CN102822353A - 确定和确认样品中存在hpv的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于对样品中的靶核酸进行基因分型的方法。在各种方面中,这些方法包括在特异针对兴趣基因型的探针和靶核酸之间产生核酸杂合体,和检测样品中的杂交。在其它方面中,这些方法包括使用多探针混合物,以减少确定靶核酸基因型所需的样品体积。
Description
相关专利申请参考
本申请要求2010年1月29日提交的美国临时专利申请号61/299,729的优先权,所述文件通过提述以其整体并入本文。
发明领域
本公开涉及用于确定和确认样品中存在靶核酸并对靶核酸进行基因分型的方法和组合物。
背景
生物样品特别是临床样品的保存是必需的,以确保样品可以连续用于各种水平的分析。经常地,研究人员或医师希望对单一的样品进行多种测试,使得一个测试的结果可与其它的结果相关联。而且,当临床样品的获得是困难的、令人不舒服或者令人痛苦时,优选不对同一个受试者或患者进行多次采样。因此,需要使在某些测试中使用的样品量最少,从而使得可以对单一样品进行的测试的数目最多。
仅作为一个实例,宫颈样品通常在妇科检查过程中收集。当观察到这类样品中异常的细胞学检查结果时,通常有益于确定组织是否受到与***有关的人***瘤病毒(HPV)的感染。用于HPV感染的最常用的测试通常只能区分高危和低危HPV感染,而不能区分高危或低危HPV的各个种。在一些情况下,确定HPV感染的具体基因型可能是有用的。
已经为HPV 16、18和45的特异性检测开发了digene HPV基因分型PSTM测试(PS测试),意图用作样品的反射基因分型测试,定量地确定含有高危人***瘤病毒(HR-HPV)。PS测试经常用于对通过digene hc2 HPV测试(HC2测试)鉴定的HR-HPV阳性样品进行基因分型,HC2测试在美国专利Nos.4,849,331;4,849,332;4,849,334;4,908,306;5,411,857;5,643,715;5,712,092;5,876,922;5,952,487;5,958,674;6,107,086;和5,981,173中描述,每篇文件通过提述并入本文。PS测试和HC2测试都基于杂合体捕获技术,其在许多参考文献例如美国专利Nos.4,732,847;4,865,980;和6,228,578B1中描述,每篇文件通过提述并入本文。已经证明PS测试与Specimen Transport MediumTM(STM)介质和通用的液基细胞学(LBC)介质(PC)相容。然而,尚没有测试其与另一种常用的LBC介质的情况。此外,意图使用PS测试分别检测HPV基因型,这需要对于每种测试的基因型的每个患者样本的分离的等分试样。此外,一些样本可能在定量测试之后缺少足够的体积以对每个待评价基因型进行单独测试。因此,开发以减少的体积在SP样品中进行PS测试的材料和方法是有益的。
发明内容
本公开在各个方面和实施例中通过提供对样品中的靶核酸进行基因分型的方法致力于解决各种需求和问题。
在一个方面中,提供了用于对样品中的靶核酸进行基因分型的方法,包括:
(a)通过如下方法产生第一检测混合物,所述方法包括使样品的一部分与第一探针组接触,其中该第一探针组包括对于靶核酸的第一基因型特异的核酸探针和对于靶核酸的第二基因型特异的核酸探针,但是不包括对于靶核酸的第三基因型特异的核酸探针;
(b)通过如下方法产生第二检测混合物,所述方法包括使样品的一部分与第二探针组接触,其中该第二探针组包括对于靶核酸的第二基因型特异的核酸探针和对于靶核酸的第三基因型特异的核酸探针,但是不包括对于靶核酸的第一基因型特异的核酸探针;和
(c)在如下条件下处理第一和第二检测混合物,其中所述核酸探针与靶核酸的第一、第二和/或第三基因型特异性地杂交;和
(d)检测核酸探针与靶核酸的杂交,其中:
(i)在第一检测混合物中杂交但在第二检测混合物中不杂交,指示所述样品包含靶核酸的第一基因型;
(ii)在第二检测混合物中杂交但在第一检测混合物中不杂交,指示所述样品包含靶核酸的第三基因型;和
(iii)在第一检测混合物和第二检测混合物中均杂交,指示所述样品包含靶核酸的第二基因型。
在一个方面中,靶核酸是HPV核酸。
在一个方面中,该靶核酸的第一、第二和第三基因型选自下组:HPV2,HPV3,HPV6,HPV10,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV27,HPV28,HPV29,HPV30,HPV31,HPV32,HPV33,HPV34,HPV35,HPV39,HPV42,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV54,HPV56,HPV57,HPV58,HPV59,HPV64,HPV66,HPV67,HPV68,HPV69,HPV70,HPV73,HPV82,HPV84,HPV85,HPV86,HPV87和HPV94核酸。
