点，它的变异速率相当于16S rRNA或者23S rRNA的十倍左右，在种内不同菌株间高度保守，而在细菌的种间存在着丰富的变化。因此具有很高的分辨率，更易区分开进化关系很近的菌种，大大增强了检测的特异性。可以为研究细菌的***发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。

聚合酶链式反应技术（Polymerase chain reaction,简称PCR技术）作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

发明内容

本发明的一个目的在于提供了一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸。

本发明的另一个目的在于提供该特异核苷酸的应用，将其设计引物，通过优化和设计，提供一种用于检测安氏军团菌的PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒检测安氏军团菌的存在。

本发明的再一个目的在于提供了对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸的分离方法。

本发明的再一个目的在于提供了含有对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸的PCR试剂盒的检测方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

一种对安氏军团菌的ITS有特异性的核苷酸，所述核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列；或具有所述核苷酸功能， 上述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中缺失、替换或***一个或多个碱基的序列。

所述的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的分离的核苷酸，全长 548和698个碱基。

本发明所述的一种对安氏军团菌的ITS有特异性的核苷酸为源于ITS的寡核苷酸，具有SEQ ID NO:4的序列，是位于SEQ ID NO:1中的267至286的碱基和位于SEQ ID NO:2中的267至286的碱基。

本发明所述的对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：

（1）基因组的提取；

（2）通过PCR扩增安氏军团菌中的ITS基因簇；

（3）构建ITS克隆；

（4）对ITS克隆测序;

（5）核苷酸序列的拼接及分析；

（6）特异引物的筛选。

上述核苷酸的应用，主要是在检测细菌时，将所述核苷酸作为引物用于PCR试剂盒、作为探针用于杂交反应与荧光检测，或者用于制造基因芯片或微阵列。

上述的PCR试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶；

其中的引物指的是：上游引物为SEQ ID NO:3，即5-GAGTAAAACGAAAAGCCGCA-3,

下游引物为SEQ ID NO:4，即5-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC -3；上游引物与下游引物的浓度比为1:1。

上游引物是根据细菌的16S rRNA基因保守区设计合成的，下游引物是根据安氏军团菌的含有tRNA间区的ITS类型设计合成的寡核苷酸引物。该引物可在试管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段（针对安氏军团菌为：479 bp靶DNA片段），因而可以将极其微量的（1 pg DNA）目的基因在较短的时间内（1.5 小时）扩增到电泳检测显而易见的水平。

本发明所述的PCR检测试剂盒包括如下试剂：25 mM MgCl₂ 50μl；10 mM dNTP 30μl；10×酶特异性反应缓冲液50μl；5 U/μl 耐热DNA聚合酶 5μl；引物各10μl；阳性对照品10μl，阴性对照品10μl；ddH₂O 1ml。

上述针对安氏军团菌的PCR检测试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。

本发明进一步公开了使用上述的PCR试剂盒检测安氏军团菌的PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品DNA模板；

（2）在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl₂、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH₂O，混匀；

（3）将薄壁PCR中混匀的混合物在PCR仪上扩增；

（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；

（5）分析并进行结果判断。

上述步骤（1）中的样品模板为安氏军团菌的纯培养物的粗提液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。

其中上述步骤（1）中的临床样品模板的提取方法为：

1）取培养物1.5ml ，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液；

2）取500μl的ddH₂O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，控干；

3）取100μl ddH₂O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；

4）再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；

5）取3μl中层上清做为PCR反应的模板。

上述步骤（3）中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；

变性温度和时间为94℃，30秒；

复性温度和时间为50℃，30秒；

延伸温度和时间为72℃，30秒；

变性、复性、延伸的循环次数为30个循环；

为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5秒。

上述步骤（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

1）取5～10μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；

2）将混合液上样于1％的琼脂糖凝胶上；

3）将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

4）观察并记录结果。

本发明通过配制一种可检测安氏军团菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测、试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测安氏军团菌所使用的试验设备简单，检测成本低。

使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。若含有安氏军团菌，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照品相同位置的条带；若不含有安氏军团菌，则与阴性对照品一样不具有这一条带。

本发明一次检测试验所使用的实际盒中的试剂量为引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4各1μl，10 mM dNTP 0.25μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，5 U/μl耐热DNA聚合酶0.2μl，25 mM MgCl₂ 2.5μl,余下的体积在除去3μl待测样品的量后用ddH₂O 补足至25μl。 

本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。

上述的阳性对照品为已确定是安氏军团菌的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是安氏军团菌的样品，如大肠杆菌。

