CN102858998A - 用于肠易激综合征诊断的新基因组生物标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了诊断、预后和亚分型IBS的新生物标记、试剂盒和方法。在一个方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中对IBS进行诊断、分类、提供预后、和分配治疗的新基因组生物标记。在另一个方面，本发明提供了用于IBS诊断和预后的新算法。

Description

用于肠易激综合征诊断的新基因组生物标记

与相关申请的交叉参考

本申请要求于2009年11月25日提交的美国申请号61/264,634的优先权，为了所有目的将该美国申请的教导内容整体引入本文作为参考。

发明背景

肠易激综合征（IBS）是所有胃肠道病症中最常见的，影响全部群体的10-20%且在所有消化***病患者中占50%以上。然而，研究表明，受IBS困扰的患者中仅约10%-50%实际上寻求医学帮助。具有IBS的患者呈现不一样的症状，例如主要与排便有关的腹痛、腹泻、便秘、或腹泻便秘交替、腹胀、腹气、和大便中过度粘液。超过40%的IBS患者具有严重的症状，使得他们不得不休假，简化其社会生活，避免***，取消约会，停止旅行，服用药物，甚至因害怕尴尬而困在家中。在美国估计的IBS健康护理费用是每年$8百万（Talley等人，Gastroenterol.，109:1736-1741（1995））。

IBS的确切病理生理学并未得到充分理解。然而，存在对内脏痛觉感受的提高敏感性，称为外周敏化。这种敏化涉及初级传入神经元的传导过程的阈值降低和放大量的增加，可归因于多种介质，包括单胺类（例如儿茶酚胺和吲哚胺）、P物质以及多种细胞因子和***素类例如E型***素（参见例如，Mayer等人，Gastroenterol.，107:271-293（1994））。在IBS的病因学中还牵涉肠运动机能障碍，这导致腔内内容物和/或气体的处理异常（参见例如，Kellow等人，Gastroenterol.，92:1885-1893（1987）；Levitt等人，Ann.Int.Med.，124:422-424（1996））。心理学因素也可以促成IBS症状，表现出，即使不是失常所触发的，也与失常（包括抑郁与焦虑）结合在一起（参见例如，Drossman等人，Gastroenterol.Int.，8:47-90（1995））。

IBS的原因并未得到充分理解。肠壁衬有肌肉层，肌肉层收缩和舒张，将食物从胃通过肠道移动到直肠。通常，这些肌肉以协调的节奏收缩和舒张。在IBS患者中，这些收缩比正常的一般更强且持续更久。因此，在某些情况下，食物被迫更快速地通过肠，引起气体、气胀和腹泻。在其他情况下，出现相反情况：食物通过减慢并且大便***且干燥，引起便秘。

IBS的确切病理生理学有待阐明。虽然肠运动障碍和改变的内脏感受被认为是症状发病机理的重要贡献者（Quigley，Scand.J.Gastroenterol.，38（Suppl.237）:1-8（2003）；Mayer等人，Gastroenterol.，122:2032-2048（2002）），但这种病状目前一般被视为脑-肠轴的病症。近来，也已提出肠道感染和肠炎症的作用。研究已记载在细菌学确认的胃肠炎后IBS发作，而其它研究已提供在IBS中低度粘膜炎症（Spiller等人，Gut，47:804-811（2000）；Dunlop等人，Gastroenterol.，125:1651-1659（2003）；Cumberland等人，Epidemiol.Infect.，130:453-460（2003））和免疫激活（Gwee等人，Gut，52:523-526（2003）；Pimentel等人，Am.J.Gastroenterol.，95:3503-3506（2000））的迹象。肠菌群也被涉及，并且近期研究证实益生生物双歧杆菌（Bifidobacterium）通过调节免疫活性在治疗该病症中的功效（O'Mahony等人，Gastroenterol.，128:541-551（2005））。

下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）是人的核心内分泌应激***（De Wied等人，Front.Neuroendocrinol.，14:251-302（1993）），并且提供在脑和肠免疫***之间的重要连接。响应身体和心理应激物两者都可以发生该轴的激活（Dinan，Br.J.Psychiatry，164:365-371（1994）），这两者都已牵涉IBS的病理生理学（Cumberland等人，Epidemiol.Infect.，130:453-460（2003））。具有IBS的患者已被报道，在儿童期中具有增加比率的性和身体滥用，以及在成人期中更高比率的紧张生活事件（Gaynes等人，Baillieres Clin.Gastroenterol.，13:437-452（1999））。此类社会心理创伤或不良的认知应对策略将显著影响症状严重性、日常功能和健康后果。

虽然IBS的病因学并未完全表征，但医学界已出现了共同的定义和标准，称为罗马II标准（Rome II criteria），以帮助基于病史来诊断IBS。罗马II标准要求在1年的时期中3个月的连续或复发性腹痛或不适，该腹痛或不适通过排便得到缓解和/或与大便频率或稠度的变化以及下述中的两种或更多种相关：改变的大便频率、改变的大便形状、改变的大便通过、粘液的通过、或气胀和腹胀。再一个必要条件是：缺乏可以引起这些症状的任何结构的或生物化学的病症。因此，罗马II标准仅在存在大量病史时可以使用，并且仅在不存在可以用于解释这些症状的异常肠解剖学或代谢过程时是可靠的。类似地，近来由医学界发展的罗马III标准仅可以在有特定的一组症状的呈现、详细病史和体格检查时使用。

文献充分表明，由于IBS与其他疾病或病症在症状上的相似性，将患者诊断为具有IBS可能是困难的。事实上，因为IBS的症状与多种其他肠道病的症状相似或等同，所以在作出正确诊断前可能花费数年。例如，具有炎性肠病（IBD）但显示出诸如气胀、腹泻、便秘和腹痛等轻度体征与症状的患者可能难以与具有IBS的患者区分。因此，在IBS和IBD之间的症状相似性致使快速和准确诊断变得困难。区别性诊断IBS和IBD的困难使得这些疾病的早期和有效治疗受到阻碍。不幸的是，目前尚没有可以用于确定地区分IBS与其他呈现相似症状的肠疾病或病症的快速和准确的诊断方法。本发明满足了此需要并且还提供相关优点。

发明概述

本发明提供方法、***和代码，其可以用于准确地分类来自个体的样品是否与肠易激综合征（IBS）或其亚型有关。作为非限制性例子，本发明可以使用统计学算法和/或经验数据，用于将来自个体的样品分类为IBS样品。本发明还可以使用统计学算法和/或经验数据的组合，用于排除呈现IBS样症状的一种或多种疾病或病症和归入（rule in）IBS。因此，本发明提供了IBS的准确诊断预测、IBS亚型的分类、和可以用于指导治疗决定的预后信息。

在一个方面，本发明提供用于在有需要的受试者中诊断肠易激综合征（IBS）的方法，该方法包括：（a）从得自受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA；（b）在适于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；（c）检测复合物的水平；和（d）确定复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是类似于与不存在IBS相关的第二参考水平，从而在受试者中诊断IBS或其亚型，其中生物标记是来自基因的RNA，所述基因选自表4中的基因，例如CCDC147。在另一个实施方案中，基因选自表6中的基因。在一个更优选的实施方案中，基因选自表7中的基因。

在另一个方面，本发明提供了用于监控受试者中肠易激综合征（IBS）的进展或消退的方法，所述方法包括：（a）从在第一时间点取自受试者的第一生物学样品，确定第一生物标记谱；（b）从在第二时间点取自受试者的第二生物学样品，确定第二生物标记谱；和（c）比较所述第一和所述第二生物标记谱，以（i）确定哪个生物标记谱最类似或最不类似于与IBS相关的第一参考谱，（ii）确定哪个生物标记谱最不类似或最类似于与不存在IBS相关的第二参考谱，或（iii）确定前述相似性中的至少2个，其中所述生物标记谱包含表4中的至少2种生物标记的表达信息，从而监控所述受试者中IBS的进展或消退。在另一个实施方案中，生物标记谱包含表6中的至少2种生物标记的表达信息。在一个更优选的实施方案中，生物标记谱包含表7中的至少2种生物标记的表达信息。

在另外一个方面，本发明提供了用于向有需要的受试者分配IBS治疗的方法，该方法包括：（a）从得自受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA；（b）在适于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；（c）检测复合物的水平；（d）确定复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是与不存在IBS相关的第二参考水平；和（e）如果所述水平更紧密地类似于与IBS相关的所述第一参考水平，那么分配IBS治疗，其中IBS RNA生物标记选自表4中的基因。在另一个实施方案中，基因选自表6中的基因。在一个更优选的实施方案中，基因选自表7中的基因。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将样品分类为IBS-便秘型（IBS-C）、IBS-腹泻型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）、IBS-交替型（IBS-A）、或感染后IBS（IBS-PI）样品。在其他实施方案中，该方法进一步包括将非IBS样品分类为正常、炎性肠病（IBD）、或非IBD样品。

在一些实施方案中，用于诊断IBS、监控IBS的进展或消退和/或分配IBS治疗的方法包括：检测表2、表4、表6和表7中的至少2、3、4、5种或更多种生物标记。在其他实施方案中，该方法进一步包括检测选自下述的生物标记：细胞因子、生长因子、抗嗜中性粒细胞抗体、抗酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）抗体、抗微生物抗体、抗组织转谷氨酰胺酶（tTG）抗体、脂质运载蛋白、基质金属蛋白酶（MMP）、脂质运载蛋白和MMP的复合物、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）、球蛋白（例如α-球蛋白）、肌动蛋白切割蛋白(actin-severing protein)、S100蛋白、血纤肽、降钙素基因相关肽（CGRP）、速激肽、生长素释放肽、神经降压肽、促皮质素释放激素（CRH）、弹性蛋白酶、C-反应蛋白（CRP）、乳铁蛋白(lactoferrin)、抗乳铁蛋白抗体、钙防卫蛋白、血红蛋白、NOD2/CARD15、血清素重摄取转运蛋白（SERT）、色氨酸羟化酶-1、5-羟色胺（5-HT）、乳酮糖、及其组合。

在一些其他实施方案中，本发明的方法进一步包括确定症状谱，其中通过鉴定所述个体中至少一种症状的存在或严重性，确定所述症状谱；和使用基于所述诊断标记谱和所述症状谱的算法，将所述样品分类为IBS样品或非IBS样品。

这些及其他目的、方面和实施方案将在下面的详述和附图中更显而易见。

附图简述

图1描述在经由RMA算法加工后8个训练样品的基因表达数据的盒须图。样品HG1和2对应于IBS-C样品，HG3、4和5对应于IBS-D，并且HG6、7和8对应于健康对照样品。

图2描述基于ANOVA分析的头5种差异表达基因的基因图。

图3描述使用阵列上的所有探针组执行的无监督分层聚类分析的聚类结果。

图4描述使用阵列上的所有未掩蔽的探针组执行的无监督分层聚类分析的聚类结果的热图。来自IBS患者和健康志愿者的转录物的总体表达分析。得自3个IBS-D、2个IBS-C和3个健康志愿者的总RNA在含有超过35,000种人基因的Affymetrix阵列上进行分析。3个正常和5个IBS样品的无监督分层聚类分析。红色指示相对于所有实验的平均表达值升高的基因。绿色指示相对于该平均表达值降低的基因。

图5描述基于所有未掩蔽的探针组的基因表达谱显现样品的分离的多维量表图。

图6描述主成分分析结果。左图（A）显示多少百分比的总变异可以由最前面的主成分来解释。右图（B）显示通过头2种主成分的样品分离。

图7A-C描述在每对组别之间，具体地，在（A）IBS-C和IBS-D组，（B）IBS-C和对照组，以及（C）IBS-D和对照组之间，比较的火山图。

图8描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照（HV）受试者的样品中FOXD3、PI4K2A、ACSS2、ASIP和OR2L8基因的差异基因表达的qRT-PCR验证结果。

图9A-C描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照（HV）受试者的样品中所选的候选生物标记的差异基因表达的qRT-PCR验证结果。

图10A-C描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照（HV）受试者的样品中36种所选差异表达基因（DEGs）的表达的实时定量PCR验证结果。

图11描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照（HV）受试者的样品中5种靶基因（SERT、TPH1、MAO-A、TLR4和TLR7）的实时定量PCR结果。

来自于2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524的图为了所有目的整体引入本文作为参考。

发明详述

I.引言

肠易激综合征（IBS）是影响西方国家中15-20%人口的高度流行的功能性胃肠道病症，在女性中具有更高的流行率。IBS根据占优势的肠症状分类为3个组：便秘占优势的IBD（IBS-C）、腹泻占优势的IBS（IBS-D）、和具有腹泻与便秘交替症状的IBS（IBS-A）。

由于IBS与其他疾病或病症的症状相似性，将患者诊断为具有IBS可能是困难的。例如，具有炎性肠病（IBD）但显示出例如气胀(bloating)、腹泻、便秘和腹痛等轻度体征与症状的患者可能难于与具有IBS的患者区分。因此，在IBS和IBD之间的症状相似性致使快速和准确诊断变得困难，并且阻碍疾病的早期和有效治疗。

目前临床实践中IBS是一种排除性诊断。患者通过基于症状的罗马标准进行诊断，其为在过去的3个月中每个月至少3天的复发性腹痛或不适，伴随排便后的改善、和发作时伴有大便频率或性状的变化。这些症状常在其他GI病症，例如功能性消化不良、纤维肌痛、慢性骨盆疼痛和间质性膀胱炎，中可见。共病的存在进一步使诊断复杂化。

虽然这种疾病的病因学仍是不清楚的，但有大量证据表明几种病理生理学途径失调，包括血清素生物合成和代谢（Gershon MD.，J ClinGastroenterol 39（5 Suppl 3）:S184-93（2005）；Coates MD等人，Gastroenterology 126（7）:1657-64（2004）；Mawe GM等人，AlimentPharmacol Ther 23（8）:1067-76（2006））、肥大细胞浸润（R óka R等人，Clin Gastroenterol Hepatol 5（5）:550-5（2007）；Barbara G等人，Gastroenterology 2007 Jan；132（1）:26-37；Guilarte M等人，Gut 56（2）:203-9（2007）；Barbara G等人，Gastroenterology 126（3）:693-702（2004）；O'Sullivan M等人，Neurogastroenterol Motil 12（5）:449-57（2000））、内脏高敏感性、应激反应和细菌感染（感染后IBS）。考虑到这种表型异质疾病的多重潜在病理生理病因学，任何单一诊断试验或生物标记都不可能可靠地鉴定具有IBS的受试者。此外，临床医生也不愿意依赖基于症状的标准来诊断IBS，加上目前可用检测的弱诊断价值，使得有必要开发简单但灵敏和特异的检测试验，以帮助临床医生作出自信的IBS诊断。朝向这个目标，Prometheus Laboratories开发了用于IBS的第一个基于血液的检测试验，其由10种血清生物标记和算法组成。这些标记与如下生物化学或生理学途径相关，所述途径涉及肠运动性、脑-肠轴、神经元调节或免疫功能。Prometheus IBS诊断试验的灵敏度、特异性和准确度分别为50%、88%和70%。

除了其他方面，本发明提供了第二代IBS诊断检测试验，其采用候选基因聚焦途径驱动的方法以及基因组宽度的基因表达谱分析。已报道了使用乙状结肠粘膜组织在IBS患者组织样品中进行的基因表达谱分析（Schmulson MW和Chang L.，Am J Med 107（5A）:20S-26S（1999））。然而，不知道在IBS患者的外周血细胞中是否存在“替代性”转录生物标记。尽管此类基因表达生物标记已在文献中报道，然而，这些标记源自公开的炎性肠病研究的数据挖掘（Tillisch K和Chang L.，Curr GastroenterolRep 7（4）:249-56（2005））。在此，我们已进行首次微阵列研究，以在得自IBS患者和健康受试者的外周血样品中鉴定基因表达生物标记，结果呈现于本公开中。

在目前临床实践中，IBS的诊断基于患者呈现的症状加上对其他胃肠道病症的排除。这种实践导致临床医生在作出IBS的确信诊断前安排多种检查。不幸的是，临床医生常规安排的大多数检查，包括全血细胞计数、化学、肝酶、甲状腺功能研究和大便取样，在具有典型IBS症状且无警报性特征（重量减轻，大便出血，无法解释的缺铁性贫血，夜间腹泻、或IBD、口炎性腹泻或结肠癌的家族史）的受试者中具有极低的诊断价值（Cash BD等人，American Journal of Gastroenterology 97（11）:2812-2819（2002））。患者通过基于症状的罗马标准进行诊断，其为在过去的3个月中每个月至少3天的复发性腹痛或不适，伴随排便后的改善、和发作时伴有大便频率或性状的变化。这些症状常在其他GI病症，例如功能性消化不良、纤维肌痛、慢性骨盆疼痛和间质性膀胱炎，中可见。因此，具有IBS的患者比非IBS患者更经常就医，消费更多药物，并且经历更多的诊断测试（Schmulson MW和Chang L.，Am J Med 107（5A）:20S-26S（1999）；Tillisch K和Chang L.，Curr Gastroenterol Rep 7（4）:249-56（2005））。共病的存在进一步使诊断复杂化。IBS症状显著损害患者的生活质量且增加健康护理费用（Spiegel BM等人，Arch Intern Med 164（16）:1773-80（2004））。

IBS患者样品的基因表达谱研究已使用乙状结肠粘膜进行报道。尽管在IBS患者中外周血细胞中的“替代”生物标记先前已有报道，但这些标记是通过对现有的炎性肠病研究的数据挖掘而选择的。因此，需要开发可以更好地促进IBS诊断的新替代性生物标记。

在一个方面，本发明通过发现可以用于IBS诊断和预后的新基因表达标记，满足这个需要。使用来自3个IBS-D、2个IBS-C患者和3个健康志愿者的外周全血样品，进行Affymetrix微阵列研究。所有IBS患者符合罗马III标准，并且健康志愿者不具有IBS史或其他活跃的共病。微阵列数据的无监督分析鉴定了区分IBS患者和健康志愿者的一组72种基因。所选基因的微阵列表达谱通过实时定量聚合酶链反应进一步验证。所选基因的验证在22个IBS-C、17个IBS-D、12个IBD-M和21个志愿者中进行。表达数据使用多重逻辑回归(Multiple Logistic Regression)和随机森林预测(Random Forest prediction)进行分析。以这种方式，证实以高准确度区分IBS患者与健康受试者的新预测物基因子集。这些基因的表达在全血细胞及其匹配的肠活检组织中进一步比较。

本发明对于IBS诊断具有重要影响。例如，在本发明的一个方面，这些新IBS表达标记可以在有需要的受试者中用于诊断、提供预后和/或亚分型IBS。在另一个方面，这些标记可以补充现有基于症状的IBS诊断。在另外一个方面，这些标记可以与本领域已知用于IBS诊断和预后的其他血清学标记组合使用。

II.定义

如本文使用的，除非另有说明，下述术语具有归于其的含义。

术语“分类”包括将样品与疾病状态“关联”或“归类”。在一些情况下，“分类”基于统计学证据、经验性证据或两者。在一些实施方案中，分类方法和***使用所谓的具有已知疾病状态的样品的训练集。一旦建立后，训练数据集充当与未知样品的特征相比较的基础、模型或模板，以便分类未知疾病状态的样品。在一些情况下，分类样品类似于诊断样品的疾病状态。在一些其他情况下，分类样品类似于区分样品的疾病状态与其它疾病状态。

术语“肠易激综合征”或“IBS”包括特征在于一种或多种症状的一组功能性肠病，所述症状包括但不限于腹痛、腹部不适、肠模式的变化、松散的或更频繁的肠运动、腹泻和便秘，一般不存在任何明显的结构异常。取决于占优势的症状，存在至少3种形式的IBS：（1）腹泻占优势的（IBS-D）；（2）便秘占优势的（IBS-C）；和（3）具有交替大便模式的IBS（IBS-A）。IBS还可以以混合症状的形式（IBS-M）出现。还存在多种IBS临床亚型，例如感染后IBS（IBS-PI）。

