CN102858962A - 用于增加多肽稳定性和活性的组合物及相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明内容提供了用于增强或提高多肽(如Taq聚合酶)稳定性的肽、多肽、融合多肽、组合物和方法。这些肽、多肽、融合多肽或组合物包括与能增强多肽稳定性的肽标签相连接的多肽。这些肽、多肽、融合多肽、组合物还可增强反应混合物中的其他多肽的活性、特异性和/或保真度。本发明内容还提供了使用这些肽、多肽、融合多肽、组合物的方法。

Description

用于增加多肽稳定性和活性的组合物及相关方法

与相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2009年11月19日的美国临时申请号61/262,919，提交于2010年6月1日的美国临时申请号61/350,457，提交于2010年6月18日的美国临时申请号61/356,541，以及提交于2010年10月7日的美国临时申请号61/390,857的权益，以上专利申请以全文引用的形式并入本文。

背景技术

本领域需要能够增强蛋白质稳定性的方法和组合物。尤其需要能够增强聚合酶，如Taq聚合酶的稳定性，使其在短期或长期暴露于冰点以上的温度后仍然能够保持酶活性的组合物。本领域还需要能够提高聚合酶的保真度、敏感性和产率的组合物。

发明内容

本公开内容提供了肽、多肽、融合多肽、组合物以及方法，它们能使酶(如DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、逆转录酶、DNA脱氨酶、RNA脱氨酶、蛋白酶)或者蛋白质(如***、人白血病抑制因子(hLIF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素、血管内皮生长因子(VEGF)、瘦素、贝伐珠单抗)在短期或长期暴露于约-20℃至约35℃的温度后仍保持活性。在一些实施方案中，本文所提供的肽、多肽、融合多肽或组合物能提高酶或蛋白质在室温下的稳定性。在一些实施方案中，本文提供的酶或蛋白质为任意核酸结合蛋白，例如，DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，其片段或其任意组合。在一些实施方案中，本文所提供的酶或蛋白质与其他蛋白质如激素受体结合。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物在-20℃到50℃之间的温度下保持活性。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物在-20℃和50℃之间的温度下保持酶活性或激素活性。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物在暴露于-20℃至50℃的温度后其酶活性或激素活性至少是暴露于所述温度之前的酶活性的50％。

在一些实施方案中，本文所提供的肽标签提高多肽、融合多肽或组合物的稳定性。在一些实施方案中，肽标签稳定多肽、融合多肽或组合物。在一些实施方案中，肽标签抑制多肽、融合多肽或组合物的酶活性丧失。在一些实施方案中，肽标签抑制多肽、融合多肽或组合物的降解。在一些实施方案中，肽标签提高多肽、融合多肽或组合物的稳定性或抑制其酶活性丧失持续至少一天。在一些实施方案中，肽标签提高多肽、融合多肽或组合物的稳定性或抑制其酶活性丧失持续至少一周。在一些实施方案中，肽标签提高多肽、融合多肽或组合物的稳定性或抑制其酶活性丧失持续至少一个月。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物，较之不含本文所提供的肽标签的相似多肽，显现出增强的稳定性、酶活性或激素活性。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物所具有的酶活性或激素活性是不含本文所提供的肽标签的相似多肽的酶活性或激素活性的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物在暴露于-20℃至50℃的温度后，其酶活性或激素活性是不含本文提供的肽标签的相似多肽的酶活性或激素活性的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物在暴露于-20℃至50℃的温度后，其酶活性和激素活性比不含本文提供的肽标签的相似多肽的酶活性和激素活性高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列的肽标签。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种具有与SEQ ID NO：1有50％至98％相同的氨基酸序列的肽标签。在一些实施方案中，肽标签具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13或SEQID NO：14所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽标签具有与SEQID NO：13或SEQ ID NO：14至少70％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物含有一种与SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11至少70％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物含有一种如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含一种与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22至少70％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物不具有如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种由与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15至少70％相同的核苷酸序列编码的肽标签。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列编码的肽标签。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种由与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：12至少70％相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含由SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列编码的多肽。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种具有与SEQ ID NO：10至少70％相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种多肽，该多肽包含能与双链DNA结合的基序。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种由与SEQ ID NO：9至少70％相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含一种由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，融合多肽包含一种由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23编码的多肽。

在一些实施方案中，本文所提供的融合多肽包含具有与SEQ IDNO：1有50％至98％相同的氨基酸序列的肽标签，以及至少一个多肽，其中该肽标签与所述至少一个多肽相连接，并且该肽标签在-20℃至50℃的温度下稳定融合多肽。在一个实施方案中，肽标签与所述至少一个多肽共价连接。在一个实施方案中，肽标签与所述至少一个多肽非共价连接。在一个实施方案中，肽标签与所述至少一个多肽的氨基末端相连接。在一个实施方案中，肽标签与所述至少一个多肽的羰基末端相连接。在一些实施方案中，融合多肽包含第一多肽和第二多肽。在一个实施方案中，第一多肽为酶，而第二多肽为双链结合蛋白。在一个实施方案中，肽标签与第一多肽的氨基末端相连接，而第一多肽的羰基末端与第二多肽的氨基末端相连接。在一个实施方案中，肽标签与第二多肽的氨基末端相连接，而第二多肽的羰基末端与第一多肽的氨基末端相连接。

一方面，本公开内容提供了一种包含与多肽相连接的肽标签的多肽、融合多肽或组合物，其中所述多肽在暴露于至少为约-10℃至约50℃的温度之下仍保留酶活性，其中所述融合多肽不具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

另一方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含(a)含有与肽相连接的第一多肽的融合多肽，其中所述融合多肽在暴露于至少为约-10℃至约50℃的温度之下仍保留酶活性；及(b)第二多肽。

在一些实施方案中，肽与多肽、所述第一多肽或所述第二多肽共价连接。在一些实施方案中，肽与多肽、所述第一多肽或所述第二多肽非共价连接。在一些实施方案中，肽与所述多肽、所述第一多肽或所述第二多肽在所述多肽、所述第一多肽或所述第二多肽的氨基末端相连接。在一些实施方案中，所述肽与所述多肽、所述第一多肽或所述第二多肽在所述多肽、所述第一多肽或所述第二多肽的羰基末端相连接。在一些实施方案中，多肽、第一多肽或第二多肽是一种热稳定的蛋白质。在一些实施方案中，所述热稳定的蛋白质是一种酶。在一些实施方案中，所述酶是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶、蛋白酶或脱氨酶。在一些实施方案中，所述融合多肽是由SEQ ID NO：4编码的多肽。在一些实施方案中，所述融合多肽与由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12编码的多肽至少70％相同。在一些实施方案中，所述肽与SEQ ID NO：1至少70％相同。

在一些实施方案中，本文所提供的组合物包含一种融合多肽，该融合多肽含有与第一多肽相连接的肽标签，以及第二多肽，其中该肽标签在-20℃至50℃的温度下稳定所述第一多肽或所述第二多肽。在一个实施方案中，肽标签在-20℃至约50℃的温度之下使第一多肽或第二多肽稳定至少一天。在一个实施方案中，融合多肽或第二多肽在-20℃至约50℃的温度之下保留酶活性或激素活性。在一个实施方案中，融合多肽或第二多肽在暴露于-20℃至50℃的温度后的酶活性或激素活性是所述融合多肽或第二多肽暴露于所述温度之前的酶活性或激素活性的至少50％。在一个实施方案中，第一多肽或第二多肽是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶、脱氨酶或蛋白酶。在一个实施方案中，第一多肽或第二多肽是***、人白血病抑制因子(hLIF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素、血管内皮生长因子(VEGF)、瘦素或贝伐珠单抗。在一个实施方案中，第一多肽或第二多肽包含至少一个突变。在一个实施方案中，融合多肽包含一种具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22至少70％相同的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，融合多肽包含一种由SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23编码的多肽。

在一些实施方案中，本文所提供的组合物另外还包含第三多肽。在一个实施方案中，融合多肽具有如SEQ ID NO：2所示的序列，第二多肽具有如SEQ ID NO：6所示的序列，而第三多肽具有如SEQ IDNO：11所示的序列。

在一些实施方案中，所述第二多肽是一种聚合酶。在一些实施方案中，所述第二多肽与由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12编码的多肽至少70％相同。在一些实施方案中，所述第二多肽与由SEQ ID NO：4编码的多肽至少70％相同。在一些实施方案中，所述融合多肽包含一种酶或聚合酶，且所述肽与由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7或SEQID NO：9编码的肽具有至少70％的同一性。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽选自DNA聚合酶I、水生栖热菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶I(Taq)和Thermococcus gorgonarius DNA聚合酶(Tgo)。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽为***。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽为Taq聚合酶。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽为Tgo聚合酶，或与Tgo聚合酶至少70％相同。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽为Taq聚合酶。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽选自嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)焦磷酸酶(TAPP)、超嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)dCTP脱氨酶、胞苷脱氨酶和脱氧胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶是RNA脱氨酶或DNA脱氨酶。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽是非热稳定的蛋白质。在一些实施方案中，所述非热稳定的蛋白质是人白血病抑制因子(hLIF)或瘦素。在一些实施方案中，所述温度是约20℃至约30℃。

在一些实施方案中，暴露于所述温度至少1周。在一些实施方案中，所述酶活性高于暴露在至少约-20℃至约35℃的温度之前的酶活性的大约50％。在一些实施方案中，所述肽具有与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述融合多肽具有与SEQ ID NO：2至少70％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽与由核苷酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9编码的肽至少70％相同。在一些实施方案中，所述肽连接的多肽与由核苷酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12编码的多肽至少70％相同。在一些实施方案中，所述肽连接的多肽与由核苷酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12编码的多肽至少70％相同。

另一方面，本公开内容提供了一种多肽、融合多肽或组合物，其包含具有与SEQ ID NO：1、8或13至少70％同源的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述肽与多肽相连接。在一些实施方案中，所述肽与多肽通过共价或非共价键相连接。在一些实施方案中，所述多肽是一种热稳定的蛋白质。在一些实施方案中，所述热稳定的蛋白质是一种酶。在一些实施方案中，所述酶是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶或脱氨酶。在一些实施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶I、水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq)、Thermococcus gorgonariusDNA聚合酶(Tgo)。在一些实施方案中，所述聚合酶是Taq聚合酶。在一些实施方案中，所述焦磷酸酶是嗜酸热原体焦磷酸酶(TAPP)。在一些实施方案中，所述焦磷酸酶是超嗜热火球菌dCTP脱氨酶。在一些实施方案中，所述脱氨酶是胞苷脱氨酶或脱氧胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，所述脱氨酶是RNA脱氨酶或DNA脱氨酶。在一些实施方案中，所述多肽是一种非热稳定的蛋白质。在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽是嗜热栖热菌(Thermusthermophilics，Tth)DNA聚合酶或ZO5聚合酶。

在一些实施方案中，所述多肽、第一多肽或第二多肽是人白血病抑制因子(hLIF)或瘦素。在一些实施方案中，所述肽连接的多肽在暴露于约-20℃至约35℃的温度之后保持酶活性。在一些实施方案中，所述多肽在暴露于约20℃至约30℃的温度之后显示酶活性。在一些实施方案中，暴露于所述温度多于1天。在一些实施方案中，酶活性高于组合物暴露于至少约-20℃至约35℃的温度之前的活性的约50％。在一些实施方案中，所述肽是由与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7至少70％相同的核苷酸序列编码的。

又一方面，本公开内容提供了一种融合多肽，其包含与由SEQ IDNO：3编码的肽至少70％相同的第一多肽，以及与由SEQ ID NO：9编码的肽至少70％相同的第二多肽。在一些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽与第三多肽相连接。在一些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽相互连接。在一些实施方案中，所述连接是共价的。在一些实施方案中，所述第一多肽与一个多肽的N末端相连接，其中所述第二多肽与所述多肽的C末端相连接。

在一些实施方案中，所述第二多肽与所述第一多肽的C末端相连接。在一些实施方案中，所述融合多肽与由SEQ ID NO：7编码的肽有至少70％的同一性。

又一方面，本公开内容提供了一种核酸扩增方法，该方法包括用含有聚合酶的混合物延伸核酸引物，其中所述聚合酶与一种肽相连接，所述肽与由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19编码的肽至少70％相同。在一些实施方案中，聚合酶在其N末端与肽相连接。在一些实施方案中，聚合酶在其C末端与肽相连接。在一些实施方案中，聚合酶是Taq聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶在暴露于-20℃至50℃的温度之后仍显示酶活性。在一些实施方案中，聚合酶在暴露于约-20℃至约35℃的温度之后仍显示酶活性。在一些实施方案中，混合物还包含第二聚合酶。在一些实施方案中，所述第二聚合酶与肽序列相连接，所述肽序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18至少70％同源。在一些实施方案中，聚合酶在暴露于约20℃至约30℃的温度至少一天之后仍显示酶活性。在一些实施方案中，酶活性高于组合物在暴露于约20℃至约30℃的温度至少一天之前的活性的约50％。

在一些实施方案中，提供了增强多肽稳定性的方法，该方法包括提供一种具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列的肽标签。

在一些实施方案中，提供了肽标签用于增强多肽稳定性的用途，其中该肽标签具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肽标签具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽标签是由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示的核酸序列编码的。在一些实施方案中，肽标签包含至少一至六个组氨酸残基。在一些实施方案中，肽标签包含蛋白酶酶切位点。在一些实施方案中，蛋白酶酶切位点包含氨基酸序列DDDDK。在一些实施方案中，肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制多肽的降解或变性。在一些实施方案中，肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制多肽的蛋白质功能的丧失。在一些实施方案中，多肽在暴露于所述温度后的蛋白质功能是该多肽在暴露于所述温度前的至少50％。在一些实施方案中，肽标签在-20℃至50℃的温度下维持多肽稳定性至少一天。在一些实施方案中，连接于多肽的肽标签具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肽标签与多肽相连接。在一些实施方案中，肽标签与多肽共价连接。在一些实施方案中，肽标签与多肽非共价连接。在一些实施方案中，肽标签与多肽的氨基末端相连接。在一些实施方案中，肽标签与多肽的羰基末端相连接。在一些实施方案中，肽标签是***、人白血病抑制因子(hLIF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素、血管内皮生长因子(VEGF)、瘦素或贝伐珠单抗。在一些实施方案中，多肽包含至少一个突变。

在一些实施方案中，肽标签不与多肽连接。

在一些实施方案中，连接于多肽的肽标签由SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的核酸序列编码。在一些实施方案中，多肽是热稳定的蛋白质或酶。在一些实施方案中，所述酶是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶、脱氨酶或蛋白酶。在一些实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶I、水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq)、Thermococcus gorgonarius DNA聚合酶(Tgo)、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶或ZO5 DNA聚合酶。在一些实施方案中，焦磷酸酶是嗜酸热原体焦磷酸酶(TAPP)。在一些实施方案中，脱氨酶是超嗜热火球菌dCTP脱氨酶。

在一些实施方案中，提供了增强多肽、融合多肽或组合物稳定性的方法，该方法包括提供与SEQ ID NO：1有50％至98％相同的肽标签。在一些实施方案中，提供了增强多肽、融合多肽或组合物稳定性的方法，该方法包括提供不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：11的多肽。在一些实施方案中，提供了抑制多肽、融合多肽或组合物的酶活性或激素活性丧失的方法，该方法包括提供与SEQ ID NO：1有50％至98％相同的肽标签。在一些实施方案中，提供了抑制多肽、融合多肽或组合物的酶活性或激素活性丧失的方法，该方法包括提供不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11的多肽。在一些实施方案中，提供了抑制多肽、融合多肽或组合物降解的方法，该方法包括提供与SEQ ID NO：1有50％至98％相同的肽标签。在一些实施方案中，提供了抑制多肽、融合多肽或组合物降解的方法，该方法包括提供不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11的多肽。在一些实施方案中，肽与多肽相连接。在一些实施方案中，多肽或组合物还包含第二多肽，其中连接于多肽的肽标签增强了第二多肽的稳定性。在一些实施方案中，多肽或组合物还包含第三多肽，其中连接于多肽的肽标签增强了第二多肽或第三多肽的稳定性

在一些实施方案中，提供了增强多肽的稳定性的方法，该方法包括提供一种具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列的肽标签，其中该肽标签不是SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，提供了肽标签用于增强多肽的稳定性的用途，其中该肽标签具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列，其中该肽标签不是SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，提供了增强多肽、融合多肽或组合物的稳定性的方法，其中该多肽、融合多肽或组合物不是连接于一个多肽的SEQ IDNO：1。在一些实施方案中，提供了肽标签用于增强多肽、融合多肽或组合物的稳定性的用途，其中该多肽、融合多肽或组合物不是连接于一个多肽的SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，提供了增强多肽、融合多肽或组合物的稳定性的方法，其中该多肽、融合多肽或组合物不是连接于Taq聚合酶的SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，提供了肽标签用于增强多肽、融合多肽或组合物的稳定性的用途，其中该多肽、融合多肽或组合物不是连接于Taq聚合酶的SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，提供了增强多肽、融合多肽或组合物的稳定性的方法，其中该多肽、融合多肽或组合物不是连接于Tgo聚合酶的SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，提供了肽标签用于增强多肽、融合多肽或组合物的稳定性的用途，其中该多肽、融合多肽或组合物不是连接于Tgo聚合酶的SEQ ID NO：1。

又一方面，本公开内容提供了一种可在细菌内使用的核酸载体，其包含位于编码与肽相连的多肽的核酸序列上游的真核翻译起始序列，其中所述多肽在约-20℃至约35℃或20℃至约50℃的温度下保持酶活性。在一些实施方案中，所述多肽被翻译成长和短两种形式。在一些实施方案中，真核翻译起始序列至少部分编码在约-20℃至约35℃的温度下保持酶活性的多肽。在一些实施方案中，真核翻译起始序列是Kozak序列(GCCGCCACCATGGTC)。在一些实施方案中，真核翻译起始序列位于编码多肽的核酸序列的上游，其中该多肽是SEQ ID NOs：1、2、6、8、10、11或13，或其变体、片段或突变体。在一些实施方案中，组合物包含含有本文所述核酸载体的细菌。

