CN102628042B - 对嗜肺军团菌O9型的wzm基因特异的核苷酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为：SEQIDNO:1所示的核苷酸和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸；与上述的核苷酸互补的核苷酸。这些核苷酸可用于制备检测嗜肺军团菌血清型O9型的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。本发明的对嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于商品化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种核苷酸及其应用，尤其涉及一种对嗜肺军团菌血清型O9型(Legionella pneumophila serogroup 9)的wzm (LPS O-抗原的ABC转运子，ABC transporter of LPS O-antigen，以下简称wzm)基因特异的核苷酸及其应用。
背景技术
军团菌最初是在美国发现的，是一种的无芽胞革兰氏阴性杆菌，对自然环境因素抵抗力较强，主要是引起呼吸道传染疾病，可通过气溶胶的方式在空气中散布，人类会因为吸入含菌的气溶胶而感染，引起军团病（Legionnaires disease，LD）。目前已知军团菌有52个种70多个血清型，能引起人类疾病的约有20种。常见的有嗜肺军团菌（Legionellapneumophila，LP）、 米氏军团菌（Legionella micdadei）、 博氏军团菌（Legionella bozemanii）、 菲氏军团菌（Legionellafeeleii）、 杜莫夫军团菌（Legionella dumoffii）和 长滩军团菌（Legionella longbeachae）等。
其中嗜肺军团菌与人类疾病关系最为密切。根据O抗原的不同，嗜肺军团菌可分为15个血清型。其中大约有70%的军团菌感染是由嗜肺军团菌O1引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺军团菌导致约5-10%的军团菌感染。
嗜肺军团菌为需氧革兰阴性杆菌，兼性胞内寄生菌，无荚膜 ，不产酸，不产气， 有一根至数根侧鞭毛或端鞭毛，可运动，菌体长 2-50μm,宽0.5-1μm。该菌生长营养要求较高，生长时需要半胱氨酸，甲硫氨酸和铁离子等，在活性炭 - 酵母浸出液琼脂（ BCYE） 培养基上可生长，在GVPC 平板上呈灰白色，边缘有紫蓝色光泽，挑起有拉丝；在含 2.5 % - 5.0 %的 CO2环境中生长很好, 厌氧条件下不生长。最适温度为 35 ℃ - 36℃， 具有一定的耐酸性和耐热性菌落颜色一般呈灰白色、紫色、蓝色或绿色, 但在普通血平板、普通琼脂或巧克力琼脂上不生长。
嗜肺军团菌在普通自来水中可存活400天以上，在60℃ 左右甚至在火山口附近的水塘里都能发现军团菌的踪迹。我国报告的病例多是嗜肺军团菌血清 O1 型、O5型、O6型。在欧美各国嗜肺军团菌肺炎占肺炎病例中的2.4 %-8.4 %。
随着分子技术特别是PCR技术的发展，许多分子生物学方法被用于军团菌分子分型和流行病学研究。目前已用于军团菌分型的4种常用分子分型技术为：随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、脉冲场凝胶电泳( Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、核酸测序分型(Sequence-based typing，SBT)。由于其一次即可分离出大量DNA片段，且具有操作简便，重复率好等优势，先后用于军团菌分子分型和流行病学调查。
聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因特异的核苷酸，所述核苷酸为：
1）SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；
2）与1）所示的核苷酸互补的核苷酸。
上述核苷酸可以用于制备检测嗜肺军团菌血清型O9型的wmt基因的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列；所述嗜肺军团菌血清型O9型可以取样于自来水、矿泉水、空调冷却水的培养物的粗提液，或是嗜肺军团菌血清型O9型的纯培养物的粗提液等，均采用常规的酚氯仿法制备。
本发明还提供一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
SEQ NO:1 ACAGATGGTTTGCCTTAC 特异扩增嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因上游引物
SEQ NO:2 TTCATACCAAAACCGCAG 特异扩增嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因下游引物
上述多重PCR检测试剂盒可以包括如下试剂： 10 mM dNTP 20μL；10×酶特异性反应缓冲液50μL；5 U/μL 耐热DNA聚合酶 8μL；引物各10μL；阳性对照品10μL，阴性对照品10μL；ddH2O 5mL。
上述针对嗜肺军团菌血清型O9型的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
由上述的技术方案可见，本发明建立的一种PCR反应体系，可检测嗜肺军团菌血清型O9型，该试剂盒有如下优点：
（1）方法简便，周期短、速度快、可操作性强: 本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测速度快、周期短，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却较低，市场应用前景广。本发明PCR试剂盒若用嗜肺军团菌O9型的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致，且敏感度和特异性无差别，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了物力人力。