术语“样品”包括得自个体的任何生物学样本。在本发明中使用的合适样品包括但不限于，全血、血浆、血清、唾液、尿、大便、痰、泪、任何其他体液、组织样品（例如活检组织）及其细胞提取物（例如红血细胞提取物）。在一个优选实施方案中，样品是血清样品。样品例如血清、唾液和尿的使用是本领域众所周知的（参见例如，Hashida等人，J.Clin.Lab.Anal.，11:267-86（1997））。本领域技术人员应当理解样品例如血清样品可以在分析标记水平前进行稀释。

术语“生物标记”或“标记”包括任何诊断标记，例如生物化学标记、血清学标记、遗传标记或其他临床或回波描记(echographic)特征，其可以用于将来自个体的样品分类为IBS样品，或在来自个体的样品中排除与IBS样症状相关的一种或多种疾病或病症。术语“生物标记”或“标记”还涵盖任何分类标记，例如生物化学标记、血清学标记、遗传标记或其他临床或回波描记特征，其可以用于将IBS分类为其多种形式或临床亚型中的一种。适于在本发明中使用的诊断标记的非限制性例子在下文描述，并且包括下表2和3中的mRNAs和蛋白质（例如FOXD3、PI4K2A、MAP1LC3A、ACSS2、ASIP、OR2L8、LPAR5、JARID1B、CDKN1C等）。诊断标记的其他例子包括在下述文献中描述的那些：于2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524、于2009年6月25日提交的美国临时申请序列号61/220,525、和于2009年10月30日提交的美国临时申请序列号61/256,717，所有这些文献为了所有目的整体引入本文作为参考。在某些实施方案中，诊断标记可以用于将IBS分类成其多种形式或临床亚型之一。在其他实施方案中，分类标记可以用于将样品分类为IBS样品，或排除与IBS样症状相关的一种或多种疾病或病症。本领域技术人员将明了适于在本发明中使用的其它诊断和分类标记。

如本文使用的，术语“谱”（profile）包括代表与疾病或病症例如IBS或IBD相关的独特特征或特性的任何数据集。该术语涵盖：分析样品中的一种或多种诊断标记的“诊断标记谱”，鉴定个体正在经历或已经历的一种或多种IBS相关临床因素（即症状）的“症状谱”，及其组合。例如，“诊断标记谱”可以包括代表与IBS和/或IBD相关的一种或多种诊断标记的存在或水平的数据集。在一个实施方案中，谱包括“表达谱”或“核酸谱”，包含对应于一个标记或一组标记（例如RNAs、mRNAs、miRNAs、非编码RNAs、蛋白质等）在得自受试者的样品中的表达水平的一组数据。“基因表达谱”包括代表与IBS、IBD或其亚型相关的一种或多种基因的RNAs、mRNAs、miRNAs和/或非编码RNA水平的一组基因表达数据。同样地，“症状谱”可以包括代表与IBS和/或IBD相关的一种或多种症状的存在、严重性、频率和/或持续时间的一组数据。

术语“个体”、“受试者”或“患者”一般指人，但也可以指其他动物，包括例如其他灵长类动物、啮齿类动物、犬、猫、马、绵羊、猪等。

术语“基因”包括可以转录成RNA，包括mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、非编码RNA等，的DNA区段。该术语涵盖参与产生多肽链的DNA区段以及在编码区前和后的区域，例如启动子、5’-非翻译区（5’UTR）和3’-非翻译区（3’UTR）、以及位于各编码区段（外显子）之间的***序列（内含子）。

术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性质，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另有说明，一个特定核酸序列还隐含地包含其保守修饰变体（例如简并密码子置换）、等位基因、剪接变体、直向同源物、SNPs和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子置换可以通过生成如下序列来达到，在所述序列中一个或多个所选（或所有）密码子的第三个位置由混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换（Batzer等人，Nucleic Acid Res.,19:5081（1991）；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260:2605-2608（1985）；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，8:91-98（1994））。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的RNA（例如mRNA、miRNA、tRNA、rRNA等）互换使用。

术语“多态性”包括在群体中出现2个或更多个遗传决定的可变序列或等位基因。“多态性位点”包括出现分歧的座位。多态性座位可以小至1个碱基对（单核苷酸多态性，或SNP）或可以包含多个核苷酸的***或缺失。多态性标记包括但不限于限制性片段长度多态性、串联重复序列可变数（VNTR's）、高变区、小卫星、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、和***元件例如Alu。第一个被鉴定的等位基因可以被主观地指定为参考等位基因，而其他等位基因指定为可变或“变体等位基因”。在所选群体中最频繁出现的等位基因有时被称为“野生型”等位基因。二倍体生物对于变体等位基因可以是纯合或杂合的。变体等位基因可以在携带变体等位基因的个体中产生或不产生可观察的物理或生物化学特征（“表型”）。例如，变体等位基因可以改变由目的基因编码的蛋白质的酶促活性。

“单核苷酸多态性”或“SNP”发生在由单个核苷酸占据的多态性位点上，其是等位基因序列之间的变异位点。该位点通常之前和之后是等位基因的高度保守序列（例如在群体的小于1/100或1/1000成员中不同的序列）。SNP通常由在多态位点上一个核苷酸被另一个核苷酸置换而引起。转换是一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶替换。颠换是嘌呤被嘧啶替换或反之亦然。单核苷酸多态性还可以起因于相对于参考等位基因的核苷酸缺失或核苷酸***。

如本文使用的，术语“基因型”包括生物的遗传组成，包括例如，二倍体生物对于一种或多种目的变体等位基因是杂合还是纯合的。

如本文使用的，术语“基本上相同的氨基酸序列”包括与天然存在的氨基酸序列相似但不等同的氨基酸序列。例如，与天然存在的肽、多肽或蛋白质具有基本上相同的氨基酸序列的氨基酸序列可以，相对于天然存在的肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列，具有一个或多个修饰，例如氨基酸添加、缺失或置换，条件是经修饰的序列基本上保留天然存在的肽、多肽或蛋白质的至少一种生物学活性，例如免疫反应性。对于氨基酸序列之间的基本相似性，通常以约6–100个残基的序列，优选约10–100个残基，且更优选约25–35个残基的序列进行比较。本发明的肽、多肽或蛋白质或其片段的特别有用的修饰是赋予例如增加的稳定性的修饰。掺入一个或多个D-氨基酸是在增加多肽或多肽片段的稳定性中有用的修饰。类似地，赖氨酸残基的缺失或置换可以通过保护多肽或多肽片段不受降解来增加稳定性。

术语“监控IBS的进展或消退”包括使用本发明的方法、***和代码确定个体的疾病状态（例如IBS的存在或严重性）。在一些情况下，可以将算法（例如学习统计学分类器***）的结果与早先针对相同个体获得的那些结果相比较。在某些实施方案中，本发明的方法、***和代码可以用于预测IBS的进展，例如通过：基于诊断标记的分析和/或IBS相关症状的鉴定，确定IBS在个体中快速或缓慢进展的可能性。在其他实施方案中，本发明的方法、***和代码可以用于预测IBS的消退，例如通过：基于诊断标记的分析和/或IBS相关症状的鉴定，确定IBS在个体中快速或缓慢消退的可能性。

术语“在接受对于治疗IBS有用的药物的个体中监控药物功效”包括使用本发明的方法、***和代码确定治疗剂在施用后用于治疗IBS的有效性。在一些情况下，可以将算法（例如学习统计学分类器***）的结果与在治疗剂使用开始前或在治疗的早期从相同个体获得的那些结果相比较。如本文使用的，对于治疗IBS有用的药物是可以用于改善个体的健康的任何化合物或药物，并且包括但不限于IBS药物例如5－羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、氯离子通道阻断剂、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物、促皮质素释放因子（CRF）拮抗剂、益生菌、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。

术语“治疗有效量或剂量”包括在有需要的受试者中能够达到疗效的药物剂量。例如，用于治疗IBS的药物的治疗有效量可以是能够防止或减轻与IBS相关的一种或多种症状的量。确切量可以通过本领域技术人员使用已知技术确定（参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms，Vols.1-3（1992）；Lloyd，The Art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding(1999）；Pickar，Dosage Calculations（1999）；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro，编辑，Lippincott，Williams & Wilkins（2003））。

III.实施方案的描述

本发明提供了用于准确分类来自个体的样品是否与IBS相关的方法、***和代码。在某些实施方案中，本发明使用统计学算法（例如学***），用于将来自个体的样品分类为IBS样品。本发明还可以使用统计学算法和/或经验性数据的组合，用于排除呈现IBS样症状的一种或多种疾病或病症和归入IBS。相应地，本发明提供了IBS的准确诊断预测和用于指导治疗决定的预后信息。

A.诊断IBS

在一个方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中诊断肠易激综合征（IBS）的方法，该方法包括：（a）从得自受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA；（b）在适合于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；（c）检测复合物的水平；和（d）确定复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是与不存在IBS相关的第二参考水平，从而诊断受试者中的IBS，其中生物标记是来自基因的RNA，所述基因选自表4中的基因。在另一个实施方案中，基因选自表6中的基因。在一个更优选的实施方案中，基因选自表7中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或26种基因。

在本发明的某些实施方案中，IBS RNA生物标记是mRNA或表达的非编码RNA。在特定实施方案中，该方法包括检测表4中的至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70种或更多种基因。在另一个优选实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表6中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40种。在一个更优选的实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表7中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或26种。

在本发明的一个实施方案中，IBS RNA生物标记是编码具有SEQ IDNOS:1-75和154–162之任一的氨基酸序列的蛋白质的mRNA分子。在另一个实施方案中，IBS RNA生物标记是包含SEQ ID NOS:76–153之任一的核酸序列的RNA分子。

在一个特定实施方案中，IBS RNA生物标记是由选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3的基因转录的RNA分子。在一个优选实施方案中，基因是CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A或GNG3。在另一个实施方案中，用于诊断或亚分型IBS的方法包括检测一组至少约5种生物标记。在一个优选实施方案中，标记包含CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3。

在一些实施方案中，检测试剂包含寡核苷酸，并且检测复合物水平（例如经由转化）的步骤包括寡核苷酸杂交（例如基于微阵列或珠的杂交试验、xMAP试验、RNA印迹、斑点印迹、RNA酶保护法等）和/或核酸扩增（例如PCR、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR、质谱法等）。在另外其他实施方案中，检测试剂是抗体，并且确定样品中复合物水平（例如转化）的方法包括免疫化学试验（即，免疫荧光试验、ELISA、IFA等）。

用于检测或确定至少一种诊断标记的存在或水平的样品一般是全血、血浆、血清、唾液、尿、大便（即粪便）、泪及任何其他体液、或组织样品（即活检组织）例如小肠或结肠样品。优选地，样品是血清、全血、血浆、大便、尿或组织活检物。在一些情况下，本发明的方法进一步包括在检测或确定样品中至少一种诊断标记的存在或水平前从个体中获得样品。

在特定实施方案中，本发明的方法包括确定RNA IBS生物标记谱以及另外的蛋白质或血清学IBS生物标记。在某些实施方案中，该另外的诊断标记谱通过检测至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种另外的诊断标记的存在或水平来确定，其中所述另外的诊断标记选自表2中的，于2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524、于2009年6月25日提交的美国临时申请序列号61/220,525、和于2009年10月30日提交的美国临时申请序列号61/256,717中的那些。

在某些实施方案中，可以构建用于测量上述诊断标记中的一种或多种的一个组，并用于将样品分类为IBS样品、IBS亚型样品或非IBS样品。本领域技术人员将理解，可以使用例如个体样品的等分试样或稀释物，同时或相继地确定多种诊断标记的存在或水平。在一些情况下，在个体的样品中一种特定诊断标记的水平可以被视为升高了，当它比在可比样品（例如正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品）或样品群体（例如大于可比的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中相同标记的中值水平）中相同标记的水平大至少约25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%时。在一些其他情况下，在个体的样品中一种特定诊断标记的水平可以被视为减少了，当它比在可比样品（例如正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品）或样品群体（例如小于可比的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中相同标记的中值水平）中相同标记的水平至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时。在另外其他实施方案中，IBS标记视为差异表达的，当相对于在可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中的相同标记，其log2倍数变化的量值（即正或负值）是至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更大时。在一个优选实施方案中，差异表达的IBS生物标记的量值是至少约1.0、更优选至少约1.5、且最优选至少约2.5。

在某些实施方案中，归入IBS、诊断IBS或分类IBS的方法包括：确定诊断标记谱，任选地与症状谱组合，其中症状谱通过鉴定个体中至少一种症状的存在或严重性而确定；以及使用基于诊断标记谱和症状谱的算法，将样品分类为IBS样品或非IBS样品。本领域技术人员应当理解诊断标记谱和症状谱可以同时或以任何次序相继地确定。

在某些实施方案中，将样品分类为IBS样品或非IBS样品基于单独或与症状谱组合的诊断标记谱、以及统计学算法。在一些情况下，统计学算法是学习统计学分类器***。学习统计学分类器***可以选自随机森林（RF）、分类回归树（C&RT）、boosted树、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）、一般卡方自动交互式检测器模型（general chi-squaredautomatic interaction detector model）、交互树（interactive tree）、多元自适应回归样条(mutiadaptive regression spline)、机器学习分类器、及其组合。优选地，学习统计学分类器***是基于树的统计学算法（例如RF，C&RT等）和/或NN（例如人工NN等）。

在一些情况下，统计学算法是单个学***（即诊断标记谱），单独地或与至少一种症状的存在或严重性（即症状谱）组合，用于将样品分类为IBS样品或非IBS样品。单个学习统计学分类器***的使用一般将样品分类为IBS样品，具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度。

在一些其他情况下，统计学算法是至少2种学***行使用的，RF和NN。作为非限制性例子，基于单独或与症状谱组合的诊断标记谱，RF可以首先用于生成预测或概率值，然后基于预测或概率值以及相同或不同诊断标记谱或谱的组合，NN可以用于将样品分类为IBS样品或非IBS样品。有利地，本发明的该杂合RF/NN学习统计学分类器***可以将样品分类为IBS样品，具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度。

在某些情况下，由使用学***行或系列方式使用此类数据处理算法的组合。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将非IBS样品分类为正常、炎性肠病（IBD）、或非IBD样品。非IBS样品的分类可以例如使用上述诊断标记中的至少一种执行。

在一些其他实施方案中，本发明的方法进一步包括将IBS分类结果发送给临床医生，例如胃肠病学家或一般从业者。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了以个体患IBS的概率的形式给出的诊断。例如，个体可以具有约0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大的罹患IBS的概率。在另外一个实施方案中，本发明的方法进一步提供了个体中IBS的预后。例如，预后可以是手术、一类或一个亚型的IBS的发展、一种或多种症状的发展、或从疾病恢复。

在某些实施方案中，在个体诊断为具有IBS后，给个体施用治疗有效量的可以用于治疗与IBS相关的一种或多种症状的药物。合适的IBS药物包括但不限于5－羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、氯离子通道阻断剂、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类激动剂、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、GLP-1类似物、CRF拮抗剂、益生菌、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。其他IBS药物包括膨胀剂、多巴胺拮抗剂、祛风剂、镇静剂、右托非索泮(dextofisopam)、苯妥英（phenytoin）、噻吗洛尔(timolol)和地尔硫卓(diltiazem)。另外，可以施用通过影响神经元或神经胶质细胞的信号传导来调节肠透过性的氨基酸，如谷氨酰胺和谷氨酸，以治疗具有IBS的患者。

在其他实施方案中，本发明的方法进一步包括将IBS样品分类为IBS-便秘型（IBS-C）、IBS-腹泻型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）、IBS-交替型（IBS-A）、或感染后IBS（IBS-PI）样品。在一些情况下，基于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种分类标记的存在或水平，将IBS样品分类成IBS的类、形式或临床亚型。分类标记的非限制性例子在下文描述。优选地，基于瘦素的存在或水平，将至少一种形式的IBS与至少一种其他形式的IBS区分。在一些情况下，本发明的方法可以用于在先前鉴定为具有IBS的个体中区分IBS-C样品与IBS-A和/或IBS-D样品。在一些其他情况下，本发明的方法可以用于将来自先前未诊断有IBS的个体的样品分类为IBS-A样品、IBS-C样品、IBS-D样品或非IBS样品。

在一些实施方案中，该方法进一步包括将来自分类的结果发送给临床医生。在特定其他实施方案中，该方法进一步提供以个体具有IBS-A、IBS-C、IBS-D、IBS-M或IBS-PI的概率的形式给出的诊断。本发明的方法可以进一步包括给个体施用治疗有效量的用于治疗IBS-A、IBS-C、IBS-D、IBS-M或IBS-PI的药物。合适药物包括但不限于替加色罗（tegaserod,Zelnorm）、阿洛司琼（alosetron,

）、鲁比前列酮（lubiprostone,Amitiza）、利福昔明（rifamixin,Xifaxan）、MD-1100、益生菌及其组合。在样品分类为IBS-A或IBS-C样品和/或个体诊断有IBS-A或IBS-C的情况下，治疗有效剂量的替加色罗或其他5-HT₄激动剂（例如莫沙必利（mosapride）、伦扎必利(renzapride)、AG1-001等）可以施用于个体。在某些情况下，当样品分类为IBS-C和/或个体诊断有IBS-C时，治疗有效量的鲁比前列酮或其他氯离子通道激活物、利福昔明或能够控制肠细菌过度生长的其他抗生素、MD-1100或其他鸟苷酸环化酶激动剂、阿西马朵林(asimadoline)或其他阿片类激动剂、或他尔奈坦(talnetant)或其他神经激肽拮抗剂可以施用于个体。在其他情况下，当样品分类为IBS-D和/或个体诊断有IBS-D时，治疗有效量的阿洛司琼或其他5-HT₃拮抗剂（例如雷莫司琼(ramosetron)、DDP-225等）、crofelemer或其他氯离子通道阻断剂、他尔奈坦或其他神经激肽拮抗剂（例如沙瑞度坦(saredutant)等）、或抗抑郁药例如三环抗抑郁药可以施用于个体。

在另外的实施方案中，本发明的方法进一步包括排除肠炎症。肠炎症的非限制性例子包括急性炎症、憩室炎(diverticulitis)、回肠袋肛管吻合术(ileal pouch-anal anastomosis)、显微镜结肠炎（microscopic colitis）、感染性腹泻及其组合。在某些情况下，基于C-反应蛋白（CRP）、乳铁蛋白、钙防卫蛋白或其组合的存在或水平，排除肠炎症。

B.监控IBS

在另一个方面，本发明提供了用于监控受试者中肠易激综合征（IBS）的进展或消退的方法，所述方法包括：（a）从在第一时间点得自受试者的第一生物学样品，确定第一生物标记谱；（b）从在第二时间点得自受试者的第二生物学样品，确定第二生物标记谱；和（c）比较所述第一和所述第二生物标记谱，以（i）确定哪个生物标记谱最类似于或最不类似于与IBS相关的第一参考谱，（ii）确定哪个生物标记谱最不类似于或最类似于与不存在IBS相关的第二参考谱，或（iii）确定前述相似性中的至少2个，其中所述生物标记谱包含表4中的至少2种生物标记的表达信息，从而监控所述受试者中IBS的进展或消退。在另一个实施方案中，生物标记谱包含表6中的至少2种生物标记的表达信息，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40种。在一个优选的实施方案中，生物标记谱包含表7中的至少2种生物标记的表达信息，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或26种。

在本发明的某些实施方案中，IBS RNA生物标记是mRNA或表达的非编码RNA。在特定实施方案中，该方法包括检测表4中的至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70种或更多种基因。在另一个优选实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表6中基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40种。在一个更优选的实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表7中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或26种。

在本发明的一个实施方案中，IBS RNA生物标记是编码具有SEQ IDNOS:1-75和154–162之任一的氨基酸序列的蛋白质的mRNA分子。在另一个实施方案中，IBS RNA生物标记是包含SEQ ID NOS:76–153之任一的核酸序列的RNA分子。