在一个方面中,该靶核酸的第一、第二和第三基因型是HPV16,HPV18和HPV45核酸。
在一个方面中,样品是保存在液基细胞学介质中的临床样品。
在一个方面中,液基细胞学介质选自下组:Preservcyt和SurePath。
在一个方面中,核酸探针的杂交形成DNA:RNA杂合体。
在一个方面中,DNA:RNA杂合体通过如下方法检测,所述方法包括将DNA:RNA杂合体与DNA:RNA特异性抗体接触。
在一个方面中,靶核酸首先通过如下方法鉴定为靶核酸的第一、第二或第三基因型,所述方法包括用能够扩增靶核酸的第一、第二和第三基因型中每一种的至少一部分的共有引物扩增HPV核酸。
在一个方面中,靶核酸通过包括定量PCR的方法扩增。
在一个方面中,靶核酸首先通过如下方法鉴定为靶核酸的第一、第二或第三基因型,所述方法包括将共有探针与靶核酸的基因型杂交,其中该共有探针对于靶核酸的第一、第二和第三基因型的每一种是特异的。
在一个方面中,共有探针与第一、第二和/或第三HPV核酸的杂交产生DNA:RNA杂合体。
在一个方面中,DNA:RNA杂合体通过如下方法检测,所述方法包括使DNA:RNA杂合体与DNA:RNA特异性抗体接触。
在一个方面中,DNA:RNA杂合体通过如下方法检测,所述方法包括使DNA:RNA杂合体与DNA:RNA特异性抗体接触。
在一个方面中,该方法包括、基本上由或者由如下构成:(1)对样品进行定量PCR反应以获得存在HR-HPV基因型的初始指示;(2)进行杂合体捕获测定法以确认存在HR-HPV的确定结果;和(3)进行PS测试以对样品中确定存在的HR-HPV进行基因分型。
附图简述
图1图示了用于确定样品中存在HPV的例示流程。
图2显示了用于进行PS测试的例示流程。
图3比较了多重探针混合物与单一探针混合物用于检测2pg/mL浓度质粒DNA的灵敏性。
发明详述
本公开涵盖用于确定样品中至少一种HPV核酸的基因分型的方法、组合物、试剂和试剂盒。这些方法、组合物、试剂、***和试剂盒可用于临床诊断目的,包括但不限于,确定和鉴定HPV感染的组织,并确定发生与HPV感染有关的病理状态的风险。
在一个方面中,提供了用于对样品中HPV核酸进行基因分型的方法,包括:
(a)通过如下方法产生第一检测混合物,所述方法包括使样品的一部分与第一探针组接触,其中该第一探针组包含对于第一HPV核酸特异的核酸探针和对于第二HPV核酸特异的核酸探针,但是不包含对于第三HPV核酸特异的核酸探针;
(b)通过如下方法产生第二检测混合物,所述方法包括使样品的一部分与第二探针组接触,其中该第二探针组包含对于第二HPV核酸特异的核酸探针和对于第三HPV核酸特异的核酸探针,但是不包含对于第一HPV核酸特异的核酸探针;和
(c)在如下条件下处理第一和第二检测混合物,其中核酸探针与第一、第二和/或第三HPV核酸特异性地杂交;和
(d)检测核酸探针与HPV核酸的杂交,其中:
(i)在第一检测混合物中发生杂交但在第二检测混合物中不杂交,表明样品包含第一HPV核酸;
(ii)在第二检测混合物中发生杂交但在第一检测混合物中不杂交,表明样品包含第三HPV核酸;
(iii)在第一检测混合物和第二检测混合物中均发生杂交,表明样品包含第二HPV核酸。
A.样品
A.样品
任何样品均可用作起始点,包括但不限于样本或培养物(例如细胞、微生物和病毒培养物),包括临床和实验生物学和环境样品。生物样品可来自动物,包括人,流体、固体(例如粪便)或组织,以及液体或固体食物和饲料产品和成分如乳品(dairy item)、植物/蔬菜(vegetable)、肉类和肉类副产品,和废物。环境样品包括环境材料,如表面物质、污物/土壤(soil)、水和工业样品,以及从食物和乳品加工设施、设备、装置、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。
例示的生物样品包括,但不仅限于,宫颈上皮细胞(例如从宫颈拭子获得的样品)、腺样细胞、***上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰和***。