又一方面，本公开内容提供了一种包含与肽相连的多肽的组合物，其中所述多肽在约-20℃至约35℃的温度下保持酶活性，其中所述多肽是由具有真核翻译起始序列的核酸序列编码的。在一些实施方案中，多肽是热稳定的蛋白质。在一些实施方案中，多肽是酶。在一些实施方案中，酶是聚合酶、焦磷酸酶或脱氨酶。在一些实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶I、水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq)或Thermococcus gorgonarius DNA聚合酶(Tgo)。在一些实施方案中，聚合酶是Taq聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶不是Taq聚合酶。在一些实施方案中，焦磷酸酶是嗜酸热原体焦磷酸酶(TAPP)。在一些实施方案中，脱氨酶是超嗜热火球菌dCTP脱氨酶。在一些实施方案中，所述脱氨酶是胞苷脱氨酶或脱氧胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，所述脱氨酶RNA脱氨酶或DNA脱氨酶。在一些实施方案中，所述真核翻译起始序列是Kozak序列(GCCGCCACCATGGTC)。在一些实施方案中，所述组合物包含短型和长型的所述多肽。在一些实施方案中，所述与肽相连的多肽与由核酸序列SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：12编码的多肽至少70％相同。在一些实施方案中，所述多肽连接至与SEQ ID NO：1、3或10至少70％相同的肽。

在一些情况下，当酶(如Taq聚合酶、DNA脱氨酶、RNA脱氨酶)与肽(如与SEQ ID NO：1至少70％相同的肽)相连接时，显现出的活性为其短期或长期暴露于约-20℃至约35℃的温度前的活性的至少20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，暴露持续至少1、2、3、4、5、6或10小时，至少1、2、3、4、5或6天，或至少1、2、3、4、5、6或10周，或至少1、2、3、4、5、6或10个月。

本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请通过引用整体并入本文，其程度等同于各出版物、专利及专利申请明确且单独地通过引用并入本文。

附图说明

本文所提供的实施方案的新特征在所附权利要求中特别陈述。参考以下描述说明性实施方案(其中运用了实施方案的原理)的详细说明及附图，可更好地理解本文所提供的实施方案的特征及优势。

图1描述了为了检测肽-多肽融合蛋白(SEQ ID NO：2)在暴露于35℃后的稳定性而进行的qPCR扩增。新鲜qPCR混合物的第一个样品储存于-20℃(上图)，而第二个样品于35℃储存4周(下图)。

图2描述了42个氨基酸的肽标签的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图3描述了由图2中的肽标签(SEQ ID NO：1)连接于野生型Taq聚合酶的N末端组成的融合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。42个氨基酸的肽标签的序列以下划线标出。

图4描述了编码42个氨基酸的肽标签(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

图5描述了由图2中的肽标签(SEQ ID NO：1)连接于野生型Taq聚合酶的N末端所组成的融合多肽(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列。其完整的核苷酸序列被命名为SEQ ID NO：4。编码42个氨基酸的肽标签的核苷酸序列以下划线标出。

图6描述了融合多肽(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列，该融合多肽是由图2中的经修饰的肽标签片段(SEQ ID NO：1)(粗体且有下划线)连接于双链结合蛋白(DSP)片段的相应肽(下划线部分，非粗体)，并连接于野生型Taq聚合酶的N末端而组成的。其完整的核苷酸序列被命名为SEQ ID NO：5。

图7描述了融合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，该融合多肽是由图2中的经修饰的肽标签片段(SEQ ID NO：1)(粗体且有下划线)连接于双链结合蛋白(DSP)片段的相应肽(下划线部分，非粗体)，并连接于野生型Taq聚合酶的N末端而组成的。

图8描述了编码肽标签的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，该肽标签是由经修饰的图2中的肽标签片段(SEQ ID NO：1)(粗体且有下划线)连接于双链结合蛋白(DSP)片段的相应肽(下划线部分，非粗体)而组成的。

图9描述了肽标签的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，该标签肽是由经修饰的图2中的肽标签片段(SEQ ID NO：1)(粗体且有下划线)连接于双链结合蛋白(DSP)片段的相应肽(下划线部分，非粗体)而组成的。

图10描述了编码DSP标签肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

图11描述了DSP标签的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

图12描述了融合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，该融合多肽是图2中的经修饰的肽标签片段(SEQ ID NO：1)(粗体且有下划线)与连接于DSP肽(下划线部分，非粗体)的Tgo聚合酶多肽相连接而成的。

图13描述了编码融合多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)，该融合多肽是经修饰的图2中的肽标签片段(SEQ ID NO：1)(粗体且有下划线)与连接于DSP肽(下划线部分，非粗体)的Tgo聚合酶多肽相连接而成的。

图14描述了SEQ ID NO：1肽的片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。

图15描述了显示用多种聚合酶从大麦基因组DNA进行的DNA扩增的电泳凝胶。

图16描述了SEQ ID NO：1肽的修饰片段的氨基酸序列(SEQ IDNO：14)。

图17描述了编码36个氨基酸的肽(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。

图18描述了SEQ ID NO：1肽的修饰片段的氨基酸序列(SEQ IDNO：16)。

图19描述了编码40个氨基酸的肽(SEQ ID NO：16)的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。

图20描述了SEQ ID NO：1肽的修饰片段的氨基酸序列(SEQ IDNO：18)。

图21描述了编码29个氨基酸的肽(SEQ ID NO：18)的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。

图22描述了与人***多肽连接的SEQ ID NO：1肽的修饰片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。

图23描述了编码SEQ ID NO：20多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)。

图24描述了与人白血病抑制因子连接的SEQ ID NO：1肽的修饰片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。

图25描述了编码SEQ ID NO：22多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。

图26描述了显示用肽标签-聚合酶混合物从鼠基因组DNA进行的DNA扩增的电泳凝胶。

发明详述

概述

本公开内容提供了在短期或长期暴露在介于-20℃和+50℃之间或从约-20℃至+35℃的温度后，增强蛋白质(如热稳定酶、非热稳定酶)稳定性的组合物和方法。在一些实施方案中，组合物是肽标签或包含肽标签的融合蛋白。蛋白质可以是任何类型的蛋白质。肽标签能协助保持蛋白质的结构、稳定性、酶活性、结合活性及任何其他性质。在一些实施方案中，蛋白质是核酸结合蛋白质。在一些实施方案中，与不含标签的相似蛋白质相比，融合蛋白显现出增强的稳定性或酶活性，特别是在短期或长期暴露于特定温度(如室温)之后。本文还公开了融合多肽，当融合多肽与反应样品中的其他蛋白质混合在一起时，该融合多肽能增强这些蛋白质的活性(如敏感性、产率、特异性)。本文还提供了用于本文所述组合物的载体、试剂盒以及使用该组合物的方法。

肽标签

本文所提供的组合物包含能增强多肽(例如酶、Taq聚合酶)及其变体、突变体和片段的稳定性的肽(如具有SEQ ID NO：1(图2)、SEQ ID NO：8(图9)、SEQ ID NO：10(图11)、SEQ ID NO：13(图13)、SEQ ID NO：14(图16)氨基酸序列的肽)。

本文使用的“增强或提高多肽的稳定性”是指，例如，维持多肽的稳定性、抑制多肽降解、抑制多肽变性、抑制多肽的蛋白质活性(如酶活性或激素活性)丧失、抑制多肽聚集、抑制多肽结晶、抑制多肽吸收、保留多肽功能或保留多肽的一级、二级或三级结构。

SEQ ID NO：1(图2)显示本文所述长型(42个氨基酸)肽标签的氨基酸序列。SEQ ID NO：13(图14)公开了SEQ ID NO：1的31个氨基酸的片段，该片段也可用作本文所公开的多肽、融合多肽、组合物及方法中的肽标签。SEQ ID NO：14(图16)公开了SEQ ID NO：1的36个氨基酸的片段，该片段也可用作本文所公开的多肽、融合多肽、组合物及方法中的肽标签。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：13及SEQID NO：14可以单独使用、一起使用或与其他标签联合使用，以增强多肽的稳定性、结合亲和力、酶活性、产率或其他性质。

SEQ ID NO：10公开了双链DNA结合蛋白(DSP)片段的序列。肽SEQ ID NO：10也可以独自或与肽标签SEQ ID NO：1或其他本文所述肽标签一起用于本文所述的组合物及方法。例如，图7(SEQ IDNO：6)提供了与SEQ ID NO：1的片段相连接且与SEQ ID NO：10的片段相连接的聚合酶的示例。图12(SEQ ID NO：11)提供了同时与SEQ ID NO：1的片段及DSP片段(SEQ ID NO：10)相连接的聚合酶(此处为tgo聚合酶)的示例，其公开为SEQ ID NO：11中非粗体、以下划线标出的序列(图12)。

所述组合物还包含与SEQ ID NO：1(图2)、SEQ ID NO：8(图9)、SEQ ID NO：10(图11)、SEQ ID NO：13(图14)或SEQ ID NO：14(图16)至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同(或同源)的肽。类似地，组合物还包含与由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15编码的肽至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的肽。

在一些实施方案中，肽标签限制在50个氨基酸以内。在一些实施方案中，肽标签限制在55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸以内。

两个氨基酸序列的序列同一性百分比是用如Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman等人，(1970)，J.Mol.Biol.48：444；Sellers(1974)，SIAM J.Appl.Math.，26：787)所述的、把肽或多肽的全长考虑在内的总体比对进行比对的。FASTA分析的说明性参数为：ktup＝1、空位开放罚分＝10、空位延伸罚分＝1、置换矩阵＝BLOSUM62。

在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含His肽标签，其中His肽标签含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15或20个His残基。在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含His肽标签，其中His肽标签含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15或20个His残基。在一些实施方案中，His肽标签含有1至5个、2至6个、3至7个、4至8个、5至9个、6至10个、7至11个、8至12个、9至13个、10至14个、1至10个、2至11个、3至12个、4至13个、5至14个、6至15个、7至16个、8至17个、9至19个、10至20个、1至20个、2至19个、3至18个、4至17个、5至16个、6至15个、7至14个、8至13个、9至12个、10至11个、1至6个、1至7个、1至9个或1至10个His残基。

在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含可被蛋白酶酶切的序列。在一些实施方案中，肽标签包含蛋白酶酶切位点。蛋白酶及相关酶切残基(括号内)的非限制性示例包括胰蛋白酶(Arg或Lys)、糜蛋白酶(Trp、Tyr、Phe、Leu、Met或His)、内切蛋白酶Asp-N(Asp)、内切蛋白酶Asp-C(Arg)、内切蛋白酶Glu-C(Glu)、内切蛋白酶Lys-C(Lys)、脯氨酸-内肽酶(Pro)、胃蛋白酶(Phe、Tyr、Trp或Leu)、嗜热菌蛋白酶(Ile、Leu、Val、Ala、Met或Phe)、凝血酶(Arg)、弹性蛋白酶(Ala或Val)、木瓜蛋白酶(Leu或Gly)、蛋白酶K(芳香族氨基酸)、枯草杆菌蛋白酶(His、Ser、Asp)和梭菌蛋白酶(Arg)。在一些实施方案中，肽标签包含可被羧肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶P、羧肽酶Y、组织蛋白酶C、无环氨基酸释放酶(acycloamino-acid-releasing enzyme)和焦谷氨酸氨基肽酶所酶切的序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含蛋白酶酶切位点，其中肽标签含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个蛋白酶酶切位点。在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含蛋白酶酶切位点，其中该蛋白酶酶切位点含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个蛋白酶酶切位点。在一些实施方案中，肽标签包含1至5个、2至6个、3至7个、4至8个、5至9个、6至10个、7至11个、8至12个、9至13个、10至14个、1至10个、2至11个、3至12个、4至13个、5至14个、6至15个、7至16个、8至17个、9至19个、10至20个、1至20个、2至19个、3至18个、4至17个、5至16个、6至15个、7至14个、8至13个、9至12个、10至11个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个或1至10个蛋白酶酶切位点。在一些情况下，蛋白酶酶切位点具有序列：DDDDK。在一些情况下，蛋白酶酶切位点有至少四个“D”残基。蛋白酶酶切位点可能与序列DDDDK至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同。在一些情况下，肽标签可能包含类似于蛋白酶酶切位点，但实际上并不作为蛋白水解切割位点的序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含(Asp)D标签，其中肽标签包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个Asp残基，如DD、DDD、DDDD等。在一些实施方案中，Asp标签包含至少4个Asp残基。在一些实施方案中，本文所提供的肽标签包含具有不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20个Asp残基的Asp标签。在一些实施方案中，Asp标签包含1至5个、2至6个、3至7个、4至8个、5至9个、6至10个、7至11个、8至12个、9至13个、10至14个、1至10个、2至11个、3至12个、4至13个、5至14个、6至15个、7至16个、8至17个、9至19个、10至20个、1至20个、2至19个、3至18个、4至17个、5至16个、6至15个、7至14个、8至13个、9至12个、10至11个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个或1至10个Asp残基。在一些实施方案中，肽标签包含His标签(如本文所述)及Asp标签。在一些实施方案中，一个或多个Asp残基被其他氨基酸(如一个或多个Glu残基)取代。在一些实施方案中，His标签被一个或多个氨基酸取代(如Lys或Arg)。

本文提及的所有多肽、蛋白质及肽是指氨基酸残基的聚合物。换言之，针对多肽的描述同样适用于针对肽的描述以及针对蛋白质的描述，反之亦然。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸如氨基酸类似物的氨基酸聚合物。本文所用的这些术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(如抗原)，其中氨基酸残基以共价肽键相连接。

术语“氨基酸”是指天然存在的或非天然存在的氨基酸，以及通过与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，即α位碳原子上结合氢原子、羧基、氨基和R基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但仍保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。

本文所用的术语“非天然氨基酸”或“非天然编码的氨基酸”是指不属于20种常见天然存在的氨基酸或硒代半胱氨酸或焦赖氨酸之一的任何氨基酸、经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。可与术语“非天然编码的氨基酸”和“非天然氨基酸”同义使用的其他术语有“非天然的氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”及其各种带连字符或不带连字符的形式。术语“非天然编码的氨基酸”还包括但不限于经过修饰(如翻译后修饰)天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常见的氨基酸或焦赖氨酸和半胱氨酸)而得到的，但其自身不通过翻译复合体天然并入生长的多肽链中的氨基酸。这些非天然存在的氨基酸的示例包括但不限于N-乙酰葡萄糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰葡萄糖氨基-L-苏氨酸、O-磷酸酪氨酸、氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、4-氨基丁酸(piperidinic acid)、氨基己酸、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、二氨基丁酸、锁链素、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸(hyroxylysine)、别-羟赖氨酸、羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸(orithine)、4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其他相似氨基酸和氨基酸(如4-羟脯氨酸)。

术语“肽”是指由通过肽键连接的1至约50个氨基酸残基、其相关天然存在的结构变体及合成的非天然存在的类似物组成的聚合物。

术语“多肽”是指由通过肽键连接的至少约50个氨基酸残基、其相关天然存在的结构变体及合成的非天然存在的类似物组成的聚合物。如本文所用的，本文提供的多肽可以是融合多肽或蛋白质。

术语“核酸”是指天然存在的及非天然存在的核酸，以及通过与天然存在的核酸相同的方式起作用的核酸类似物。核酸可选自RNA、DNA或核酸类似物分子，如糖修饰或骨架修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。然而，应注意其他核酸类似物，如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)，也适用。非天然存在的核酸的例子包括：卤素取代的碱基、烷基取代的碱基、羟基取代的碱基、巯基取代的碱基以及5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胸腺嘧啶、肌苷、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2，6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤)和N8-(7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤)、2-氨基-6-“h”-嘌呤、6-氨基-2-“h”-嘌呤、6-氧代-2-“h”-嘌呤、2-氧代-4-“h”-嘧啶、2-氧代-6-“h”-嘌呤、4-氧代-2-“h”-嘧啶。它们将与非硫醇化及硫醇化的碱基形成两个氢键碱基对；该碱基分别为：2，4二氧代及4-氧代-2-硫酮嘧啶、2，4二氧代及2-氧代-4-硫酮嘧啶、4-氨基-2-氧代及4-氨基-2-硫酮嘧啶、6-氧代-2-氨基及6-硫酮-2-氨基嘌呤、2-氨基-4-氧代及2-氨基-4-硫酮嘧啶，以及6-氧代-2-氨基及6-硫酮-2-氨基嘌呤。

本文所用的词语“约”，除非另有说明，是指经过该词修饰的数值上下浮动不超过10％的数值。例如，词语“约-20℃”意味着从-22℃至-18℃的范围。又例如，“约1小时”意味着从54分钟至66分钟的范围。

连接

在一些实施方案中，本文所提供的肽标签在与蛋白质以某种方式(如共价或非共价连接)连接后可增强蛋白质(或多肽)的稳定性。在一些情况下，肽(如SEQ ID NO：1、8、10、13、或14的肽)与多肽或酶(如Taq、Tgo、TAPP、CDA、超嗜热火球菌脱氨酶)共价连接。肽可与多肽或酶(如Taq、Tgo、TAPP、CDA、超嗜热火球菌脱氨酶)的N末端相连接。例如，如图3所示，与由SEQ ID NO：3编码的肽至少70％相同的肽可与Taq聚合酶的N末端相连接。同样地，如图7所示，与由SEQ ID NO：7编码的肽至少70％相同的肽可与Taq聚合酶的N末端相连接。在其他情况下，肽与多肽或酶的C末端相连接。例如，图13描述了与DSP肽的片段在其C末端相连接的Tgo聚合酶的核酸序列。

在一些情况下，多个肽标签与本文所述的多肽相连接。多肽可以与多个拷贝的相同肽标签或两种或更多种不同肽标签相连接，在一些实例中，一个肽标签与多肽的N末端连接，而第二个肽标签与该多肽的C末端连接。例如，图12所示的多肽(SEQ ID NO：11)包括连接于Tgo聚合酶N末端的肽标签(SEQ ID NO：1)，还包括与Tgo聚合酶C末端融合的不同肽标签(DSP片段)(SEQ ID NO：11中的下划线部分)。在其他实例中，两个或更多个(相同或不同的)标签与多肽串联连接。例如，图7(SEQ ID NO：6)描述了SEQ ID NO：1的片段与SEQ ID NO：10的DSP肽(图11)相连接，随后SEQ ID NO：10的DSP肽又连接到与Taq聚合酶的N末端相连的另一个SEQ IDNO：1的片段上。

在一些情况下，本文所提供的肽标签彼此直接相连接和/或与多肽直接连接。图7显示了直接彼此相连然后与多肽直接连接的标签的示例。在其他情况下，标签通过接头(如肽接头或本文所述的其他接头)彼此分开。标签还可通过接头与多肽连接。

在一些实施方案中，肽与多肽或酶(如聚合酶)通过基因工程技术相连接。例如，创建一个DNA构建体，它能表达含有与酶(如Taq聚合酶)融合的肽(如SEQ ID NO：1所示的肽)的多肽。图5描述了这种构建体的部分核酸序列的一个示例(SEQ ID NO：4)。图6描述了另一个示例(SEQ ID NO：5)，图13描述了又一个示例(SEQ IDNO：12)。

