CN102839203A - 淀粉质原料的酶解方法及发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淀粉质原料的酶解方法，所述方法包括：（1）将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，然后在淀粉酶的存在下进行酶解，得到第一液化液；（2）将步骤（1）得到的第一液化液进行固液分离得到滤渣；（3）将步骤（2）得到的滤渣调浆后在淀粉酶和纤维素酶的存在下进行酶解，得到第二液化液。还公开了一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括将黑曲霉接种至发酵培养基中并发酵产生柠檬酸，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，所述淀粉质原料酶解产物为如上所述的方法制备得到的淀粉质原料酶解产物。本发明的淀粉质原料的酶解方法制得的酶解产物用于柠檬酸发酵，可提高终点柠檬酸含量，提高转化率，从而降低柠檬酸的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产柠檬酸技术领域，具体地，涉及一种淀粉质原料的酶解方法，及采用含有该酶解方法得到的淀粉质原料酶解产物的发酵培养基发酵制备柠檬酸的方法。
背景技术
柠檬酸是一种广泛应用于饮料、食品及医药等行业的有机酸。目前，柠檬酸主要通过发酵法制备，例如，一般需要先将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物与水混合调浆，调浆后与酶接触进行酶解，得到酶解产物，并将黑曲霉接种至含有所述酶解产物的发酵培养基中发酵产生柠檬酸。
在上述工艺中，淀粉质原料的酶解至关重要。目前的淀粉质原料酶解工艺，大多采用二次喷射液化工艺。即淀粉调浆后与淀粉酶接触，然后经过两次喷射，喷射后降温再与淀粉酶进行接触，从而得到液化液。
但是，由现有的淀粉质原料酶解工艺得到的酶解产物中的残淀粉含量偏高，因此，柠檬酸发酵的终点柠檬酸含量较低，转化率较低，柠檬酸的生产成本较高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有淀粉质原料酶解工艺造成柠檬酸发酵的终点柠檬酸含量较低，转化率较低，柠檬酸的生产成本较高的问题，提供一种新的淀粉质原料的酶解方法以及一种发酵制备柠檬酸的方法。
本发明的发明人在研究中意外发现，将现有的二次喷射液化工艺得到的液化液进行固液分离，对所得滤渣进行调浆，调浆后与淀粉酶和纤维素酶接触再次进行酶解，在淀粉酶总用量相同的情况下，采用含有该淀粉质原料酶解产物的发酵培养基发酵制备柠檬酸，可提高终点柠檬酸含量，提高转化率，从而降低柠檬酸的生产成本。
因此，为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种淀粉质原料的酶解方法，所述方法包括：
（1）将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，然后在淀粉酶的存在下进行酶解，得到第一液化液；
（2）将步骤（1）得到的第一液化液进行固液分离得到滤渣；
（3）将步骤（2）得到的滤渣调浆后在淀粉酶和纤维素酶的存在下进行酶解，得到第二液化液。
优选地，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（1）和步骤（3）中所述淀粉酶的总用量为4-50酶活力单位，步骤（1）中淀粉酶的用量与步骤（3）中的淀粉酶的用量的比为8-10:1。
优选地，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（3）中纤维素酶的用量为2-10酶活力单位，进一步优选为6-8酶活力单位。
第二方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括将黑曲霉接种至发酵培养基中并发酵产生柠檬酸，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，其特征在于，所述淀粉质原料酶解产物为如上所述的方法制备得到的淀粉质原料酶解产物。
优选地，所述淀粉质原料酶解产物由第一液化液，以及由将步骤（2）中的第一液化液进行固液分离得到的液化清液和将步骤（3）中得到的第二液化液进行固液分离得到的液化清液组成的液化清液混合物组成。
优选地，以淀粉质原料酶解产物为100重量份为基准，所述第一液化液为15-20重量份，所述液化清液混合物为80-85重量份。
将本发明的淀粉质原料的酶解方法制得的酶解产物用于柠檬酸发酵，可提高终点柠檬酸含量，提高转化率，从而降低柠檬酸的生产成本。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种淀粉质原料的酶解方法，该方法包括：
（1）将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，然后在淀粉酶的存在下进行酶解，得到第一液化液；
（2）将步骤（1）得到的第一液化液进行固液分离得到滤渣；
（3）将步骤（2）得到的滤渣调浆后在淀粉酶和纤维素酶的存在下进行酶解，得到第二液化液。
本发明中，淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。
β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。
糖化酶又称淀粉α-1,4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1,6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。
异淀粉酶又称淀粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1,6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。
