CN102827259A

CN102827259A - 一种猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其应用

Info

Publication number: CN102827259A
Application number: CN2012103157763A
Authority: CN
Inventors: 王宏华; 于春梅; 凌红丽; 蒋皓静; 张园园
Original assignee: QINGDAO BOITE BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd; Qingdao Continent Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: QINGDAO BOITE BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd; Qingdao Continent Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其应用，蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明的圆环病毒2型Cap蛋白可用于制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗。本发明获得的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗经肌肉接种21日龄PCV2阴性断奶仔猪5头，另取5头作为对照。接种28日后取血测PCV2抗体，免疫组PCV2抗体全部为阳性，有效率达到100%，对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗可以引起仔猪的免疫应答。

Description

一种猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其应用

技术领域

本发明属于家畜基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其应用。

背景技术：

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）是断奶仔猪多***衰竭综合征（Postweaning multsystemic wasting syndrome， PMWS）的病原，该病毒可引起断奶仔猪发生进行性消瘦、咳嗽、呼吸困难、腹泻、皮肤苍白或者黄染、***肿大、肾脏灰白水肿等症状。同时该病毒还会造成一定程度上的的免疫抑制，容易造成其它疾病的继发或并发感染。自1991年加拿大首次发现临床猪圆环病毒以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此，对猪圆环病毒2型的研究一直是家禽养殖领域的重点之一。

猪圆环病毒2型的Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，可自我装配成病毒性粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫保护，是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。目前，国外已有昆虫杆状病毒表达猪圆环病毒2型的Cap蛋白制备的基因工程亚单位疫苗实现商业化应用。但随着猪圆环病毒2型毒株不断变异，现有疫苗的免疫保护力不断下降。因此，筛选当前流行毒株的Cap蛋白进行疫苗研发无疑具有重要的现实意义和市场开发价值。

发明内容：

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型Cap蛋白基因及其应用，即一种新的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因，及其作为疫苗的应用。

本发明一个方面提供一种圆环病毒2型Cap蛋白，包括氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白。

本发明另一个方面涉及编码上述蛋白的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明再一个方面涉及圆环病毒2型Cap蛋白在制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明获得的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗经肌肉接种21日龄PCV2阴性断奶仔猪，接种28日后取血测PCV2抗体，免疫组PCV2抗体全部为阳性，有效率达到100%，而对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗可以引起仔猪的免疫应答。

说明书附图

图1：本发明所用的载体构建图谱。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

一、猪圆环病毒2型Cap蛋白基因的扩增

将临床分离疑似PMWS的病料处理后接种无PCV1污染的PK-15细胞、盲传三代后，PCR扩增猪圆环病毒2型基因全长，引物序列如下：

P1: 5′--GCTGGCTGAACTTTTGAAAG--3′

P2： 5 ′--AAATTTCTGACAAACGTTAC--3′

扩增的条件如下：94℃ 5min变性，94℃ 30S，65℃ 30S，72℃1.5min，30个循环，72℃延伸10min。

扩增产物进行测序后将Cap蛋白基因序列部分在NCBI上Blast比对，同源性最高为97%，表明扩增的样品为发生变异的病毒株。其翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。对Cap蛋白基因进行大肠杆菌稀有密码子改造，改造后的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。将改造后的Cap蛋白基因的核苷酸（SEQ ID NO：2）5′端和3′端分别加上BamH I和HindIII酶切位点，送基因公司进行全基因合成。

二、基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得

1、上述扩增得到的Cap蛋白基因双酶切后连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/mCap表达载体（图1）。

2、用CaCl₂法将pET30a/mCap表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培养至0.6～0.8时加入0.3mM IPTG诱导4～5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在30KD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为35%以上。经PCV2抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白（SEQ ID NO：1）的工程菌。

三、发酵、纯化与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的制备

1、发酵工艺

1） LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO₄·7H₂O的LB培养基作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 5 g/L。

2）发酵过程

挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50μg/ml的LB培养基，37℃振荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2%接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37℃，200转，溶氧控制在20%以上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0.3mmol/L IPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。

3）镍柱纯化、脱盐

4）亲和层析

采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脱液洗下来，纯度达到90％以上

5）脱盐

收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐即得重组蛋白液。

2、猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的制备

将制备的序列为SEQ ID NO：1的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分搅拌混合作为水相。同时注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。

四、重组蛋白制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的动物试验

将制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗经肌肉接种21日龄PCV2阴性断奶仔猪5头，另取5头作为对照。接种28日后取血测PCV2抗体，免疫组PCV2抗体全部为阳性，有效率达到100%，对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗可以引起仔猪的免疫应答。并且，由于本发明的猪圆环病毒2型基因为新的等位基因，可以更有效的对仔猪进行免疫保护。

Claims

1.一种圆环病毒2型Cap蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2.一种核苷酸，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的圆环病毒2型Cap蛋白。

3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸的序列为SEQID NO：2。

4.权利要求1所述的圆环病毒2型Cap蛋白在制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗中的应用。