在一些情况下，多肽(如聚合酶、Taq聚合酶等)与含有双链结合蛋白(DSP)片段(本文也称为“部分”)的肽(SEQ ID NO：6，有下划线但非粗体的部分)或其变体、片段或突变体相连接。在一些情况下，DSP片段与肽标签(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13所示的肽)或其突变体或变体相连接。在其他情况下，肽(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13所示的肽)与聚合酶的片段相连接，后者又与第二个聚合酶相连接。

在一些实施方案中，肽还可通过接头如肽接头与酶相连接。肽序列接头长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上的氨基酸。示例是含有多个天冬氨酸或谷氨酸残基的多肽。合适的肽的序列及长度可用本领域所熟知的方法确定，如采用多肽接头预测软件程序确定潜在接头。George和Heringa，(2003)，Protein Engineering，15(11)：871-879中公开了这类接头程序的一个示例。

在另一些其他情况下，肽(如SEQ ID NO：1所示的肽)通过共价连接与酶相连。可能有用的接头的示例包括：酸不稳定的接头、酯接头、腙接头、含磺酰胺的接头、可酶切的接头或基于聚合物的接头。基于聚合物的接头，如聚乙二醇(PEG，式VI)，广泛用于偶联小分子及大分子药物。当用于连接肽与治疗剂时，PEG偶联的多肽可提供许多期望的优点，包括药物的溶解度更高、免疫原性更低，半衰期延长、靶向递送及活性增强。

多种含多个反应性基团的分子可作为有用的交联成分，并且可在市场上从如Sigma-A1drich或Pierce的公司购得。特别有用的是能以活化形式获得并且能够直接用于偶联的交联成分。交联成分可包含具有相似或相同化学结构的多个反应性基团。这些反应性基团可同时被激活并与多个相同的非交联成分偶联，导致直接形成同多亚基产物。具有多个相似反应性基团的交联成分的示例为柠檬酸、EDTA和TSAT。含有多个相同反应性基团的分枝PEG分子也可能是有用的。

有大量特定化学产品是基于下列少量基础反应路线图进行工作的，所有反应路线图在www.piercenet.com中详细描述。有用的交联剂的示例为亚氨酸酯、活性卤素、马来酰亚胺、吡啶基二硫醚及NHS-酯。同双功能交联剂具有两个相同的反应性基团，且常用于一步式化学交联过程。示例有BS3(不可切割的水溶性DSS类似物)、BSOCOES(碱基可逆的)、DMA(己二亚氨酸二甲酯-2HCl)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯-2HCl)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯-2HCl)、DSG(DSS的5-碳类似物)、DSP(Lomant’s试剂)、DSS(不可切割的)、DST(可被氧化剂切割的)、DTBP(3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯-2HCl)、DTSSP、EGS、磺基-EGS、THPP、TSAT，DFDNB(1，5-双氟-2，4-二硝基苯)特别可用于小空间距离之间的交联(Kornblatt，J.A.和Lake，D.F.(1980)，Cross-linking of cytochrome oxidase subunits withdifluorodinitrobenzene.Can J.Biochem.58，219-224)。

巯基-反应性同双功能交联剂是与巯基反应、且常基于马来酰亚胺的同双功能蛋白质交联剂，其在pH6.5-7.5时与-SH基团反应，形成稳定的硫醚键。BM[PEO]3是一种8个原子的聚醚间隔区，降低在巯基-巯基交联应用中偶联物沉淀的可能性。BM[PEO]4是类似的但有11个原子的间隔区。BMB是一种含4碳间隔区的不可切割的交联剂。BMDB形成能用过碘酸盐切割的连接。BMH是一种广泛使用的同双功能巯基反应***联剂。BMOE是一种特别短的接头。DPDPB及DTME是可切割的交联剂。HVBS不具有马来酰亚胺的水解潜能。TMEA是另一种选择。异双功能交联剂具有两种不同的反应性基团，其示例为经EDC激活的NHS-酯及胺/肼、AEDP、ASBA(光敏的、可碘化的)、EDC(水溶性碳二亚胺)。胺-巯基反应性双功能交联剂为AMAS、APDP、BMPS、EMCA、EMCS、GMBS、KMUA、LC-SMCC、LC-SPDP、MBS、SBAP、SIA(超短)、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、SMPT、SPDP、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-LC-SMPT、磺基-LC-SPDP、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB。氨基反应性异双功能交联剂为ANB-NOS、MSA、NHS-ASA、SADP、SAED、SAND、SANPAH、SASD、SFAD、磺基-HSAB、磺基-NHS-LC-ASA、磺基-SADP、磺基-SANPAH、TFCS。精氨酸反应***联剂为，例如，在pH7-8下与精氨酸发生特异性反应的APG。

肽标签的一些性质

在一些情况下，肽使酶能显现出的活性是不与该肽相连的相同或相似酶的活性的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，肽使酶能显现出的活性是其长期或短期暴露于某温度(如室温，任何高于-20℃的温度)前酶活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，肽能使酶较之长期或短期暴露于某温度(如室温，任何高于-20℃的温度)前的结合亲和力，显现出至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的结合亲和力。

在一些情况下，本文所述的多肽融合蛋白能增强反应混合物中其他多肽的活性。例如，在一些情况下，融合多肽(如由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12编码的融合多肽)增强反应的灵敏度、特异性、保真度或产率。例如，具有DNA聚合酶活性的融合多肽(如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11)可加到含有第二种(不同的)DNA聚合酶(如Taq聚合酶、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11的Taq融合物)的样品中，从而增强第二种DNA聚合酶的特异性、保真度、灵敏度或产率。在一些情况下，增强程度高于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、2500％、3000％、4000％或5000％。在一些情况下，融合多肽还可增强第三种聚合酶或含有三种或更多种聚合酶的反应混合物的特异性、保真度或产率。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签将增强融合多肽在短期或长期暴露于某一特定温度(如室温)后的稳定性、酶活性或其他性质。例如，聚合酶(如Taq聚合酶)在暴露于室温一周或多周或甚至一天或多天或三小时或多小时后可能丧失其活性的相当一部分。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物(如具有氨基酸序列SEQ ID NO：1(图2)、SEQ ID NO：8(图9)或SEQ ID NO：10或13的肽)可能与酶或聚合酶(如Taq聚合酶、Tgo聚合酶)相连接，从而能使酶或聚合酶在过久暴露于某一温度(如室温)后仍保持活性。在一些情况下，肽与聚合酶(如Taq聚合酶)相连接，从而使聚合酶能保持其活性的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，甚至是在长期或短期暴露于某一特定温度(如约20℃至22℃的室温)后。在一些情况下，肽与不是Taq聚合酶的聚合酶或酶相连接。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签还可增强多肽(如聚合酶)结合单链DNA和/或双链DNA的能力。此类DNA的结合通常是非特异性的。在一些情况下，增强程度高于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、2500％、3000％、4000％或5000％。SEQ ID NO：10所示的DSP肽标签以及其片段、变体及突变体可能特别适用于增强多肽的非特异性结合双链或单链DNA的能力。

在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物在-20℃至50℃的温度下保持其活性。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物在-15℃至50℃、-10℃至50℃、-5℃至50℃、0℃至50℃、5℃至50℃、10℃至50℃、15℃至50℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、20℃至25℃、20℃至22℃、15℃至25℃、10℃至25℃、5℃至25℃、0℃至25℃、0℃至30℃、0℃至35℃、0至40℃、0至45℃、5至10℃、5℃至15℃、5℃至20℃、5℃至25℃、5℃至30℃、5℃至35℃、5℃至40℃、5℃至45℃、10℃至15℃、10℃至20℃、10℃至25℃、10℃至30℃、10℃至35℃、10℃至40℃、10℃至45℃、15℃至20℃、15℃至30℃、15℃至35℃、15℃至40℃、15℃至45℃的温度下保持其活性。

在一些情况下，融合多肽(如SEQ ID NO：2、6或11所示的融合蛋白)暴露于至少约-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃的温度，之后保持一定百分率的其稳定性、活性、灵敏度、保真度、产率或其他性质。暴露于所述温度可能是短期或长期的。暴露于某一温度可持续至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。暴露于所述温度可持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，至少1、2、3、4、5或6天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些情况下，所述温度为室温(例如，约20℃至22℃)。在一些情况下，聚合酶暴露于室温至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。例如，聚合酶(如Taq)可暴露于室温或至少35℃至少4周，至少6周，至少10周或至少15周。

在一个实例中，图1描述了与肽融合的Taq聚合酶在-20℃储存或在+35℃储存4周后的活性。上图显示了聚合酶储存于-20℃时的聚合酶活性，下图显示了肽-融合多肽在35℃储存4周后的聚合酶活性。如图1所示，Taq聚合酶融合酶在以上两种条件下储存后显现出相似的活性。

多肽

在一些实施方案中，本文所述的组合物(如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13所示的肽，或者其片段、变异体或突变体)可与多种多肽、蛋白质、酶或肽相连接。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与任何对聚合酶链反应(PCR)有用的酶相连接，聚合酶链反应(PCR)即例如，如美国专利号4,683,195、4,683,202及4,965,188所述的K.B.Mullis方法，以及本领域已知的其他改良方法。PCR是一种无需克隆或纯化，就可以增加DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。这种扩增靶序列的方法一般包括，将过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需靶序列的DNA混合物中，接着在DNA聚合酶存在下进行一个精确时序的热循环。所述两种引物与双链靶序列中的其对应链分别互补。为实现扩增，将混合物变性，随后引物与靶分子中它们的互补序列退火。退火后，引物在聚合酶的作用下延伸，生成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复许多次(即，变性、退火和延伸构成一次循环)，从而得到所需靶序列的高浓度扩增片段。

在一些实施方案中，多种聚合酶可与本文所述的肽标签相连接。这些聚合酶包括Taq聚合酶(用于如聚合酶链反应(PCR)试验)、DNA聚合酶I(用于如缺口翻译和引物延伸试验)、Klenow聚合酶(用于如随机引物标记)、末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)(用于如3’末端标记)、逆转录酶(如用于从RNA模板合成DNA)或者其他聚合酶，例如用于体外转录的SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与依赖于DNA的DNA聚合酶相连接，这种酶通过将核苷酸加到新生成链的3’末端，从DNA模板合成一个互补的DNA拷贝。一些DNA聚合酶还具有校正活性，这是由3’到5’的核酸外切酶活性提供的。

在一些实施方案中，本文所提供的依赖于DNA的DNA聚合酶可以是从细菌或噬菌体分离得到的天然存在的酶，或是重组表达得到的，或者可以是修饰的或具有演变的形式，该形式已经工程化从而具有特定的期望特征，如热稳定性，或从多种经修饰的模板中识别或合成一种DNA链的能力。依赖于DNA的DNA聚合酶需要互补的引物来启动合成。众所周知，在适合的条件下，依赖于DNA的DNA聚合酶可以从RNA模板合成互补的DNA拷贝。依赖于RNA的DNA聚合酶(本文所述的)通常也具有依赖于DNA的DNA聚合酶的活性。

DNA聚合酶的非限制性示例包括水生栖热菌(Thermusaquaticus，Taq)DNA聚合酶、大肠杆菌(E.Coli)DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus littoralis DNA聚合酶、噬菌体T7 DNA聚合酶、Thermococcus gorgonarius(Tgo)聚合酶、Pfu聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、Tma DNA聚合酶、外-Tli DNA聚合酶、外-KOD DNA聚合酶、外-JDF-3 DNA聚合酶、外-PGB-D DNA聚合酶、U1Tma(N截短型)海栖热袍菌(Thermatoga martima)DNA聚合酶，或来自噬菌体T4、Phi-29、M2或T5的DNA聚合酶。

在一些实施方案中，如果需要，温度稳定型聚合酶可与本文所公开的肽标签相连接。参见例如美国专利号4,889,818，其中公开了一种从水生栖热菌中分离到的具有代表性的热稳定酶。其他的具有代表性的温度稳定型聚合酶包括但不限于，例如从细菌中提取的聚合酶，如水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq)、Thermococcus gorgonarius(Tgo)、超嗜热火球菌、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)、丝状栖热菌(Thermus fuliformis)、黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(Thermus ruber)、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(其最适温度比其他所列的稍低些)、乳栖热菌(Thermuslacteus)、红色栖热菌(Thermus rubens)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、Thermococcus littoralis和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermusfervidus)。

在一些情况下，本文所述的肽标签与热稳定酶相连接，所述热稳定酶可能具有或不一定具有聚合酶活性(例如，嗜酸热原体焦磷酸酶(TAPP)，焦磷酸酶，dCTP脱氨酶(CDA)，脱氧胞苷脱氨酶，胞苷脱氨酶，RNA脱氨酶，DNA脱氨酶)。在一些情况下，肽标签(如SEQ ID NO：1或8所示的肽)与非热稳定的多肽(如人白血病抑制因子(hLIF)，瘦素)相连接。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与表现出链置换活性(又称滚环聚合反应)的聚合酶相连接。链置换可导致环状DNA模板的串联拷贝的合成，并且对于等温PCR反应也特别有用。本文所提供的合适的滚环聚合酶的非限制性示例包括但不限于T5 DNA聚合酶(Chatterjee等人，Gene 97：13-19(1991))和T4 DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic，Curr.Biol.5：149-157(1995))，噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等人，Gene 84：247(1989))，噬菌体PRD1 DNA聚合酶(Jung等人，Proc.Natl.Aced.Sci.USA 84：8287(1987)，以及Zhu和Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219：267-276(1994))，DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等人，Eur.J.Biochem.45：623-627(1974))。

一类滚环聚合酶的一个示例利用蛋白质引发作为启动复制的方式。该类聚合酶的示例是经过修饰或未经修饰的DNA聚合酶，其选自或源自噬菌体

PRD1、Cp-1、Cp-5、Cp-7、

BS 32 L17、PZE、PZA、Nf、M2Y(或M2)、PR4、PR5、PR722、B103、SF5、GA-1，以及短尾病毒科的相关成员。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与依赖于DNA的RNA聚合酶或转录酶相连接，所述酶可以从含有启动子序列的双链或部分双链的DNA分子合成多个RNA拷贝，该启动子序列通常是双链的。RNA分子从启动子下游的特定位置开始按5’-3’的方向合成。转录酶的示例是来自大肠杆菌和噬菌体T7、T3和SP6的依赖于DNA的RNA聚合酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与依赖于RNA的DNA聚合酶或逆转录酶(RT)相连接，所述酶是从RNA模板合成互补DNA拷贝的酶。在该方法中，逆转录与PCR相结合，如美国专利号5,322,770中所述。在RT-PCR中，由于酶的逆转录酶活性，RNA模板被转换为cDNA，然后利用同种酶或不同酶的聚合活性进行扩增。所有已知的逆转录酶也都具有从DNA模板合成互补DNA拷贝的能力；因此，他们同时是依赖于RNA和依赖于DNA的DNA聚合酶。逆转录酶(RT)还具有RNA酶H的活性。热稳定或热不稳定的逆转录酶和聚合酶均可使用。

常见的逆转录酶可源自莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV-RT)。本文所述的肽标签可与具有逆转录酶活性的多肽相连接，后者包括但不限于，莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV-RT)逆转录酶、劳斯肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、禽成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶、劳斯相关病毒(RAV)逆转录酶、成髓细胞白血病相关病毒(MAV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、禽类肉瘤-造白细胞组织增生病毒(ASLV)逆转录酶、逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、乙型肝炎逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、细菌逆转录酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neopolitana，Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENTR^TM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENT^TM、火球菌属(Pyrococcus)种GB-D DNA聚合酶、沃氏火球菌(Pyrococcus woosii，Pwo)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、嗜钙芽孢杆菌(Bacillus caldophilus，Bca)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfoloblus acidocaldarius，Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原体(Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Tfl/Tub)DNA聚合酶、红栖热菌(Tru)DNA聚合酶、Thermus brockianus(DYNAZYME^TM)DNA聚合酶、热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum，Mth)DNA聚合酶，及其突变体、变体和衍生物。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与淀粉酶相连接。淀粉酶的非限制性示例包括那些源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、食木薯乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)、海洋葡萄嗜热菌(Staphylothermus marinus)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、海藻热球菌(Thermococcusaggreganes)、Thermococcus fumicolans、热水热球菌(Thermococcushydrothermalis)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosas)、Thermococcus profoundus、环状芽孢杆菌(Bacillus ciculans)、蜡状芽孢杆菌丝状变种(Bacillus cereus var.Mycoides)以及热产硫磺梭菌(Clostridium thermosulphurogenes)的淀粉酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与支链淀粉酶相连接。支链淀粉酶的非限制性示例包括那些源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)、激烈火球菌、沃氏火球菌、海藻热球菌、嗜钙栖热菌(Thermuscaldophilus)GK24、速生热球菌(Thermococcus celer)、热水热球菌、Thermococcus litoralis和海栖热袍菌MSB8的支链淀粉酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与木聚糖水解酶(xylanse)相连接。木聚糖水解酶的非限制性示例包括那些源自解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、芽孢杆菌(Bacillussp.)SPS-0菌株、枯草芽孢杆菌、状芽孢杆菌(Clostridium abosum)、网球菌(Dictyoglomus sp.)B₁菌株、多誉镰孢(Fusarium proliferatum)、激烈火球菌、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)、链霉菌(Streptomyces sp.)S38菌株、硫磺矿硫化叶菌、疏棉状嗜热丝孢菌、嗜热子囊菌(Thermoasus aurantiacus)、海栖热袍菌MSB8、新阿波罗栖热袍菌、热袍菌(Thermotoga sp.)FjSS3-B1菌株和温泉栖热袍菌(Thermotoga thermarum)的木聚糖水解酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与纤维素酶相连接。纤维素酶的非限制性示例包括那些源自Anaerocellu thermophilum、枯草芽孢杆菌、激烈火球菌、超嗜热火球菌、海洋红嗜热杆菌(Rhodothermus marinus)、海栖热袍菌MSB8和新阿波罗栖热袍菌(内纤维素酶A或B)的纤维素酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与蛋白水解酶相连接。蛋白水解酶的非限制性示例包括那些源自短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)JB-99、嗜热脂肪芽孢杆菌TP26、芽孢杆菌AH-101、热红芽胞杆菌(Bacillus thermoruber)、火球菌(Pyrococcus sp.)KODI、海洋葡萄嗜热菌(Staphylothermus marinus)、嗜热嗜酸菌(Thermoacidophiles)、海藻热球菌、速生热球菌、Thermococcus litoralis和海栖热袍菌的蛋白水解酶。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签可与脂肪酶相连接。脂肪酶的非限制性示例包括那些源自酸热芽孢杆菌(Bacillusacidocaldarius)、芽孢杆菌RSJ-1、芽孢杆菌J33菌株、嗜热脂肪芽孢杆菌、热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenletus)、喜热噬油芽孢杆菌(Bacillus thermoleovorans)ID-1、地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、Pyrobaculum calidifontis、激烈火球菌和超嗜热火球菌。