本PCR试剂盒若用安氏军团菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致。敏感度和特异性无差别，这样可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了人力物力。

采用本发明所提供的PCR检测方法进行扩增的安氏军团菌应在479bp处有一条带。

根据引物设计的结果，扩增出的安氏军团菌片段长度应为479bp，因此若扩增结果在479bp左右具有和阳性对照相同位置的条带，则可判断此待测样品带有病菌，详见图1，其中，A为待测样品，检测到病菌目的带；＋阳性对照；－阴性对照；M为DNA marker。

本发明公开的一种新的对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸与现有技术相比，所具有的优点在于：

（1）实用性强：本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低，市场应用前景广。

（2）准确性高：本发明通过对安氏军团菌的ITS克隆、测序，将得到序列与GeneBank中的ITS比较，找到安氏军团菌ITS的特异区，设计出引物。继而利用引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将安氏军团菌和其近源菌种分开。

（3）灵敏度高：本发明提供的安氏军团菌检测试剂盒及其检测方法具有相当高的敏感性，检测精度高，可以检测到1pg/μl的DNA模板。

附图说明

图1为本发明试剂盒检测结果图；其中A为待测样品，检测到病原菌；P为阳性对照品；N为阴性对照品；M为DL2000 DNA marker；

图2 为本发明试剂盒检测军团菌属非安氏军团菌电泳结果图；其中：1，安氏军团菌G2826；2，戈尔曼军团菌G2827；3，麦氏军团菌G2823；4，长滩军团菌G2825；5，沃氏军团菌G2821；6，施氏军团菌G2830；7，博兹曼军团菌G2828；8.杜莫夫军团菌G3418；M，DL2000 DNA marker；

图3 为本发明检测军团菌属临床菌株电泳结果图；其中：1，安氏军团菌 G2826； 2，嗜肺军团菌G2759；3，嗜肺军团菌G2760；4，嗜肺军团菌G2761；5，嗜肺军团菌G2762；6，嗜肺军团菌G2763；7，嗜肺军团菌G2764；M，DL2000 DNA marker；

图4 为本发明试剂盒检测其它种属近源菌种标准菌株电泳结果图；其中：1，安氏军团菌G2826；2，沙门杆菌 ；3，痢疾志贺菌；4，金黄色葡萄球菌；5，小肠结肠炎耶尔森菌；6铜绿色假单胞菌；7，嗜水气单胞菌；8.大肠杆菌；9.肺炎链球菌 M，DL2000 DNA marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，所用到的试剂均有市售。

实施例1：

基因组的提取

在CO₂培养箱37℃过夜培养涂布安氏军团菌的BCYE平板，刮取并收集离心得到细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50℃温育2小时，再加入3 ul 10mg/ml 的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的***抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2

通过PCR扩增安氏军团菌中的ITS

以安氏军团菌的基因组为模板通过PCR扩增其ITS。首先根据ITS一端的16S rRNA基因的保守区设计上游引物（5’– TGT ACA CAC CGC CCG TC -3’），再根据23S rRNA基因的保守区设计下游引物（5’-GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC -3’）。PCR反应程序如下：在94℃预变性5分钟;然后94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，这样进行30个循环；最后，在72℃继续延伸5分钟, 得到PCR产物，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并3管long PCR产物，并用上海生工生物工程技术公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物中最短的条带；

实施例3

构建ITS克隆。

(1)首先是连接产物的获得：将PCR纯化产物与Promega公司的3×10^–3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为10μl，其中有1μl的10×buffer和0.5单位的T4DNA连接酶,得到连接产物。

(2)其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180 rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm 离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm 离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm 离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm 离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10%的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为60ul一管，-70℃保存。

(3)最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与60ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoR I酶切鉴定其中的***片段的大小，得到白色克隆群即为安氏军团菌的ITS克隆。

实施例4

对ITS克隆测序:

挑选***片段最小和次小的各8个克隆由用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的***片段双向进行测序，从而获得含tRNA基因的ITS的序列。

实施例5

特异引物的筛选:

针对安氏军团菌的ITS的特异区设计引物；在特异区设计一条上游引物与23S rRNA基因保守区内的下游引物结合，用这对引物（上游引物是见序列SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4）以普通安氏军团菌、7株非安氏军团菌，6株临床军团菌，8株非军团菌菌株的基因组为模板进行PCR，体系为10uM 引物1ul、25mM MgCl₂ 2.5ul、10×buffer2.5ul、10mM dNTP 0.25ul、5 U/ul Taq 聚合酶0.25ul及3ul的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH₂O补足至25ul。所有引物都在安氏军团菌中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增出大小正确的带，也就是说，在其他组中没有得到任何PCR产物带，所以该寡核苷酸对安氏军团菌及其ITS都是高度特异的。