在一个特定实施方案中，IBS RNA生物标记是由选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3的基因转录的RNA分子。在一个优选实施方案中，基因是CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A或GNG3。在另一个实施方案中，用于监控受试者中IBS的进展或消退的方法包括检测一组至少约5种生物标记。在一个优选实施方案中，标记包含CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3。

在特定实施方案中，检测试剂包含寡核苷酸，并且检测复合物（例如经由转化）水平的步骤包括寡核苷酸杂交（例如基于微阵列或珠的杂交试验、xMAP试验、RNA印迹、斑点印迹、RNA酶保护试验等）和/或核酸扩增（例如PCR、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR、质谱法等）。在另外其他实施方案中，检测试剂是抗体，并且确定样品中复合物（例如经由转化）水平的方法包括免疫化学试验（即，免疫荧光测定试验、ELISA、IFA等）。

用于检测或确定至少一种诊断标记的存在或水平的样品一般是全血、血浆、血清、唾液、尿、大便（即粪便）、泪及任何其他体液、或组织样品（即活检组织）例如小肠或结肠样品。优选地，样品是血清、全血、血浆、大便、尿或组织活检物。在特定情况下，本发明的方法进一步包括在检测或确定样品中至少一种诊断标记的存在或水平前从个体中获得样品。

在特定实施方案中，本发明的方法包括确定RNA IBS生物标记谱，与另外的蛋白质或血清学IBS生物标记组合。在某些实施方案中，该另外的诊断标记谱通过检测至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种另外的诊断标记的存在或水平来确定，其中所述另外的诊断标记选自表2中的那些、于2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524、于2009年6月25日提交的美国临时申请序列号61/220,525、和于2009年10月30日提交的美国临时申请序列号61/256,717中的那些。

在某些实施方案中，可以构建用于测量上述诊断标记中的一种或多种的一个组，并用于监控受试者中IBS的进展或消退。本领域技术人员可以理解，使用例如个体样品的等分试样或稀释物，多种诊断标记的存在或水平可以同时或相继确定。在特定情况下，在个体的样品中特定诊断标记的水平可以视为升高的，当它比可比较的样品（例如正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品）或样品群体（例如大于可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中相同标记的中值水平）中相同标记的水平大至少约25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%时。

在一个方面，用于监控受试者中肠易激综合征（IBS）的进展或消退的方法包括：在第一个时间点和第二个时间点确定一种或多种生物标记的水平或谱，且比较所述水平或谱。在一个实施方案中，其中生物标记的升高水平或表达与IBS相关，与在第一个时间得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在第二个时间得自受试者的样品中生物标记水平的降低，指示受试者中IBS的消退。在另一个实施方案中，其中生物标记的升高水平或表达与IBS相关，与在第一个时间得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在第二个时间得自受试者的样品中生物标记水平的增加，指示受试者中IBS的进展。

在特定其他情况下，在个体的样品中特定诊断标记的水平可以视为减少的，当它比可比较样品（例如正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品）或样品群体（例如小于可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中相同标记的中值水平）中相同标记的水平小至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时。

在另一个实施方案中，其中生物标记的减少水平或表达与IBS相关，与在第一个时间得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在第二个时间得自受试者的样品中生物标记水平的增加，指示受试者中IBS的消退。在另一个实施方案中，其中生物标记的减少水平或表达与IBS相关，与在第一个时间得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在第二个时间得自受试者的样品中生物标记水平的降低，指示受试者中IBS的进展。

在另外其他实施方案中，IBS标记视为差异表达的，当相对于可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中的相同标记，其log2倍数变化的量值（即正或负值）是至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更大时。在一个优选实施方案中，差异表达的IBS生物标记的量值是至少约1.0、更优选至少约1.5、且最优选至少约2.5。

在某些实施方案中，监控受试者中IBS的进展或消退的方法包括：确定诊断标记谱，任选地与症状谱组合，其中症状谱通过鉴定在第一个时间点在个体中至少一种症状的存在或严重性而确定；鉴定在第二个时间点在个体中至少一种症状的存在或严重性；比较在所述第一个时间点和所述第二个时间点该至少一种症状谱的存在或严重性；使用基于诊断标记谱和症状谱的算法，确定在个体中是否已存在IBS的进展或消退。本领域技术人员将理解，诊断标记谱和症状谱可以同时或以任何次序相继确定。

在某些实施方案中，监控受试者中IBS的进展或消退的方法包括：确定诊断标记谱，任选地与症状谱组合，其中症状谱通过鉴定在个体中至少一种症状的存在或严重性而确定；和使用基于诊断标记谱和症状谱的算法，将样品分类为IBS样品或非IBS样品。本领域技术人员理解，诊断标记谱和症状谱可以同时或以任何次序相继确定。

在某些实施方案中，监控受试者中IBS的进展或消退的方法基于与统计学算法结合的诊断标记谱（单独或与症状谱组合）。在特定情况下，统计学算法是学习统计学分类器***。学习统计学分类器***可以选自随机森林（RF）、分类回归树（C&RT）、boosted树、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）、一般卡方自动交互式检测器模型、交互树、多元自适应回归样条、机器学习分类器、及其组合。优选地，学习统计学分类器***是基于树的统计学算法（例如RF，C&RT等）和/或NN（例如人工NN等）。

在特定情况下，统计学算法是单个学***（即诊断标记谱），单独地或与至少一种症状的存在或严重性（即症状谱）组合，单个学习统计学分类器***可以用于监控受试者中IBS的进展或消退。单个学习统计学分类器***的使用一般将样品分类为进展的或消退的IBS样品，具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度。

在特定其他情况下，统计学算法是至少2种学***行使用的RF和NN。作为非限制性例子，基于单独或与症状谱组合的诊断标记谱，RF可以首先用于生成预测或概率值，并且基于预测或概率值以及相同或不同诊断标记谱或谱的组合，NN随后可以用于确定样品是否对应于IBS的进展或消退。有利地，本发明的杂合RF/NN学习统计学分类器***将样品分类为进展或消退IBS样品，具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度。

在某些情况下，由使用一种或多种学***行或系列方式使用此类数据处理算法的组合。

在特定其他实施方案中，本发明的方法进一步包括将IBS分类结果发送给临床医生，例如胃肠病学家或一般从业者。在另一个实施方案中，本发明的方法以IBS在受试者中正在进展或消退的概率的形式提供诊断。例如，个体可以具有约0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大的概率具有正在进展或消退的IBS。在另外一个实施方案中，本发明的方法进一步提供了个体中IBS的预后。例如，预后可以是手术、一类或一个临床亚型的IBS的发展、一种或多种症状的发展、或从疾病恢复。

在某些实施方案中，个体诊断为具有IBS后，给个体施用治疗有效量的用于治疗与IBS相关的一种或多种症状的药物。合适的IBS药物包括但不限于5－羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、氯离子通道阻断剂、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类激动剂、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、GLP-1类似物、CRF拮抗剂、益生菌、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。其他IBS药物包括膨胀剂、多巴胺拮抗剂、祛风剂、镇静剂、右托非索泮(dextofisopam)、苯妥英（phenytoin）、噻吗洛尔(timolol)和地尔硫卓(diltiazem)。另外，可以施用通过影响神经元或神经胶质细胞的信号传导来调节肠透过性的氨基酸，如谷氨酰胺和谷氨酸，以治疗具有IBS的患者。

本发明的方法可以进一步包括给个体施用治疗有效量的用于治疗IBS-A、IBS-C、IBS-D、IBS-M或IBS-PI的药物。合适药物包括但不限于替加色罗（Zelnorm）、阿洛司琼鲁比前列酮（Amitiza）、利福昔明（Xifaxan）、MD-1100、益生菌及其组合。在其中样品分类为IBS-A或IBS-C样品和/或个体诊断有IBS-A或IBS-C的情况下，治疗有效剂量的替加色罗或其他5-HT4激动剂（例如莫沙必利、伦扎必利、AG1-001等）可以施用于个体。在某些情况下，当样品分类为IBS-C和/或个体诊断有IBS-C时，治疗有效量的鲁比前列酮或其他氯离子通道激活物、利福昔明或能够控制肠细菌过度生长的其他抗生素、MD-1100或其他鸟苷酸环化酶激动剂、阿西马朵林或其他阿片类激动剂、或他尔奈坦或其他神经激肽拮抗剂可以施用于个体。在其他情况下，当样品分类为IBS-D和/或个体诊断有IBS-D时，治疗有效量的阿洛司琼或其他5-HT3拮抗剂（例如雷莫司琼、DDP-225等）、crofelemer或其他氯离子通道阻断剂、他尔奈坦或其他神经激肽拮抗剂（例如沙瑞度坦等）、或抗抑郁药例如三环抗抑郁药可以施用于个体。

在一个实施方案中，用于监控IBS的进展或消退的方法可以包括监控已施用IBS治疗的受试者，例如在第一生物学样品收集和第二生物学样品收集之间的间隔时间中已施用IBS治疗的受试者。相应地，在一个实施方案中，用于监控IBS的进展或消退的方法用于评价IBS治疗的临床功效。

在一个实施方案中，其中生物标记的升高水平或表达与IBS相关，与在治疗施用前的时间点得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在IBS治疗施用后的时间点得自受试者的样品中生物标记水平的降低，指示有治疗功效。在另一个实施方案中，其中生物标记的升高水平或表达与IBS相关，与在治疗施用前的时间点得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在IBS治疗施用后的时间点得自受试者的样品中生物标记水平的增加，指示缺乏治疗功效。

在另一个实施方案中，其中生物标记的减少水平或表达与IBS相关，与在治疗施用前的时间点得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在IBS治疗施用后的时间点得自受试者的样品中生物标记水平的增加，指示有治疗功效。在另外一个实施方案中，其中生物标记的减少水平或表达与IBS相关，与在治疗施用前的时间点得自受试者的样品中生物标记的表达相比较，在IBS治疗施用后的时间点得自受试者的样品中生物标记水平的减少，指示治疗功效的缺乏。

在确定IBS治疗在受试者中的功效后，在受试者响应治疗的情况下，该方法可以进一步包括治疗的继续施用，或在受试者不响应治疗的情况下，该方法可以包括对受试者中断、改变治疗和/或施用可替代治疗。

C.分配IBS治疗

在另一个方面，本发明提供了用于向有需要的受试者分配IBS治疗的方法，该方法包括：（a）从得自受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA；（b）在适合于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；（c）检测复合物的水平；（d）确定复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是与不存在IBS相关的第二参考水平；和（e）如果所述水平更紧密地类似于与IBS相关的所述第一参考水平，那么分配IBS治疗，其中IBSRNA生物标记选自表4中的那些。在一个优选实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表6中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40种。在一个更优选的实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表7中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或26种。

在本发明的某些实施方案中，IBS RNA生物标记是mRNA或表达的非编码RNA。在特定实施方案中，该方法包括检测表4中的至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70种或更多种基因。在一个优选实施方案中，该方法包括检测表6中的至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40种基因。在一个优选实施方案中，RNA生物标记（一种或多种）为表6中的基因，例如至少1、至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40种。在一个更优选的实施方案中，该方法包括检测表7中的至少2或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25种或所有26种基因。

在本发明的一个实施方案中，IBS RNA生物标记是编码具有SEQ IDNOS:1-75和154-162中任何一个的氨基酸序列的蛋白质的mRNA分子。在另一个实施方案中，IBS RNA生物标记是包含SEQ ID NOS:76-153中任何一个的核酸序列的RNA分子。

在一个特定实施方案中，IBS RNA生物标记是由选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3的基因转录的RNA分子。在一个优选实施方案中，基因是CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A或GNG3。在另一个实施方案中，用于向有需要的受试者分配IBS治疗的方法包括检测一组至少约5种生物标记。在一个优选实施方案中，标记包含CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3。

在特定实施方案中，检测试剂包含寡核苷酸，并且检测复合物（例如经由转化）水平的步骤包括寡核苷酸杂交（例如基于微阵列或珠的杂交试验、xMAP试验、RNA印迹、斑点印迹、RNA酶保护试验等）和/或核酸扩增（例如PCR、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR、质谱法等）。在另外其他实施方案中，检测试剂是抗体，并且确定样品中复合物（例如经由转化）水平的方法包括免疫化学测定试验（即，免疫荧光测定试验、ELISA、IFA等）。

用于检测或确定至少一种诊断标记的存在或水平的样品一般是全血、血浆、血清、唾液、尿、大便（即粪便）、泪及任何其他体液、或组织样品（即活检组织）例如小肠或结肠样品。优选地，样品是血清、全血、血浆、大便、尿或组织活检物。在特定情况下，本发明的方法进一步包括在检测或确定样品中至少一种诊断标记的存在或水平前从个体中获得样品。

在特定实施方案中，本发明的方法包括确定RNA IBS生物标记谱，与另外的蛋白质或血清学IBS生物标记组合。在某些实施方案中，该另外的诊断标记谱通过检测至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种另外的诊断标记的存在或水平来确定，所述另外的诊断标记选自表2中的那些、于2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524、于2009年6月25日提交的美国临时申请序列号61/220,525、和于2009年10月30日提交的美国临时申请序列号61/256,717中的那些。

在某些实施方案中，可以构建用于测量上述一种或多种诊断标记的一个组，且用于向有需要的受试者分配IBS治疗。本领域技术人员理解，使用例如个体样品的等分试样或稀释物，多种诊断标记的存在或水平可以同时或相继确定。在特定情况下，在个体的样品中特定诊断标记的水平可以视为升高的，当它大于可比较样品（例如正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品）或样品群体（例如大于可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中相同标记的中值水平）中相同标记的水平至少约25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%时。在特定其他情况下，在个体的样品中特定诊断标记的水平可以视为减少的，当它小于可比较样品（例如正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品）或样品群体（例如小于可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中相同标记的中值水平）中相同标记的水平至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%时。在另外其他实施方案中，IBS标记视为差异表达的，当相对于在可比较的正常、GI对照、IBS、IBD和/或乳糜泻样品群体中的相同标记，其log2倍数变化的量值（即正或负值）是至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更大时。在一个优选实施方案中，差异表达的IBS生物标记的量值是至少约1.0、更优选至少约1.5、且最优选至少约2.5。

在某些实施方案中，用于分配IBS治疗的方法包括确定诊断标记谱，任选地与症状谱组合，其中症状谱通过鉴定个体中至少一种症状的存在或严重性而确定；并且使用基于诊断标记谱和症状谱的算法，分配IBS治疗。本领域技术人员理解，诊断标记谱和症状谱可以同时或以任何次序相继确定。

在某些实施方案中，分配IBS治疗基于与统计学算法结合的、单独或与症状谱组合的诊断标记谱。在特定情况下，统计学算法是学习统计学分类器***。学习统计学分类器***可以选自随机森林（RF）、分类回归树（C&RT）、boosted树、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）、一般卡方自动交互式检测器模型、交互树、多元自适应回归样条、机器学习分类器、及其组合。优选地，学习统计学分类器***是基于树的统计学算法（例如RF，C&RT等）和/或NN（例如人工NN等）。

在一些情况下，统计学算法是单个学***（即诊断标记谱），单独地或与至少一种症状的存在或严重性（即症状谱）组合，用于分配IBS治疗。单个学习统计学分类器***的使用一般将样品分类为IBS样品，具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度。

在一些其他情况下，统计学算法是至少2种学***行使用的，RF和NN。作为非限制性例子，基于单独或与症状谱组合的诊断标记谱，RF可以首先用于生成预测或概率值，然后基于预测或概率值以及相同或不同诊断标记谱或谱的组合，NN可以用于分配IBS治疗。有利地，本发明的该杂合RF/NN学习统计学分类器***可以将样品分类为IBS样品，具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度。

在某些情况下，由使用学***行或系列方式使用此类数据处理算法的组合。

在一些其他实施方案中，本发明的方法进一步包括将治疗的分配结果发送给临床医生，例如胃肠病学家或一般从业者。在另一个实施方案中，本发明的方法以个体将响应所分配的特定治疗的概率的形式提供治疗分配。例如，个体可以具有约0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大的响应该治疗的概率。在另外一个实施方案中，本发明的方法进一步提供了个体中治疗的预后。例如，预后可以是手术、一类或一个亚型的IBS的发展、一种或多种症状的发展、IBS消退、IBS进展、或从疾病恢复。

在某些实施方案中，在分配治疗后，给个体施用治疗有效量的可以用于治疗与IBS相关的一种或多种症状的药物（即，施用所分配的治疗）。合适的IBS药物包括但不限于5－羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、氯离子通道阻断剂、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类激动剂、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、GLP-1类似物、CRF拮抗剂、益生菌、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。其他IBS药物包括膨胀剂、多巴胺拮抗剂、祛风剂、镇静剂、右托非索泮(dextofisopam)、苯妥英（phenytoin）、噻吗洛尔(timolol)和地尔硫卓(diltiazem)。另外，可以施用通过影响神经元或神经胶质细胞的信号传导来调节肠透过性的氨基酸，如谷氨酰胺和谷氨酸，以治疗具有IBS的患者。

在其他实施方案中，本发明的方法进一步包括将IBS样品分类为IBS-便秘型（IBS-C）、IBS-腹泻型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）、IBS-交替型（IBS-A）、或感染后IBS（IBS-PI）样品。在一些情况下，基于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种分类标记的存在或水平，将IBS样品分类成IBS的类、形式或临床亚型。分类标记的非限制性例子在下文描述。优选地，基于瘦素的存在或水平，将至少一种形式的IBS与至少一种其他形式的IBS区分。在一些情况下，本发明的方法可以用于在先前鉴定为具有IBS的个体中区分IBS-C样品与IBS-A和/或IBS-D样品。在一些其他情况下，本发明的方法可以用于将来自先前未诊断有IBS的个体的样品分类为IBS-A样品、IBS-C样品、IBS-D样品或非IBS样品。

在一些实施方案中，该方法进一步包括将来自分类的结果发送给临床医生。在特定其他实施方案中，该方法进一步以个体具有IBS-A、IBS-C、IBS-D、IBS-M或IBS-PI的概率的形式提供诊断。本发明的方法可以进一步包括给个体施用治疗有效量的用于治疗IBS-A、IBS-C、IBS-D、IBS-M或IBS-PI的药物。合适药物包括但不限于替加色罗（tegaserod,Zelnorm）、阿洛司琼（alosetron,

）、鲁比前列酮（lubiprostone,Amitiza）、利福昔明（rifamixin,Xifaxan）、MD-1100、益生菌及其组合。在样品分类为IBS-A或IBS-C样品和/或个体诊断有IBS-A或IBS-C的情况下，治疗有效剂量的替加色罗或其他5-HT₄激动剂（例如莫沙必利（mosapride）、伦扎必利(renzapride)、AG1-001等）可以施用于个体。在某些情况下，当样品分类为IBS-C和/或个体诊断有IBS-C时，治疗有效量的鲁比前列酮或其他氯离子通道激活物、利福昔明或能够控制肠细菌过度生长的其他抗生素、MD-1100或其他鸟苷酸环化酶激动剂、阿西马朵林(asimadoline)或其他阿片类激动剂、或他尔奈坦(talnetant)或其他神经激肽拮抗剂可以施用于个体。在其他情况下，当样品分类为IBS-D和/或个体诊断有IBS-D时，治疗有效量的阿洛司琼或其他5-HT₃拮抗剂（例如雷莫司琼(ramosetron)、DDP-225等）、crofelemer或其他氯离子通道阻断剂、他尔奈坦或其他神经激肽拮抗剂（例如沙瑞度坦(saredutant)等）、或抗抑郁药例如三环抗抑郁药可以施用于个体。

D.症状谱的确定

症状谱一般通过鉴定选自下述的至少一种症状的存在或严重性进行确定：胸痛、胸痹、胃灼热、在进食分量适中的膳食后不舒服的饱胀感、不能完成适中分量的膳食、腹痛、腹部不适、便秘、腹泻、胀气、腹膨胀、与具有疼痛或不适相关的负面想法或感觉、及其组合。