在一些情况下，一个或多个下列聚合酶与由SEQ ID NO：3、SEQID NO：7或SEQ ID NO：9编码的肽标签相连接，或与本文所述的其他肽标签相连接：G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678GCS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、ΔZO5R DNA聚合酶、ZO5聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、黄栖热菌(Tfl)聚合酶(如包含本文所述T-终止子核苷酸的、经修饰的Tfl聚合酶)、海栖热袍菌-或Tma-25聚合酶、Tma-30聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)种SPS-17聚合酶、E615G Taq聚合酶、栖热菌属ZO5R聚合酶、T7DNA聚合酶、Kornberg DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、微球菌(Micrococcal)DNA聚合酶、α-DNA聚合酶、逆转录酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、大肠杆菌RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、RNA聚合酶II、末端转移酶、多核苷酸磷酸化酶(PNP)、引入核糖核苷酸的DNA聚合酶，等等。在一些情况下，校正酶与由SEQ ID NO：3编码的肽标签相连接，或与由SEQ ID NO：7编码的肽标签相连接。或者，任何聚合酶(如本文所述的聚合酶)可与由SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9编码的多肽的片段相连接，例如与双链结合蛋白(DSP)相连接。

在一些实施方案中，本文提供的肽标签(或者结构)也能向非聚合酶的多肽提供稳定性。肽标签可以帮助保持多肽的任何活性，如结合活性、酶活性，特别是当多肽暴露于某个温度(例如，室温)一段特定时间时。例如，本文所述的肽标签可与红细胞生成素(EPO)(又称***或血细胞生成素)相连接，例如从而提高其在室温下的稳定性。EPO是一种控制红细胞生成或红细胞产生的糖蛋白激素。它是针对骨髓中红细胞(红血球)前体的细胞因子。纯化形式的EPO可用于治疗例如贫血或神经***疾病(如精神***症)等疾病。市场上可以获得的EPO类型包括但不限于红细胞生成素(Epoeitin-alpha^TM)和Darbepoietin-alpha^TM。商品名称包括但不限于：Epogen^TM、Epoetin^TM、Procrit^TM、Eprex^TM、NeoRecormon^TM、Darbepoetin^TM、Epoetin delta^TM、PDpoetin^TM、Aranesp^TM以及甲氧基聚乙二醇-β依泊汀(Mircera^TM)。

EPO是由含有五个外显子的单拷贝基因编码的。人和小鼠的EPO基紧邻转录起始位点的上游有90％的相似序列，编码区域有80％的相似序列，而第一个内含子有65％的相似序列。内含子和剪接供体的位置以及受***点在人和小鼠EPO基因之间是保守的。EPO的mRNA含有5’端和3’端非翻译区，并且编码先导肽序列，以及对于人和小鼠为166个氨基酸的预测成熟EPO蛋白，和对于猴为168个氨基酸的预测成熟EPO蛋白。分泌型人EPO，无论是从尿液中回收的天然存在的EPO(uh-EPO)，还是在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达的重组EPO(rh-EPO)，都缺少C-末端精氨酸，所述C-末端精氨酸是通过翻译后切割去除的。成熟的人EPO蛋白包含165个氨基酸，分子量为34kDa，其中约40％的分子量由糖基残基贡献。EPO分子含有四个螺旋，通过他们的疏水域相互作用在水环境中形成一个主要为球状的结构(Cheetham等人，1998，Nat.Struct.Biol.5：861-866)。人和鼠EPO含有四个半胱氨酸而猴EPO含有五个半胱氨酸。人EPO在Cys7和Cys161之间以及Cys29和Cys33之间存在内部二硫键。这些二硫键中至少有一个对于二级结构非常重要。

EPO通过与红细胞生产素受体(EPOR)同二聚体(即(EPOR)₂)的胞外部分结合，启动红细胞生成，所述(EPOR)₂是以单个EPOR亚基上的特定位点之间桥接的方式预先形成的。当EPO与(EPOR)₂结合时，球状配体的大部分远离结合区域且面朝外，并且离开EPO和(EPOR)₂的复合物而进入水性介质中。人EPO有四个糖基化位点：Ser126处的一个O-连接位点，在Asn24、Asn38和Asn83处的3个N-连接位点。N-连接糖基化位点在鼠和猴EPO间是保守的。人EPO的寡糖链是含岩藻糖的唾液酸化的四触角寡糖，其中一些含有重复的N-乙酰乳糖胺。剩下的N-连接的寡糖是三触角和二触角寡糖。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或者组合物包含原生型EPO。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或者组合物包含具有一个或多个突变的EPO。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物包含在四个糖基化位点处有一个或多个突变的EPO：Ser126处的一个O-连接位点，以及Asn24、Asn38和Asn83处的3个N-连接位点。在一些实施方案中，多肽、融合多肽或组合物包含在四个螺旋处有一个或多个突变的EPO。在一些实施方案中，多肽，融合多肽或组合物包含在形成二硫键的残基处(Cys7、Cys161、Cys29和Cys33)有一个或多个突变的EPO。在一些实施方案中，EPO突变可以包含保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。

在一些实施方案中，任何蛋白质治疗剂可与本文所公开的肽标签相连接。在Leader等人(2008)Nature Review/Drug Discovery 7：21-39中可以找到蛋白质治疗剂的总结。蛋白质治疗剂的示例包括，具有酶活性或酶调节活性的蛋白质治疗剂、具有特定靶向活性的蛋白质治疗剂、蛋白质疫苗和蛋白质诊断剂。

在一些实施方案中，本文所提供的多肽、融合多肽或组合物包含装饰肽或多肽。在一些实施方案中，装饰肽或多肽包括但不限于，表皮生长因子(EGF)、角质化细胞生长因子(KGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)、***(IGF)、神经生长因子(NGF)、促血小板生成素、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、胎盘生长因子、人骨形态发生蛋白(BMP)、BMP2、BMP7、血小板衍生生长因子(PDGF)、胶原酶、明胶酶、基质金属蛋白酶-1、-2、-3、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-23A、-23B、-24、-25、-26、-27或-28。

具有酶活性或调节活性的蛋白质治疗剂的示例包括用于治疗以下病症的治疗剂：内分泌紊乱(例如，胰岛素、促生长素(GH)、鲑降钙素、人甲状旁腺激素残基1-34)；止血和血栓形成紊乱(例如，因子VIIa、VIII、因子IX、抗凝血酶III、浓缩蛋白C、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶)；新陈代谢缺陷(例如，β葡糖脑苷脂酶、α艾杜糖醛酸酶)；肺和肠胃紊乱(例如，α-1-蛋白酶抑制物、乳糖酶、胰酶)；免疫缺陷性疾病(例如，腺苷脱氨酶、混合免疫球蛋白)；血液紊乱(例如，如本文所述的，人白蛋白、红细胞生成素)；生育力(人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺素(HCH)、α-促黄体素)；免疫调节(例如，干扰素(IFN)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、I型α-IFN、IFN-β、IFN-γ、IFN-γ1β、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-15、白细胞介素-16、白细胞介素-17、白细胞介素-18、白细胞介素-19、白细胞介素-20、白细胞介素-21、白细胞介素-22、白细胞介素-23、白细胞介素-24、白细胞介素-25、白细胞介素-26、白细胞介素-27、白细胞介素-28、白细胞介素-29、白细胞介素-30、白细胞介素-31、白细胞介素-32、白细胞介素-33、白细胞介素-34、白细胞介素-35)；生长调节(例如，血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)、***(IGF)、神经生长因子(NGF)、促血小板生成素、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、胎盘生长因子、人骨形态发生蛋白(BMP)、BMP2、BMP7、血小板衍生生长因子(PDGF))。其他蛋白质治疗剂包括蛋白水解治疗剂(例如，胰蛋白酶)、奈西立肽；A型或B型肉毒杆菌毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶I、阿法链道酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、人源化抗体(例如，贝伐珠单抗(Avastintm^TM)、利妥昔单抗、曲妥珠单抗)；恩夫韦地、阿昔单抗、蛋白质疫苗(例如，HBsAg疫苗、HPV疫苗、OspA)和抗恒河猴IgG。

在一些实施方案中，蛋白质诊断剂也可与本文所述的肽标签相连接。示例包括但不限于：胰高血糖素、生长素释放激素、癌症和其他疾病的造影剂，以及HIV抗原和HCV抗原。

在一些实施方案中，与本文所述的肽标签相连的多肽可以是纤维状蛋白或球状蛋白。能够与肽标签连接的蛋白质类型包括，但不限于：细胞骨架蛋白(例如，肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、肌营养不良蛋白、FtsZ％、角蛋白、肌球蛋白、血影蛋白、Tau(蛋白质)、微管蛋白)；细胞外基质蛋白(如胶原蛋白、弹性蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素)；血浆蛋白(如血清白蛋白、血清淀粉样P组分)；凝血因子(如补体蛋白、C1抑制剂、C3-转化酶、因子VIII、因子IX、因子XIII、纤维蛋白、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、凝血酶、von Willebrand因子)；急性期蛋白(如C-反应蛋白)；血红素蛋白；细胞粘着蛋白(如钙粘蛋白、整联蛋白、NCAM、选择蛋白)；跨膜转运蛋白(如CFTR、血型糖蛋白D、爬行酶)；离子通道(如乙酰胆碱受体)；G-蛋白偶联受体；钾通道；同向转运/反向转运蛋白；激素和生长因子(如表皮生长因子、胰岛素、***、催产素、促卵泡激素、***)；转录调节蛋白(如MyoD、C-myc)；营养储存/转运蛋白(如铁蛋白)；免疫球蛋白；胰蛋白酶。

在一些实施方案中，与本文所述的肽标签相连的多肽可以是核酸结合肽(例如，能与包括DNA、RNA、mRNA、cRNA、miRNA、siRNA、cDNA在内的任何核酸结合的肽)。

在一些实施方案中，本文所述的肽是一种限制性内切酶。限制性内切酶的示例包括AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BclI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp 1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO 109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI，RsrII，SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、T、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI和ZraI。

在一些实施方案中，肽也可以是归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶的示例包括I-CeuI、I-SceI、PI-PspI和PI-SceI。肽也可以是一种切口(nicking)核酸内切酶。切口核酸内切酶的示例包括Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI和Nt.CviPII。在一些实施方案中，肽具有高保真度。肽可以是本文所述的任何肽的高保真变体。

在一些实施方案中，肽是细胞核酸酶、绿豆核酸酶、P1核酸酶、S1核酸酶。在一些实施方案中，肽是单链特异性(sss)核酸酶。在一些实施方案中，肽是用于突变分析和/或单核苷酸多态性分析的核酸酶。细胞核酸酶可用于突变分析和单核苷酸多态性分析，以切割异源双链DNA模板中的单碱基对错配——TILLING(定向诱导基因组局部损伤)错配切割法。在其他实施方案中，肽能够快速消化。

在一些实施方案中，本文所述的肽标签相连的肽可以是脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶、核糖核酸外切酶、脱氧核糖核酸内切酶、核糖核酸内切酶、寡核酸酶、RecBCD、脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、脱氧核糖核酸酶IV、UvrABC核酸内切酶、曲霉核酸酶S1或微球菌核酸酶。

经修饰的多肽

在一些实施方案中，本文所述的多肽可用本领域中所知的任何方法修饰。例如，本文所述的聚合酶可经修饰以用于热启动PCR方法。“热启动PCR”是传统聚合酶链反应(PCR)的一种改良形式。本文所公开的聚合酶也可经过修饰以在热启动PCR方法中使用。热启动PCR一般涉及聚合酶的使用，这种聚合酶在较低温度和室温下失活，随后在较高的温度下，通常是在PCR的变性步骤中被激活(例如，当反应温度达到90至105℃，如95℃时)。在一些实例中，样品必须在特定温度下(如大约85℃、90℃、95℃、100℃、105℃或110℃)孵育一段特定的时间(如长于1、5、7、10、15、20或30分钟)。例如，反应体系可在95℃孵育15分钟，以激活热启动PCR聚合酶。使用所述聚合酶可以防止PCR方案期间非特异性退火的引物的延伸和在低温下形成引物二聚体。热启动PCR技术尤其可用于避免DNA的非特异性扩增、增加灵敏度和产率。

抗体、肽或化学修饰可以抑制用于热启动PCR的聚合酶。修饰通常是在活性部位侧链上进行(如Abgene Thermostart)。用于热启动PCR的、经化学修饰的聚合酶的一个示例是用醛修饰试剂，优选用甲醛修饰的聚合酶(参见美国专利号6,183,998)。其他示例包括通过其他化学反应修饰的聚合酶，比如通过酸酐反应，以及其他在美国专利号5,773,258中所述的修饰。还可通过与聚合酶特异性抗体连接来修饰用于热启动PCR的聚合酶(参见，例如，美国专利号5,338,671)。在一些情况下，在热循环开始前，通过物理屏障将聚合酶和反应混合物中的其他试剂相隔离。例如，在腊-屏障法中，采用诸如石蜡的腊或石蜡珠来隔离聚合酶与反应混合物中的其他试剂。

在一些实施方案中，可通过本领域中所知的任何方法化学修饰本文所公开的聚合酶，从而促进热启动PCR法(参见，例如，美国专利号5,773,258、美国专利号6,183,998)。在一些情况下，用抗体或肽修饰所述聚合酶，以达到促进热启动PCR法的目的。在其他情况下，本文所述的聚合酶被隔离在石蜡中(如石蜡珠)。

实施热启动PCR所必需的试剂被包装在市场上可以购得的试剂盒中。这种在较高温度如高温下对聚合酶的激活反应可用于PCR的变性步骤。

多肽变体

在一些实施方案中，本公开内容所述的多肽(如聚合酶)也包括大量可生成(如在体外)并可筛查活性和稳定性的其序列变体、突变体以及片段。还包括市场上可购得的任何经修饰的多肽(如钛聚合酶(Invitrogen)；Taq Gold(Applied Biosystem)等)。截短的Taq聚合酶通常保持活性。因此本文所述的多肽包括Taq聚合酶的N’和C’末端截短型。实际上，本文所述的多肽包括任何保持活性的Taq聚合酶。

为了分离序列变体，可对整个序列或对应于特定结构域的特定子序列实施随机诱变。或者，可反复进行定点诱变，同时避免蛋白酶功能的关键残基发生突变。突变耐受性预测程序可以用来大大减少严格通过随机诱变将产生的非功能性序列变体的数量。用于预测蛋白质序列中氨基酸置换对蛋白质功能的影响的多种程序在例如Henikoff等人，(2006)，Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.，7：61-80中有所描述。

此外，本公开内容为所述的多肽提供了不同百分比的序列同一性。序列同一性百分比是通过传统的方法来确定的。参见，例如，Altschul等人，(1986)，Bull.Math.Bio.，48：603，以及Henikoff和henikoff，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915。简单地说，将两个氨基酸序列对齐，以使用空位开放罚分10、空位扩展罚分1和Henikoff和Henikoff(同上)的“BLOSUM62”评分矩阵来优化比对得分。然后这样计算同一性百分比：([相同匹配的总数]/[较长序列的长度加上为了对齐两条序列而向较长序列内引入的空位数])(100)。

有许多已经建立的算法可以用于比对两条氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是一种适用于检查本文所述的氨基酸序列与另一种肽的氨基酸序列所共有的同一性水平的蛋白质比对方法。Pearson等人，(1988)，Proc.Nat’I Acad.Sci.USA.85：2444和Person(1990)，Meth.Enzymo1.183：63中描述了FASTA算法。简单地说，FASTA首先通过识别查询序列(如SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：9)与检测序列所共有的区域来表征序列相似性，查询序列和检测序列要么具有最高密度的同一性(如果ktup变量为1)，要么具有成对的同一性(如果ktup＝2)，不考虑保守氨基酸置换、***或缺失。然后通过使用氨基酸置换矩阵比较所有配对的氨基酸的相似性来对具有最高密度同一性的十个区域进行重新打分，并“修剪”区域的末端以仅包括那些贡献最高得分的残基。如果有多个区域的得分高于“截断”值(基于序列的长度和ktup值，通过预定的公式计算)，则检查被修剪的最初的区域，以决定该区域是否能够连接起来形成具有空位的近似对齐。最终，使用允许氨基酸***和缺失的改良Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman等人，(1970)，J.Mol.Biol.48：444；Sellers(1974)，SIAM J.Appl.Math.，26：787)比对两条氨基酸序列的最高评分区域。FASTA分析的说明性参数是：ktup＝1，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝1，置换矩阵＝BLOSUM62。能够通过修改评分矩阵文件(”SMARTIX”)将这些参数引入FASTA程序中，如Pearson，(1990)，Meth.Enzymol.，183：63附录2所解释的。

本文也提供了与本文所公开的氨基酸序列相比，具有保守氨基酸变化的蛋白质。在常见的氨基酸中，例如，用以下每一组内的氨基酸之间的置换来说明“保守氨基酸置换”：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是从蛋白质序列片段的大约2,000次局部多重比对得到的氨基酸置换矩阵，代表了超过500组相关蛋白质的高度保守区域。参见Henikoff等人，(1992)，Proc.Nat’I Acad.Sci.，USA，89：10915。因此，可以使用BLOSUM62置换频率来定义可以被引入本文提供的氨基酸序列内的保守氨基酸置换。虽然可以仅仅基于化学性质(如上所述)来设计氨基酸置换，但是用语“保守氨基酸置换”优选地是指由大于-1的BLOSUM62值所代表的置换。例如，如果一个氨基酸置换的特征是BLOSUM62值为0、1、2或3，那么该氨基酸置换是保守的。按照该***，优选的保守氨基酸置换的特征是BLOSUM62值至少为1(如1、2或3)，而更优选的保守氨基酸置换的特征是BLOSUM62值至少为2(如2或3)。

也应当理解，氨基酸序列可包括额外的残基，例如额外的N-或C-末端氨基酸，并且仍旧基本上如本文所公开的序列中的一个所说明的那样，只要该序列保留足够的生物学蛋白质活性，能够在本文所提供的组合物和方法中有功能。

在一些情况下，组合物包含一种多肽，该多肽与由SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12所编码的多肽及其片段、变异体或变体至少10％、20％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同。

药物组合物

本文所提供的组合物可以作为药物制剂给药，包括那些适合于经口(包括面颊和舌下)、直肠、鼻内、局部、经皮、透皮贴剂、肺、***、栓剂或肠胃外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、真皮内、腹膜内、皮下和静脉内)给药的制剂，或以适合通过雾化、吸入或吹入给药的形式给药。药物递送***的基本信息能够在Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(LippencottWilliams & Wilkins，Baltimore Md.(1999)中找到。