实施例6

一、PCR检测试剂盒

检测实验所需材料及设备的准备

1.试剂盒组成：

1）MgCl₂（25mM）                               50ul;

2）dNTP（10mM）                               30ul;

3）10×buffer（10×酶特异性反应缓冲液）       50ul；

4）Taq 聚合酶（5 U/ul）                        5ul；

5）引物混合物（10 uM）                       10ul；

6）阳性对照品（KP）                          10ul；

7）阴性对照品（KN）                          10ul；

8）ddH₂O                                      5ml。

每个试剂盒可用于检测10个样品；

其中MgCl₂、10×buffer 、dNTP、Taq 聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH₂O由我们自行制备(按常规方法制备)。

检测所使用的引物：

上游引物是SEQ ID NO:3，即5-GAGTAAAACGAAAAGCCGCA-3,

下游引物是SEQ ID NO:4即5-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC -3，浓度比为1：1。

2.仪器设备：

PCR仪（又名DNA热循环扩增仪）、电泳设备（包括电泳仪及电泳槽）、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。

3.待测样品的提供：

我们收集了7株非安氏军团菌，6株临床军团菌，8株与安氏军团菌亲缘关系近的非军团菌验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表1:

 表1

Legionella anisa	1	G2826	17627	DSMZ（德国微生物菌种保藏中心）
					Legionella longbeachae	1	G2825	10572	DSMZ（德国微生物菌种保藏中心）
Legionella micdadei	1	G2823	11371	NCTC（英国全国菌种保藏中心）
					Legionella waltersii	1	G2821	13017	NCTC（英国全国菌种保藏中心）
Legionella steigerwaltii	1	G2830	11991	NCTC（英国全国菌种保藏中心）
					Legionella bozemanii	1	G2828	35545	ATCC（美国菌种保藏中心）
Legionella gormanii	1	G2827	43769	ATCC（美国菌种保藏中心）
					Legionella dumoffii	1	G3418	33279	上海CDC
Salmonella	1	G1445	M330	AUS（澳大利亚医学和兽医学研究中心）
					Shigella. dysenteriae	1	G2547	51491	CMCC(中国医学微生物菌种保存管理中心/中国药品生物制品检定所)
Staphylococcus aureus	1	G1758	CMCC 26058	CMCC(中国医学微生物菌种保存管理中心/中国药品生物制品检定所)
					Yersinia enterocolitica	1	G2776	DSM 11067	DSMZ（德国微生物菌种保藏中心）
Pseudomonas aeruginosa	1	G1760	AS 1.50	AS（中国科学院微生物研究所）
					Aeromonas hydrophila	1	G2738	1.2017	CMCC(中国医学微生物菌种保存管理中心/中国药品生物制品检定所)
Streptococcus pneumoniae 25A	1	G1520	D-25A
					E.coli		G1055	M1177	AUS（澳大利亚医学和兽医学研究中心）

表2 供试临床菌株的生化检验结果

二、检测实施的具体操作：

将上述菌株进行了同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测：

1.待测样品模板的提取

A.针对军团菌

1）取5微升原菌液涂布在BCYE平板在CO₂培养箱中培养；

2）刮取平板上菌体于ddH₂O中，8000rpm离心5分钟，去上清。

3）500ul ddH₂O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。

4）100ul ddH₂O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，

5）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。

6）取3ul中层上清做为PCR反应的模板。

B．针对非军团菌

1）1％接菌量无菌操作，接种于3ml LB培养基中，200rpm，37℃过夜培养；

2）500ul ddH₂O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。

3）100ul ddH₂O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，

4）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟；

5）取3ul中层上清做为PCR反应的模板。2.用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中10uM 引物1ul，25mM的MgCl₂2.5ul，10×buffer2.5ul、10mM的dNTP                                                  0.25ul，5 U/ul Taq 聚合酶0.25ul及3ul的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH₂O补足至25ul，充分混匀；

3.将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增：95℃ 5分钟1个循环；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 5分钟 1个循环。

4.在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果：

1）取3ul扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液混合；

2）将混合液上样于1.5％的琼脂糖凝胶上；

3）将琼脂糖凝胶经120v电压稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

4）观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。

5.依据如下条件进行结果判断安氏军团菌应在479bp处有一条带。

阳性对照和阴性对照试验只要将待测样品模板换成安氏军团菌阳性模板和安氏军团菌阴性模板（含大肠杆菌）即可，含有安氏军团菌的样品模板具有479bp片段，不含安氏军团菌的样品模板无此片段。利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测安氏军团菌。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津生物芯片技术有限责任公司