在优选实施方案中，鉴定本文描述的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种症状的存在或严重性，以生成症状谱，其可以用于诊断IBS、归入IBS、排除IBD、预测IBS、监控IBS的进展或消退、提供关于IBS的预后、分配用于IBS的治疗等。在特定情况下，问卷或其他形式的书面、口头或电话调查用于产生症状谱。问卷或调查一般包含一组标准化的问题和答案用于自应答者收集有关其目前和/或近期IBS相关症状的信息。例如，来自美国专利公开号2008/0085524的实施例13提供了示例性问题，其可以包括在问卷中，用于鉴定个体中一种或多种IBS相关症状的存在或严重性。

在特定实施方案中，通过汇编和/或分析针对问卷或调查中给出的问题的所有或部分答案，产生症状谱。在特定其他实施方案中，基于个体对下述问题的回答，产生症状谱：“你目前正在经历任何症状吗？”依照这些实施方案任一生成的症状谱可以在本文描述的基于算法的方法中与诊断标记谱组合使用，以改善诊断IBS、归入IBS、排除IBD、预测IBS、监控IBS的进展或消退、提供关于IBS的预后、分配用于IBS的治疗等的准确度。

IV.诊断标记

如本文提供的，鉴定了66种基因，其转录物于至少20%的样品中被检测到在IBS和正常受试者之间改变大于2倍。在IBS中最显著升高的转录物有与疼痛、炎症和肠通透性相关的基因，包括TACR2、SH3GRL3、MICALL1、Rab7L1、VIPR1。TACR2是速激肽神经肽K物质（神经激肽A）的受体。它与G蛋白偶联，激活磷脂酰肌醇-钙第二信使***。Ibodutant是目前处于IBS的II期临床试验中的速激肽NK2受体（TACR2）拮抗剂。5-羟色胺通过介导神经元兴奋而触发兔回肠的收缩。神经激肽（NK1和NK2）受体的拮抗剂可以部分地阻断该5-羟色胺反应。VIPR1是VIP的受体。该受体的活性由激活腺苷酸环化酶的G蛋白介导。VIP浓度在IBS患者的血清中是升高的。另一种有意义的DEG是MICALL1，其是与Rab13结合的细胞支架调节物。已报道，MICALL1/Rab13相互作用参与整联蛋白至细胞表面的运输。整联蛋白是在炎症状况下白细胞浸润肠的重要介质。增加的白细胞浸润已在IBS患者亚组中观察到。虽然这些以上基因可能具有与IBS的生物学相关性，但鉴定到具有未知生物学功能的其他DEGs，例如CCDC147是具有未定义的生物学功能的含卷曲螺旋的蛋白质。因为IBS是复杂疾病并且其病因学有待确定，所以此类基因可以保证用于IBS调查的未来研究。相同家族中的许多其他基因的未改变水平暗示，那些途径的特异性，而不是全体，激活是IBS外周血中该疾病标签的重要部分。

IBS不伴有可以定义其存在的任何确定的生物化学、结构或血清学异常。IBS的标志特征是与改变的排便习惯相关的腹痛或不适，并且常常地，腹痛促使患者寻求医疗护理。因为IBS的症状是许多其他GI状况共有的，所以IBS长期被视为“排除性诊断”，导致具有特征性症状的患者的过度检查。幸运的是，研究中的进展已增加了对IBS病理生理学的了解，这使得可以开发生物学相关的生物标记和开发一致的指导原则，支持主要基于在IBS患者中参与疾病和转录物改变的途径进行的IBS阳性诊断。具有生物学相关性的基因表达生物标记例如TACR2和VIPR1的鉴定将进一步增强IBS发病机理的了解。

本文提供的由外周血细胞鉴定的生物标记与使用肠活检组织鉴定的已公开的生物标记并不重叠。依赖替代终点或推定的替代物的一般局限性在于，“替代标记”可能缺乏生物学相关性。作为例子，在外周血细胞中TACR2的表达变化可能与肠组织中，特别是肠神经元细胞（在此处，疼痛应答被起始和传递）中，TACR2表达的变化无关。尽管使用肠组织的基因表达谱分析是用于预测IBS的更佳量度，但对于IBS诊断，这不是一个可行的检查。未来研究可以使用匹配的外周血和肠活检组织进行，以比较所选基因的表达。

在起始的基因芯片研究中，仅使用IBS-C和IBS-D患者样品（实施例2）。所选基因使用qPCR在IBS-M患者样品中进行验证（实施例5）。单个基因的相对表达在IBS的3个亚型中不同，大多数DEGs的总体模式在3个亚型中是一致的。因为IBS亚型的临床分配根据腹泻、便秘或混合类型的症状是直接而简单的，所以本研究的焦点是鉴定在所有3个亚型中均被调节的基因。

IBS具有诊断挑战性，因为症状与其他GI病症，例如炎性肠病、乳糜泻、胆道疾病、消化性溃疡病、结直肠癌，的症状重叠。共病进一步使诊断复杂化。“黄金标准”的缺乏已使得非常难以开发诊断检查。在本文提供的实施例中，由专门从事IBS诊断和治疗的带头GI医生收集样品。为了避免可能与共病相关的混淆标记，除去具有其他GI病症和精神病的患者。用于这个研究的样品来自“同质”IBS患者群体。

因为临床药物基因组分析获得承认且在临床试验中变得越来越平常，所以越来越明显地，微阵列将常规地用作诊断设备。一个重要问题是：建立慎密的基于数字的方法用于报道来自诊断试验的表达模式结果、以及如何计算和报道该模式的相关参考范围。在一个实施方案中，加权表决法可以用于将来自许多基因的表达模式结果瓦解(collapse)成单一数值置信度得分。一个重要优点是，它可以报道预测性强度得分，指示对每个患者预测的置信度。以后，可以针对正确诊断的患者和正确非诊断的无疾病个体的累积库，计算收集的平均置信度得分，并且可以报道所讨论的特定预测性基因集诊断的参考范围值。

如此，在一个实施方案中，本发明确立，在IBS患者的外周血中存在疾病相关的基因标签。这可能是因为血液作全身循环，所以它们的表达谱可以充当疾病和健康的灵敏指示器以及生理学监测器。

A.RNA标记

多种诊断标记适合于在本发明的方法、***和代码中使用，用于将来自个体的样品分类为IBS样品或用于在来自个体的样品中排除与IBS样症状相关的一种或多种疾病或病症。诊断标记的例子包括但不限于在IBS或IBS亚型中差异表达的任何基因、表达的RNAs或蛋白质，例如表1、表4、表5、表6或表7中的那些。在一个特定实施方案中，在本发明的方法、***和代码中有用的诊断标记是表1中的基因、表达的RNA或蛋白质。在一个优选实施方案中，在本发明的方法、***和代码中有用的诊断标记是表6中的基因、表达的RNA或蛋白质。在一个更优选的实施方案中，在本发明的方法、***和代码中有用的诊断标记是表7中的基因、表达的RNA或蛋白质。在本发明的一个实施方案中，生物标记是编码具有SEQ IDNOS:1-75和154-162中任何一个的氨基酸序列的蛋白质的mRNA分子。在一个相关实施方案中，生物标记是包含SEQ ID NOS:76-153中任何一个的核酸序列的RNA分子。

在本发明的一个优选实施方案中，IBS RNA生物标记包含由选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3的基因表达的RNA（例如mRNA）。在一个相关实施方案中，生物标记可以是由选自表4的基因编码的蛋白质或多肽。在一个优选实施方案中，生物标记可以是由选自表6的基因编码的蛋白质或多肽。在一个更优选的实施方案中，生物标记可以是由选自表7的基因编码的蛋白质或多肽。在一个特定实施方案中，蛋白质由选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3的基因编码。

在一个最优选实施方案中，本发明的生物标记由选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3的基因编码。在一个实施方案中，本发明的方法包括检测CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3中的至少2、3、4种或所有。在特定实施方案中，生物标记是RNA（例如mRNA）。在其他实施方案中，生物标记是由IBS RNA生物标记编码的蛋白质或多肽。

1.CCDC147含卷曲螺旋结构域147（CCDC147）

CCDC147是由CCDC147基因（Entrez GeneID:159686；NM_001008723（SEQ ID NO:75））编码的104kDa蛋白质（NP_001008723（SEQ ID NO:144））。关于CCDC147的生物学知之甚少。来自具有IBS的98个患者的外周血样品的qRT-PCR验证性研究指示，CCDC147对于IBS且特别是IBS-D亚型具有高度预测性（实施例4）。在特定实施方案中，CCDC147和/或编码CCDC147的mRNA是IBS的有用生物标记。

在一些情况下，使用试验例如杂交试验、基于扩增的试验，例如qPCR试验、RT-PCR试验、或基于质谱法的试验，在mRNA表达水平上，检测CCDC147或其前体的存在或水平（例如经由转化）。在一些其他情况下，，使用例如免疫试验（例如ELISA）、免疫组织化学试验、或基于质谱法的试验，在蛋白质表达水平上检测CCDC147的存在或水平（例如经由转化）。

2.血管活性肠肽受体1（VIPR1）

VIPR1是与血管活性肠肽（VIP）相互作用的7跨膜结构域神经肽受体。VIPR1在许多组织，包括脑、外周血白细胞和小肠中发现。值得注意的是，VIP诱导平滑肌松弛，抑制胃酸分泌和自肠腔的吸收，且刺激水分泌到胰液和胆汁内。VIPR1是由血管活性肠肽受体1基因（Entrez GeneID:7433；NM_004624（SEQ ID NO:58））编码的48.5kDa跨膜蛋白质，并且在血管活性肠肽受体1前体多肽（NP_004615（SEQ ID NO:127））加工后产生。来自具有IBS的98个患者的外周血样品的qRT-PCR验证性研究指示，VIPR1对IBS且特别是IBS-D亚型具有高度预测性（实施例4）。在特定实施方案中，VIPR1、VIPR1前体蛋白质和/或编码VIPR1的mRNA是IBS的有用生物标记。

在一些情况下，用试验例如杂交试验、基于扩增的试验例如qPCR试验、RT-PCR试验、或基于质谱法的试验，在mRNA表达水平上（例如经由转化），检测VIPR1的存在或水平。在一些其他情况下，使用例如免疫试验（例如ELISA）、免疫组织化学试验、或基于质谱法的试验，在蛋白质表达水平上，检测VIPR1或其前体的存在或水平。用于确定血清、血浆、唾液或尿样品中VIPR1的存在或水平的合适ELISA试剂盒可从例如Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）、US Biological（Swampscott，MA）、和Novus Biologicals（Littleton，CO）获得。

3.溶血磷脂酸受体5（GPR98；LPAR5）

LPAR5是7跨膜结构域G蛋白偶联受体，其通过异源三聚体G蛋白将细胞外信号从溶血磷脂酸传递给细胞。LPAR5与许多发信号分子相互作用，包括法尼基焦磷酸（FPP）、N-花生四烯酰基甘氨酸（NAG）和溶血磷脂酸。LPAR是41.3kDa跨膜蛋白质（NP_065133（SEQ ID NOS:84和85）），由溶血磷脂酸受体5基因（Entrez GeneID:57121；NM_020400（SEQ ID NO:9）；NM_001142961（SEQ ID NO:10））编码。来自具有IBS的98个患者的外周血样品的qRT-PCR验证性研究指示，LPAR5对IBS且特别是IBS-D亚型具有高度预测性（实施例4）。在特定实施方案中，LPAR5和/或编码LPAR5的mRNA是IBS的有用生物标记。

在一些情况下，用试验例如杂交试验、基于扩增的试验例如qPCR试验、RT-PCR试验、或基于质谱法的试验，在mRNA表达水平上（例如经由转化），检测LPAR5或其前体的存在或水平。在一些其他情况下，使用例如免疫试验（例如ELISA）、免疫组织化学试验、或基于质谱法的试验，在蛋白质表达水平上，检测LPAR5的存在或水平。用于确定血清、血浆、唾液或尿样品中LPAR5的存在或水平的合适ELISA试剂盒可从例如Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）、Abcam（Cambridge，MA）、和Novus Biologicals（Littleton，CO）获得。

4.含卷曲螺旋结构域144A（CCDC144A）

CCDC144A是由CCDC147基因（Entrez GeneID:9720；NM_014695（SEQ ID NO:28））编码的165kDa蛋白质（NP_055510（SEQ IDNO:103））。关于CCDC144A的生物学知之甚少。来自具有IBS的98个患者的外周血样品的qRT-PCR验证性研究指示，CCDC144A对于IBS且特别是IBS-D亚型具有高度预测性（实施例4）。在特定实施方案中，CCDC144A和/或编码CCDC144A的mRNA是IBS的有用生物标记。

在一些情况下，用试验例如杂交试验、基于扩增的试验例如qPCR试验、RT-PCR试验、或基于质谱法的试验，在mRNA表达水平上（例如经由转化），检测CCDC144A或其前体的存在或水平。在一些其他情况下，使用例如免疫试验（例如ELISA）、免疫组织化学试验、或基于质谱法的试验，在蛋白质表达水平上，检测CCDC144A的存在或水平。

5.鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（I）/G（S）/G（O）亚基γ-3（GNG3）

GNG3是异源三聚体G蛋白的γ亚基。GNG3提供异源三聚体G蛋白和G蛋白受体（GPR）之间的相互作用的特异性。GNG3由鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）γ3基因（Entrez GeneID:2785；NM_012202（SEQID NO:16））编码，并且在鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）γ3前体多肽（NP_036334（SEQ ID NO:91））加工后产生。来自具有IBS的98个患者的外周血样品的qRT-PCR验证性研究指示，GNG3对于IBS且特别是IBS-D亚型具有高度预测性（实施例4）。在特定实施方案中，GNG3、GNG3前体多肽和/或编码GNG3的mRNA是IBS的有用生物标记。

在一些情况下，用试验例如杂交试验、基于扩增的试验例如qPCR试验、RT-PCR试验、或基于质谱法的试验，在mRNA表达水平上（例如经由转化），检测GNG3的存在或水平。在一些其他情况下，使用例如免疫试验（例如ELISA）、免疫组织化学试验、或基于质谱法的试验，在蛋白质表达水平上，检测GNG3或其前体的存在或水平。用于确定血清、血浆、唾液或尿样品中GNG3的存在或水平的合适ELISA试剂盒可从例如Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）、Abcam（Cambridge，MA）、和NovusBiologicals（Littleton，CO）获得。

表1.选择用于qRT-PCR验证的差异表达基因。

B.另外的诊断标记

在特定实施方案中，本发明的方法包括确定RNA IBS生物标记谱，与另外的蛋白质或血清学IBS生物标记组合。在某些实施方案中，该另外的诊断标记谱通过检测选自下述的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种诊断标记的存在或水平进行确定：细胞因子（例如IL-8、IL-1β、TWEAK、瘦素、OPG、MIP-3β、GROα、CXCL4/PF-4和/或CXCL7/NAP-2）、生长因子（例如EGF、VEGF、PEDF、BDNF和/或SDGF）、抗嗜中性粒细胞抗体（例如ANCA、pANCA、cANCA、NSNA和/或SAPPA）、ASCA（例如ASCA-IgA、ASCA-IgG和/或ASCA-IgM）、抗微生物抗体（例如抗OmpC抗体、抗鞭毛蛋白抗体和/或抗I2抗体）、肥大细胞标记（例如类胰蛋白酶、组胺和/或***素E2（PGE2））、应激标记（例如Urocortin（Ucn）、促皮质素释放激素-结合蛋白（CRFBP）、皮质醇和/或促肾上腺皮质激素（ACTH、促皮质素））、胃肠道激素（例如降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质、神经生长因子（NGF）、神经激肽A、神经激肽B、血管活性肠肽（VI P）、胰高血糖素样肽2（GLP-2）、促胃动素和/或垂体腺苷酸环化酶-激活肽（PACAP））、血清素代谢产物（例如色氨酸、5-HT-o-硫酸盐、血清素O-硫酸盐（5-羟色胺O-硫酸盐；5-HT-o-硫酸盐）、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、5-HT葡糖苷酸（5-HT-GA）或5-羟基色醇（5-HTOL））、血清素途径标记（例如UDP-葡糖醛酸基转移酶1-6（UGT1A6）、血清素重摄取转运蛋白（SERT）、色氨酸羟化酶1（TPH1）、单胺氧化酶A（MAO-A）、单胺氧化酶B（MAO-B）、或羟基色胺（血清素）受体3A（5-HT3A；5-HT3R））、碳水化合物缺陷转铁蛋白（CDT）、乳铁蛋白、抗组织转谷氨酰胺酶（tTG）抗体、脂质运载蛋白（例如NGAL、NGAL/MMP-9复合物）、基质金属蛋白酶（MMP；例如MMP-9）、脂质运载蛋白和MMP的复合物、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs；例如TIMP-1）、球蛋白（例如α-球蛋白、α-2-巨球蛋白、触珠蛋白和/或血清类粘蛋白）、肌动蛋白切割蛋白（例如凝溶胶蛋白）、S100蛋白（例如钙粒蛋白）、血纤肽（即FIBA）、降钙素基因相关肽（CGRP）、速激肽（例如物质P）、生长素释放肽、神经降压肽、促皮质素释放激素（CRH）、弹性蛋白酶、C-反应蛋白（CRP）、乳铁蛋白、抗乳铁蛋白抗体、钙防卫蛋白、血红蛋白、NOD2/CARD15、血清素重摄取转运蛋白（SERT）、色氨酸羟化酶-1、5-羟色胺（5-HT）、乳酮糖、丝氨酸蛋白酶（例如类胰蛋白酶，例如β-类胰蛋白酶）、***素（例如PGE2）、组胺、及其组合。在特定实施方案中，另外的生物标记选自表2中的那些。适合于在本发明的方法中使用的生物标记的其他非限制性例子包括：于2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524、于2009年6月25日提交的美国临时申请序列号61/220,525、和于2009年10月30日提交的美国临时申请序列号61/256,717中的那些。在本发明的一个实施方案中，本发明的新RNA IBS生物标记可以与表2中的诊断标记组合。本领域技术人员也将知道适合于在本发明中使用的其他诊断标记。

表2.适于在IBS诊断、预后和分类中使用的示例性诊断标记。

C.分类标记

多种分类标记适合于在本发明的方法、***和代码中使用，用于将IBS分类至类、形式或临床亚型，例如IBS-便秘型（IBS-C）、IBS-腹泻型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）、IBS-交替型（IBS-A）、或感染后IBS（IBS-PI）。分类标记的例子包括但不限于任何上述诊断mRNA标记，以及例如瘦素、血清素重摄取转运蛋白（SERT）、色氨酸羟化酶-1、5-羟色胺（5-HT）、类胰蛋白酶、PGE₂、组胺、粘膜蛋白质9、角蛋白-8、claudin-8、连蛋白、促皮质素释放激素受体-1（CRHR1）、促皮质素释放激素受体-2（CRHR2）等。

例如，2009年6月25日提交的美国临时申请序列号61/220,525（其为了所有目的整体引入本文作为参考）的实施例1和2举例说明了，测量α-类胰蛋白酶水平对于区分IBS-C患者样品与IBS-A和IBS-D患者样品特别有用。类似地，2007年8月14日提交的美国专利公开号2008/0085524（其为了所有目的整体引入本文作为参考）的实施例1举例说明，测量瘦素水平对于区分IBS-C患者样品与IBS-A和IBS-D患者样品特别有用。此外，粘膜SERT和色氨酸羟化酶-1表达已显示在IBS-C和IBS-D中是降低的（参见例如，Gershon，J.Clin.Gastroenterol.，39（5Suppl）:S184-193（2005））。此外，IBS-C患者显示受损的餐后5-HT释放，而IBS-PI患者具有较高的5-HT峰水平（参见例如，Dunlop，Clin GastroenterolHepatol.，3:349-357（2005））。