在各种实施方案中，药物组合物包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)，水，油，包括那些来源于石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等，盐溶液，葡萄糖水溶液和甘油溶液，增味剂，着色剂，防粘剂，和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂，其他为了接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、温润剂等等。赋形剂的示例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。在一些实施方案中，药物制剂基本上不含防腐剂。在其他实施方案中，药物制剂可含有至少一种防腐剂。关于药物剂型的一般方法能够在Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(Lippencott Williams & Wilkins，Baltimore Md.(1990))中找到。应当认识到，尽管本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可用于施用本文所提供的组合物，但是载体的类型将根据给药方式而变化。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，AR，ed.，20th edition，2000：Williams and Wilkins PA，USA中可以找至关于药学上可接受的载体/赋形剂的深入讨论。

也可使用众所周知的技术将化合物包封在脂质体中。生物可降解的微球体也可作为载体应用于本文所提供的药物组合物中。合适的生物可降解的微球体，例如，在美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252中公开。

化合物可在脂质体或微球体(或微粒)中施用。用于制备向患者施用的脂质体和微球体的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。美国专利号4,789,734(其内容通过引用并入本文)描述了在脂质体中包封生物材料的方法。实质上，将材料溶解在水性溶液中，加入合适的磷脂和脂质，如果需要的话也加入表面活性剂，然后在必要时透析或者超声处理该材料。G.Gregoriadis，第14章，″Liposomes，″Drug Carriers in Biology and Medicine，pp.2.sup.87-341(AcademicPress，1979)提供了对已知的方法的综述。

由聚合物或蛋白质形成的微球体对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且能够特别设计为通过胃肠道直接进入血流。或者，可以掺入化合物，植入微球体或者微球体的复合物，以缓慢释放从数天到数月的一段时间。参见，例如，美国专利号4,906,474，4,925,673和3,625,214，以及Jein，TIPS 19：155-157(1998)，其内容通过引用并入本文。

如本领域众所周知的，可调节药物的浓度，缓冲溶液的pH值并调节等渗性，以与静脉内注射相匹配。

本文所提供的化合物可以在本领域众所周知的合适的载体中配制成无菌溶液或悬浮液。药物组合物可通过常规的、熟知的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行过滤除菌。所得到的水性溶液可以被包装以照原样使用，或者冻干，冻干制剂在施用前与无菌溶液结合。Remington“The Science and Practice of Pharmacy”(第20版，LippincottWilliams & Wilkins，Baltimore MD)中描述了合适的制剂和附加的载体，其教导通过参考整体并入本文。

药剂或其药学上可接受的盐可以单独提供，或与一种或多种其他药剂相结合，或与一种或多种其他形式相结合提供。例如，制剂可包含特定比例的一种或多种药剂，取决于每种药剂的相对效能和预期适应症。例如，在针对两个不同的主体目标且效能相似的组合物中，可以使用大约1∶1的药剂比例。两种形式可一起配制在同一剂量单位中，例如，同一乳膏、栓剂、片剂、胶囊、气雾喷雾剂，或将要溶解于饮料的粉末包中；或各种形式可以配制到单独的单位中，例如，两种乳膏、两种栓剂、两种片剂、两种胶囊、一种片剂和一种用于溶解该片剂的液体、两种气雾喷雾剂，或一包粉末和一种用于溶解该粉末的液体，等等。

术语“药学上可接受的盐”是指那些保留本文所提供的药剂的生物学有效性和性质，并且在生物学上或其他方面没有不良影响的盐。例如，药学上可接受的盐不会干扰本文所提供的药剂在防止、降低或去稳定多亚单位复合物的形成，或促进多亚单位复合物的瓦解方面的效应。

典型的盐是例如钠、钾、钙、镁离子等无机离子的盐。这样的盐包括无机酸或有机酸的盐，例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、醋酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或顺丁烯二酸的盐。此外，如果药剂含有羧基或其他酸性基团，它与无机碱或有机碱可以转变为药学上可接受的加成盐。合适的碱的示例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨、环己胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等等。

药学上可接受的酯或酰胺是指那些保留本文所提供的药剂的生物学有效性和性质，并且在生物学或其他方面没有不良影响的酯或酰胺。例如，所述酯或者酰胺不能干扰本文所提供的药剂在防止、降低或去稳定多亚单位复合物的装配，或促进多亚单位复合物在细胞中的瓦解或消除，或防止或减轻个体中与暴露于一种或多种多亚单位复合物或不溶性组分相关的一个或多个指征或病理症状方面的有益的效果。典型的酯包括乙酯、甲酯、异丁酯、乙二醇酯等等。典型的酰胺包括未取代的酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺等等。

本文提供的水性组合物包含有效量的本发明的组合物，后者可被溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。本文使用的药学上可接受的载体可包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂对于药学活性物质的应用在本领域中是众所周知的。除了任何传统介质或试剂与活性成分不相容的情况，考虑它在治疗性组合物中的应用。补充的活性成分也可以结合到组合物中。

典型的用于可注射组合物的药学上可接受的载体包括钙盐，例如，如氯化钙、溴化钙、硫酸钙等；有机酸的盐，如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。例如，本发明的组合物可以以液体的形式提供，并且配制在不同pH(5-8)的基于盐水的水性溶液中，其中含有或不含去污剂如0.01-1％的聚山梨醇酯-80，或碳水化合物添加剂，如甘露醇、山梨醇或海藻糖。常用的缓冲液包括组氨酸、醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂来防止微生物的生长。防止微生物的作用可以用多种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟苯甲酸类、三氯叔丁醇；苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

对于人体施用，制剂应满足FDA所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准和其他管理机构标准。活性化合物通常被配制以用于肠胃外给药，例如，被配制以用于经静脉内、肌肉内、皮下、病灶内或腹腔内途径注射。本领域技术人员基于本公开内容将会了解含有活性组分或成分的水性化合物的制备。典型地，这样的组合物可被制成可注射的，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射前、加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；并且这些制剂也可被乳化。

无菌的可注射溶液的制备是根据需要，将所需要的量的活性化合物加入到含有以上列举的多种其他成分的合适的溶剂中，然后过滤除菌来制备。一般来说，分散剂的制备是通过将多种已灭菌的活性成分加入到无菌载体中，该无菌载体包含基本的分散介质和所需要的其他以上列举的成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从预先过滤除菌的溶液中产生活性成分的粉末以及任何其他期望的成分的粉末。

配制后，以与剂量制剂相匹配的方式和以基于本文所述标准治疗有效的量，***性施用溶液。将制剂以多种剂型容易地施用，例如以上所述的可注射溶液的类型，但是也可以使用药物释放胶囊等。

将要施用的药物组合的合适的量、治疗次数和单位剂量根据所治疗的对象和对象的疾病状态而不同。无论如何，负责给药的人将决定用于个体对象的合适的剂量。

除了配制用于肠胃外给药如静脉内或肌肉内注射的化合物外，也可以使用本发明的其他替代给药方法，包括但不限于皮内给药(参见美国专利号5,997,501、5,848,991和5,527,288)、肺部给药(参见美国专利号6,361,760、6,060,069和6,041,775)、口腔给药(参见美国专利号6,375,975和6,284,262)、经皮给药(参见美国专利号6,348,210和6,322,808)和透粘膜给药(参见美国专利号5,656,284)。这些给药方法是本领域所熟知的。也可使用本发明的鼻内给药，诸如使用鼻腔溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂。鼻腔溶液通常是设计用于以滴入或喷入对鼻道给药的水性溶液。制备鼻腔溶液使得它们在许多方面与鼻腔分泌物相似。因此，水性的鼻腔溶液通常是等渗的并略微缓冲以将pH值保持在5.5到6.5之间。此外，如有需要，制剂中也可包含与眼用制剂中使用的防腐剂相似的抗微生物防腐剂和适当的药物稳定剂。已知多种商用鼻腔制剂，包括，例如，用于预防哮喘的抗生素和抗组胺剂。

适合于其他给药模式的其他制剂包括栓剂和***栓剂。也可使用直肠塞剂或栓剂。栓剂是具有不同重量和形状的固体剂型，通常加入药物，用于塞入直肠或尿道。塞入后，栓剂在腔液中***、融化或溶解。对于栓剂来说，通常包含传统的粘合剂和载体，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可由包含任何适当范围，例如0.5％-10％，优选1％-2％的活性成分的混合物形成。

口服制剂包含常用的赋形剂，例如，药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式。在某些确定的实施方案中，口服药物组合物包含惰性稀释剂或可消化的、可食用的载体，或者它们可以被装入硬壳或软壳的明胶胶囊中，或者它们可以压制成片剂，或者它们可以被直接加入饮食的食物中。对于口服治疗给药来说，活性化合物可与赋形剂一起加入并以可吸收的片剂、口腔片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片剂等形式使用。这样的组合物和制剂可包含至少0.1％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以是不同的，适合地可在单位重量的大约2％到大约75％之间，或者在大约25-60％之间。这类治疗上有用的组合物中的活性化合物的量使得将会获得合适的剂量。

片剂、含片、丸剂、胶囊等也可包含以下成分：粘合剂，诸如黄蓍胶、***胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；和甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精，或增味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃香精。当剂量单位形式是胶囊时，除以上类型的材料外，它还可包含液体载体。可以存在多种其他物质作为包衣，或者另外改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以使用虫胶、糖或两者包被。酏剂的糖浆可包含活性化合物蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸亚甲基酯和丙酯作为防腐剂，染料和增味剂，诸如樱桃或桔子香料。在一些实施方案中，口服药物组合物可以用肠溶衣包覆以保护活性成分免受胃部环境的影响；肠溶衣包衣方法和配方在本领域中是众所周知的。

试剂盒/混合物/进一步的组合物

在一些实施方案中，本文公开的组合物可以直接配制成在需要使用热稳定酶的技术中使用的组合物(如5×溶液浓度)，例如用于定量聚合酶链反应(qPCR)(如实时PCR、RT-PCR、RT-qPCR、探针qPCR、EvaGreen-qPCR、HRM)的组合物。

本文所公开的试剂盒可包含DNA结合染料，特别是结合双链DNA并发出诸如荧光信号的信号的染料。DNA结合染料的非限制性示例包括美国专利号7,601,498中描述的EvaGreen^TM；LC Green；SYTO9；Chromofy；BEBO及SYBR Green。这些染料对于定量PCR(qPCR)应用特别有用。

试剂盒可包含参考染料(如ROX染料)，或猝灭染料(如TAMRA)。在其他情况下，可以使用FRET。FRET也可用于参考染料。在一些情况下，用于参考染料的FRET染料由荧光团染料(如FAM)接着是核酸序列接着是染料(如Rox染料)组成。核酸序列的示例包括脱氧核苷酸，如重复的dT元件。示例包括6、7、8、9、10、11、12或更多的dT核苷酸。其他核苷酸(重复的或者不同核苷酸的混合物都可以使用)。例如，可使用重复的dA、dC、dG或dU核苷酸。FRET染料的非限制性示例包括以下染料：5′FAM-TTTTTTTT-3′ROX(8dT)、5′FAM-TTTTTTTTT-3′ROX(9dT)或5′FAM-TTTTTTTTTT-3′ROX (10dT)。FRET现象可在从1-5nm直到10nM的距离起作用。T-T距离可近似于0.24到0.36nm。参考染料和猝灭染料之间的距离可在大约0.24-0.36nm之间。参考染料可具有一种核苷酸序列，该序列使FRET对彼此之间处于允许FRET发生的适当的距离。在一些实施方案中，FRET对之间的预期距离可小于大约或是大约2至6纳米。在一些实施方案中，FRET对之间的距离可以是大约或高达大约2.72、3.06或3.4nm。通过选择不同数量的重复核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个重复的A、C、T、或G核苷酸，可以调节参考染料和猝灭染料之间的距离。也可使用其他参考和猝灭染料，例如，本文所描述的那些染料。

在一些实施方案中，以上提到的参考染料可用在多种反应中，包括用于实时定量PCR的反应。它能允许实时计算说明被动参考染料的曲线。参考染料可用在多种混合物中，包括探针混合物、evagreen混合物，和HRM和evagreen的混合物。参考染料可在不同的QPCR机器如ABI 7900HT、AB17500和OneStepPlus之间以单一浓度使用。参考染料的浓度可能不需要按照使用的机器进行调整。不限于理论，参考染料可在多种机器间以单一浓度使用，因为参考染料利用了FRET现象。

在一些实施方案中，参考染料可具有解链温度高达大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23℃的任何序列。具有重复的核苷酸，例如，重复的胸腺嘧啶核苷酸的参考染料，作为种参考染料可能是有用的，因为该核苷酸序列具有低解链温度。低解链温度能够降低参考染料与不需要的部分退火的可能性。这能够减少双标记的寡核苷酸与DNA模板之间的相互作用。这也能减少二聚体的形成。

参考染料可表现出温度和pH稳定性。在大约、高达大约或高于大约-80、-60、-40、-30、-20、-10、0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100℃孵育1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100小时后，参考染料能保留大约或大于大约60、70、80、90或100％的有效性。在大约、高达大约或高于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的pH下孵育1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100小时后，参考染料能保留60、70、80、90或100％的有效性。

在一些实施方案中，参考染料能耐受漂白。在暴露于环境光线大约或长于大约1、2、5、10、30、60、90、120、180、240或360分钟后，参考染料能保留大约或高于大约50、60、70、80、90、100％的荧光发射能力。

试剂盒也可包含反应介质或缓冲液。对于包含聚合酶的试剂盒，适当的反应介质或缓冲液允许按照本发明的方法进行核酸扩增。这样的介质和条件是本领域技术人员已知的，并且在多种出版物中有所描述，诸如美国专利号5,554,516、5,716,785、5,130,238、5,194,370、6,090,591、5,409,818、5,554,517、5,169,766、5,480,784、5,399,491、5,679,512和PCT公开号WO 99/42618。例如，缓冲液可以是Tris缓冲液，虽然也可使用其他缓冲液，只要缓冲液的组分对本发明方法中的酶组分是非抑制性的。pH值是大约5到大约11，但是也可以是从大约6到大约10，从大约7到大约9，或从大约7.5到大约8.5。也可使用更具酸性和碱性的缓冲液。

在一些实施方案中，反应介质也可包括二价金属离子，如Mg²⁺或Mn²⁺，游离离子的最终浓度在大约0.01至大约15mM，或大约1至10mM的范围内。在一些实施方案中，反应介质包含MgCl₂(例如高于1、1.5、2.5、2、5、7.5、10、15、20、25、30、40或50mM的MgCl₂)。

在一些实施方案中，反应介质也可包括形成介质的总离子强度的其他盐，如KCl或NaCl。例如，诸如KCl的盐的范围优选地是大约0至大约125mM，更优选大约0至大约100mM，最优选大约0至大约75mM。反应介质可进一步包括能够影响扩增反应的表现，但对于该方法的酶组分的活性来说并非不可或缺的添加剂。这样的添加剂包括诸如BSA、单链结合蛋白(例如T4基因32蛋白)的蛋白质，和诸如NP40或Triton的非离子型去污剂。也可包括能够保持酶活性的试剂，如DTT。这些试剂在本领域内是已知的。

在一些实施方案中，本发明的缓冲液可包括50-80mM TRIS，pH 8.3-9.0和10-20mM(NH₄)₂SO₄或30-50mM KCl。缓冲液的pH值可根据聚合酶而调整。在一些实施方案中，较高的pH，例如，大约为、低于大约或高于大约8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或8.9的pH，可用于标准聚合酶，而较低的pH，例如，大约为、低于大约或高于大约8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或8.9的pH，可用于热启动聚合酶。

在一些实施方案中，基于Evagreen的实时PCR混合物可含有3种聚合酶。该混合物可含有一种主聚合酶。主聚合酶可具有大约、高于大约或低于大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的浓度，该浓度可以是wt％、vol％或mol％，或是混合物中总聚合酶的摩尔、质量或体积百分比。该混合物可包含这样的聚合酶，其具有整合在本发明的肽标签与主要Taq氨基酸序列之间的双链结合结构域，例如，具有双链结合结构域的主聚合酶。这种聚合酶的浓度可以是大约、高于大约或低于大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％，这些可以是wt％、vol％或mol％，或是混合物中总聚合酶的摩尔、质量或体积百分比。该混合物也可包含校正聚合酶(可以是基于Tgo的)，其中肽标签位于N-末端，而双链结合结构域位于C-末端。这种聚合酶的浓度可以是大约、高于大约或低于大约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％，这些可以是wt％、vol％或mol％，或是混合物中总聚合酶的摩尔、质量或体积百分比。这些聚合酶可具有肽标签，而对聚合酶的3’至5’外切核酸酶或校正活性没有影响。

在一些实施方案中，本发明的探针混合物可具有两种聚合酶。主聚合酶可以是具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶。该聚合酶可具有不影响5’至3’外切核酸酶活性的肽标签。该标签可位于N-末端。该探针混合物也可包含具有双链结合结构域的聚合酶。该双链结合结构域能降低5’至3’外切核酸酶活性。活性的降低可以是大约、低于大约或高于大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％。

在一些实施方案中，典型的用于终点PCR的主混合物可含有3种聚合酶、添加剂(如BSA-牛血清白蛋白)、DNA示踪染料(如溴酚蓝)、DNA样品上样成分(如甘油)。所述3种聚合酶可分别具有如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。该混合物可含有一种主聚合酶。所述主聚合酶的浓度可以是大约、高于大约或低于大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，这些可以是wt％、vol％或mol％，或是混合物中总聚合酶的摩尔、质量或体积百分比。该混合物可含有这样的聚合酶，其具有整合到本发明的肽标签与主要Taq氨基酸序列之间的双链结合结构域，例如具有双链结合结构域的主聚合酶。该聚合酶的浓度可以是大约、高于大约或低于大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，这些可以是wt％、vol％或mol％，或是混合物中总聚合酶的摩尔、质量或体积百分比。该混合物还可含有校正聚合酶(可以是基于Tgo的)，其中肽标签位于N-末端而双链结合结构域位于C-末端。该聚合酶的浓度可以是大约、高于大约或低于大约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，这些可以是wt％、vol％或mol％，或是混合物中总聚合酶的摩尔、质量或体积百分比。这样的聚合酶可具有肽标签，而不影响聚合酶的3’至5’外切核酸酶活性或校正活性。

在一些实施方案中，本文所述的缓冲液可包括线性聚丙烯酰胺(LPA)。LPA可增强酶的特异性和敏感性。LPA可加入到实时混合物中，包括含有Evagreen染料或任意探针，如本文所述的任意探针的实时混合物中。

在一些实施方案中，缓冲液可在贮存缓冲液中含有浓度为12.5mM的MgCl₂而反应浓度可为2.5mM的MgCl₂。在其他实施方案中，MgCl₂反应浓度可介于1.5和2.5mM之间。DNA模板的浓度可为1至50ng/微升。