<120>  一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸及其应用

<160>  4      

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  548

<212>  DNA

<213>  安氏军团菌

 

<400>  1

aggggaacct gcggctggat cacctcctta aattaagagc actaaagaat ttaaagtgcc         60

cacacagttt gttttcgaga ataaagaaac ccaatgcacc cgaaaggggc ataaatgcta        120 

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taacacaagc gtcttgtatt gtgaaagcat gtaatctgag gtaattgaga ttatatggtc           540

aagaagag                                                                                           548

 

<210>  2

<211>  698

<212>  DNA

<213>  安氏军团菌

 

<400>  2

aagggaacct gcggctggat cacctcctta aattaagagc actaaagaat ttaaagtgcc       60

cacacagttt gttttcgaga taatgaagaa tcccaaccgc gactgagaag aagcggaaaa      120

 

gatattcgat cacgagattg ttgttgatgt aagtgaggtg ttgtagtgcc tctcaataaa         180

cgcgatgcta aatcgcaagt caaaaaagca aagtgcatcg aagcattttt gcgagagttt        240

tcgtgcaggc gcgagcaagc gaaggagcat gcatcagtat gtgaccaagc gagcgagtgg      300

atgcaatgaa aacaaatttt gcgagagatt gagtaaaacg aaaagccgca gtaaaagtga        360

aggagcatac atcagtatgt gactgaacga gcgagtgcat gcaacgtaga gtaaaacaaa        420

agctcgaagc aaaaaagtga aaatgggtct gtagatcagt tggttagatc gcacccctga        480

taagggtgag gtcggtggtt caagtccacc cagacccacc aatcctacgg aattcttcat        540

tgggattatc cagattaaag tgcttttatt tgagggcatt ttaatctgga atgaccagac           600

gttcattaaa aattagggta aataaagagg taacacaagc gtcttgtatt gtgaaagcat         660

gtaatctgag gtaattgaga ttatatggtc aagaagag                                            698               

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  安氏军团菌

 

<400>  3

gagtaaaacg aaaagccgca                                                 20

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  安氏军团菌

 

<400>  4

ggtacttaga tgtttcagtt c                                                21

 

Claims (8)

1.一种对安氏军团菌的ITS有特异性的核苷酸，其特征在于所述核苷酸包含如下（1）、（2）或（3）所示的序列：

（1）SEQ ID NO:1所示的序列；

（2）SEQ ID NO:2所示的序列；

（3）具有所述核苷酸功能， 上述（1）或（2）中缺失、替换或***一个或多个碱基的序列。

2.权利要求1所述核苷酸在制备检测细菌时作为引物用于PCR试剂盒、作为探针用于杂交反应与荧光检测，或用于制造基因芯片或微阵列方面的应用。

3.权利要求2所述核苷酸的应用，其中所述的PCR试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的引物指的是：上游引物为SEQ ID NO:3，下游引物为SEQ ID NO:4，上游引物与下游引物的浓度比为1:1。

4.要求权利要求3所述核苷酸的应用，其中上游引物是根据安氏军团菌的含有tRNA-Ala间区的ITS类型设计合成的，所述下游引物是根据细菌的23S rRNA基因保守区设计合成的。

5.权利要求3所述核苷酸的应用，其中所述的PCR试剂盒检测安氏军团菌的检测方法按以下步骤进行：

（1）提取待测样品DNA模板；

（2）在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl₂、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH₂O，混匀；

（3）将薄壁PCR中混匀的混合物在PCR仪上扩增；

（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；

（5）分析并进行结果判断。

6.权利要求5所述核苷酸的应用，其中所述步骤（1）中样品模板的提取方法为：

（1）将菌液涂布于BCYE平板置于CO2培养箱中培养，并用ddH₂O刮取菌体；

（2）取500μl的ddH₂O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，控干；

（3）取100μl ddH₂O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；

（4）再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；

（5）取3μl中层上清做为PCR反应的模板。

7.权利要求5所述核苷酸的应用，其中所述步骤（3）中PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；

变性温度和时间为94℃，30秒；

复性温度和时间为50℃，30秒；

延伸温度和时间为72℃，40秒；

变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；

为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5秒。

8.权利要求5所述核苷酸的应用，其中所述步骤（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

（1）取5～10μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；

（2）将混合液上样于1％的琼脂糖凝胶上；

（3）将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

（4）观察并记录结果。

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