V.试验

本领域已知的多种试验、技术和试剂盒中的任何一种都可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平，以分类样品是否与IBS相关。

本发明部分地依赖确定得自个体的样品中至少一种标记的存在或水平。如本文使用的，术语“确定至少一种标记的存在”包括通过使用本领域技术人员已知的任何定量或定性试验来确定每种目的标记的存在。在特定情况下，确定特定性状、变量或生物化学或血清学物质（例如RNA、mRNA、miRNA、蛋白质或抗体）的存在或不存在的定性试验适用于检测各目的标记。在特定其他情况下，确定RNA、蛋白质、抗体或活性的存在或不存在的定量试验适用于检测各目的标记。如本文使用的，术语“确定至少一种标记的水平”包括通过使用本领域技术人员已知的任何直接或间接定量试验来确定每种目的标记的水平。在特定情况下，确定例如RNA、mRNA、miRNA、蛋白质、抗体或活性的相对或绝对量的定量试验适用于检测每种目的标记的水平。本领域技术人员理解，用于确定标记的水平的任何试验也可以用于确定标记的存在或不存在。

使用常规技术例如RNA分析、逆转录酶聚合酶链反应（例如qRT-PCR、RT-PCR）、微阵列分析、Luminex MultiAnalyte Profiling（xMAP）技术、或基于与核酸序列（与标记编码序列的部分互补）的杂交的任何其他方法（例如狭缝斑点杂交），分析标记mRNA的水平，在本发明的范围内。可应用的PCR扩增技术在例如下述文献中描述：Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.New York（1999），第7章和增补47；Theophilus等人，“PCR MutationDetection Protocols,”Humana Press,（2002）；和Innis等人，PCRProtocols，San Diego，Academic Press，Inc.（1990）。一般的核酸杂交方法在Anderson，“Nucleic Acid Hybridization,”BIOS ScientificPublishers，1999中描述。多种转录的核酸序列（例如mRNA或cDNA）的扩增或杂交也可以由在微阵列中排列的mRNA或cDNA序列执行。微阵列方法一般性描述在Hardiman，“Microarrays Methods andApplications:Nuts & Bolts,”DNA Press，2003；和Baldi等人，“DNAMicroarrays and Gene Expression:From Experiments to Data Analysisand Modeling,”C ambridge University Press，2002中。

标记例如遗传标记的基因型分析可以使用本领域已知的技术执行，包括但不限于，基于聚合酶链反应（PCR）的分析、序列分析、和电泳分析。基于PCR的分析的非限制性例子包括可从Applied Biosystems获得的

等位基因区别试验。序列分析的非限制性例子包括Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序（Sears等人，Biotechniques，13:626-633（1992））、固相测序（Zimmerman等人，Methods Mol.Cell Biol.，3:39-42（1992））、伴随质谱法例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS；Fu等人，NatureBiotech.，16:381-384（1998））的测序、和通过杂交的测序（Chee等人，Science，274:610-614（1996）；Drmanac等人，Science，260:1649-1652（1993）；Drmanac等人，Nature Biotech.，16:54-58（1998））。电泳分析的非限制性例子包括板凝胶电泳例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。用于在标记中的多态位点上进行个体基因分型的其他方法包括，例如，来自Third Wave Technologies，Inc.的

试验，限制性片段长度多态性（RFLP）分析、等位基因特异性寡核苷酸杂交、异源双链体迁移试验、和单链构象多态性（SSCP）分析。

如本文使用的，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子群体，其可以是多克隆或单克隆的且可以是任何同种型、或免疫球蛋白分子的免疫活性片段。此类免疫活性片段含有重和轻链可变区，其构成抗体分子中特异性结合抗原的部分。例如，本领域称为Fab、Fab'或F（ab'）2的免疫球蛋白分子的免疫活性片段包括在术语抗体的含义内。

流式细胞术可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平。此类流式细胞术试验，包括基于珠的免疫试验，可以以和针对检测白色念珠菌（Candida albicans）和HIV蛋白质的血清抗体所描述的相同方式（参见例如，Bishop和Davis，J.Immunol.Methods，210:79-87（1997）；McHugh等人，J.Immunol.Methods，116:213（1989）；Scillian等人，Blood，73:2041（1989）），用于确定例如抗体标记水平。

用于表达标记特异性的重组抗原的噬菌体展示技术也可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平。需要时，可以使用抗体例如抗噬菌体单克隆抗体，将表达特异于例如抗体标记的抗原的噬菌体颗粒锚定在多孔板上（Felici等人，“Phage-Displayed Peptides as Tools for Characterizationof Human Sera”in Abelson（编辑），Methods in Enzymol.，267，San Diego:Academic Press，Inc.（1996））。

多种免疫试验技术，包括竞争性和非竞争性免疫试验，可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平（参见例如，Self和Cook，Curr.Opin.Biotechnol.，7:60-65（1996））。术语免疫试验涵盖技术，包括但不限于酶免疫试验（EIA），例如酶放大的免疫试验技术（EMIT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、抗原捕获ELISA、夹心ELISA、IgG抗体捕获ELISA（MAC ELISA）和微粒酶免疫试验（MEIA）；毛细管电泳免疫试验（CEIA）；放射性免疫试验（RIA）；免疫放射分析试验（IRMA）；荧光偏振免疫试验（FPIA）；和化学发光试验（CL）。需要时，此类免疫试验可以是自动化的。免疫试验还可以与激光诱导的荧光结合使用（参见例如，Schmalzing和Nashabeh，Electrophoresis，18:2184-2193（1997）；Bao，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.，699:463-480（1997））。脂质体免疫试验，例如流动-注射脂质体免疫试验和脂质体免疫传感器，也适于在本发明中使用（参见例如，Rongen等人，J.Immunol.Methods，204:105-133（1997））。此外，比浊法试验也适于在本发明中使用，其中蛋白质/抗体复合物的形成导致增加的光散射，所述光散射可以作为标记浓度的函数转换为峰比率信号。比浊法试验从Beckman Coulter（Brea，CA；Kit#449430）商购可得，并且可以使用Behring Nephelometer Analyzer（Fink等人，J.Clin.Chem.Clin.Biol.Chem.，27:261-276（1989））执行。

抗原捕获ELISA可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平。例如，在抗原捕获ELISA中，针对目的标记的抗体与固相结合，加入样品，使得标记与抗体结合。在未结合的蛋白质通过洗涤去除后，结合的标记的量可以使用例如放射性免疫试验进行定量（参见例如，Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988））。夹心ELISA也可以适用于本发明。例如，在2抗体夹心试验中，第一抗体与固体载体结合，并且允许目的标记与第一抗体结合。标记的量通过测量结合标记的第二抗体的量来定量。抗体可以固定在多种固体载体上，例如磁性或色谱基质颗粒、试验板（例如微量滴定孔）的表面，固体基质材料或膜（例如塑料、尼龙、纸）的小片等。试验测试条可以通过将阵列中的抗体或多种抗体包被在固体载体上进行制备。这种测试条随后可以浸到测试样品内，并且通过洗涤和检测步骤快速处理，以生成可测量信号，例如色斑。

使用例如碘-125（¹²⁵I）标记的二级抗体（Harlow和Lane，同上）的放射性免疫试验也适合于确定样品中一种或多种标记的存在或水平。由化学发光标记物标记的二级抗体也适合于在本发明中使用。使用化学发光的二级抗体的化学发光试验适合于标记水平的灵敏、非放射性检测。此类二级抗体可以从多个来源，例如Amersham Lifesciences，Inc.（ArlingtonHeights，IL）商业获得。

上述免疫试验特别可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平。作为非限制性例子，使用IL-8结合分子例如抗IL-8抗体或细胞外IL-8结合蛋白（例如IL-8受体）的ELISA，可以用于确定样品是否为IL-8蛋白质阳性的或用于确定样品中的IL-8蛋白质水平。固定的嗜中性粒细胞ELISA可以用于确定样品是否是ANCA阳性的或用于确定样品中的ANCA水平。类似地，使用酵母细胞壁磷酸肽甘露聚糖(phosphopeptidomannan)的ELISA可以用于确定样品是否是ASCA-IgA和/或ASCA-IgG阳性的，或用于确定样品中的ASCA-IgA和/或ASCA-IgG水平。使用OmpC蛋白质或其片段的ELISA可以用于确定样品是否是抗OmpC抗体阳性的，或用于确定样品中的抗OmpC抗体水平。使用I2蛋白质或其片段的ELISA可以用于确定样品是否是抗I2抗体阳性的，或用于确定样品中的抗I2抗体水平。使用鞭毛蛋白（例如Cbir-1鞭毛蛋白）或其片段的ELISA可以用于确定样品是否是抗鞭毛蛋白抗体阳性的，或用于确定样品中的抗鞭毛蛋白抗体水平。此外，上述免疫试验特别地还可以用于确定样品中其他诊断标记的存在或水平。

抗体与目的标记的特异性免疫结合可以直接或间接检测。直接标记物包括附着至抗体的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。由碘-125（¹²⁵I）标记的抗体可以用于确定样品中一种或多种标记的水平。使用标记特异性的化学发光抗体的化学发光试验，适于标记水平的灵敏、非放射性检测。由荧光染料标记的抗体也适于确定样品中一种或多种标记的水平。荧光染料的例子包括但不限于DAPI、荧光素、Hoechst 33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、Texas red和丽丝胺。与荧光染料连接的二级抗体可以商业获得，例如山羊F（ab'）2抗人IgG-FITC可从Tago Immunologicals（Burlingame，CA）获得。

间接标记包括本领域已知的多种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶、尿素酶等。辣根过氧化物酶检测***可以例如与生色底物四甲基联苯胺（TMB）一起使用，该底物在过氧化氢的存在下产生在450nm可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测***可以与生色底物例如对硝基苯基磷酸酯一起使用，产生在450nm可容易检测的可溶产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测***可以与生色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）一起使用，产生在410nm可检测的可溶产物。尿素酶检测***可以与底物例如尿素-溴甲酚紫（SigmaImmunochemicals；St.Louis，MO）一起使用。与酶连接的有用的二级抗体可以得自许多商业来源，例如山羊F（ab'）2抗人IgG-碱性磷酸酶可以购自Jackson ImmunoResearch（West Grove，PA.）。

来自直接或间接标记物的信号可以例如使用分光光度计进行分析，以检测来自生色底物的颜色；使用放射计数器，以检测放射，例如γ计数器用于检测¹²⁵I；或使用荧光计，以在特定波长的光存在下检测荧光。对于酶联抗体的检测，标记水平的量的定量分析可以使用分光光度计，例如EMAX Microplate Reader（Molecular Devices；Menlo Park，CA），依照制造商的说明书进行。需要时，本发明的试验可以是自动化的或由机器人执行，并且来自多重样品的信号可以同时检测。

定量蛋白质印迹也可以用于检测或确定样品中一种或多种标记的存在或水平。蛋白质印迹可以通过众所周知的方法进行定量，例如扫描密度测量法或磷屏成像（phosphorimaging）。作为非限制性例子，蛋白质样品在10%SDS-PAGE Laemmli凝胶上进行电泳。一级鼠单克隆抗体与印迹反应，抗体结合可以使用预备的狭缝印迹实验证实为线性的。山羊抗小鼠辣根过氧化物酶偶联的抗体（BioRad）用作二级抗体，并且使用化学发光，例如用Renaissance化学发光试剂盒（New England Nuclear；Boston，MA）根据制造商的说明书，执行信号检测。印迹的放射自显影图可以使用扫描密度计（Molecular Dynamics；Sunnyvale，CA）进行分析，并且针对阳性对照进行标准化。值可以例如报道为实际值与阳性对照之间的比（密度计指数）。此类方法是本领域众所周知的，在例如Parra等人，J.Vasc.Surg.，28:669-675（1998）中描述。

可替代地，多种免疫组织化学试验技术可以用于确定样品中一种或多种标记的存在或水平。术语免疫组织化学试验涵盖：使用荧光显微镜检查或光学显微镜检查，视觉检测与抗体偶联（即缀合）的荧光染料或酶的技术，其中所述抗体与目的标记反应；所述试验包括但不限于直接荧光抗体试验、间接荧光抗体（IFA）试验、抗补体免疫荧光、抗生物素蛋白-生物素免疫荧光和免疫过氧化物酶试验。IFA试验例如可以用于确定样品是否是ANCA阳性的、样品中的ANCA水平、样品是否是pANCA阳性的，样品中的pANCA水平，和/或ANCA染色模式（例如cANCA、pANCA、NSNA和/或SAPPA染色模式）。可以例如通过终点滴定或通过与已知参考标准比较来测量荧光的可见光强度，定量样品中ANCA的浓度。

可替代地，目的标记的存在或水平可以通过检测或定量纯化的标记的量而确定。标记的纯化可以例如通过单独或与质谱法（例如MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、SELDI-TOF/MS、串联MS等）组合的高压液相色谱（HPLC）达到。目的标记的定性或定量检测还可以通过众所周知的方法来确定，包括但不限于Bradford试验、考马斯亮蓝染色、银染色、用于放射性标记的蛋白质的试验、和质谱法。

多种标记的分析可以以一个测试样品，分开或同时执行。对于标记的分开或顺次试验，合适的装置包括临床实验室分析仪，例如ElecSys（Roche）、AxSym（Abbott）、Access（Beckman）、

（Bayer）、和NICHOLS（Nichols Institute）免疫试验***。优选的装置或蛋白质芯片执行在单一表面上多种标记的同时测定。特别有用的物理形式包括具有多个不连续、可寻址位置的表面，用于检测多种不同标记。此类形式包括蛋白质微阵列，或“蛋白质芯片”（参见例如，Ng等人，J.Cell Mol.Med.，6:329-340（2002））和一些毛细管装置（参见例如，美国专利号6,019,944）。在这些实施方案中，为了在每个位置上进行检测，每个不连续表面位置都可以包含抗体，以固定一种或多种标记。表面可以备选地包含固定在表面的不连续位置上的一种或多种离散颗粒（例如微米颗粒或纳米颗粒），其中微米颗粒包含抗体以固定一种或多种标记用于检测。用于执行多种标记的同时测定的另外一种合适的形式是Luminex MultiAnalyte Profiling（xMAP）技术，先前称为FlowMetrix和LabMAP（Elshal和McCoy，2006）。这是一种多重的基于珠的流式细胞术试验，其利用由不同强度的红色和红外荧光团内部染色的聚苯乙烯珠。珠可以通过多种捕获试剂例如抗体、寡核苷酸和肽结合，由此促进对各种RNA、mRNA、miRNA、蛋白质、配体和DNA的定量（Fulton等人，1997；Kingsmore，2006；Nolan和Mandy，2006，Vignali，2000；Ray等人，2005）。

几种目的标记可以组合到一个检查试验中，以便有效处理多个样品。此外，本领域技术人员将认识到，测试来自相同受试者的多种样品（例如在相继的时间点等）的价值。对系列样品的此测试可以允许鉴定标记水平随着时间的变化。标记水平的增加或降低、以及标记水平的无变化，也可以提供有用信息，以分类IBS或排除与IBS样症状相关的疾病和病症。

可以构建用于测量一种或多种上述标记的一个组，以提供与本发明的方法有关的相关信息，用于将样品分类为与IBS相关。可以构建一个组，以确定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100种或更多种标记的存在或水平。也可以由本领域技术人员在多种临床情况下执行单一标记或标记亚组的分析。这些包括但不限于，门诊、紧急护理、重症护理、加强护理、监护***、住院患者、门诊患者、医生诊室、医务所和健康普查单位。

标记的分析也可以以多种物理形式执行。例如，微量滴定板或自动化的使用可以用于促进大量测试样品的加工。可替代地，可以开发单一样品形式，以利于及时的治疗和诊断。

VI.统计学算法

在一些方面，本发明提供用于分类样品是否与IBS相关的方法、***和代码，其中使用统计学算法或程序，将样品分类为IBS样品或非IBS样品。在其他方面，本发明提供用于分类样品是否与IBS相关的方法、***和代码，其中使用第一统计学算法或程序，将样品分类为非IBD样品或IBD样品（即IBD排除步骤），随后使用第二统计学算法或程序，将非IBD样品分类为IBS样品或非IBS样品（即IBS归入步骤）。优选地，这些统计学算法或程序独立地包含一种或多种学习统计学分类器***。如本文描述的，对于分类样品是否与IBS相关，学习统计学分类器***的组合可以有利地提供改善的灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值和/或总体准确度。

术语“统计学算法”或“统计学程序”包括用于确定变量之间的关系的多种统计学分析中的任何一种。在本发明中，变量是至少一种目的标记的存在或水平和/或至少一种IBS相关症状的存在或严重性。可以使用本文描述的统计学算法，对任何数目的标记和/或症状进行分析。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100种或更多种生物标记和/或症状可以包括在统计学算法中。在一个实施方案中，使用逻辑回归。在另一个实施方案中，使用线性回归。在一些情况下，本发明的统计学算法可以使用在给定群体内特定标记的分位数测量值作为变量。分位数是一组“截点”，其将数据样品分成含有（尽可能）相等数目的观察值的组。例如，四分位数是将数据样品分成含有（尽可能）相等数目观察值的4个组的值。下四分位数是向上路过该有序数据集的四分之一的数据值；上四分位数是向下路过该有序数据集的四分之一的数据值。五分位数是将数据样品分成含有（尽可能）相等数目观察值的5个组的值。本发明还可以包括使用标记水平的百分位数（例如三分位数、四分位数、五分位数等），或其累积指数（例如标记水平的四分位数和等），作为算法中的变量（正如连续变量一样）。

优选地，本发明的统计学算法包含一种或多种学习统计学分类器***。如本文使用的，术语“学习统计学分类器***”包括能够适应于复杂数据集（例如一组目的标记和/或一列IBS相关症状）且基于此数据集作出决定的机器学习算法技术。在某些实施方案中，使用单一学习统计学分类器***例如分类树（例如随机森林）。在其他实施方案中，使用2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种学习统计学分类器***的组合，优选串联使用。学习统计学分类器***的例子包括但不限于使用如下的***：归纳学习（例如决策/分类树，例如随机森林、分类回归树（C&RT）、boosted树等）、概率近似正确性（Probably Approximately Correct,PAC）学习、连接主义学习（例如神经网络（NN）、人工神经网络（ANN）、模糊神经网络（NFN）、网络结构、感知器例如多层感知器、多层前馈网络、神经网络的应用、贝叶斯信念网络学习等）、强化学习（例如在已知环境中的被动学习例如朴素学习(native learning)、自适应动态学习(adaptive dynamiclearning)和即时差分学习(temporal difference learning)，在未知环境中的被动学习，在未知环境中的主动学习，学习行为值函数(learningaction-value functions)，强化学习的应用等）、和遗传算法及进化规划(evolutionary programming)。其他学习统计学分类器***包括支持向量机（例如Kernel方法）、多元自适应回归样条（MARS）、Levenberg-Marquardt算法、高斯牛顿算法(Gauss-Newton algorithms)、混合高斯模型(mixtures of Gaussians)、梯度下降算法(gradient descentalgorithms)、和学习向量量化（learning vector quantization,LVQ）。

随机森林(Random forests)是使用由Leo Breiman和Adele Cutler开发的算法构建的学习统计学分类器***。随机森林使用多个单独的决策树，并且通过选择由这些单个树决定的类别的众数（即最频繁出现的）来决定类别。随机森林分析可以例如使用可从Salford Systems（San Diego，CA）获得的RandomForests软件执行。关于随机森林的描述，参见例如，Breiman，Machine Learning，45:5-32（2001）；和http://stat-www.berkeley.edu/users/breiman/RandomForests/cc_home.htm。