在采用Evagreen染料的反应中，引物(正向或反向)的终反应浓度可介于80至250nM之间。在不采用Evagreen染料而包括探针的反应中，引物的终浓度可以为200-400nM，而探针的终浓度可以是100至250nM。

在采用校正酶的反应中，MgCl₂的浓度可以是1.5mM，引物(正向或反向)的浓度可以是100-300nM，而模板DNA的浓度可以是5-50ng/微升。

在适当的情况下，还可包括不会抑制本方法所采用的RNase活性的RNase抑制剂(如Rnasin)。本发明方法的任何方面可在相同温度或可变温度下发生。优选地，扩增反应(特别是引物的延伸，而不是第一及第二链cDNA合成步骤，和链置换)在等温下进行，这避免了麻烦的热循环过程。所述扩增反应是在允许引物与模板聚核苷酸及引物延伸产物杂交并且不会实质上抑制所采用的酶的活性的温度下进行的。温度可在约25℃至约85℃、约30℃至80℃或约37℃至约75℃的范围内。

本文所提供的扩增反应的寡核苷酸组分一般超过待扩增的靶核酸序列的数量。它们可以以靶核酸量的大约或至少约任一下述倍数提供：10、102、104、108、1010、1012倍。

在一个实施方案中，在扩增过程起始时同时加入上述组分。在另一实施方案中，按扩增反应的要求和/或许可，在扩增过程中的适宜时间点之前或之后按任何顺序加入组分。本领域技术人员可很容易地确定该时间点。可在靶核酸变性步骤之前，变性步骤之后，或引物与靶RNA或DNA杂交之后，向反应混合物中加入用于根据本发明方法的核酸扩增的酶，如根据它们的热稳定性和/或本领域技术人员所熟知的其他考虑因素所决定的。

扩增反应可以在许多不同时间点停止，并在稍晚时候再开始。本领域技术人员可很容易地确定所述时间点。

在一些实施方案中，组合物还可包含dNTP(例如，大于1、1.5、2、5、7.5、10、15、20、25、30、40或50mM的dNTP)。所述dNTP可以是超纯的dNTP。所述dNTP可包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP或其任意组合。在一些情况下，组合物包含染料(如蓝色或黄色染料)。在一些情况下，缓冲液包含本文所述的去污剂。在一些情况下，缓冲液不包含去污剂。在一些情况下，缓冲液具有高pH。在其他实施方案中，缓冲液具有低或中性pH。在一些情况下，缓冲液含有(NH₄)₂SO₄。

在一些实施方案中，本文所提供的组合物可在溶液中提供。溶液可以以不同浓度配制。例如，溶液可以是1×、2×、3×、4×、5×、10×或大于15×的浓度。在此提供了关于组合物的制剂的进一步描述。

一些试剂盒包含两种聚合酶。例如，试剂盒可包含一种具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶(如SEQ ID NO：2)，其浓度为总聚合酶浓度的约10％、20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。这样的试剂盒可包含第二种聚合酶(例如用SEQ IDNO：10的肽标记的聚合酶)，其浓度为总聚合酶浓度的0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一个优选实施方案中，具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶(如SEQ ID NO：2)(或任何含有SEQ ID NO：1的肽标签的多肽)以高于聚合酶总浓度的85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％的浓度存在，而第二种聚合酶以低于0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％的浓度存在。在另一个优选实施方案中，含有SEQ IDNO：1的肽标签的融合多肽以高于聚合酶总浓度的85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％的浓度存在，而第二种多肽是包含DSP肽(SEQ ID NO：10)或两种肽标签(如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11(在一种聚合酶中显示两种肽标签))的多肽，并且以低于0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％的浓度存在。在其他情况下，野生型Taq(或任意聚合酶)以聚合酶总浓度的85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％的浓度存在，而第二种多肽是包含DSP肽(SEQ ID NO：10)或两种肽标签(如SEQ ID NO：8)的多肽，或者是具有被聚合酶分开的两种肽标签(如SEQ ID NO：11)的聚合酶，并且以低于0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％的浓度存在。

在特定的实施方案中，一些试剂盒可包含三种或多种聚合酶。例如，试剂盒可包含一种聚合物(例如SEQ ID NO：2或任何包含SEQID NO：1的肽标签的多肽)，其浓度为总聚合酶浓度的约10％、20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.5％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。此外，所述试剂盒可包含第二种聚合酶，例如含有SEQ ID NO：8、10或13的肽标签的聚合酶。再者，所述试剂盒可包含第三种聚合酶，例如校正聚合酶(如Tgo聚合酶)。这样的校正聚合酶可包含SEQ ID NO：1、8、10或13的肽标签。例如，这样的校正聚合酶可以是SEQ ID NO：11(图12)。第二种及第三种聚合酶可各自以低于0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％的浓度存在。

在一些实施方案中，组合物还可用于涉及使用热稳定DNA聚合酶如Taq或Tgo DNA聚合酶或其突变体、衍生物或片段的扩增中。例如在一些情况下，由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：12编码的多肽与聚合酶(如Taq聚合酶)或校正聚合酶(如Tgo DNA聚合酶)组合用于扩增中。在一些情况下，由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体、片段或突变体，或由SEQ ID NO：4(或SEQ ID NO：12)编码的多肽或其变体、片段或突变体的量比扩增所用的聚合酶(如Taq或Tgo DNA聚合酶)的量至少低1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、100、250、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹倍。因此，在一些情况下，本文所述的组合物是由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体、片段或突变体，或由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体、片段或突变体，以及聚合酶(如Taq或Tgo DNA聚合酶)组成的混合物，其中由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体、突变体或片段，或由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体、突变体或片段的量比聚合酶的量至少低1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、100、250、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹倍。在一些特定的优选实施方案中，组合物是由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体、突变体或片段以及由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体、突变体或片段组成的混合物，其中混合物中由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体的量比由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体的量至少低1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、100、250、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹倍。

在一些情况下，由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体或由SEQID NO：4编码的多肽或其变体的浓度比扩增中所用的聚合酶(如Taq或Tgo DNA聚合酶)的浓度至少低1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、100、250、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹倍。因此，在一些情况下，本文所公开的组合物包含由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体，或SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体以及聚合酶(如Taq或Tgo DNA聚合酶)组成的混合物，其中由SEQ ID NO：5编码的多肽或其变体或由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体的浓度比聚合酶(如Taq或Tgo DNA聚合酶)的浓度至少低1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、100、250、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹倍。本文所公开的所有实施方案还可包括多肽，该多肽含有由SEQ ID NO：7编码的多肽或其突变体、变体或片段，如图中所示的DSP片段，和/或一种或多种多肽，其包含由SEQ ID NO：3编码的多肽，或其片段、突变体或变体。

在一些情况下，组合物是由SEQ ID NO：5编码的多肽或其片段、突变体或变体，由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体、突变体或片段的混合物。在一些情况下，所述组合物还进一步包含校正酶(如Tgo DNA聚合酶)。因此，在一些情况下，所述组合物包含具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶，以及具有3’→5’校正活性的酶。

在一些情况下，这样的组合物中由SEQ ID NO：5编码的多肽或其突变体、片段或变体的量(或含有由SEQ ID NO：7编码的多肽或其片段如DSP的多肽的量)比由SEQ ID NO：4编码的多肽或其变体和/或校正酶的量至少低1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、100、250、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000、50,000、100,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹倍。

在一些情况下，多肽被翻译成短型和长型两种形式。在一些情况下，真核生物翻译起始因子用来帮助多肽的翻译。在一些情况下，翻译发生在细菌中。

试剂盒中可包含一种或多种本文所述的组合物，以及介绍所述组合物的用法的说明书。所述说明书可包括配制反应样品的说明(包括聚合酶、模板、引物(正向和反向)、dNTP、BSA和H₂O的相关浓度)。所述说明书还可包括运行PCR循环的推荐程序，特别是变性、退火和延伸阶段。这样的说明书可包括每一步骤的温度条件及时间长度，或循环数。例如，qPCR的推荐程序可能有95℃15分钟的初始变性步骤(例如，用以激活热启动酶)，随后是以下步骤的40个循环：95℃变性15秒，60-65℃退火20秒，和72℃延伸20秒。

核酸载体/细胞

本文所公开的组合物还包括编码本文所述任意多肽的核酸及载体。这样的构建体的非限制性示例包括含有SEQ ID NO：3、4、5、7、9和/或12的核酸序列的构建体。其他示例包括含有编码具有SEQ IDNO：1、2、6、8、10、11和/或13氨基酸序列的多肽的核酸的构建体。所述组合物还包括上述构建体的片段、变体和/或突变体。

所述核酸构建体可包含单链DNA、双链DNA、cDNA、RNA、cRNA。所述核酸载体可在任何已知的，例如真核的、原核的、体外的等表达***中使用。在优选的实施方案中，所述核酸载体在原核***(如大肠杆菌细菌)中使用，并且该核酸载体携带强真核翻译信号。例如，所述核酸载体可携带强真核翻译信号如Kozak序列GCCGCC(A/G)CCAUGG，如Nakagawa等人(2007)Nuc.Acids Res.1-11.(doi：10.1093/nar/gkm1102)所述。例如，载体可包括序列GCCGCCACCATGGTC。载体可能还包括核糖体结合位点(例如，如AGGA的序列)。所述强真核翻译信号可允许起始自不同Met残基的多个肽的翻译。例如，含有本文所述真核翻译信号以及编码SEQ IDNO：1的核酸序列的载体，可表达长型肽(如图2所示)，以及短型肽(图14，SEQ ID NO：13)。在这个示例中，短型肽起始于SEQ IDNO：1所示的原始序列的MVDDL残基。

核酸载体中含有强真核信号可导致更高的蛋白质产率。令人惊讶的是，这可能在这种载体用于细菌***时发生，如在大肠杆菌细菌中表达时发生。结果，从细菌中分离出来的蛋白质的产率可能增加超过1.5、2、3、4、5、7、10、15、20、30或40倍。所述核酸载体还可含有本领域所知的转录控制区(如启动子、增强子、操纵子等)。

在一些实施方案中，本文提供了整合有一种或多种本发明载体的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。所述细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌)。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是小鼠骨髓瘤杂交瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是中国仓鼠鸟巢(CHO)细胞。如本领域所知，任何适宜的技术可以用来将载体引入细胞。可通过例如永久整合进入染色体核酸，或通过例如引入附加体遗传元件，引入核酸载体。

方法

本文所公开的组合物可用于许多方法。由于多种本文所述的肽、多肽、融合多肽和组合物在较温暖的温度下具有增强的稳定性，它们对于不可能冷藏或冷冻试剂或治疗剂的应用可能特别有用。因此，所述肽标签可用于为在没有可靠电力供应的偏远地区使用而设计的治疗剂、试剂或诊断剂中。

在优选的实施方案中，所述组合物是聚合酶，并可用于核酸扩增，如聚合酶链反应(PCR)。PCR的一般程序在美国专利号4,683195(Mullis)和4,683,202(Mullis等人)中教导，在本文别处也有所描述。简单地说，用PCR扩增核酸包括热变性DNA、两个引物与位于待扩增的靶核酸片段侧翼的序列退火、用聚合酶延伸退火的引物的重复循环。引物与靶核酸的相反链杂交且被定向，使得通过聚合酶的合成在引物之间的片段上进行，有效地使靶片段的量加倍。此外，由于延伸产物也与引物互补，且能与引物结合，每一轮连续的循环基本上会将上一轮循环中合成的靶核酸的量加倍。这样导致特定的靶核酸以约2ⁿ的速度指数积累，其中n是循环次数。

典型的常规PCR热循环方案包括以下步骤的30个循环：(a)在90℃至95℃的温度变性0.5至1分钟，(b)在50℃至65℃的温度退火1至2分钟，及(c)在68℃至75℃下延伸至少1分钟。也可使用目标探针进行其他方案，包括但不限于通用扩增方案，以及快速循环方案。

可使用本文所提供的组合物进行的常规PCR的另一种变化是采用嵌套引物的“嵌套PCR”。当样品中靶核酸的量极其有限时，例如在采用存档的法医样品的情况下，该方法是优选的。进行嵌套PCR时，首先用一组能够与位于靶核酸较大片段侧翼的序列杂交的外部引物扩增核酸，随后采用一组能够与所述较大片段内的靶序列杂交的内部引物进行第二轮扩增循环。

在一些实施方案中，本文所公开的组合物可用于逆转录酶PCR反应(RT-PCR)，其中逆转录酶首先将RNA分子转换为双链cDNA分子，后者然后用作随后的聚合酶链反应扩增中的模板。进行RT-PCR时，一般是在靶核酸热变性后向反应样品中加入逆转录酶。随后，在预定扩增循环开始之前，将反应保持在一个适合的温度下(如30-45℃)充分进行一段时间(如5-60分钟)，以生成cDNA模板。该反应在检测其遗传信息储存于RNA分子内的生物实体时特别有用的。

在一些实施方案中，本文所提供的组合物还可用于连接酶链聚合酶链反应(LCR-PCR)。该方法包括将靶核酸连接到一组引物对上，每个引物对含有靶特异性部分以及与靶序列无关的短锚定序列。然后用第二组含有锚定序列的引物扩增与第一组引物相连接的靶序列。LCR-PCR的操作程序是本领域技术人员所熟知的，因此本文不作详细描述(参见如美国专利号5,494,810)。

另外，聚合酶反应的产物可用本领域已知的任何其他方法分析，如HRM、凝胶电泳、毛细管电泳。

qPCR

在一些实施方案中，本文所述的聚合酶还可用于定量聚合酶链反应(qPCR)中。qPCR，也称为实时PCR，可用于扩增并同时定量靶DNA分子。qPCR与传统PCR类似，区别在于在反应进行中，而不是在反应结束后，对扩增得到的DNA进行实时检测。两种常用的检测实时PCR产物的方法是：(1)嵌有任意双链DNA的非特异性荧光染料(如EvaGreen及本文所述的其他染料)，及(2)用荧光指示剂标记的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，该荧光指示剂使得只有在探针与其互补DNA靶标杂交后才能检测到。TaqMan探针由与寡核苷酸探针5’端共价连接的荧光团以及3’端的猝灭剂组成。有多种不同的荧光团(如缩写为FAM的6-羧基荧光素或缩写为TET的四氯荧光素)和猝灭剂(如缩写为TAMRA的四甲基罗丹明或缩写为MGB的二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合剂)可供使用。当被循环仪的光源通过FRET(荧光共振能量转移)激发时，猝灭剂分子猝灭荧光团发出的荧光。只要荧光团与猝灭剂靠近，猝灭就将抑制任何荧光信号。

在一些实施方案中，实时PCR与逆转录相结合用于定量细胞或组织中的信使RNA以及非编码RNA。在其他实施方案中，本发明提供了用本文所述方法对扩增过程实时进行定量评估。扩增过程的“实时”评估包括在扩增反应过程中连续或定期测定反应混合物中扩增子的量，测定的数值用于计算样品中最初存在的靶序列的量。有许多种不同的方法可用于基于实时扩增来测定样品中存在的初始靶序列的量。这些包括如Wittwer等人的美国专利号6,303,305“Method forQuantification of an Analyte″，以及Yokoyama等人的美国专利号6,541,205“Method for Assaying Nucleic Acid”中公开的方法。Ryder等人的美国专利号5,710,029“Method for Determining Pre-AmplificationLevels of a Nucleic Acid Target Sequence from Post-AmplificationLevels of Product”中公开了另一种用于测定样品中最初存在的靶序列量的方法，但此方法不是基于实时扩增。本发明由于副产物的生成被降低、减少或基本上消除，因此特别适用于实时评估。

可通过采用多种自杂交探针实时检测扩增产物，大多数自杂交探针具有茎环结构。标记这样的自杂交探针，使得它们能发出不同的可检测信号，这取决于探针是处于自杂交状态还是通过与靶序列杂交而处于改变的状态。

具有自我互补性的检测探针的另一个示例是“分子信标”。分子信标包括具有靶互补序列的核酸分子、在扩增产物中不存在靶序列时将探针保持在封闭构象的亲和对(或核酸臂)、以及当探针处于封闭构象时相互作用的标记对。靶序列与靶互补序列的杂交将亲和对的成员分开，从而使探针转变为开放构象。由于标记对(可以是例如荧光团和猝灭剂(如DABCYL和EDANS))的相互作用减少，可以检测到向开放构象的转变。Tyagi等人的美国专利号5,925,517“DetectablyLabeled Dual Confirmation Oligonucleotide Probes，Assays and Kits”以及Tyagi等人的美国专利号6,150,097“Nucleic Acid Detection ProbesHaving Non-FRET Fluorescence Quenching and Kits and AssaysIncluding Such Probes”中公开了分子信标，这两篇专利通过引用以其全文整体并入本文。

本发明所用的其他自杂交探针是本领域中普通技术人员所熟知的。举例来说，具有相互作用标记的探针结合对，如Morrison的美国专利号5,928,862“Competitive Homogenous Assay”(其内容通过引用并入本文)所公开的那些，可以调整成适用于本发明。用于检测单核苷酸多态性(snps)的探针***也可用于本发明。另外的检测***还包括“分子开关”，如Arnold等人的美国临时申请号60/467,517“Oligonucleotides Comprising a Molecular Switch”所公开的，该临时申请与本申请具有共同的拥有人，其通过引用以其全文整体并入本文。其他探针，如包含嵌入染料和/或荧光染料的探针，可能对本发明扩增产物的检测是有用的。参见例如Ishiguro等人的美国专利号5,814,447“Method of Detecting Specific Nucleic Acid Sequences”，其内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的qPCR反应中产生的信号可通过多种不同方法检测。一般来说，信号强度的改变可以用本领域已知的任何方法检测，一般取决于所用的荧光基团的选择。检测可在光学***的辅助下进行。这样的***一般包含至少两个元件，即激发源和光子探测器。本领域中有这些元件的许多示例。一个示例性激发源是激光，如偏振激光。激光的选择取决于探针上附着的荧光基团。对于大多数的荧光基团，所需的激发光在约300nm至约1200nm的范围之内，或更常见的是从约350nm至约900nm。此外，仅仅作为举例，本发明的化合物可用约300至约350nm、350至400nm、400至450nm、450至500nm、500至550nm、550至600nm、600至650nm、650至700nm、750nm至800nm或从800nm至850nm的激发波长激发。本领域技术人员通过常规实验可以很容易地确定激发指定荧光团的适宜激发波长(参见，例如，前面通过引用并入本文的The Handbook-‘A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，TenthEdition’(2005)(可从Invitrogen，Inc./Molecular Probes获得))。如果需要，可以采用其他光学***。这些光学***可包含如光学阅读器、高效光子检测***、光电倍增管、感光门FET’s、纳米管FET’s、光电二极管(如雪崩光电二极管(APD))、照相机、电荷耦合器件(CCD)、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)和共焦显微镜的元件。这些光学***可能还包含光传输元件，如光纤、光学开关、镜子、透镜(包括微透镜和纳米透镜)、准直器。其他示例包括光学衰减器、偏振滤镜(如双色滤镜)、波长滤波器(低通、带通或高通)、波片和延迟线。在一些实施方案中，所述光传输元件可以是与阵列光限域进行光通讯的平面波导。参见，例如，美国专利号7,292,742、7,181,122、7,013,054、6,917,726、7,267,673和7,170,050。这些和其他本领域已知的光学器件可以通过多种不同的方式组合并装配，以实现可辨识信号的检测。