在一个方面中,生物样品被收集和储存在收集介质中。收集介质具有多种功能,包括作为防腐介质以保存核酸并抑制核酸酶,从而防止核酸在分析之前被降解。在一个方面中,收集介质是基于洗涤剂的。没有任何限制,例示的收集介质包括见于美国专利公开No.US 2010-0105060A1和美国专利公开No.US2010-0159463A1的那些,两篇文件均通过提述以它们的整体并入本文。
在一个方面中,基于洗涤剂的收集介质包含如下,基本上由如下组成或者由如下组成:1.0% NP-40,0.25%脱氧胆酸钠,50mM Tris-HCl,25mM EDTA,150mM NaCl和0.05%叠氮化钠。在另一个方面中,基于洗涤剂的收集介质包含如下,基本上由如下组成或者由如下组成:约0.5%-约2.0%NP-40,约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,约25mM-约75mM Tris-HCl,约10mM-约50mMEDTA,约50mM-约200mM NaCl,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在另一个方面中,基于洗涤剂的收集介质包含如下,基本上由如下组成或者由如下组成:约0.8%-约1.5%NP-40,约0.20%-约0.40%脱氧胆酸钠,约30mM-约60mMTris-HCl,约20mM-约40mM EDTA,约100mM-约200mM NaCl,和约0.025%-约0.075%叠氮化钠。在另外一个方面中,基于洗涤剂的收集介质包含如下,基本上由如下组成或者由如下组成:约0.9%-约1.2%NP-40,约0.20%-约0.30%脱氧胆酸钠,约30mM-约60mM Tris-HCl,约20mM-约30mMEDTA,约100mM-约150mM NaCl,和约0.04%-约0.06%叠氮化钠。
在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由NP-40和EDTA组成。在另一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由NP-40、EDTA和叠氮化钠组成。在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由脱氧胆酸钠、EDTA和叠氮化钠组成。在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由NP-40、脱氧胆酸钠、EDTA和叠氮化钠组成。在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由NP-40、脱氧胆酸钠、Tris-HCl、EDTA和叠氮化钠组成。
在另一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由如下组成:0.5%-约2.0%NP-40和10mM-约50mM EDTA。在另一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由如下组成:0.5%-约2.0%NP-40,10mM-约50mM EDTA,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由如下组成:约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,10mM-约50mM EDTA,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由如下组成:约0.5%-约2.0%NP-40,约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,10mM-约50mMEDTA,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在一个方面中,收集介质包含、基本上由或者由如下组成:约0.5%-约2.0%NP-40,约0.10%-约0.40%脱氧胆酸钠,约25mM-约75mM Tris-HCl,约10mM-约50mM EDTA,和约0.01%-约0.10%叠氮化钠。在某些方面中,收集介质包含、基本上由或者由如下组成:1%NP-40,0.25%脱氧胆酸钠,50mM Tris-HCl,25mM EDTA,150mM NaCl和0.09%叠氮化钠。该介质在本文常常称为Digene收集介质或DCM。
可将样品收集在其它已知的收集介质中,并可以用在本文所述的方法中。其它收集介质的实例包括PRESERVCYT,SUREPATH,尿(urine)和STM(样品/样本传输介质)。在这些介质的一些中收集的样品在可对样品中的核酸进行检测和分析之前可需要处理。处理样品(也称作制备样品)的多种方法是本领域已知的。例如,在介质如PRESERVCYT中收集的用于细胞学分析的宫颈细胞样品可以和基于洗涤剂的裂解缓冲液组合,然后添加包含核酸结合表面的磁珠。