分类回归树是拟合经典回归模型的运算密集型替代物，一般用于基于一种或多种预测物确定类别或连续目的应答的最佳可能模型。分类和回归树分析可以例如使用可从Salford Systems获得的CART软件或可从StatSoft，Inc.（Tulsa，OK）获得的统计学数据分析软件执行。分类和回归树的描述可以参见例如Breiman等人“Classification and RegressionTrees,”Chapman和Hall，New York（1984）；和Steinberg等人，“CART:Tree-Structured Non-Parametric Data Analysis,”Salford Systems，SanDiego,（1995）。

神经网络是人工神经元的互联组，其基于连接主义计算方法，使用数学或计算模型用于信息加工。一般地，神经网络是自适应***，其基于流动通过网络的外部或内部信息改变其结构。神经网络的具体例子包括前馈神经网络，例如感知器、单层感知器、多层感知器、反向传播网络、ADALINE网络、MADALINE网络、Learnmatrix网络、径向基函数（radialbasis function,RBF）网络和自组织图或Kohonen自组织网络；递归神经网络（recurrent neural networks）例如简单递归网络和Hopfield网络；随机神经网络(stochastic neural networks)例如Boltzmann机器；模块神经网络（modular neural networks）例如委员会机器和联想神经网络(associativeneural network)；和其他类型的网络，例如瞬时训练的神经网络(instantaneously trained neural network)、脉冲神经网络（spiking neuralnetworks）、动态神经网络和级联神经网络(cascading neural networks)。神经网络分析可以例如使用可从StatSoft，Inc获得的统计学数据分析软件执行。关于神经网络的描述，参见例如，Freeman等人，In“NeuralNetworks:Algorithms，Applications and Programming Techniques,”Addison-Wesley Publishing Company（1991）；Zadeh，Information andControl，8:338-353（1965）；Zadeh，“IEEE Trans.on Systems，Man andCybernetics,”3:28-44（1973）；Gersho等人，In“Vector Quantizationand Signal Compression,”Kluywer Academic Publishers，Boston，Dordrecht，London（1992）；和Hassoun，“Fundamentals of Artificial NeuralNetworks,”MIT Press，Cambridge，Massachusetts，London（1995）。

支持向量机是用于分类和回归的一组相关监督学习技术，描述在例如Cristianini等人，“An Introduction to Support Vector Machines and OtherKernel-Based Learning Methods,”Cambridge University Press（2000）。支持向量机分析可以例如使用由Thorsten Joachims（Cornell University）开发的SVM^light软件或使用由Chih-Chung Chang和Chih-Jen Lin（National Taiwan University）开发的LIBSVM软件执行。

本文描述的学习统计学分类器***可以使用来自健康个体、IBS患者、IBD患者和/或乳糜泻患者的样品（例如血清学样品）队列进行训练和测试。例如，使用活检组织、结肠镜检查术或如例如美国专利号6,218,129中所述的免疫试验由医生且优选由胃肠病学家诊断为具有IBD的患者的样品，适合于在训练和测试本发明的学习统计学分类器***中使用。使用如例如美国专利号5,750,355和5,830,675中所述的免疫试验，来自诊断有IBD的患者的样品也可以分层为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。来自诊断有IBS的患者的样品可以分层为IBS-便秘型（IBS-C）、IBS-腹泻型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）、IBS-交替型（IBS-A）、或感染后IBS（IBS-PI）。使用公开的标准，例如Manning、罗马I、罗马II或罗马III诊断标准，被诊断患有IBS的患者的样品适用于在训练和测试本发明的学习统计学分类器***中使用。来自健康个体的样品可以包括未鉴定为IBD和/或IBS样品的那些。本领域技术人员将知道用于获得患者样品队列的另外技术和诊断标准，其可以用于训练和测试本发明的学习统计学分类器***。

如本文使用的，术语“灵敏度”指当样品是阳性的，例如具有IBS时，本发明的诊断方法、***或代码给出阳性结果的概率。灵敏度计算为真阳性结果的数目除以真阳性和假阴性的总和。灵敏度实质上是本发明的方法、***或代码如何良好地从不含疾病的患者中正确鉴定出具有IBS的患者的亮度。可以选择统计学算法，使得分类IBS的灵敏度是至少约60%，并且可以是例如至少约65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在优选实施方案中，当使用学习统计学分类器***的组合时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例10，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的灵敏度是至少约90%，或当使用单一学习统计学分类器***时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例11，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的灵敏度是至少约85%。

术语“特异性”指当样品不是阳性的，例如不具有IBS时，本发明的诊断方法、***或代码给出阴性结果的概率。特异性计算为真阴性结果的数目除以真阴性和假阳性的总和。特异性实质上是本发明的方法、***或代码如何良好地从具有IBS疾病的患者中排除不具有IBS的患者的量度。可以选择统计学算法，从而使得分类IBS的特异性是至少约70%，例如至少约75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在优选实施方案中，当使用学习统计学分类器***的组合时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例10，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的特异性是至少约86%，或当使用单一学习统计学分类器***时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例11，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的特异性是至少约84%。

如本文使用的，术语“阴性预测值”或“NPV”指鉴定为不具有IBS的个体实际上不具有该疾病的概率。阴性预测值可以计算为真阴性数目除以真阴性和假阴性的总和。阴性预测值由诊断方法、***或代码的特征以及疾病在分析的群体中的流行率决定。可以选择统计学算法，从而使得在具有疾病流行性的群体中的阴性预测值在约70%-约99%的范围中，并且可以是例如至少约70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个优选实施方案中，当使用学习统计学分类器***的组合时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例10，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的阴性预测值是至少约87%。

术语“阳性预测值”或“PPV”指鉴定为具有IBS的个体实际上具有该疾病的概率。阳性预测值可以计算为真阳性数目除以真阳性和假阳性的总和。阳性预测值由诊断方法、***或代码的特征以及疾病在分析的群体中的流行性来确定。可以选择统计学算法，从而使得在具有疾病流行性的群体中的阳性预测值在约80%-约99%的范围中，并且可以是例如至少约80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在优选实施方案中，当使用学习统计学分类器***的组合时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例10，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的阳性预测值是至少约90%。

预测值，包括阴性和阳性预测值，受疾病在分析的群体中的流行性影响。在本发明的方法、***和代码中，可以选择统计学算法，以针对具有特定IBS流行率的临床群体产生期望的临床参数。例如，可以针对高达约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%的IBS流行率（这可以例如在临床医生的诊室中，例如胃肠病学家的诊室或一般从业者的诊室中看见），选择学习统计学分类器***。

如本文使用的，术语“总体相符（overall agreement）”或“总体准确度”指本发明的方法、***或代码分类疾病状态的准确度。总体准确度计算为真阳性和真阴性的总和除以样品结果的总数目，其受疾病在分析的群体中的流行性影响。例如，可以选择统计学算法，从而使得在具有疾病流行性的患者群体中的总体准确度是至少约60%，并且可以是例如至少约65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在优选实施方案中，当使用学习统计学分类器***的组合时（参见来自美国专利公开号2008/0085524的实施例10，其为了所有目的整体引入本文作为参考），分类IBS的总体准确度是至少约80%。

VII.疾病分类***

来自美国专利公开号2008/0085524（其为了所有目的整体引入本文作为参考）的图2举例说明根据本发明的一个实施方案的疾病分类***（DCS）（200）。如其中显示的，DCS包括具有处理器（215）和存储模块（210）的DCS智能模块（205），例如计算机。智能模块还包括通讯模块（未显示），用于通过一个或多个直接连接（例如USB、Firewire或其他界面）和一个或多个网络连接（例如包括调制解调器或其他网络接口设备）传递和接受信息。存储模块可以包括内部存储设备和一个或多个外部存储设备。智能模块还包括显示模块（225），例如监视器或打印机。在一个方面，智能模块自数据采集模块例如检测***（250），通过直接连接或经过网络（240），接受数据例如患者检测结果。例如，检测***可以配置为可以在一个或多个患者样品（255）上运行多重分析物测试，并且将检测结果自动提供给智能模块。数据还可以通过用户经由直接输入提供给智能模块，或它可以从便携式媒介例如光盘（CD）或数字多功能光碟（DVD）下载。检测***可以与智能模块整合，与智能模块直接偶联，或它可以经过网络与智能模块远程偶联。智能模块还可以如众所周知的经过网络与一个或多个客户***（230）进行数据往来交流。例如，医生或健康护理提供者可以使用客户***（230）从智能模块获得且察看报告，所述智能模块可以驻留在实验室或医院中。

网络可以是LAN（局域网）、WAN（广域网）、无线网络、点对点网络、星形网、令牌环网、hub network、或其他配置。目前使用的最常见类型的网络是TCP/IP（传输控制协议和互联网协议（Transfer ControlProtocol and Internet Protocol））网络，例如全球互联网络，通常称为“因特网”（具有大写“I”），其将在本文的许多实施例中使用，但应当理解本发明可以使用的网络并不限制于其，尽管TCP/IP是目前优选的协议。

在美国专利公开号2008/0085524的图2所示***中几个元件可以包括常规、众所周知的元件，其无需在此处详细解释。例如，智能模块可以作为台式个人计算机、工作站、主机、便携式电脑等实现。每个客户***可以包括台式个人计算机、工作站、便携式电脑、PDA、手机或任何具有WAP功能的设备或能够与因特网或其他网络连接直接或间接接口连接的任何其他计算设备。客户***一般运行HTTP客户程序，例如浏览器程序例如Microsoft's Internet Explorer浏览器、Netscape's Navigator浏览器、Opera's浏览器、或在手机的情况下具有WAP功能的浏览器、PDA或其他无线设备等，允许客户***的用户经过网络访问、处理且察看可以从智能模块获得的信息和页面。每个客户***还一般包括一种或多种用户界面设备，例如键盘、鼠标、触摸屏、笔等，用于与由智能模块提供的页面、表格和其他信息、以及与在显示器（例如监视屏、LCD显示器等）（235）上由浏览器提供的图形用户界面（GUI）相互作用。如上文讨论的，本发明适合于与因特网一起使用，所述因特网指网络的特别全球互联网络。然而，应当理解，可以使用其他网络代替因特网，例如内联网、外联网、虚拟私人网络（VPN）、基于非TCP/IP的网络、任何LAN或WAN等。

根据一个实施方案，每个客户***及其所有组分是可以使用应用程序，例如浏览器，包括计算机代码，使用中央处理器例如

处理器等，由操作者配置的。类似地，智能模块及其所有组分可以使用一种或多种应用程序，包括使用计算机代码，使用中央处理器（215）例如IntelPentium处理器等或多个处理器，由操作者配置。用于操作和配置智能模块以如本文描述的处理数据和检测结果的计算机代码，优选下载且贮存于硬盘上，但整个程序代码或其部分也可以贮存于如众所周知的任何其他易失性或非易失性存储器或设备中，例如ROM或RAM，或提供在能够贮存程序代码的任何其他计算机可读介质（260）上，例如光盘（CD）媒介、数字多功能光盘（DVD）媒介、软盘、ROM、RAM等。

用于实施本发明的各个方面和实施方案的计算机代码可以以任何可以在计算机***上执行的编程语言实现，所述编程语言例如以C、C++、C#、HTML、Java、JavaScript、或任何其他脚本语言，例如VBScript。另外，整个程序代码或其部分可以具体化为载体信号，其可以经过因特网或经过众所周知的任何其他方便的网络连接（例如外联网、VPN、LAN等），使用众所周知的任何通讯媒介和方案（例如TCP/IP、HTTP、HTTPS、以太网等），从软件来源（例如服务器）传递和下载。

根据一个实施方案，智能模块实施疾病分类程序以分析患者检测结果和/或问卷答案，从而确定患者样品是否与IBS相关。数据可以在一个或多个数据表或其他逻辑数据结构中贮存于与智能模块偶联的存储器（210）或分开的贮存或数据库***中。一般向特定患者的数据集，包括检测数据，应用一种或多种统计学程序。例如，检测数据可以包括诊断标记谱，其包含指示患者样品中至少一种标记的存在或水平的数据。检测数据还可以包括症状谱，其包含的数据指示患者正在经历或最近经历过的与IBS相关的至少一种症状的存在或严重性。在一个方面，统计学程序产生基于诊断标记谱和/或症状谱将患者样品分类为IBS样品或非IBS样品的统计学衍生决策。在另一个方面，第一统计学程序产生第一统计学衍生决策，其中基于诊断标记谱和/或症状谱，将患者样品分类为IBD样品或非IBD样品。如果患者样品分类为非IBD样品，那么将第二统计学程序应用于相同或不同数据集，以产生将非IBD样品分类为IBS样品或非IBS样品的第二统计学衍生决策。该第一和/或第二统计学衍生决策可以展示在与智能模块结合或偶联的显示设备上，或可以将决策（一个或多个）提供且展示在分开的***例如客户***（230）上。展示的结果允许医生作出合理的诊断或预后。

VIII.具有IBS样症状的疾病和病症

多种结构或代谢疾病和病症可以引起类似于IBS的体征或症状。作为非限制性例子，具有下述疾病和病症的患者可以呈现类似于IBS的与轻度至中度疼痛相关的腹部不适和大便的稠度和/或频率的变化：例如炎性肠病（IBD）、乳糜泻（CD）、急性炎症、憩室炎、回肠袋肛管吻合术、显微镜结肠炎、慢性感染性腹泻、乳糖酶缺乏症、癌症（例如结肠直肠癌）、小肠或结肠的机械性梗阻、肠道感染、缺血、消化不良、吸收不良、子宫内膜异位症和未确认的肠道炎性病症。另外的IBS样症状可以包括慢性腹泻或便秘或交替形式、重量减轻、腹膨胀或胀气、和粘液便。

大多数IBD患者可被分类为2个不同临床亚型之一，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。克罗恩氏病是影响回肠的下部分且常涉及结肠和肠道的其他区域的炎性疾病。溃疡性结肠炎的特征在于主要局限于大肠的粘膜和粘膜下层的炎症。患有IBD的这些临床亚型的患者典型地具有IBS样症状，例如腹痛、慢性腹泻、重量减轻和痉挛。

乳糜泻的临床表现的特征也在于IBS样症状，例如与慢性腹泻相关的腹部不适、重量减轻和腹部膨胀。乳糜泻是免疫介导的肠粘膜病症，其一般与绒毛萎缩、隐窝增生和/或小肠的粘膜衬里的炎症相关。除营养素的吸收不良外，具有乳糜泻的个体处于矿物质缺乏、维生素缺乏、骨质疏松症、自身免疫疾病和肠恶性肿瘤（例如淋巴瘤和癌）的危险中。据认为，在合适的遗传和环境背景中，暴露于蛋白质例如谷蛋白（例如存在于小麦、黑麦、大麦、燕麦、粟、黑小麦、斯佩耳特小麦和kamut中的麦谷蛋白和谷醇溶蛋白），负责引起乳糜泻。

呈现IBS样症状的特征在于肠炎症的其他疾病和病症包括，例如急性炎症、憩室炎、回肠袋肛管吻合术、显微镜结肠炎和慢性感染性腹泻、以及未确认的肠道炎性病症。经历急性炎症发作的患者一般具有升高的C反应蛋白（CRP）水平加上IBS样症状。CRP在炎症性过程的急性期中由肝产生，并且通常在炎症性过程的开始后约24小时释放。患有憩室炎、回肠袋肛管吻合术、显微镜结肠炎和慢性感染性腹泻的患者一般具有升高的粪便乳铁蛋白和/或钙防卫蛋白水平加上IBS样症状。乳铁蛋白是由粘膜分泌的糖蛋白，并且是白细胞的次级颗粒中的主要蛋白质。白细胞通常被募集至炎性部位，在此它们被激活，释放颗粒内容物至周围区域。这个过程增加大便中乳铁蛋白的浓度。

当与袋的其他非炎性病症如易激袋综合征(irritable pouch syndrome)比较时，在具有回肠袋肛管吻合术（即在克罗恩氏病的严重病例中在结肠完全切除后产生袋）的患者中观察到增加的乳铁蛋白水平。升高水平的乳铁蛋白也在具有憩室炎的患者中观察到，憩室炎是消化道中的凸起袋（即憩室）变得发炎和/或感染的病状，引起严重腹痛、发热、恶心和排便***相关的慢性炎性病症。显微镜结肠炎的特征在于持久的水样腹泻（非血性）、腹痛通常伴有重量减轻、在结肠镜检查术和放射检查中正常粘膜、和非常特异性的组织病理学变化。显微镜结肠炎由2种疾病组成，胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎。胶原性结肠炎具有未知病因学，并且在具有长期水样泻和正常结肠镜检的患者中发现。胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎两者的特征都在于在结肠的衬里中增加的淋巴细胞。胶原性结肠炎的特征进一步在于结肠的上皮下胶原层的增厚。慢性感染性腹泻是也与增加的粪便乳铁蛋白水平相关的病。慢性感染性腹泻通常由细菌、病毒或原生动物感染引起，患者呈现IBS样症状例如腹泻和腹痛。增加的乳铁蛋白水平也在具有IBD的患者中观察到。

除确定CRP和/或乳铁蛋白和/或钙防卫蛋白水平外，与肠炎症相关的疾病和病症也可以通过检测大便中血液的存在，例如粪便血红蛋白，而加以排除。患者不知道的肠出血称为潜性或隐性出血。潜性出血（例如粪便血红蛋白）的存在一般在来自患者的大便样品中观察到。其他状况例如溃疡（例如胃、十二指肠）、癌症（例如胃癌、结肠直肠癌）和痔疮也可以呈现IBS样症状，包括腹痛和大便的稠度和/或频率的变化。

此外，还可以评估粪便钙防卫蛋白水平。钙防卫蛋白是主要地衍生自嗜中性粒细胞和单核细胞的具有抗微生物活性的钙结合蛋白质。已发现钙防卫蛋白在囊性纤维化、类风湿性关节炎、IBD、结肠直肠癌、HIV及其他炎性疾病中具有临床相关性。它的水平已在血清、血浆、口腔、脑脊髓液和滑液、尿和粪便中进行测量。在GI病症中粪便钙防卫蛋白的优点已得到公认：在室温稳定3-7天，使得可以通过普通邮寄运送样品；具有克罗恩氏病的患者中与粪便α1-抗胰蛋白酶相关；以及在具有胃肠道癌和IBD的绝大多数患者中升高。已经发现，粪便钙防卫蛋白与溃疡性结肠炎的疾病活性的内窥镜和组织学分级、以及与铟-111标记的嗜中性粒细胞的粪便***良好关联，其是IBD中的疾病活性的标准。

考虑到前述，清楚地，广泛多样的疾病和病症可以引起IBS样症状，从而造成将样品明确地分类为IBS样品的重大障碍。然而，通过使用例如统计学算法将来自个体的样品分类为IBS样品，或通过使用例如统计学算法的组合在样品中将与IBS共享相似临床表现的那些疾病和病症剔除（即排除）并鉴定（即归入）IBS，本发明克服了这个局限性。

IX.治疗和治疗监控

在来自个体的样品已分类为IBS样品后，本发明的方法、***和代码可以进一步包括给个体施用治疗有效量的用于治疗与IBS相关的一种或多种症状的药物（即IBS药物）。对于治疗应用，IBS药物可以单独施用，或与一种或多种另外的IBS药物和/或减少与IBS药物相关的副作用的一种或多种药物组合共施用。

IBS药物可以按需要与合适的药学赋形剂一起施用，并且可以经由任何公认的施用方式进行。因此，施用可以是例如静脉内、局部、皮下、经皮、透皮(transdermal)、肌内、经口、颊、舌下、齿龈、腭、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、损伤内、鼻内、直肠、***或通过吸入。“共施用”意指IBS药物与第二药物（例如其它IBS药物、用于减少IBS药物的副作用的药物等）同时、正好在之前、或正好在之后施用。

治疗有效量的IBS药物可以重复施用，例如至少2、3、4、5、6、7、8次或更多次，或剂量可以通过连续输注方式施用。剂量可以采取固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，例如片剂、丸剂、小丸、胶囊、粉末、溶液、悬液、乳状液、栓剂、保留灌肠剂、乳膏、软膏、洗剂、凝胶、气溶胶、泡沫等，优选以适于精确剂量的简单施用的单位剂型。