根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。更优选使用α-淀粉酶。
本发明中，根据GB 8275-2009定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），于70℃、pH=6.0条件下，1min内液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g（或u/ml）表示，本发明中淀粉酶的酶活力单位沿用此定义。
本发明中，纤维素酶是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。内切β-葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切β-葡聚糖酶作用于还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。
本发明中，纤维素酶的酶活力单位的定义为：1g酶粉或1ml酶液在50℃、pH4.8的条件下，1小时水解羧甲基纤维素钠溶液产生1mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位，以u/g（或u/ml）表示。
根据本发明，尽管采用上述方法即可实现本发明的目的，即在淀粉酶总用量相同的情况下，将上述方法制得的酶解产物用于柠檬酸发酵，可提高终点柠檬酸含量，提高转化率，且降低柠檬酸的生产成本。本发明的发明人在上述方法的基础上，意外发现当步骤（1）中淀粉酶的用量与步骤（3）中的淀粉酶的用量的比为8-10:1时，更有利于终点柠檬酸含量和转化率的提高，可进一步降低柠檬酸的生产成本。因此，优选情况下，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（1）和步骤（3）中淀粉酶的总用量为4-50酶活力单位，优选为20-40酶活力单位，步骤（1）中淀粉酶的用量与步骤（3）中的淀粉酶的用量的比为8-10:1。
另外，本发明的发明人经过大量实验研究发现，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（3）中纤维素酶的用量为2-10酶活力单位，优选为6-8酶活力单位，更有利于将滤渣中的由纤维素包裹的残淀粉充分释放出来，而提高终点柠檬酸含量和转化率，可进一步降低柠檬酸的生产成本。因此，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（3）中纤维素酶的用量优选为2-10酶活力单位，进一步优选为6-8酶活力单位。
本发明中，步骤（1）中，酶解的方法为本领域的公知常识，可以采用本领域常用的各种方法，例如，可以采用常用的一次喷射液化工艺或者二次喷射液化工艺，优选情况下，所述二次喷射液化工艺包括：
（ⅰ）将淀粉质原料粉碎后的产物调浆后与淀粉酶接触，得到混合物，将所述混合物与蒸汽接触，一次喷射至75-95℃，并在该温度下保持30-90分钟；再将一次喷射得到的产物与蒸汽接触，二次喷射至100-120℃，并在该温度下保持1-10分钟；
（ⅱ）将步骤（ⅰ）得到的产物降温至80-90℃，并与淀粉酶接触，得到第一液化液。
本发明中，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆的方法可以采用本领域技术人员公知的各种常规的方法，例如，将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物与水混合得到淀粉浆液。将淀粉质原料粉碎的条件和方式没有特别的限制，只要能够使淀粉质原料充分破碎便于酶解液化即可，优选情况下，得到的粉碎后的产物的颗粒直径为300-1000微米。将粉碎后的产物与水混合得到淀粉浆液的过程中，水的用量没有特别限定，通常情况下，为了便于后续步骤的酶解更充分，水与粉碎后产物的重量比可以为2-4:1。所述淀粉浆液的pH值可以为5-7。
按照本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）、小麦和高粱中的一种或几种。
根据本发明，尽管采用常用的二次喷射液化工艺即可得到第一液化液，但由于本发明方法后续还要使滤渣调浆后与淀粉酶接触，因此，在淀粉酶总用量相同的情况下，本发明的发明人对淀粉酶的用量分配进行了大量实验，并发现，当步骤（1）采用二次喷射液化工艺时，步骤（ⅰ）中淀粉酶的用量与步骤（ⅱ）中的淀粉酶的用量的比为1:0.5-0.8时，更有利于终点柠檬酸含量和转化率的提高，可进一步降低柠檬酸的生产成本，因此，优选情况下，步骤（ⅰ）中淀粉酶的用量与步骤（ⅱ）中的淀粉酶的用量的比为1:0.5-0.8。更优选情况下，步骤（ⅰ）中淀粉酶的用量与步骤（ⅱ）中的淀粉酶的用量与步骤（3）中淀粉酶的用量的比为5-6:3-4:1，可更进一步提高终点柠檬酸含量和转化率，更进一步降低柠檬酸的生产成本。
本发明中，步骤（ⅰ）中，与淀粉酶接触的条件优选包括：温度为45-60℃，时间为30-60分钟；步骤（ⅱ）中，与淀粉酶接触的条件优选包括：温度为80-90℃，时间为60-150分钟。
根据本发明，步骤（ⅱ）中，可以通过多种方式将步骤（ⅰ）得到的产物降温80-90℃，优选情况下，通过闪蒸的方式将步骤（ⅰ）得到的产物降温80-90℃，以使大颗粒淀粉膨胀破裂为小颗粒淀粉，从而达到更佳的酶解效果。可以通过本领域常规的工艺进行闪蒸，因此本文不再赘述。更优选的情况下，将闪蒸后得到的冷凝水用于步骤（3）中滤渣的调浆，这样不仅可以提高热能利用效率，还有利于进一步降低粮耗。
本发明中，步骤（2）中，对于固液分离的方式无特殊要求，可以采用本领域常用的各种固液分离的方式，如离心分离或者压滤等方式，具体在此不再赘述。对于固液分离的程度，以固液分离得到的滤渣的固含量表示，滤渣的固含量优选为45-55重量%，进一步优选为49-51重量%。
本发明中，步骤（3）中，酶解的方法优选包括：将步骤（2）得到的滤渣调浆后与淀粉酶和纤维素酶接触，得到混合物，将混合物与蒸汽接触喷射至80-90℃，并在该温度下保持30-90分钟。