（2）检测灵敏度高：本发明提供的PCR检测试剂盒及其检测方法敏感性高，检测精度高，可以检测到1ng/μL的DNA模板。对常见致病菌可以进行全面、***、准确的检测与鉴定。
(3)检测成本相对较低：可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。
（4）准确性高：本发明根据嗜肺军团菌O9型的wzm基因的特异核苷酸序列，设计出引物。从而利用引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将嗜肺军团菌血清型O9型和其他近源菌分开。
附图说明
图1为本发明的试剂盒检测结果图，其中：1为待测样品，检测到病原菌；P为阳性对照品；N为阴性对照品；M为DL2000 DNA marker；
图2 为本发明试剂盒检测嗜肺军团菌其他血清型标准菌株电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O9型 G2774；2，嗜肺军团菌O1型G2756；3，嗜肺军团菌O2型 G2773；4，嗜肺军团菌O3型 G2772；5，嗜肺军团菌O4型G2781；6，嗜肺军团菌O5型 G3408；7，嗜肺军团菌O6型G2771；嗜肺军团菌O7 型G3410；9，嗜肺军团菌O8型 G2820；10，嗜肺军团菌O10型 G2818；11，嗜肺军团菌O11型 G2824；12，嗜肺军团菌O12型 G2822；13，嗜肺军团菌O13型 G2819；14，嗜肺军团菌O14型 G2817；15，嗜肺军团菌O15型 G2829；M，DL2000 DNA marker；
图3 为本发明试剂盒检测军团菌属非嗜肺军团菌电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O9型G2774；2，戈氏军团菌；3，麦氏军团菌；4，长滩军团菌；5，沃氏军团菌；6，施氏军团菌；7，博兹曼军团菌；8，安氏军团菌；M，DL2000 DNA marker；
图4 为本发明检测军团菌属临床菌株电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O9型 G2774； 2，嗜肺军团菌O1型G2759；3，嗜肺军团菌O1型G2760；4，嗜肺军团菌O2型G2761；5，嗜肺军团菌O3型G2762；6，嗜肺军团菌O7型G2763；7，嗜肺军团菌O7型G2764；M，DL2000 DNA marker；
图5 为本发明试剂盒检测其它种属近源菌种标准菌株电泳结果图，其中：1，嗜肺军团菌O9型G2774；2，沙门杆菌 ；3，痢疾志贺菌；4，金黄色葡萄球菌；5，小肠结肠炎耶尔森菌；6铜绿色假单胞菌；7，嗜水气单胞菌；M，DL2000 DNA marker；
具体实施方式：
为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明白易懂，下面特举较佳实施例，同时结合说明书附图及具体实例对本发明进一步详细描述。
实施例1：
基因组的提取
（1）在超净工作台中，从菌种保藏管中吸取少量菌液，划线接种到军团菌BCYE生长平板上，37°C，5.0% CO2培养5-7天。
（2）向BCYE生长平板中加入2mL无菌水，用无菌圆头玻璃棒轻轻刮起菌苔，然后将菌悬液吸到1.5 mL离心管中，8000 rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次。
（3）加入250 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，12000 rpm离心5分钟，弃上清。
（4）加入250 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，再加10 μL 0.45M EDTA(pH 8.0)，充分悬浮，37℃温浴20分钟。
（5）加入10 μL 20 mg/mL溶菌酶，37℃温浴20分钟。
（6）加入1.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。
（7）加入15 μL 10%SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次。
（8）加2 μL 20 mg/mL RNAse，65℃水浴30分钟。
（9）用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。
（10）在通风橱中加入250 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。
（11）在通风橱中加入250 μL氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管。
（12）加入2.5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80℃沉淀DNA。12000 rpm ，4℃离心15 min。
（13）用1 mL 70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65℃，10 min烘干。
（14）用30 μL TE溶解，并于-20 °C冰箱备用。
用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，同时用NanoDrop2000 OD仪测量DNA的纯度和浓度。
实施例2：
引物的设计
嗜肺军团菌血清型O9型的O-抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，选取wzm基因作为该菌的特异靶基因，针对嗜肺军团菌O9型的wzm基因的特异区设计引物；如表1所示，上游引物是5’- ACAGATGGTTTGCCTTAC -3’，见序列SEQ ID NO:1；下游引物是5’- TTCATACCAAAACCGCAG -3’，见序列SEQ ID NO:2。