如本文使用的，术语“单位剂型”指作为合适作为单位剂量用于人受试者和其他哺乳动物的物理上不连续的单位，每个单位（例如安瓿）含有与合适的药学赋形剂结合的预定数量IBS药物，所述预定量经计算可以产生期望的发作、耐受性和/或疗效。此外，可以制备更浓缩的剂型，随后可以由其产生更稀释的单位剂型。更浓缩的剂型因此将含有实质性超过，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍于，IBS药物的量。

用于制备此类剂型的方法是本领域技术人员已知的（参见例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，MackPublishing Co.，Easton，PA（1990））。剂型一般包括常规药学载体或赋形剂，并且可以另外包括其他医学试剂、载体、助剂、稀释剂、组织穿透增强剂、增溶剂等。合适的赋形剂可以通过本领域众所周知的方法，调整以适应特定剂型和施用途径（参见例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，同上）。

合适赋形剂的例子包括但不限于，乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、***树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和聚丙烯酸例如卡波普，例如卡波普941、卡波普980、卡波普981等。剂型可以另外包括润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂例如甲基、乙基和丙基-羟基-苯甲酸酯（即对羟基苯甲酸酯）；pH调节剂例如无机和有机酸和碱；甜味剂；和调味剂。剂型还可以包含生物可降解聚合物珠、葡聚糖和环糊精包合配合物(inclusion complex)。

对于口服施用，治疗有效剂量可以为片剂、胶囊、乳状液、悬液、溶液、糖浆剂、喷雾剂、锭剂、粉末和持续释放制剂的形式。用于经口施用的合适赋形剂包括药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。

在某些实施方案中，治疗有效剂量采取丸剂、片剂或胶囊的形式，并且因此该剂型可以含有IBS药物并连同下述中的任何物质：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂例如淀粉或其衍生物；润滑剂例如硬脂酸镁等；和粘合剂例如淀粉、***树胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。IBS药物也可以配制成栓剂，放置在例如聚乙二醇（PEG）载体中。

液体剂型可以通过将IBS药物和任选的一种或多种药学可接受的助剂溶解或分散在载体中进行制备，所述载体例如水性盐水（例如0.9%w/v氯化钠）、水性葡萄糖、甘油、乙醇等，以形成溶液或悬液，例如用于经口、局部或静脉内施用。IBS药物还可以配制成保留灌肠剂。

对于局部施用，治疗有效剂量可以为乳状液、洗剂、凝胶、泡沫、乳膏、凝胶剂、溶液、悬液、软膏和经皮贴剂的形式。对于通过吸入的施用，IBS药物可以作为干粉或以液态形式经由雾化器递送。对于肠胃外施用，治疗有效剂量可以为无菌可注射溶液和无菌包装的粉末的形式。优选地，可注射溶液被配制在约4.5–约7.5的pH。

治疗有效剂量还可以以冻干形式提供。此类剂型可以包括缓冲剂，例如碳酸氢钠，用于在施用前重构，或缓冲剂可以包括在冻干剂型中以用例如水重构。冻干剂型可以进一步包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干剂型可以在注射器中提供，任选与用于重构的缓冲剂组合包装，从而使得重构的剂型可以立即施用于个体。

在用于IBS治疗的治疗用途中，IBS药物可以以每天约0.001mg/kg-约1000mg/kg的起始剂量进行施用。可以使用约0.01mg/kg-约500mg/kg、约0.1mg/kg-约200mg/kg、约1mg/kg-约100mg/kg、或约10mg/kg-约50mg/kg的日剂量范围。然而，剂量可以取决于个体的需要、IBS症状的严重性和待采用的IBS药物而改变。例如，考虑在根据本文描述的方法分类为具有IBS的个体中IBS症状的严重性，剂量可以经验确定。在本发明的背景中，施用于个体的剂量应足以在个体中一段时间实现有利治疗应答。剂量的大小还可以由任何不良副作用的存在、性质和程度决定，所述不良副作用伴随特定IBS药物在个体中的施用。决定用于特定情况的合适剂量是本领域从业者的技术范畴内的事。一般地，治疗用较小剂量起始，所述较小剂量小于IBS药物的最佳剂量。其后，剂量通过小增量增加，直至达到在情况下的最佳效应。为了方便起见，需要时，每日总剂量可以分开且在白天中分部分地施用。

如本文使用的，术语“IBS药物”包括药物的所有药学可接受的形式，其对于治疗与IBS相关的一种或多种症状有用。例如，IBS药物可以为外消旋或异构混合物，与离子交换树脂结合的固体复合物等。此外，IBS药物可以为溶剂化物形式。术语“IBS药物”还预期包括描述的IBS药物的所有药学可接受的盐、衍生物和类似物，以及其组合。例如，IBS药物的药学可接受的盐包括但不限于酒石酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐（tartarate）、酒石酸氢盐（bitartarate）、二盐酸盐、水杨酸盐、半琥珀酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、盐酸盐、氨基甲酸盐、硫酸盐、硝酸盐及其苯甲酸盐形式，以及其组合等。任何形式的IBS药物都适于在本发明的方法中使用，例如IBS药物的药学可接受的盐、IBS药物的游离碱、或其混合物。

用于治疗与IBS相关的一种或多种症状的合适药物包括但不限于：5-羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、氯离子通道阻断剂、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物、促皮质素释放因子（CRF）拮抗剂、益生菌、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。其他IBS药物包括膨胀剂、多巴胺拮抗剂、祛风剂、镇静剂、右托非索泮、苯妥英、噻吗洛尔和地尔硫卓。

5-羟色胺能药物对于治疗IBS症状例如便秘、腹泻和/或腹泻便秘交替有用。5-羟色胺能药物的非限制性例子在Cash等人，Aliment.Pharmacol.Ther.，22:1047-1060（2005）中描述，并且包括5-HT₃受体激动剂（例如MKC-733等）、5-HT₄受体激动剂（例如替加色罗（Zelnorm）、普卢卡必利、AG1-001等）、5-HT₃受体拮抗剂（例如阿洛司琼

西兰司琼(cilansetron)、昂丹司琼(ondansetron)、格拉司琼(granisetron)、多拉司琼(dolasetron)、雷莫司琼(ramosteron)、帕洛诺司琼（palonosetron）、E-3620、DDP-225、DDP-733等）、混合的5-HT₃受体拮抗剂/5-HT₄受体激动剂（例如西沙必利(cisapride)、莫沙必利(mosapride)、伦扎必利(renzapride)等）、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。另外，可以施用通过影响神经元或神经胶质细胞发信号来调节肠通透性的氨基酸，如谷氨酰胺和谷氨酸，以治疗具有IBS的患者。

抗抑郁药例如选择性血清素重摄取抑制剂（SSRI）或三环抗抑郁药对于治疗IBS症状例如腹痛、便秘和/或腹泻特别有用。SSRI抗抑郁药的非限制性例子包括西酞普兰(citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)、帕罗西汀(paroxetine)、氟西汀(fluoxetine)、舍曲林(sertraline)、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。三环抗抑郁药的非限制性例子包括但不限于地昔帕明(desipramine)、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、多塞平(doxepin)、丙咪嗪(imipramine)、曲米帕明(trimipramine)、马普替林(maprotiline)、阿莫沙平(amoxapine)、氯米帕明(clomipramine)、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。

氯离子通道激活物对于治疗IBS症状例如便秘有用。氯离子通道激活物的非限制性例子是鲁比前列酮（Amitiza）、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物或其类似物。此外，氯离子通道阻断剂例如crofelemer对于治疗IBS症状例如腹泻有用。鸟苷酸环化酶激动剂例如MD-1100对于治疗与IBS相关的便秘有用（参见例如，Bryant等人，Gastroenterol.，128:A-257（2005））。抗生素例如新霉素也可以适于用于治疗与IBS相关的便秘（参见例如，Park等人，Gastroenterol.，128:A-258（2005））。不可吸收的抗生素如利福昔明（Xifaxan）适合于治疗与IBS相关的小肠细菌过度生长和/或便秘（参见例如，Sharara等人，Am.J.Gastroenterol.，101:326-333（2006））。

阿片类例如κ阿片类（例如阿西马朵林）可以用于治疗与IBS相关的疼痛和/或便秘。神经激肽（NK）拮抗剂例如他尔奈坦、沙瑞度坦和其他NK2和/或NK3拮抗剂可以用于治疗IBS症状，例如结肠肌肉的过度敏感性、便秘和/或腹泻。镇痉剂或抗胆碱能药物例如双环维林(dicyclomine)可以用于治疗IBS症状，例如肠和膀胱的肌肉痉挛。其他镇痉剂或抗胆碱能药物例如颠茄生物碱（例如阿托品(atropine)、东莨菪碱(scopolamine)、莨菪碱(hyoscyamine)等）可以与巴比妥酸盐例如***组合使用，以减少与IBS相关的肠痉挛。GLP-1类似物例如GLP-010可以用于治疗IBS症状例如便秘。CRF拮抗剂例如astressin和益生菌例如

可以用于治疗一种或多种IBS症状。本领域技术人员知道，适于治疗与IBS相关的一种或多种症状的、目前在使用中或开发中的另外IBS药物。

在来自个体的样品已分类为IBS样品后，个体还可以以定期时间间隔进行监控，以评估特定治疗方案的功效。例如，特定标记的水平可以基于治疗例如药物的疗效而改变。监控患者，以评估应答和了解个体化方法中特定药物或治疗的效果。另外，患者可能不响应药物，但标记可能改变，暗示这些患者属于可以通过其标记水平鉴定的特别群体（非响应性的）。这些患者可以中断其目前治疗，并且开出可替代治疗。

X.实施例

A.实施例1

本实施例描述血样收集和自其的RNA分离。简言之，从3个IBS-D患者、2个IBS-C患者和3个健康志愿者中收集血样。所有IBS患者符合罗马III标准，并且健康志愿者不具有IBS史或其他活跃共病。在这种情况下，从每个受试者中收集约2.4ml全血。将血样分成2个等分试样，并且一个根据上述白细胞方案进行加工，而另一个收集在PAXgene***（PreAnalytX；Hombrechtikon，瑞士）中且相应加工。

因为在这2种技术之间的主要差异是包括来自红细胞级分的RNA，所以研究了过度大量的血红蛋白mRNA是否可以解释在全血和白细胞生成的样品之间的表达差异。使用PAXgene血液收集方案，从来自健康受试者的全血中分离额外的RNA。在4个供体样品上，使用RNA酶H和特别设计用于9种常见的血红蛋白基因（Feezor RJ等人，Physiol Genomics19:247-254（2004））的引物，进行样品中多种血红蛋白mRNA的降解。简言之，将5μg总细胞RNA在10mM Tris·HCl，pH 7.6，20mM KCl中与10μM寡核苷酸引物一起在70℃温育5分钟。将样品冷却至4℃，并且加入2U RNA酶H（New England Biolabs），连同20U SUPERase抑制剂（Ambion）。将缓冲条件调整至55mM Tris·HCl、85mM KCl、3mMMgCl2和10mM二硫苏糖醇，并且将样品在37℃温育15分钟。在温育后立即将样品再次冷却至4℃，并且加入1μl 0.5M EDTA，以停止RNA酶H降解。随后使用RNeasy Mini Protocol for RNA Cleanup（Qiagen），根据制造商的说明书并且包括任选的DNA酶处理，再次纯化样品。

B.实施例2

本实施例描述提取的mRNA样品与寡核苷酸阵列的杂交。对于IBD和对照血清RNA样品的分析，使用Affymetric人基因1.0ST阵列（Affymatrix，Santa Clara，CA）。这些阵列是含有~35,000种转录物的基于寡核苷酸探针的基因阵列芯片，其提供对全人基因组的全面覆盖。

为了制备用于杂交的RNA样品，8微克总RNA用于合成cDNA。遵循制造商的方案（Affymatrix，San Diego，California），在第一链合成过程中引入的T7启动子序列随后用于指导cRNA合成，其由生物素化的三磷酸脱氧核苷酸标记。在片段化后，生物素化的cRNA与基因芯片阵列在45℃杂交16小时。将芯片洗涤，用藻红蛋白-链霉亲和素染色，并且用GeneChip Scanner 3000扫描。在本底校正后，在Microarray Suite 5.0软件（MAS 5.0，Stratagene，La Jolla，CA）中完成初步数据分析。对于初级分析，如软件Gene Spring GX10.0（Agilent Technologies，Santa.Clara）的工作流程中推荐的，使用PLIER。

实施例3

如先前实施例中描述的，本实施例描述实施的微阵列的数据分析。分析每个样品的RNA完整性数值（RIN）和每个微阵列实验的性能，用于质量控制目的。结果在表3中给出。

表3.RNA样品和微阵列质量控制矩阵。

将每个探针组的荧光强度上载至Array Assist 6.5和Gene SpringGX10.0（Agilent Technologies，Santa Clara）软件。数据通过定量标准化进行标准化，并且随后对数转化用于进一步分析，以确定在IBS患者中特定基因的变化。为了比较基因表达中的变化，通过使用50RFU荧光值作为阈值，将数据进一步标准化，确定显示倍数变化的统计学分析（p≤0.05）。使用2log2倍数变化作为截断值，鉴定了最前面的72种标记，显示于表4中。

表4.使用2log2倍数变化，鉴定的最前面72种基因标记。

^＊ProbeSet ID号；指在Affymetric人基因1.0ST阵列中使用的探针的身份。

在严格统计学检验中合格的基因用于基因本体和途径分析。含有基因标识符及其相应表达值（作为倍数变化）的表达数据集，作为制表符分隔的文本文件，上载至Ingenuity pathway Analysis（IPA）软件（Ingenuitysystems，Mountain view，CA）。对作图至Ingenuity途径数据库的基因，基于分子功能、基因本体和生物学过程进行分类。每个类别基于其p值分组。命名为聚焦基因的鉴定的基因也作图到IPA数据库中的遗传网络上，且按照得分排序。计算的概率得分代表网络中的基因集合是否可以仅因偶然而出现。

MAS5算法

微阵列分析套件（Microarray Analysis Suite）5.0（MAS 5.0）算法由Affymetrix开发，以量度来自使用Affymetrix GeneChip阵列的微阵列实验的相对强度。信号使用One-Step Tukey’s Biweight Estimate进行计算，其产生对于异常值相对不敏感的强加权平均值。Tukey’s Biweight方法给出对数据中变异量的估计，确切地作为标准差量度距平均值的变化量。MAS 5.0自PM信号扣除“杂散信号”估计量（这是基于MM信号的强度）。然而，在MM信号超过PM信号的情况下，使用调整的值。这些调整将消除负值。

RMA算法

来自8个微阵列的数据也使用RMA算法（Irizarry,RA等人，Biostatistics，4，249-264（2003））进行预处理。该算法的输出是以log2标尺表示的原始基因表达强度。所有样品的强度的曲线图显示于图1中。

ANOVA检验

方差分析（ANOVA）是统计学模型及其相关程序的集合，其中观测到的变异由于不同的解释性变量而分割为组分。ANOVA通常用于比较超过2组的平均值。

对每个探针组执行方差分析（ANOVA）。该检验设计为检测在任何一对组别之间的差异表达基因（DEGs）。调整p值以控制多重假设检验（Benjamini & Hochberg，1995）中的假发现率（FDR）。表4显示在多个原始p值和FDR调整的p值阈值下的DEGs数目。使用p.fdr<0.25的阈值，存在总计228种差异表达基因（DEGs）。头5种DEGs的基因表达水平图显示在图2中。

多重假设检验

在假设检验中，一般规定当零假设是真实时拒绝该零假设由此犯第一类错误的最大可接受概率。在微阵列研究中，执行大量假设检验。当检验许多假设，并且每个检验具有指定的第一类误差概率时，犯至少一些第一类误差的概率通常随着假设数目的增加而增加，常常是急剧增加。为了控制总体第一类误差，应用对统计学检验p值的调整，以控制总体假发现率或FDR（Benjamini & Hochberg，1995）。其他可获得的多重假设校正方法包括其中p值乘以比较数目的Bonferroni校正、Holm校正（Holm，1979）、Hochberg校正（Hochberg，1988）、和Hommel校正（Hommel，1988）。

分层聚类分析

分层聚类分析是基于测量的特征用于发现相对同质的案例丛的统计学方法。它从分开的丛中的每个案例开始，随后相继地组合这些丛，在每个步骤中减少丛的数目直至仅剩下一个丛。当存在N个案例时，这涉及N-1个聚类步骤或融合。具有二维分层聚类结果的热图时常用于微阵列分析中，以基于基因表达谱来展示样品和基因聚类结构。

执行分层聚类分析以探究DEGs的基因表达谱是否可以将IBS和对照样品分到不同类别内。所有未掩蔽(unmasked)的探针组用于这个分析中。图3显示聚类结果，并且图4提供描述一组基因的差异表达的热图，该组基因包括表4中显示的所选72种基因的子集。IBS-C（组1；HG1和2）、IBS-D（组2；HG3、4和5）和对照（组3；HG6、7和8）组通过DGEs的基因表达谱完全分开，其通过热图上方的彩色面板指示。

多维量表

多维量表（MDS）是通常用于信息显现的一组相关统计学技术，用于探究数据中的相似性或不同性。MDS是排列的一个特别情况。MDS算法从项目-项目相似性的矩阵开始，随后在低维空间中分配每个项目的位置，适于2D或3D显现。基于所有未掩蔽的探针组的基因表达谱的样品分离图显示于图5中。

主成分分析

主成分分析（PCA）涉及将许多（可能地）相关变量转化成称为主成分的（较小）数目的无关变量的数学程序。第一个主成分尽可能多地负责数据中的变异，并且每个后续组分也占尽可能多地负责剩余的变异。图6A描述了可以由最前面的主成分之每一个解释的变异。图6B描述通过头2种主成分的样品分离。

T检验

t检验评估2个组的平均值是否统计学上彼此不同。这个分析允许比较2个组的平均值。在每对组别之间进行了配对t检验。在每个比较中对阵列上的每个探针组计算倍数变化、p值和FDR调整的p值（Benjamini &Hochberg，1995）。差异表达基因（DEGs）定义为具有FDR调整的p值<0.25和2log2倍数变化>2的那些基因。例如，表4显示通过倍数变化排序的72种在组2和组3之间的DEGs。

火山图

火山图沿着生物学和统计学显著性的维度安排基因。第一个（水平）维度是在2个组之间的倍数变化（在对数标尺上，从而使得上和下调看起来对称），第二个（垂直）轴代表样品之间差异的t检验p值（最方便地在负对数标尺上，从而使得更小的p值看起来更高）。第一个轴指示变化的生物学影响；第二个指示统计学证据，或变化的可靠性。

火山图显示在生物学显著性（倍数变化）和统计学显著性（p值）之间的关系。图7A-C显示在每对组别之间的比较（（A）IBS-C与IBS-D组比较，（B）IBS-C与对照组比较，和（C）IBS-D与对照组比较）的火山图。尽管原始p值在Y轴上标绘，但DEGs通过FDR调整的p值<0.25和倍数变化>2的阈值确定，其边界在图7C中用虚线标记。DEGs以红色突出显示。

Fisher精确检验

Fisher精确检验是用于确定在2个分类变量之间是否存在非随机相关性的统计学检验。Fisher精确检验注视列联表，其展示第一个变量如何影响第二个变量或相反。它的零假设是两者是独立的。

C.实施例3

为了验证通过微阵列实验鉴定的IBS标记的效用，使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析，验证了5种鉴定基因的mRNA表达水平。简言之，通过PCR RNA核心试剂盒（Applied Biosystems，Bedford，MA），从来自12个IBS-M、22个IBS-C、12个IBS-D和21个对照受试者的RNA样品合成cDNA。使用基因特异性PCR引物，执行用SYBER Green的实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），以验证微阵列数据。选择具有Log2倍数变化>2和FDR调整的p值<0.25的5种基因（FOXD3、PI4K2A、ACSS2、ASIP和OR2L8），并且生成用于扩增每种基因的引物。样品一式三份地运行，并且通过ABI 7700热循环仪（Applied Biosystems，Bedford，MA）执行PCR。qRT-PCR分析的结果显示于图8中。