本发明中，为了利于提高热能利用效率并进一步降低粮耗，优选采用步骤（ⅱ）闪蒸后得到的冷凝水对滤渣进行调浆，对于水的用量没有特别限定，通常情况下，为了便于后续酶解更充分，滤渣与水的重量比优选为1:1-3。滤渣调浆后得到的滤渣浆液的pH值优选为5.5-5.8。
本发明中，与淀粉酶和纤维素酶接触的条件优选包括：温度为60-70℃，时间为20-40min。
本发明中，对于步骤（ⅰ）和步骤（3）中喷射的方式和时间没有特别限定，只要分别喷射至上述各要求温度即可。喷射可以在本领域技术人员所公知的喷射器（例如，兆光喷射器或天长水热器）中进行，在此不再赘述。需要说明的是，喷射至某温度（以100℃为例），指的是喷射后物料的温度为100℃，而不是喷射使用的蒸汽温度为100℃。
另一方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括将黑曲霉接种至发酵培养基中并发酵产生柠檬酸，发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，该淀粉质原料酶解产物为如上所述的方法制备得到的淀粉质原料酶解产物。
本发明中，淀粉质原料酶解产物优选由第一液化液，以及由将步骤（2）中的第一液化液进行固液分离得到的液化清液和将步骤（3）中得到的第二液化液进行固液分离得到的液化清液组成的液化清液混合物组成。以淀粉质原料酶解产物为100重量份为基准，第一液化液优选为15-20重量份，液化清液混合物优选为80-85重量份。
本发明中，发酵培养基优选由第一液化液，以及由将步骤（2）中的第一液化液进行固液分离得到的液化清液和将步骤（3）中得到的第二液化液进行固液分离得到的液化清液组成的液化清液混合物组成。以发酵培养基为100重量份为基准，第一液化液优选为15-20重量份，液化清液混合物优选为80-85重量份。
本发明中，对于第二液化液进行固液分离的程度，以固液分离得到的滤渣的固含量表示，滤渣的固含量优选为45-55重量%，进一步优选为49-51重量%。
本发明中，对于发酵制备柠檬酸的其他具体方法和条件均可参照本领域的公知常识进行，在此不再赘述。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
在以下实施例和对比例中：
黑曲霉菌种为黑曲霉Co827。
根据GB 1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度（即终点柠檬酸含量）。
按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度，当发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下时，确定为发酵终点，停止发酵。
单罐供酸量=柠檬酸溶液的浓度×柠檬酸溶液的体积。
转化率（%）=单罐供酸量/用糖的总重量×100%，其中用糖的总重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的淀粉质原料的酶解方法及发酵制备柠檬酸的方法。
（1）将玉米粉碎得到玉米粉（颗粒直径为400μm），用水调浆得到玉米浆液，玉米粉与水的重量比为1:3，并调节玉米浆液的pH值为6。然后将玉米浆液在55℃下与淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶）接触45分钟，得到混合物，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为16.5u/g。
（2）将步骤（1）得到的混合物与200℃的蒸汽在兆光喷射器中进行一次喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），一次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为85℃，并在该温度下保持60分钟；再将一次喷射获得的产物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行二次喷射（蒸汽与一次喷射获得的产物的重量比为0.05:1），二次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为110℃，并在该温度下保持4min。
（3）将步骤（2）得到的产物进行闪蒸（压力为0.07MPa，时间为10s）以降温至85℃，然后在该温度下与淀粉酶接触100分钟，得到第一液化液，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为10.5u/g。
（4）将步骤（3）的第一液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和滤渣，其中，滤渣的固含量为51重量%。
（5）将步骤（4）得到的滤渣用步骤（3）闪蒸后得到的冷凝水调浆，得到滤渣浆液，滤渣与水的重量比为1:2，并调节滤渣浆液的pH值为5.5。然后将滤渣浆液在65℃下与淀粉酶和纤维素酶（购于济宁和美生物工程有限公司，本发明实施例中均为此纤维素酶）接触30分钟，得到混合物，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为3u/g，纤维素酶的用量为7u/g。
（6）将步骤（5）得到的混合物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为85℃，并在该温度下保持60min，得到第二液化液。
（7）将步骤（6）的第二液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和滤渣，其中，滤渣的固含量为51重量%，将液化清液与步骤（4）的液化清液混合，得到液化清液混合物。
（8）配制发酵培养基，将180.5千克的液化清液混合物、35.5千克的第一液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。