采用任一本文所述聚合酶进行PCR反应后，也可用高分辨率熔解(HRM)分析法检测并定量扩增的DNA。HRM的应用的非限制性示例包括：SNP分型/点突变检测、特定基因座的接合性检测，以及DNA甲基化状态分析。

本文所述的聚合酶及其他组合物可在多种分子细胞学应用中使用。非限制性的示例包括：测序反应、克隆、诱变、基因检测、点突变检测、扣除杂交和微阵列。

生产或合成肽、多肽或融合多肽的方法

本文所述的肽、多肽或融合多肽可利用本领域公知的重组或合成技术制得。特别是，固相蛋白质合成适用于长度相对较短的肽、多肽或融合多肽，并可提供更高的产率和更一致的结果。此外，固相蛋白质合成可为肽、多肽或融合多肽的生产提供额外的灵活性。例如，可在合成阶段将所需的化学修饰引入肽、多肽或融合多肽：相对于赖氨酸，高瓜氨酸可用于肽的合成，从而避免需要在合成后氨甲酰化所述肽。

合成

在肽的固相合成中，将α-氨基及侧链均被保护的氨基酸固定在树脂上。参见，例如，Nilsson，B.，Soellner，M.和Raines，R.ChemicalSynthesis of Proteins，Annu.Rev.Biomol.Struct.2005.34：91-118；Meldal M.1997，Properties of solid supports.Methods Enzymol.289：83-104，以及Songster M F，Barany G.1997，Handles for solid-phasepeptide synthesis，Methods Enzymol.289：126-74。通常，可采用两种α-氨基保护基团：酸敏感性叔丁氧羰基(Boc)基团或碱敏感性9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团。Wellings D A，Atherton E.1997.Standard Fmocprotocols.Methods Enzymol.289：44-67。快速且完全去除这些α-氨基保护基团后，另一个具有活化羧基的被保护氨基酸可与未保护的树脂结合的胺偶联。通过采用过量的活化的可溶性氨基酸，强制结束偶联反应。重复去保护和偶联的循环，以完成该序列。经过侧链去保护和切割，树脂产出所需的肽。Guy C A，Fields G B.1997，Trifluoroacetic acidcleavage and deprotection of resin-bound peptides following synthesis byFmoc chemistry，Methods Enzymol.289：67-83，以及Stewart J M.1997，Cleavage methods following Boc-based solid-phase peptide synthesis，Methods Enzymol.289：29-44。Bang，D.& Kent，S.，2004，A One-PotTotal Synthesis of Crambin，Angew.Chem.Int.Ed.43：2534-2538；Bang，D.，Chopra，N.，& Kent，S.2004，Total Chemical Synthesis of Crambin.，J.Am.Chem.Soc.126：1377-1383；Dawson，P等人，1994，Synthesis ofProteins by Native Chemical Ligation，Science，266：776-779；Kochendoerfer等人，2003，Design and Chemical Synthesis of aHomogenous Polymer-Modified Erythropoiesis Protein，Science，299：884-887公开了另外的进行固相蛋白质合成的方法。

如果需要，固相肽合成产生的较小的肽可以通过肽连接如天然化学连接组合在一起。在此过程中，一个肽的N末端半胱氨酸残基上的硫醇攻击第二个肽的C末端硫酯，从而影响转硫酯化反应。在快速S.fwdarw.N酰基转移后，形成酰胺键。参见Dawson，P.等人1994，Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation，Science，266：776-779。

另外，本文所提供的肽、多肽或融合多肽可包含拟肽，包括天然存在或非天然存在的氨基酸的肽，例如类肽。类肽是N-取代的甘氨酸、甘胆酸、硫代脯氨酸(thiopronine)、肌氨酸及硫甲基氧代苯丙甘氨酸(thiorphan)的寡聚物。这些结构往往具有一种通用结构(--(C＝O)--CH₂--NR--)_n，其中R基团作为侧链。这样的类肽可根据Simon等人，Peptoids：A molecular approach to drug discovery，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：9367-9371(1992)以及Li等人，PhotolithographicSynthesis of Peptoids，J.AM.CHEM.SOC.2004，126，4088-4089的方案采用固相合成法合成。此外，本文提供了拟肽或肽模拟物、具有与模板肽相似的性质的非肽药物的用途。(Fauchere，J.(1986)Adv.DrugRes.15：29；Veber和Friedinger(1985)TINS p.32；以及Evans等人(1987)J.Med.Chem 30：1229)。例如，Methods of Organic Chemistry(Houben-Weyl)，Synthesis of Peptides andPeptidomimetics-Workbench Edition，卷E22c(主编Goodman M.)2004中综述了各种类型的拟肽的合成。

重组技术

可利用多种宿主表达载体***制备本文所提供的肽、多肽或融合多肽。这样的宿主表达***不仅指感兴趣的肽、多肽或融合多肽可以在其中生产并随后可以纯化的载体，还指当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时能原位展现修饰过的基因产物的细胞。这些宿主表达载体***包括但不限于细菌、昆虫、植物、哺乳动物，包括人宿主***，例如，但不限于用含有肽、多肽或融合多肽编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的，或用含有编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞***；或哺乳动物细胞***，包括人细胞***，例如携带重组表达构建体的HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3，该重组表达构建体含有源于哺乳动物细胞基因组的启动子，如金属硫蛋白启动子，或源于哺乳动物病毒的启动子，如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子。

另外，可以选择那些可调节***序列的表达，或能以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。这些对蛋白质产物的修饰和加工对蛋白质功能可能至关重要。不同宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质及基因产物的特殊机制。可选择适合的细胞系或宿主***，以确保表达的外源蛋白质被正确修饰和加工。为此目的，可以使用真核宿主细胞，其拥有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化及磷酸化的细胞机器。这样的哺乳动物宿主细胞(包括人宿主细胞)包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3及WI38。

为了长期高产率的生产重组肽，优选稳定表达。例如，可以将稳定表达重组组织保护性细胞因子相关分子基因产物的细胞系工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可用由合适的表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA及选择性标记转化宿主细胞。引入外源DNA后，工程化的细胞可在富集培养基中生长1-2天，然后转到选择培养基中。重组质粒中的选择性标记赋予细胞对选择的抗性，并使细胞能将质粒稳定地整合到其染色体中，并生长形成转化灶(foci)，转化灶转而能被克隆并扩大为细胞系。此方法可有利地用于将表达组织保护性产物的细胞系工程化。这样的工程化细胞系在筛选和评估影响基因产物内源活性的化合物中可能特别有用。

多核苷酸的合成

可采用任何已知的合成多核苷酸的方法。可采用Caruthers等人在美国专利号4,458,066中公开的固相合成法。该技术中，通过一个长有机接头将生长的DNA链连接于不溶性支持体，该有机接头使得生长的DNA链溶解于支持体所处的溶剂中。从而，被溶解的、但仍固定的DNA链可与周围溶剂里的试剂反应，并且允许容易地将试剂从连有寡核苷酸的固体支持体上洗去。

核苷上有几个位点具有相似化学性质，如----OH或羟基。然而在寡核苷酸合成过程中，单体亚基必须与生长的寡核苷酸分子以位点特异性的方式连接。这要求将生长链上的或引入碱基上的位点功能化，用于将引入的单体构件连接到生长链上。为防止引入的单体连接到错误的位点上，必须封闭错误的位点，同时使正确的位点开放可以进行反应。这要求使用保护基团，所述保护基团是与潜在反应位点暂时连接，以阻止其发生反应的化合物。所述保护基团在所述反应过程中必须稳定，但最终必须被去除，以暴露出原始位点。寡核苷酸的合成要求保护多个位点，特定位点必须脱保护，而其他位点保持保护状态。这些保护基团集合成一组被称为正交保护基团。

固相寡核苷酸合成方案通常采用二甲氧基三苯甲基保护基团保护核苷的5’羟基。在3’羟基位点上采用亚磷酰胺官能团。合成在一个循环中一般是从亚磷酰胺核苷的核糖或脱氧核糖组分的3’至5’进行，一个合成循环一次向生长的寡核苷酸链上添加一个核苷酸。Beaucage等人(1981)Tetrahedron Lett.22：1859。在合成循环的第一步，“偶联”步骤中，生长链的5’端与引入单体的3’亚磷酰胺偶联，形成亚磷酸盐三酯中间体(已加入的单体的5’羟基上有保护基团，所以每个循环只有一个新单体加至生长链上)。Matteucci等人(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185。接着，利用任选的“封端反应”停止在任何具有未反应5’羟基的链上的合成，这样在合成的末端将少一个核苷酸。每个偶联反应后，亚磷酸三酯中间体都会经过氧化(“氧化”步骤)，产生更稳定的磷酸三酯中间体。如不经过氧化，不稳定的亚磷酸三酯键在后续合成步骤的酸性条件下将被切割。Letsinger等人(1976)J.Am.Chem.Soc.98：3655。去除新加入的单体的5’保护基团(“脱保护”步骤)一般是通过与酸性溶液的反应完成的，得到游离5’羟基，该游离5’羟基可与下一个受保护的核苷亚磷酸酰胺偶联。每加入一个单体都要重复这个过程，直至合成得到所需序列。

根据一些方案，可以通过省略封端步骤，或通过将氧化步骤移到循环“之外”而对完成的链进行单次氧化反应，从而缩短偶联、封端、氧化和脱保护的合成循环。例如，根据H-膦酸酯方案的寡核苷酸合成允许在合成循环完成时进行单次氧化步骤。然而，其偶联产率的效率比亚磷酰胺化学方法低，并且其氧化也比亚磷酰胺(amidite)化学方法要求更长的时间以及更严厉的试剂。

常规用于保护核苷5’-羟基的化学基团为二甲氧基三苯甲基(“DMT”)，其可用酸去除。Khorana(1968)Pure Appl.Chem.17：349；Smith等人(1962)J.Am.Chem.Soc.84：430。这种酸不稳定的保护基团为研究核苷和寡核苷酸提供了许多优势。例如，DMT基团可以被区域选择性地、高产率地引入核苷上。Brown等人(1979)Methods inEnzymol.68：109。另外，DMT基团的亲脂性大大提高了核苷在有机溶剂中的溶解度，并且由酸性脱保护产生的碳阳离子提供了一个强发色团，该发色团可用于间接监测偶联效率。Matteucci等人(1980)Tetrahedron Lett.21：719。另外，可利用基团的疏水性来帮助在反向HPLC上分离。Becker等人(1985)J.Chromatogr.326：219。

涉及治疗、预防或诊断疾病的方法

在一些实施方案中，本文所公开的聚合酶可用于许多应用，包括绘制基因表达图谱、鉴别序列变异、检测微生物以及测定病毒载量。鉴于他们在较高的温度下是稳定的，因此它们在为较温暖气候下诊断疾病所设计的试剂盒中可能是特别有用的。在优选的实施方案中，聚合酶用于评估受试者的传染病状态(如HIV-1、HIV-2、肝炎病毒(如hep a、hep b、hep c)、疟疾)。本文所公开的聚合酶可在用于检测这些病原体的试剂盒中使用，以及在为确定病毒载量所设计的试剂盒中使用。在其他情况下，聚合酶可以用于对遗传疾病(如癌症、神经性疾病如阿尔茨海默病)进行诊断、治疗或提供预后。