D.实施例4

为了进一步验证上文鉴定的新基因表达IBS标记的效用，通过Log2倍数变化确定的头72种发现相基因中的14种的表达水平，在独立确定的连续入选的98个IBS患者的前瞻性队列的临床研究中进行确定。每个患者由委员会证明了资格的胃肠病学家进行诊断；IBS通过活检组织进行确认，并且IBS符合罗马III标准。所有方案是IRB批准的；获得知情同意书，并且从所有患者中收集外周血样品和临床数据。通过分离总mRNAs、合成cDNAs且执行实时定量PCR，从外周全血样品获得表达数据。对每个患者样品确定候选生物标记基因的表达水平，并且针对患者内参考基因标准化。所选生物标记的表达水平显示于图9A-C中。

通过PCR RNA核心试剂盒（Applied Biosystems，Bedford，MA），从RNA样品合成cDNA。使用基因特异性PCR引物，执行用SYBER Green的实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），以验证微阵列数据。样品一式三份地运行，并且通过ABI 7700热循环仪（Applied Biosystems，Bedford，MA）执行PCR。按照geNorm方法，确定持家基因β-肌动蛋白的表达用于标准化。执行线性回归分析，并且计算变异系数，以评估在这些所选基因的RT-PCR和基因阵列结果之间的关联性。候选基因表达的Log2倍数变化和p值显示于表5中。

表5.通过qRT-PCR验证的14种所选候选IBS标记基因的Log2倍数变化和计算的p值。

基因	得分	P值
			CCDC147	6.425	0.011
VIPR1	4.818	0.028
			LPAR5	3.881	0.049
CCDC 144A	2.944	0.086
			GNG3	2.901	0.089
ACSS2	2.516	0.113
			ZNF33B	1.902	0.168
PMS2L2	1.629	0.202
			RUSC1	1.384	0.239

ARHGE	1.226	0.268
			ASIP	1.119	0.29
OR2L8	1.094	0.296
			PI4K2A	0.578	0.447
FOXD3	0.553	0.457

E.实施例5

为了进一步确定对IBS最具有预测性的基因表达模式，通过使用方差分析（ANOVA），分析实施例2中获得的原始基因表达数据，以比较所有3个组中的杂交信号的平均值。使用t检验比较IBS-D和健康志愿者组。评估在2个组中统计学上差异的基因。使用的分析软件是AffymetrixCommand Console，Affymetrix Expression Console和R。

网络、基因本体和标准(canonical)途径分析

在严格统计学检验中合格的基因用于基因本体和途径分析。含有基因标识符及其相应表达值(作为倍数变化)的表达数据集，作为制表符分隔的文本文件，上载至Ingenuity pathway Analysis（IPA）软件（Ingenuitysystems，Mountain view，CA）。对作图至Ingenuity途径数据库的基因基于分子功能、基因本体和生物学过程进行分类。每个类别基于其p值分组。命名为聚焦基因的鉴定的基因也作图到IPA数据库中的遗传网络上，且通过得分排序。计算的概率得分代表网络中的基因集合是否可以仅由偶然发生。

通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）的mRNA表达分析试验

通过qRT-PCR进一步验证66种所选基因。通过PCR RNA核心试剂盒（Applied Biosystems，Bedford，MA），从RNA样品合成cDNA。使用基因特异性PCR引物，执行用SYBER Green的实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），以验证微阵列数据。随机选择11种基因，并且用于扩增每种基因的引物在Additional File-1中列出。样品一式三份地运行，并且通过ABI 7700热循环仪（Applied Biosystems，Bedford，MA）执行PCR。按照geNorm方法，同时确定多个持家基因（GNB、β-肌动蛋白、GAPDH和微管蛋白）的表达用于标准化。执行线性回归分析，并且计算变异系数，以评估在这11种随机选择的基因的RT-PCR和基因阵列结果之间的关联性。

自Affymetrix芯片研究鉴定差异表达基因。

简言之，对每个探针组执行方差分析（ANOVA）。该检验设计为检测在任何组对之间的差异表达基因。调整p值以控制多重假设检验（Benjamini & Hochberg，1995）中的假发现率（FDR）。使用p.fdr<0.25的阈值，累积鉴定了228种差异表达基因（DEGs）。随后执行分层聚类分析以探究DEGs的基因表达谱是否可以将样品分到不同类别内。所有未掩蔽的探针组用于这个分析中。图4显示聚类结果。3个组通过DGEs的基因表达谱完全分开，其通过热图上方的彩色面板指出（图4）。使用多维量表图，基于所有未掩蔽的探针组的基因表达谱，进一步显现样品间的分离（图5）。

为了选择差异表达基因，在每个组对之间执行配对t检验。在每个比较中对阵列上的每个探针组计算倍数变化、p值和FDR调整的p值（Benjamini & Hochberg，1995）。差异表达基因（DEGs）定义为具有FDR调整的p值<0.25和倍数变化>2的那些基因。例如，表6显示通过倍数变化排序的IBS-D和健康志愿者之间的40种DEGs。进行在每对组之间t检验DEGs的完全列表。为了鉴定可以用于IBS-C和IBS-D亚组诊断的基因，进一步选择基于倍数变化和P值在2个组中都上调的所选26种基因（表7）。

所选差异表达基因（DEGs）的实时定量PCR验证。由微阵列数据分析鉴定的66种所选基因，通过q-PCR进一步验证，其中使用购自AppliedBiosystems的探针（表8）。在来自27个健康志愿者、19个IBS-C、22个IBS-D和17个IBS-M患者的Paxgene血样中，通过相对于β-肌动蛋白标准化每种基因的表达，测量所选基因的相对表达。在66种所选基因中，16种基因通过RT q-PCR无法检测。就个体IBS患者的倍数变化水平，在剩余的50种基因中相对表达在很大程度上证实了微阵列结果。这些q-PCR反应中的36个的数据显示于图10中。此外，qRT-PCR数据也针对5种靶向基因（SERT、TPH1、MAO-A、TLR2和TLR4）获得，这些基因在IBS-C、IBS-D和IBS-M患者中不是差异表达的（图11）。

表6.在IBS-D与健康志愿者比较中差异表达的前40种基因。

表7.基于倍数变化和P值在2个组（IBS-C和IBS-D）中都上调的26种基因。

表8.选择用于qRT-PCR验证的66种差异表达基因

F.实施例6

使用外周血中的表达模式，分类IBS和正常状态。

随后应用实施例5中发现的结果，以使用外周血中的表达模式确定最低限度基因集合分类IBS与正常状态的能力。所有数据分析使用R版本2.7.2执行。将原始数据对数转化，以达到更接近于高斯分布的分布。0值替换为每种基因的检测值的最小值的50%。在由于遗失数值而去除1个样品（#3）后，形成62x28数据矩阵。将IBS患者样品合并在一起作为标记“1”，并且健康志愿者标记为“0”。对于每种基因执行在疾病和健康阶段之间的标准t检验，并且平均值之间的p值和差异在表7中列出。基于p.值<0.01和abs（差异.平均值）>0.5的组合标准，选择基因。使用测试的4种不同的机器学习算法在R中进行预测，以构建从健康阶段预测疾病阶段的模型。表9显示当建立不同模型时，IBS的预测准确度。

表9.使用4种不同预测模型通过基因表达分析的IBS预测

预测模型	所有基因	所选基因
			收缩质心（PAM）	79%
随机森林	80%	82%
			支持向量机模型	74%	82%
神经网络模型	71%	77%

收缩质心（PAM）模型

基于在R的“pamr”包中进行的收缩质心算法，构建了收缩质心（PAM）模型。该模型由24种基因组成，并且留一法(leave-one-out)准确度是79%。

随机森林模型

我们使用的第二预测模型基于在R的“randomForest”包中执行的随机森林算法。第一个模型基于整个基因集，第二个模型基于由t检验选择的7种基因。2个模型的留一法准确度分别是80%和82%。

支持向量机模型：

基于在R的“svm”包中执行的支持向量机算法，构建2个模型。第一个模型基于整个基因集，第二个模型基于由t检验选择的7种基因。2个模型的留一法准确度分别是74%和82%。

神经网络模型：

基于在R的“nnet”包中执行的神经网络算法，构建2个模型。第一个模型基于整个基因集，并且第二个模型基于由t检验选择的7种基因。2个模型的留一法准确度分别是71%和77%。

如表10中所示，在实施例5中鉴定的66种DEGs的基因本体分析揭示，6种基因本体与IBS-D和健康志愿者之间的DEGs显著相关，包括核糖体、蛋白质生物合成、RNA结合、细胞内、信号转导和蛋白质结合本体。对于IBS诊断和预后特别有用的7种基因的生物学功能在表11中概述。

表10.66种DEGs的基因本体富集分析。6种基因本体与IBS-D和健康志愿者之间的DEGs显著相关。

DB_术语	DB_类	p值	比值比	95%CI
					核糖体	细胞组分	2.70E-07	49.52	13.31-156.96
蛋白质生物合成	生物学过程	2.00E-06	32.69	8.83-103.07
					RNA结合	分子功能	5.40E-06	18.88	5.62-57.69
细胞内	细胞组分	0.0062	4.69	1.40-14.27
					信号转导	生物学过程	0.02	3.92	1.07-12.25
蛋白质结合	分子功能	0.021	3.33	1.10-10.52

表11.所选基因的生物学功能及其与IBS的生物学相关性。

尽管为了澄清理解的目的，本发明已通过举例说明和例子进行了一定详细程度的描述，但本领域技术人员将理解，可以实施一些变化和修饰而仍落入后附权利要求的范围。此外，本文提供的每个参考文献整体引入作为参考，其程度与每个参考文献单独地引入作为参考一样。

序列表

 

Claims (63)

1.一种在有需要的受试者中诊断肠易激综合征（IBS）的方法，所述方法包括：

（a）从得自所述受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA；

（b）在适于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使所述分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；

（c）检测所述复合物的水平；和

（d）确定所述复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是与不存在IBS相关的第二参考水平，从而在所述受试者中诊断IBS，

其中所述生物标记是来自基因的RNA，所述基因选自表4中的基因，例如CCDC147。

2.权利要求1的方法，其中所述方法包括检测选自表4中的标记的至少2种IBS生物标记，例如CCDC147和VIPR1，的水平。

3.权利要求2的方法，其中所述方法包括检测选自表4中的标志的至少5种IBS生物标记的水平。

4.权利要求3的方法，其中所述生物标记是CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3。

5.权利要求1–3中任一项的方法，其中所述生物标记选自表1中的那些。

6.权利要求1的方法，其中所述生物标记选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3。

7.权利要求6的方法，其中所述生物标记是CCDC147。

8.权利要求6的方法，其中所述生物标记是VIPR1。

9.权利要求6的方法，其中所述生物标记是LPAR5。

10.权利要求6的方法，其中所述生物标记是CCDC144A。

11.权利要求6的方法，其中所述生物标记是GNG3。

12.权利要求1的方法，其中所述生物标记是编码具有SEQ ID NOS:1-75和154–162之任一的氨基酸序列的蛋白质的mRNA分子。

13.权利要求1的方法，其中所述生物标记是包含SEQ ID NOS:76–162之任一的核酸序列的RNA分子。

14.权利要求1的方法，其中所述检测试剂包含寡核苷酸。

15.权利要求14的方法，其中所述检测复合物水平的步骤包括寡核苷酸杂交。

16.权利要求15的方法，其中所述方法包括基于微阵列或珠的杂交。

17.权利要求14的方法，其中所述检测复合物水平的步骤包括核酸扩增。

18.权利要求17的方法，其中所述方法包括qPCR或质谱法。

19.权利要求2或3的方法，其中所述检测复合物水平的步骤包括定量多种生物标记的水平，从而确定生物标记谱。

20.权利要求18的方法，其中所述确定复合物水平更紧密地类似于第一还是第二参考水平的步骤包括：应用算法，以确定该生物标记谱更紧密地类似于与IBS相关的第一参考谱还是与不存在IBS相关的第二参考谱。

21.权利要求20的方法，其中所述算法包括学习统计学分类器***。

22.权利要求21的方法，其中所述学习统计学分类器***选自随机森林、分类回归树、boosted树、神经网络、支持向量机、一般卡方自动交互式检测器模型、交互树、多元自适应回归样条、机器学习分类器、及其组合。

23.权利要求21的方法，其中所述统计学算法包括单一学习统计学分类器***。

24.权利要求21的方法，其中所述统计学算法包括至少2种学习统计学分类器***的组合。

25.权利要求1的方法，其中生物学样品选自血清、血浆、全血和大便。

26.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括检测选自下述的生物标记：细胞因子、生长因子、抗嗜中性粒细胞抗体、抗酿酒酵母抗体（ASCA）、抗微生物抗体、肥大细胞标记、应激标记、胃肠道激素、血清素代谢物、血清素途径标记、碳水化合物缺陷转铁蛋白（CDT）、乳铁蛋白、抗组织转谷氨酰胺酶（tTG）抗体、脂质运载蛋白、基质金属蛋白酶（MMP）、脂质运载蛋白和MMP的复合物、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）、球蛋白（例如α-球蛋白）、肌动蛋白切割蛋白、S100蛋白、血纤肽、降钙素基因相关肽（CGRP）、速激肽、生长素释放肽、神经降压肽、促皮质素释放激素（CRH）、弹性蛋白酶、C-反应蛋白（CRP）、乳铁蛋白、抗乳铁蛋白抗体、钙防卫蛋白、血红蛋白、NOD2/CARD15、血清素重摄取转运蛋白（SERT）、色氨酸羟化酶-1,5-羟基色胺（5-HT）、乳酮糖、丝氨酸蛋白酶、***素、组胺、及其组合。

27.权利要求26的方法，其中所述细胞因子选自IL-8、IL-1β、TNF-相关的细胞凋亡弱诱导物（TWEAK）、瘦素、护骨蛋白（OPG）、MIP-3β、GROα、CXCL4/PF-4、CXCL7/NAP-2、及其组合。

28.权利要求26的方法，其中所述生长因子选自表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、色素上皮衍生的因子（PEDF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、双调蛋白（SDGF）、及其组合。

29.权利要求26的方法，其中所述抗嗜中性粒细胞抗体选自抗嗜中性粒细胞细胞质抗体（ANCA）、核周抗嗜中性粒细胞细胞质抗体（pANCA）及其组合。

30.权利要求26的方法，其中所述ASCA选自ASCA-IgA、ASCA-IgG及其组合。

31.权利要求26的方法，其中所述抗微生物抗体选自抗外膜蛋白C（抗OmpC）抗体、抗鞭毛蛋白抗体、抗I2抗体及其组合。

32.权利要求26的方法，其中所述脂质运载蛋白选自嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白（NGAL）、NGAL/MMP-9复合物及其组合。

33.权利要求26的方法，其中所述MMP是MMP-9。

34.权利要求26的方法，其中所述TIMP是TIMP-1。

35.权利要求26的方法，其中所述α-球蛋白选自α-2-巨球蛋白、触珠蛋白、血清类粘蛋白及其组合。

36.权利要求26的方法，其中所述肌动蛋白切割蛋白是凝溶胶蛋白。

37.权利要求26的方法，其中所述S100蛋白质是钙粒蛋白。

38.权利要求26的方法，其中所述血纤肽是血纤肽A（FIBA）。

39.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括确定症状谱，其中所述症状谱通过鉴定所述个体中至少一种症状的存在或严重性而确定；和使用基于所述诊断标记谱和所述症状谱的算法，将所述样品分类为IBS样品或非IBS样品。

40.权利要求39的方法，其中所述至少一种症状选自胸痛、胸痹、胃灼热、在进食分量适中的膳食后不舒服的饱胀感、不能完成适中分量的膳食、腹痛、腹部不适、便秘、腹泻、胀气、腹部膨胀、与具有疼痛或不适相关的负面想法或感觉、及其组合。

41.权利要求39的方法，其中所述至少一种症状的存在或严重性使用问卷进行鉴定。

42.权利要求41的方法，其中所述问卷选自：询问所述个体关于所述至少一种症状的存在或严重性的一组问题、询问所述个体关于与具有疼痛或不适相关的负面想法或感觉的存在或严重性的一组问题、及其组合。

43.权利要求39的方法，其中所述至少一种症状的存在或严重性通过询问所述个体是否所述个体目前正在经历任何症状而鉴定。

44.权利要求39的方法，其中所述症状谱通过鉴定至少2、3、4、5或6种症状的存在或严重性而确定。

45.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括步骤：以所述受试者具有IBS的概率的形式，对所述受试者提供诊断。

46.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括将样品分类为IBS-便秘型（IBS-C）、IBS-腹泻型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）、IBS-交替型（IBS-A）、或感染后IBS（IBS-PI）样品。

47.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括将非IBS样品分类为正常、炎性肠病（IBD）或非IBD样品。

48.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括排除肠炎症。

49.一种用于监控受试者中肠易激综合征（IBS）的进展或消退的方法，所述方法包括：

（a）从在第一时间点得自所述受试者的第一生物学样品，确定第一生物标记谱；

（b）从在第二时间点得自所述受试者的第二生物学样品，确定第二生物标记谱；和

（c）比较所述第一和所述第二生物标记谱，以（i）确定哪个生物标记谱最类似于或最不类似于与IBS相关的第一参考谱，（ii）确定哪个生物标记谱最不类似于或最类似于与不存在IBS相关的第二参考谱，或（iii）确定前述相似性中的至少2个，

其中所述生物标记谱包含表4中的至少2种生物标记的表达信息，

从而监控所述受试者中IBS的进展或消退。

50.权利要求49的方法，其中所述生物标记选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3。

51.权利要求50的方法，其中所述生物标记是CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3。

52.权利要求49的方法，其中在获取所述第一生物学样品的时间和获取所述第二生物学样品的时间之间的时间段中，向所述受试者施用用于IBS的治疗。

53.权利要求52的方法，其中所述治疗是选自下述的药物：5-羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。

54.一种用于对有需要的受试者分配用于IBS的治疗的方法，所述方法包括：

（a）从得自所述受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA；

（b）在适于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使所述分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；

（c）检测所述复合物的水平；

（d）确定所述复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是与不存在IBS相关的第二参考水平；和

（e）如果所述水平更紧密地类似于与IBS相关的所述第一参考水平，那么分配用于IBS的治疗，其中所述IBS RNA生物标记选自表4中的那些。

55.权利要求54的方法，其中所述方法包括检测选自表4中的标记的至少2种IBS生物标记的水平。

56.权利要求54的方法，其中所述方法包括检测选自表4中的标记的至少5种IBS生物标记的水平。

57.权利要求54的方法，其中所述生物标记是CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A和GNG3。

58.权利要求54–56之任一项的方法，其中所述生物标记选自表1中的那些。

59.权利要求54的方法，其中所述生物标记选自CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A和FOXD3。

60.权利要求54的方法，其中所述生物标记是编码具有SEQ IDNOS:1-75和154–162之任一的氨基酸序列的蛋白质的mRNA分子。

61.权利要求54的方法，其中所述生物标记是包含SEQ ID NOS:76–162之任一的核酸序列的RNA分子。

62.权利要求54的方法，其中所述方法进一步包括给所述受试者施用用于IBS的治疗。

63.权利要求62的方法，其中所述治疗包括施用选自下述的药物：5-羟色胺能药物、抗抑郁药、氯离子通道激活物、鸟苷酸环化酶激动剂、抗生素、阿片类、神经激肽拮抗剂、镇痉剂或抗胆碱能药物、颠茄生物碱、巴比妥酸盐、其游离碱、其药学可接受的盐、其衍生物、其类似物、及其组合。

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