（9）将第一液化液加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养基，将种子培养基投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种，每升种子培养基中黑曲霉的接种量为2.5×108个孢子。在35℃、起始pH值为5、0.3体积:（体积·分钟）的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH＜2.0、酸度＞1g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
（10）将步骤（9）培养的黑曲霉菌种加入到步骤（8）的发酵罐中开始发酵，接种量为3×107个孢子，发酵条件包括温度为35℃，起始pH值为5，通气量为0.3体积:（体积·分钟），发酵至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下停止发酵，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的淀粉质原料的酶解方法及发酵制备柠檬酸的方法。
（1）将玉米粉碎得到玉米粉（颗粒直径为380μm），用水调浆得到玉米浆液，玉米粉与水的重量比为1:2，并调节玉米浆液的pH值为5。然后将玉米浆液在45℃下与淀粉酶接触60分钟，得到混合物，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为10u/g。
（2）将步骤（1）得到的混合物与200℃的蒸汽在兆光喷射器中进行一次喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.03:1），一次喷射的时间为3s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为75℃，并在该温度下保持90分钟；再将一次喷射获得的产物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行二次喷射（蒸汽与一次喷射获得的产物的重量比为0.03:1），二次喷射的时间为3s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为100℃，并在该温度下保持10min。
（3）将步骤（2）得到的产物进行闪蒸（压力为0.07MPa，时间为10s）以降温至80℃，然后在该温度下与淀粉酶接触150分钟，得到第一液化液，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为8u/g。
（4）将步骤（3）的第一液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和滤渣，其中，滤渣的固含量为50重量%。
（5）将步骤（4）得到的滤渣用步骤（3）闪蒸后得到的冷凝水调浆，得到滤渣浆液，滤渣与水的重量比为1:1，并调节滤渣浆液的pH值为5.6。然后将滤渣浆液在70℃下与淀粉酶和纤维素酶接触40分钟，得到混合物，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为2u/g，纤维素酶的用量为6u/g。
（6）将步骤（5）得到的混合物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为80℃，并在该温度下保持90min，得到第二液化液。
（7）将步骤（6）的第二液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和滤渣，其中，滤渣的固含量为50重量%，将液化清液与步骤（4）的液化清液混合，得到液化清液混合物。
（8）配制发酵培养基，将172.8千克的液化清液混合物、43.2千克的第一液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。
（9）将第一液化液加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养基，将种子培养基投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种，每升种子培养基中黑曲霉的接种量为2×108个孢子。在36℃、起始pH值为5.5、0.6体积:（体积·分钟）的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH＜2.0、酸度＞1g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
（10）将步骤（9）培养的黑曲霉菌种加入到步骤（8）的发酵罐中开始发酵，接种量为2.2×107个孢子，发酵条件包括温度为36℃，起始pH值为4.5，通气量为0.8体积:（体积·分钟），发酵至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下停止发酵，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的淀粉质原料的酶解方法及发酵制备柠檬酸的方法。
（1）将玉米粉碎得到玉米粉（颗粒直径为370μm），用水调浆得到玉米浆液，玉米粉与水的重量比为1:4，并调节玉米浆液的pH值为7。然后将玉米浆液在60℃下与淀粉酶接触30分钟，得到混合物，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为24u/g。
（2）将步骤（1）得到的混合物与200℃的蒸汽在兆光喷射器中进行一次喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.08:1），一次喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为95℃，并在该温度下保持30分钟；再将一次喷射获得的产物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行二次喷射（蒸汽与一次喷射获得的产物的重量比为0.08:1），二次喷射的时间为3s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为120℃，并在该温度下保持1min。