表1 嗜肺军团菌血清型O9型的特异引物序列
实施例3：
特异引物的筛选
收集了1株嗜肺军团菌O9型标准菌株，14株嗜肺军团菌其它血清型的标准菌株、7株军团菌属其他菌株、6株近缘菌验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表2。
表2 供试的标准菌株
本专利所使用的临床菌株如下表3所示：
表3 供试临床菌株的生化检验结果
PCR体系为10 μM 引物0.3 μL、10×buffer 2.5 μL、10 mM dNTP 0.25 μL、5 U/μL Taq 聚合酶0.2 μL及3 μL的待测样品模板到0.2 mL的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25 μL。所用引物在嗜肺军团菌O9型的模板中得到阳性结果，在其它组中没有得到任何PCR产物带，所以这些寡核苷酸片段是高度特异的。
实施例4：
PCR检测试剂盒
一、检测实验所需材料及设备的准备
1. 试剂盒组成：
1）dNTP（10mM） 50μL
2）10×buffer（10×酶特异性反应缓冲液） 300μL
3）MgCl2 （25mM） 300μL
4）Taq 聚合酶（5 U/μL） 5μL
5）引物混合物（5 μM） 70μL
6）阳性对照品（KP） 10μL
7）阴性对照品（KN） 10μL
8）ddH2O 5mL
每个试剂盒可用于检测10个样品。
其中10×buffer 、dNTP、Taq 聚合酶由宝生物工程（大连）有限公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品（含有嗜肺军团菌O9型的样品）、阴性对照品（将模板换成ddH2O）和ddH2O由我们自行制备。
使用上述PCR检测试剂盒进行嗜肺军团菌O9型检测的方法包括以下步骤：
(1)待测环境样品模板的提取:
环境样品模板通常为痰、血、胸水肺组织、支气管抽提物、矿泉水取样、自来水取样、空调冷却水取样等的培养物的粗提液，或是嗜肺军团菌O9型的纯培养物的粗提液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。
用1.5 mL 50 mM Tris-HCl (pH8.0) 刮取培养物，在12000 rpm条件下离心1分钟，去掉上清液；用500 μL的ddH2O重悬沉淀，在12000 rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，倒干；用100 μLddH2O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；再置于冰上10分钟后，在12000 rpm条件下离心2分钟；用5 μL中层上清做为PCR反应的模板。
（2）在PCR薄壁管中加入dNTP、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH2O，混匀，将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
58℃ 40秒
72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟
（3）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果
①取3μL扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液以9：1的体积比混合；
②将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；
③将琼脂糖凝胶电泳120V稳压电泳约15分钟，用DL2000 Marker进行对照；
④观察并记录结果。
（4）分析并进行结果判断。
本发明通过配制一种可检测嗜肺军团菌血清型O9型，可商品化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的成分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过简单的操作程序就能进行灵敏、快速、简便的检测，检测试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测嗜肺军团菌O9型所使用的试验设备简单，检测成本低。
使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。
本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量见下表4所示，DNA模板量为0.5μL。
表4 一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量
| 成分 | 浓度 | 加样量（μL） |
| ddH2O | - | 18 |
| 10×酶特异性反应缓冲液 | 10× | 2.5 |
| MgCl2 | 25mM | 2.5 |
| dNTP | 10mM | 0.25 |
| P-1 | 10μM | 0.5 |
| P-2 | 10μM | 0.5 |
| Taq酶 | 5U/μl | 0.25 |
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。
上述的阳性对照品为已确定是含有嗜肺军团菌O9型的样品，阴性对照品则为ddH2O。
2.仪器设备
SANYO高压灭菌锅（SANYO公司）；T Gradient PCR仪（Biometra公司）；
各种型号移液器（Eppendorf公司）；Sigma1-13K离心机（Sigma公司）；5804R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；ND-2000 NanoDrop OD仪器（ NanoDrop公司）；SIM-F124制冰机（日本SANYO）；超纯水净化***（Milli-Q）；凝胶成像仪（UVP公司）和0.2mL PCR薄壁管。