所述聚合酶可用于评估、治疗、诊断由众多病毒引起的感染，所述病毒包括：艾贝尔森氏白血病病毒、艾贝尔森氏鼠白血病病毒、艾贝尔森氏病毒、急性喉气管支气管炎病毒、阿德莱德河病毒、腺相关病毒组、腺病毒、非洲马瘟病毒、非洲猪瘟病毒、AIDS病毒、阿留申水貂病细小病毒、α逆转录病毒、甲病毒、ALV相关病毒、阿马帕里病毒、***病毒、呼肠孤病毒、虫媒病毒、虫媒病毒C、虫媒病毒A组、虫媒病毒B组、沙粒病毒组、阿根廷出血热病毒、阿根廷出血热病毒、动脉病毒、星状病毒、Ateline疱疹病毒组、Aujezky病毒、奥拉病毒、Ausduk病病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、禽腺病毒、禽幼红细胞增多症病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽造白细胞组织增生病毒、禽淋巴瘤病毒、禽成髓细胞瘤病毒、禽副粘病毒、禽肺炎脑炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽肉瘤病毒、禽C型逆转录病毒组、禽嗜肝DNA病毒、禽痘病毒、B病毒、B19病毒、Babanki病毒、狒狒疱疹病毒、杆状病毒、Barmah森林病毒、Bebaru病毒、Berrimah病毒、β逆转录病毒、双RNA病毒、毕特纳病毒、BK病毒、黑港渠病毒、蓝舌病毒、玻利维亚出血热病毒、博尔纳病病毒、羊边境病病毒、博纳病毒、牛α疱疹病毒1、牛α疱疹病毒2、牛冠状病毒、牛短暂热病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛造白细胞组织增生病毒、牛***炎病毒、牛***瘤病毒、牛脓疱口炎病毒、牛细小病毒、牛合胞体病毒、牛C型肿瘤病毒、牛病毒性腹泻病毒、Buggy Creek病毒、弹状病毒组、布尼奥罗病毒超群、布尼亚病毒、伯基特淋巴瘤病毒、布汪巴热病毒、CA病毒、萼状病毒、加州脑炎病毒、骆驼痘病毒、金丝雀痘病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、犬微小病毒、犬细小病毒、CanoDelgadito病毒、山羊关节炎病毒、山羊脑炎病毒、山羊疱疹病毒、绵羊痘病毒、心病毒、豚鼠疱疹病毒1、猕猴疱疹病毒1、猕猴疱疹病毒1、猕猴疱疹病毒2、钱迪普拉病毒、昌吉诺拉病毒、斑点叉尾鮰病毒、查里维勒病毒、水痘病毒、基孔肯雅病毒、黑猩猩疱疹病毒、鲢鱼呼肠孤病毒、***哈鱼病毒、Cocal病毒、银鲑呼肠孤病毒、***疹病毒、科罗拉多壁虱热病毒、科蜱病毒、哥伦比亚SK病毒、普通感冒病毒、接触性脓疱皮炎病毒、绵羊接触性脓疱皮炎病毒、冠状病毒、科里帕塔病毒、鼻病毒、牛痘病毒、柯萨奇病毒、CPV(质型多角体病毒)、蟋蟀麻痹病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、副流感二号病毒、隐病毒、质型多角体病毒属、巨细胞病毒、巨细胞病毒组、质型多角体病毒、鹿***瘤病毒、δ逆转录病毒、登革热病毒、浓核病毒、依赖病毒、多理病毒、双链RNA病毒、果蝇C病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭肝炎病毒1、鸭肝炎病毒2、轮状病毒、杜文海格病毒、畸形翼病毒DWV、东方马脑炎病毒、东方马脑脊髓炎病毒、EB病毒、埃博拉病毒、埃博拉样病毒、艾柯病毒、埃可病毒、埃可病毒10、埃可病毒28、埃可病毒9、鼠痘病毒、EEE病毒、EIA病毒、EIA病毒、脑炎病毒、脑心肌炎组病毒、脑心肌炎病毒、肠病毒、酶升高病毒、酶升高病毒(LDH)、流行性出血热病毒、动物流行性出血病毒、EB病毒、马α疱疹病毒1、马α疱疹病毒4、马疱疹病毒2、马流产病毒、马动脉炎病毒、马脑病病毒、马传染性贫血病毒、马麻疹病毒、马鼻肺炎病毒、马鼻病毒、Eubenangu病毒、欧洲麋鹿***瘤病毒、欧洲猪瘟病毒、沼泽病毒、依埃契病毒、猫疱疹病毒1、猫萼状病毒、猫纤维瘤病毒、猫疱疹病毒、猫免疫缺陷病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫白血病/肉瘤病毒、猫白血病病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、猫肉瘤病毒、猫合胞体病毒、线状病毒、法兰德斯病毒、黄病毒、手足口病病毒、摩根堡病毒、四角汉坦病毒、禽腺病毒1、禽痘病毒、弗兰德病毒、γ逆转录病毒、GB肝炎病毒、GB病毒、德国麻疹病毒、盖塔病毒、长臂猿白血病病毒、腺热病毒、山羊痘病毒、金体美洲鳊鱼病毒、枯叶蛾病毒、鹅细小病毒、颗粒性病毒、格罗斯病毒、地松鼠乙肝病毒、A组虫媒病毒、瓜纳瑞托病毒、豚鼠巨细胞病毒、豚鼠C型病毒、汉坦病毒、汉坦病毒属、文蛤呼肠孤病毒、兔纤维瘤病毒、HCMV(人巨细胞病毒)、血吸附病毒2、日本血凝病毒、出血热病毒、亨德拉病毒、亨尼帕病毒、嗜肝DNA病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒组、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、非甲非乙型肝炎病毒、肝炎病毒、肝炎病毒(非人)、肝脑脊髓炎呼肠孤病毒3、嗜肝病毒、苍鹭乙型肝炎病毒、乙型疱疹病毒、单纯疱疹病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、疱疹病毒、疱疹病毒7、蛛猴疱疹病毒、人疱疹病毒、传染疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、猪疱疹病毒、水痘疱疹病毒、高地J病毒、Hirame弹状病毒、猪霍乱病毒、人腺病毒2、人α疱疹病毒1、人α疱疹病毒2、人α疱疹病毒3、人嗜B淋巴细胞病毒、人β疱疹病毒5、人冠状病毒、人巨细胞病毒组、人泡沫病毒、人γ疱疹病毒4、人γ疱疹病毒6、人甲型肝炎病毒、人疱疹病毒1组、人疱疹病毒2组、人疱疹病毒3组、人疱疹病毒4组、人疱疹病毒6、人疱疹病毒8、人免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1、人免疫缺陷病毒2、人***瘤病毒、人T细胞白血病病毒、人T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、人T细胞白血病病毒III、人T细胞淋巴瘤病毒I、人T细胞淋巴瘤病毒II、人嗜T淋巴细胞病毒1型、人嗜T淋巴细胞病毒2型、人嗜T淋巴细胞病毒I、人嗜T淋巴细胞病毒II、人嗜T淋巴细胞病毒III、姬蜂病毒属、婴儿胃肠炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、传染性造血器官坏死病毒、传染性胰脏坏死病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、pr8型流感病毒、昆虫虹彩病毒、昆虫病毒、虹彩病毒、日本乙型病毒、日本脑炎病毒、JC病毒、胡宁病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、克麦罗沃病毒、基尔汉氏鼠病毒、克拉马斯病毒、科隆各病毒、朝鲜出血热病毒、昆巴病毒、科萨努尔森林病病毒、Kyzylagach病毒、拉克罗斯病毒、乳酸脱氢酶升高病毒、乳酸脱氢酶病毒、兔头蝙蝠病毒、叶猴病毒、兔细小病毒、拉沙热病毒、拉沙病毒、潜伏大鼠病毒、LCM病毒、Leaky病毒、慢病毒、兔痘病毒、白血病病毒(leukemia virus)、白血病病毒(leukovirus)、结节性皮肤病病毒、***病相关病毒、淋巴细胞隐病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、淋巴增生病毒组、马丘坡病毒、疯痒病毒、哺乳动物B型肿瘤病毒组、哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒组、哺乳动物D型逆转录病毒、乳瘤病毒、马普埃病毒、马尔堡病毒、马尔堡样病毒、梅森-菲泽猴病毒、哺乳动物腺病毒、马雅罗病毒、ME病毒、麻疹病毒、梅南高病毒、门果病毒(Mengo virus)、门果病毒(Mengovirus)、米德尔堡病毒、副痘苗病毒(Milker nodule virus)、貂肠炎病毒、小鼠微小病毒、MLV相关病毒、MM病毒、莫可拉病毒、软疣痘病毒、***病毒、猴B病毒、猴痘病毒、单股反链病毒目、麻疹病毒、埃尔贡山蝙蝠病毒、小鼠巨细胞病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠K病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳瘤病毒、小鼠微小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠脊髓灰质炎病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠肉瘤病毒、小鼠痘病毒、莫桑比克病毒、穆坎博病毒、粘膜病病毒、腮腺炎病毒、鼠β疱疹病毒1、鼠巨细胞病毒2、鼠巨细胞病毒组、鼠脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒、鼠白血病病毒、鼠结核诱导病毒、鼠多瘤病毒、鼠肉瘤病毒、鼠巨细胞病毒、默累溪谷脑炎病毒、粘液瘤病毒、粘病毒、多形性粘病毒、腮腺炎粘病毒、内罗毕绵羊病病毒、内罗毕病毒、Nanirna病毒、纳里瓦病毒、恩杜莫病毒、牛皮肤结节病毒、纳尔逊湾病毒、嗜神经病毒、新世界沙粒病毒、新生儿肺炎病毒、新城疫病毒、尼帕病毒、非细胞病变性病毒、诺沃克病毒、核型多角体病毒(NPV)、***颈病毒、阿尼昂尼昂病毒、奥克尔布病毒、致癌病毒、致癌病毒样颗粒、致癌RNA病毒、环状病毒、羊传染性口疮病毒、奥罗普切病毒、正嗜肝DNA病毒、正粘病毒、正痘病毒、正呼肠病毒、奥轮古病毒、绵羊***状瘤病毒、羊卡他热病毒、猫头鹰猴疱疹病毒、巴尼亚姆病毒、***瘤病毒、长毛兔***瘤病毒、***多瘤空泡病毒、副流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、副粘病毒、副痘病毒、副痘苗病毒、细小病毒、细小病毒B19、细小病毒组、瘟病毒、白蛉病毒、海豹瘟热病毒、微小脱氧核糖核酸病毒、微小核糖核酸病毒、猪巨细胞病毒-鸽痘病毒、皮理病毒、皮克孙纳病毒、小鼠肺炎病毒、肺炎病毒、脊髓灰质炎病毒(poliomyelitis virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、多DNA病毒、多面形病毒、多瘤病毒、多瘤病毒属、牛多瘤病毒、长尾猴多瘤病毒、人多瘤病毒2、猕猴多瘤病毒1、鼠多瘤病毒1、鼠多瘤病毒2、狒狒多瘤病毒1、狒狒多瘤病毒2、棉尾兔多瘤病毒、猩猩疱疹病毒1、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪C型病毒、痘病毒(pox virus)、痘病毒(poxvirus)、天花病毒、希望山病毒、原病毒、假牛痘病毒、假性狂犬病病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔肾空泡病毒、兔***瘤病毒、狂犬病毒、浣熊细小病毒、浣熊痘病毒、兰尼克特病毒、大鼠巨细胞病毒、大鼠细小病毒、大鼠病毒、劳含尔氏病毒、重组痘苗病毒、重组病毒、呼肠孤病毒、呼肠孤病毒1、呼肠孤病毒2、呼肠孤病毒3、爬行动物C型病毒、呼吸道感染病毒、呼吸道合胞体病毒、呼吸道病毒、网状内皮增生病病毒、弹状病毒、鲤鱼弹状病毒、棒状病毒(Rhadinovirus)、鼻病毒、根前毛菌噬菌体属、裂谷热病毒、赖利病毒、牛瘟病毒、RNA肿瘤病毒、罗斯河病毒、轮状病毒、麻疹病毒、劳斯肉瘤病毒、风疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒属、俄罗斯秋脑炎病毒、SA 11猿猴病毒、SA2病毒、萨比亚病毒、鹭山病毒、松鼠猴疱疹病毒1、唾液腺病毒、白蛉热病毒组、圣德吉姆巴病毒、SARS病毒、SDAV(唾液泪囊腺炎病毒)、海豹痘病毒、塞姆利基森林病毒、汉城病毒、绵羊痘病毒、肖普纤维瘤病毒、肖普***瘤病毒、猿猴泡沫病毒、猿猴甲型肝炎病毒、猴人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴副流感病毒、猿猴T细胞淋巴营养病毒、猿猴病毒、猿猴病毒40、单纯疱疹病毒、辛诺柏病毒、辛德毕斯病毒、天花病毒、南美出血热病毒、麻雀痘病毒、泡沫病毒、松鼠纤维瘤病毒、松鼠猴逆转录病毒、SSV 1病毒组、STLV(猿猴嗜T淋巴病毒)I型、STLV(猿猴嗜T淋巴病毒)II型、STLV(猿猴嗜T淋巴病毒)III型、牛丘疹口炎病毒、颌下腺病毒、猪α疱疹病毒1、猪疱疹病毒2、猪痘病毒属、沼泽地热病毒、猪痘病毒、瑞士小鼠白血病病毒、TAC病毒、塔卡里伯病毒复合病毒、塔卡里伯病毒、特纳河痘病毒、非洲大沙鼠痘病毒、鲤鱼呼肠孤病毒、泰累尔氏脑脊髓炎病毒、泰累尔氏病毒、托高土病毒、索塔帕拉亚姆病毒、蜱传脑炎病毒、刁曼病毒、披膜病毒、环曲病毒、肿瘤病毒、树鼩病毒、火鸡鼻气管炎病毒、火鸡痘病毒、C型逆转录病毒、D型肿瘤病毒、D型逆转录病毒组、渍疡病弹状病毒、乌纳病毒、尤尤库尼米病毒组、痘苗病毒、空泡形成病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、天花病毒、重型天花病毒、天花病毒、Vasin Gishu病病毒、VEE病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉出血热病毒、水泡性口炎病毒、水泡病毒、维琉斯克病毒、蝰蛇逆转录病毒、病毒性出血性败血症病毒、维斯那-梅迪病毒、维斯那病毒、田鼠痘病毒、VSV(水泡性口炎病毒)、沃洛尔病毒、沃里戈病毒、疣病毒、WEE病毒、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、西方马脑脊髓炎病毒、沃达罗病毒、冬季呕吐病毒、土拨鼠乙型肝炎病毒、绒毛猴肉瘤病毒、伤瘤病毒、WRSV病毒、雅巴猴肿瘤病毒、雅巴病毒、亚塔痘病毒、黄热病病毒及YugBogdanovac病毒。

实施例

实施例1：大麦基因组DNA的扩增

图15显示了使用肽标签-聚合酶(醛修饰型SEQ ID NO：2)进行大麦基因组DNA扩增与使用两种市场上可购得的聚合酶(ABI公司的Gold^TM和Roche公司的FastStart^TM)进行大麦基因组DNA扩增的对比结果。

大麦基因组DNA是从5种不同的基因组中获得的，第7道显示100bp梯带。

对各电泳道的描述如下：

第1-3道：2.5U/100μlPCR反应物的肽标签-聚合酶，肽标签-聚合酶从1ng/μl开始进行10倍稀释

第4-6道：4U/100μl的肽标签-聚合酶

第8-10道：2.5U/100μlPCR反应物的ABI Gold^TM，ABI Gold^TM从1ng/μl开始进行10倍稀释

第11-13道：4U/100μl的ABI Gold^TM

第14-16道：2.5U/100μlPCR反应物的Roche FastStart^TM，RocheFastStart^TM从1ng/μl开始进行10倍稀释

第17-19道：4U/100μl的Roche FastStart^TM

第1-3道：(肽标签-聚合酶)只有2.5U-显示DNA扩增

第8道：(ABI)显示小的非特异性产物(弥散带)

第14-16道：(Roche)显示在2.5U时没有产物

实施例2：使用肽标签-聚合酶混合物扩增小鼠基因组DNA

图26显示了使用多种聚合酶混合物扩增小鼠基因组DNA的结果。第1道显示1kb的DNA梯带。第2-10道显示小鼠基因组DNA的扩增，1ng/μl，1×PCR中。所有的混合物都产生了为3838bp的正确PCR产物长度。第11-19道对应于与第2-10道相同的混合物，只是使用的是质粒模板DNA。预期的PCR产物约为8.6kb，只有一个肽标签-聚合酶混合物1.5mM MgCl₂(第17道)产生正确的产物。肽标签-聚合酶混合物包含醛修饰型SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQID NO：11。第20和21道显示了仅有肽标签-聚合酶的PCR，没有产物生成。对各电泳道的描述如下：

第1道：1kb DNA梯带。

第2道：准备好上样的含牛血清白蛋白(BSA)的肽标签-聚合酶混合物(1.5mM MgCl₂)

第3道：可直接上样的含BSA的肽标签-聚合酶混合物(2.0mMMgCl₂)

第4道：可直接上样的含BSA的肽标签-聚合酶混合物(2.5mMMgCl₂)

第5道：含BSA的肽标签-聚合酶混合物(1.5mM MgCl₂)

第6道：含BSA的肽标签-聚合酶混合物(2.0mM MgCl₂)

第7道：含BSA的肽标签-聚合酶混合物(2.5mM MgCl₂)

第8道：肽标签聚合酶混合物1.5mM MgCl₂

第9道：肽标签-聚合酶混合物2.0mM MgCl₂

第10道：肽标签-聚合酶混合物2.5mM MgCl₂

第20道：肽标签-聚合酶(1.5mM MgCl₂)小鼠基因组DNA，1ng/μl，1×PCR

第21道：肽标签-聚合酶(1.5mM MgCl₂)质粒DNA。

本文已经展示和描述了本发明的优选的实施方案，但是对本领域技术人员而言显然这些实施方案只是作为示例提供的。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下将会想到许多改变、变化及替换。应当理解，在实施本发明时可以采用大量本文所述的本发明实施方案的替代方案。以下权利要求意在限定本发明的范围，从而涵盖了这些权利要求范围内的方法和结构及其等效物。

Claims (75)

1.一种增强多肽稳定性的方法，包括提供具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列的肽标签。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签具有如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示的核酸序列编码。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签包含至少一至六个组氨酸残基。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签包含蛋白酶酶切位点。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶酶切位点包含氨基酸序列DDDDK。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制多肽的降解或变性。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制多肽的蛋白质功能丧失。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多肽在暴露于所述温度后的蛋白质功能是所述多肽在暴露于所述温度前的蛋白质功能的至少50％。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下维持所述多肽的稳定性至少一天。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽标签与所述多肽相连接。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽标签与所述多肽共价连接。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽标签与所述多肽非共价连接。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽标签与所述多肽的氨基末端相连接。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽标签与所述多肽的羰基末端相连接。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述多肽是***、人白血病抑制因子(hLIF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素、血管内皮生长因子(VEGF)、瘦素或贝伐珠单抗。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多肽包含至少一个突变。

18.根据权利要求11所述的方法，其中与所述多肽连接的所述肽标签具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。

19.根据权利要求11所述的方法，其中与所述多肽连接的所述肽标签由如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示的核酸序列编码。

20.根据权利要求11所述的方法，其中所述多肽是热稳定的蛋白质或酶。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶、脱氨酶或蛋白酶。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶I、水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq)、Thermococcus gorgonarius DNA聚合酶(Tgo)、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶或ZO5 DNA聚合酶。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述焦磷酸酶是嗜酸热原体焦磷酸酶(TAPP)。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述脱氨酶是超嗜热火球菌dCTP脱氨酶。

25.根据权利要求20所述的方法，其中所述热稳定的蛋白质是装饰肽或多肽。

26.一种核酸扩增方法，包括采用含有聚合酶的混合物延伸核酸引物，其中所述聚合酶与一种肽标签相连接，所述肽标签与由SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19编码的肽至少70％相同。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述肽标签与所述聚合酶的N末端相连接。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述肽标签与所述聚合酶的C末端相连接。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述聚合酶是Taq聚合酶。

30.根据权利要求26所述的方法，其中所述聚合酶在暴露于-20℃至50℃的温度后显示酶活性。

31.根据权利要求26所述的方法，其中所述混合物还包含第二种聚合酶。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二种聚合酶连接至与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18至少70％同源的肽序列。

33.根据权利要求26所述的方法，其中所述聚合酶在暴露于20℃至30℃的温度至少一天后显示酶活性。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述酶活性是所述混合物在暴露于所述温度至少一天之前的酶活性的至少50％。

35.一种包含连接于多肽的肽标签的组合物，其中所述肽标签在约-10℃至约50℃的温度下稳定所述多肽，并且其中所述融合多肽不具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

36.一种组合物，其包含：

(a)含有与第一多肽相连的肽标签的融合多肽；和

(b)第二多肽；

其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下稳定所述第一多肽或所述第二多肽。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制所述第一多肽或第二多肽的降解或变性。

38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制所述融合多肽或所述第二多肽的蛋白质功能丧失。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述融合多肽或第二多肽在暴露于所述温度后的蛋白质功能为所述融合多肽或第二多肽在暴露于所述温度前的蛋白质功能的至少50％。

40.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一多肽或第二多肽是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶、脱氨酶或蛋白酶。

41.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一多肽或第二多肽是***、人白血病抑制因子(hLIF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素、血管内皮生长因子(VEGF)、瘦素或贝伐珠单抗。

42.根据权利要求36所述的组合物，其中所述融合多肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22至少70％相同的氨基酸序列。

43.根据权利要求36所述的组合物，其中所述融合多肽包含由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQID NO：23编码的多肽。

44.根据权利要求36所述的组合物，其进一步包含第三多肽。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述融合多肽具有如SEQ ID NO：2所示的序列，所述第二多肽具有如SEQ ID NO：6所示的序列，而所述第三多肽具有如SEQ ID NO：11所示的序列。

46.一种融合多肽，其包含：

i)具有与SEQ ID NO：1至少70％相同的氨基酸序列的肽标签；

ii)至少一个多肽；

其中所述肽标签与所述至少一个多肽相连接，所述肽标签在-20℃至50℃的温度下稳定所述融合多肽，并且其中所述融合多肽不具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

47.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述肽标签与所述至少一个多肽共价连接。

48.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述肽标签与所述至少一个多肽非共价连接。

49.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述肽标签与所述至少一个多肽的氨基末端相连接。

50.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述肽标签与所述至少一个多肽的羰基末端相连接。

51.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述至少一个多肽是***、人白血病抑制因子(hLIF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素、血管内皮生长因子(VEGF)、瘦素或贝伐珠单抗。

52.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22至少70％相同的氨基酸序列。

53.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQID NO：23编码的多肽。

54.根据权利要求51所述的融合多肽，其中所述至少一个多肽包含至少一个突变。

55.根据权利要求46所述的融合多肽，其中所述至少一个多肽是热稳定的蛋白质或酶。

56.根据权利要求55所述的融合多肽，其中所述酶是聚合酶、逆转录酶、核酸酶、焦磷酸酶、脱氨酶或蛋白酶。

57.根据权利要求56所述的融合多肽，其中所述聚合酶是DNA聚合酶I、水生栖热菌DNA聚合酶I(Taq)、Thermococcus gorgonariusDNA聚合酶(Tgo)、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶或ZO5 DNA聚合酶。

58.根据权利要求56所述的融合多肽，其中所述焦磷酸酶是嗜酸热原体焦磷酸酶(TAPP)。

59.根据权利要求56所述的融合多肽，其中所述脱氨酶是超嗜热火球菌dCTP脱氨酶。

60.根据权利要求55所述的融合多肽，其中所述热稳定的蛋白质是装饰肽或多肽。

61.根据权利要求46所述的融合多肽，其包含第一多肽和第二多肽。

62.根据权利要求61所述的融合多肽，其中所述第一多肽是酶，而所述第二多肽是双链结合蛋白。

63.根据权利要求61所述的融合多肽，其中所述肽标签与所述第一多肽的氨基末端相连接，而所述第一多肽的羰基末端与所述第二多肽的氨基末端相连接。

64.根据权利要求63所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

65.根据权利要求63所述的融合多肽，其中所述融合多肽由SEQID NO：12所示的核苷酸序列编码。

66.根据权利要求61所述的融合多肽，其中所述肽标签与所述第二多肽的氨基末端相连接，而所述第二多肽的羰基末端与所述第一多肽的氨基末端相连接。

67.根据权利要求66所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

68.根据权利要求66所述的融合多肽，其中所述融合多肽由SEQID NO：5所示的核苷酸序列编码。

69.根据权利要求45所述的融合多肽，其中所述肽标签在-20℃至50℃的温度下抑制所述多肽的蛋白质功能丧失至少1天。

70.一种包含肽标签的多肽，所述肽标签具有与SEQ ID NO：1有50％至98％相同的氨基酸序列。

71.根据权利要求70所述的多肽，其中所述肽标签具有如SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

72.根据权利要求70所述的多肽，其进一步包含具有与SEQ IDNO：10至少70％相同的氨基酸序列的多肽。

73.根据权利要求72所述的多肽，其中所述多肽由如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列编码。

74.一种包含肽标签的多肽，所述肽标签具有与SEQ ID NO：14至少70％相同的氨基酸序列。

75.根据权利要求74所述的多肽，其中所述肽标签由如SEQ IDNO：15所示的核苷酸序列编码。

Images