（3）将步骤（2）得到的产物进行闪蒸（压力为0.07MPa，时间为10s）以降温至90℃，然后在该温度下与淀粉酶接触60分钟，得到第一液化液，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为12u/g。
（4）将步骤（3）的第一液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和滤渣，其中，滤渣的固含量为49重量%。
（5）将步骤（4）得到的滤渣用步骤（3）闪蒸后得到的冷凝水调浆，得到滤渣浆液，滤渣与水的重量比为1:3，并调节滤渣浆液的pH值为5.8。然后将滤渣浆液在60℃下与淀粉酶和纤维素酶接触20分钟，得到混合物，以每克玉米粉的干重计，淀粉酶的用量为4u/g，纤维素酶的用量为8u/g。
（6）将步骤（5）得到的混合物与220℃的蒸汽在兆光喷射器中进行喷射（蒸汽与混合物的重量比为0.05:1），喷射的时间为5s，使得与蒸汽接触后的产物的温度为90℃，并在该温度下保持30min，得到第二液化液。
（7）将步骤（6）的第二液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和滤渣，其中，滤渣的固含量为49重量%，将液化清液与步骤（4）的液化清液混合，得到液化清液混合物。
（8）配制发酵培养基，将183.6千克的液化清液混合物、32.4千克的第一液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。
（9）将第一液化液加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养基，将种子培养基投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种，每升种子培养基中黑曲霉的接种量为3×108个孢子。在37℃、起始pH值为6、0.8体积:（体积·分钟）的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH＜2.0、酸度＞1g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
（10）将步骤（9）培养的黑曲霉菌种加入到步骤（8）的发酵罐中开始发酵，接种量为3.6×107个孢子，发酵条件包括温度为37℃，起始pH值为4，通气量为0.6体积:（体积·分钟），发酵至发酵液中还原糖含量达到0.3g/100mL以下停止发酵，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例4
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为9.75u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为7.8u/g，步骤（5）中淀粉酶的用量为2.45u/g，纤维素酶的用量为6u/g。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例5
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为10.2u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为8.16u/g，步骤（5）中淀粉酶的用量为1.64u/g，纤维素酶的用量为6u/g。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例6
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为12.8u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为5.2u/g，步骤（5）中淀粉酶的用量为2u/g，纤维素酶的用量为6u/g。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例7
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为9.5u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为8.5u/g，步骤（5）中淀粉酶的用量为2u/g，纤维素酶的用量为6u/g。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例8
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为10u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为8u/g，步骤（5）中淀粉酶的用量为2u/g，纤维素酶的用量为10u/g。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
实施例9
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为10u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为8u/g，步骤（5）中淀粉酶的用量为2u/g，纤维素酶的用量为2u/g。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
对比例1