3.待测样品的提供
本发明所用实验菌株如表1和表2所示。
二、检测实施的具体操作：将上述28株标准菌株和7株军团菌临床菌株在同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。
1. 待测样品模板的提取
A.针对标准菌株
1）20μL接菌量，无菌操作，划线接种于BCYE培养基中， 37℃、5%CO2培养2-3天；
2）用50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，12000rpm离心5分钟，去上清。
3）用500μL ddH2O重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，去上清，尽量空干。
4）用100μL ddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，
5）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。
6）取5μL中层上清做为PCR反应的模板。
B．针对环境培养物（痰、血、胸水肺组织、支气管抽提物、矿泉水、自来水、空调冷凝水等）。
1）用50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，12000rpm离心5分钟，去上清。
2）用500μLddH2O重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。
3）用100μLddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，
4）置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。
5）取5μL中层上清做为PCR反应的模板。
2. 用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中5μM 引物0.4μL，25mM的10×buffer 2.5μL、10mM的dNTP 0.25μL，5 U/μL Taq 聚合酶0.25μL及5μL的待测样品模板到0.2mL的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25μL，充分混匀；
3. 将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增：94℃ 5分钟1个循环；94℃ 40秒，58℃ 40秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 5分钟 1个循环。
4. 在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果。
1）取3μL扩增产物与10×溴酚蓝上样缓冲液混合；
2）将混合液上样于1.5％的琼脂糖凝胶上；
3）将琼脂糖凝胶经120V电压稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；
4）观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。
5. 依据如下条件进行结果判断嗜肺军团菌O9型应在bp420处有一条带。
阳性对照和阴性对照试验只要将待测样品模板换成嗜肺军团菌O9型阳性模板和嗜肺军团菌O9型阴性模板（含大肠杆菌）即可，含有嗜肺军团菌O9型的样品模板具有420bp片段，不含嗜肺军团菌9型的样品模板无此片段。标准菌株电泳结果记录见图2所示：所有标准菌株除嗜肺军团菌O9型有420bp片段外，其他菌株均无扩增产物。这说明采用PCR检测方法可排除假阳性反应，根据有无以上片段进行的嗜肺军团菌O9型的检测鉴定，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的损失。
利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测嗜肺军团菌血清型O9型。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津生物芯片技术有限责任公司
<120> 对嗜肺军团菌O9型的wzm基因特异的核苷酸及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 肺军团菌O9型的wzm基因
<400> 1
acagatggtt tgccttac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 嗜肺军团菌O9型的wzm基因
<400> 2
ttcataccaa aaccgcag 18
Claims (4)
1.一种对嗜肺军团菌O9型的wzm基因特异的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸和SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
2.一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述的PCR引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸。
3.权利要求2所述的试剂盒，其中的SEQ ID NO:1 ACAGATGGTTTGCCTTAC 为特异扩增嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因上游引物；SEQ ID NO:2 TTCATACCAAAACCGCAG 为特异扩增嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因下游引物。
4.权利要求1所述的核苷酸在制备检测嗜肺军团菌血清型O9型试剂盒中的应用。
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