按照实施例2的方法进行淀粉质原料的酶解及发酵制备柠檬酸，不同的是，步骤（1）中淀粉酶的用量为11.1u/g，步骤（3）中淀粉酶的用量为8.9u/g，不进行步骤（5）-（7），步骤（8）中，将172.8千克的步骤（4）的液化清液、43.2千克的第一液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。测定柠檬酸溶液的浓度，即终点柠檬酸含量，计算转化率见表1。
表1
| 实施例/对比例编号 | 终点柠檬酸含量（g/100ml） | 转化率（%） |
| 实施例1 | 14.49 | 97.25 |
| 实施例2 | 14.43 | 96.85 |
| 实施例3 | 14.45 | 96.98 |
| 实施例4 | 14.35 | 96.31 |
| 实施例5 | 14.38 | 96.51 |
| 实施例6 | 14.28 | 95.84 |
| 实施例7 | 14.25 | 95.64 |
| 实施例8 | 14.20 | 95.30 |
| 实施例9 | 14.03 | 94.16 |
| 对比例1 | 13.90 | 93.30 |
将实施例1-9与对比例1进行比较可以看出，采用本发明方法进行淀粉质原料的酶解，并将酶解产物用于柠檬酸发酵，可提高终点柠檬酸含量和转化率。
将实施例2分别与实施例4和实施例5进行比较可以看出，前两次淀粉酶的总用量与第三次淀粉酶的用量的比为8-10:1时，更有利于终点柠檬酸含量和转化率的提高；将实施例2分别与实施例6和实施例7进行比较可以看出，第一次淀粉酶的用量与第二次淀粉酶的用量的比为1:0.5-0.8时，更有利于终点柠檬酸含量和转化率的提高；将实施例2分别与实施例8和实施例9进行比较可以看出，以每克粉碎后的产物的干重计，纤维素酶的用量为6-8酶活力单位时，更有利于终点柠檬酸含量和转化率的提高。
将本发明的淀粉质原料的酶解方法制得的酶解产物用于柠檬酸发酵，可提高终点柠檬酸含量，提高转化率，从而降低柠檬酸的生产成本。
Claims (14)
1.一种淀粉质原料的酶解方法，所述方法包括：
（1）将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，然后在淀粉酶的存在下进行酶解，得到第一液化液；
（2）将步骤（1）得到的第一液化液进行固液分离得到滤渣；
（3）将步骤（2）得到的滤渣调浆后在淀粉酶和纤维素酶的存在下进行酶解，得到第二液化液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（1）和步骤（3）中所述淀粉酶的总用量为4-50酶活力单位，步骤（1）中淀粉酶的用量与步骤（3）中的淀粉酶的用量的比为8-10:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（3）中纤维素酶的用量为2-10酶活力单位。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，以每克粉碎后的产物的干重计，步骤（3）中纤维素酶的用量为6-8酶活力单位。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，步骤（1）中，所述酶解的方法包括：
（ⅰ）将淀粉质原料粉碎后的产物调浆后与淀粉酶接触，得到混合物，将所述混合物与蒸汽接触，一次喷射至75-95℃，并在该温度下保持30-90分钟；再将一次喷射得到的产物与蒸汽接触，二次喷射至100-120℃，并在该温度下保持1-10分钟；
（ⅱ）将步骤（ⅰ）得到的产物降温至80-90℃，并与淀粉酶接触，得到第一液化液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（ⅰ）中淀粉酶的用量与步骤（ⅱ）中的淀粉酶的用量的比为1:0.5-0.8。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤（ⅰ）中，与淀粉酶接触的条件包括：温度为45-60℃，时间为30-60分钟；步骤（ⅱ）中，与淀粉酶接触的条件包括：温度为80-90℃，时间为60-150分钟。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（ⅱ）中，采用闪蒸的方式将步骤（ⅰ）得到的产物降温80-90℃，并将闪蒸后得到的冷凝水用于步骤（3）中滤渣的调浆。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，步骤（3）中，所述酶解的方法包括：将步骤（2）得到的滤渣调浆后与淀粉酶和纤维素酶接触，得到混合物，将所述混合物与蒸汽接触喷射80-90℃，并在该温度下保持30-90分钟。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，与淀粉酶和纤维素酶接触的条件包括：温度为60-70℃，时间为20-40min。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述淀粉质原料选自玉米、薯类、小麦和高粱中的一种或几种。
12.一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括将黑曲霉接种至发酵培养基中并发酵产生柠檬酸，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，其特征在于，所述淀粉质原料酶解产物为权利要求1-11中任意一项所述的方法制备得到的淀粉质原料酶解产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述淀粉质原料酶解产物由第一液化液，以及由将步骤（2）中的第一液化液进行固液分离得到的液化清液和将步骤（3）中得到的第二液化液进行固液分离得到的液化清液组成的液化清液混合物组成。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，以淀粉质原料酶解产物为100重量份为基准，所述第一液化液为15-20重量份，所述液化清液混合物为80-85重量份。
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