在另一个方面中,样品可包含、由或者基本上由已从生物样品提取的核酸组成。已知大量方法用于从生物学或环境样品提取核酸,包括但不限于:酚/氯仿提取;阴离子交换层析;氯化铯梯度超离心;大小排阻层析;和二氧化硅(silca)/离液盐(chaotropic salt)提取。如果期望包含特定核酸大小的样品,则提取的核酸可通过凝胶电泳根据大小进一步分离,并从凝胶中提取。
B.靶核酸
如上文指出的,本文公开的方法涉及样品中靶核酸的检测和基因分型。靶核酸可为DNA或RNA或DNA和RNA两者,并可为单链、双链或部分单链的。靶核酸可包含在更大的核酸内。靶核酸或包含所述靶核酸的更大核酸的检测涵盖于本公开。
靶核酸可包括,但不限于,样本或培养物(例如细胞、微生物和病毒培养物)中存在的核酸,包括生物学和环境样品。所述靶核酸可存在于来自如下的生物样品中:动物包括人,流体、固体(例如粪便)或组织,以及液体和固体食品和饲料产品和成分如乳品(dairy item)、植物/蔬菜、肉类和肉类副产品,和废物。靶核酸可存在于环境样品中,并包括环境材料如表面物质、污物/土壤、水和工业样品,以及从食物和乳品加工设施、设备、装置、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。
生物样品中存在的靶核酸包括,但不限于,宫颈样品(例如从宫颈拭子获得的样品)或宫颈细胞样品、腺样细胞、***上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳、淋巴、痰和***。所述靶核酸可来自其它病毒、细菌、分枝杆菌或原质团(plasmodia),如巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、H1N1、淋病奈瑟氏菌(GC)、沙眼衣原体(CT)、***毛滴虫、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、SARS相关的冠状病毒或流感病毒。
在一个方面中,靶核酸与和如下任意一种样品相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性:宫颈样品(例如从宫颈拭子获得的样品)或宫颈细胞样品、腺样细胞、***上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳、淋巴、痰、尿和***、其它病毒、细菌、分枝杆菌或原质团(plasmodia),例如巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、H1N1、淋病奈瑟氏菌(GC)、沙眼衣原体(CT)、***毛滴虫、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、SARS相关的冠状病毒或流感病毒。
在一个方面中,所述靶核酸是HPV核酸。在另一个方面中,所述HPV核酸是HR-HPV类型的HPV DNA。在另一个方面中,所述HPV核酸是LR-HPV类型的HPV RNA。在另一个方面中,所述靶核酸是HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,和82的任一种,或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90,和91的任一种。
在另一个方面中,靶定了多种靶核酸。在一个方面中,所述多种靶核酸由如下组成:具有不同核苷酸序列的2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100种核酸的组。可以使用任何靶定核酸的组。在一个方面中,选择多种靶核酸,使得每一种均与其它靶核酸相关。作为实例而非限制,核酸的组可以是:彼此结构相关(例如基因家族的成员);彼此功能相关(例如编码致炎细胞因子的核酸);彼此种系遗传相关(例如对于病毒家族(如HPV家族病毒)的不同成员特异的核酸);由于在不同细胞或组织类型中的差异表达而相关(例如巨噬细胞相关的核酸和***相关的核酸)或者由于疾病状态而相关(***相关核酸)。在一个方面中,核酸的组是不相关的。
在一个方面中,靶核酸的组包含、由或者基本上由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82,或其任何亚组组成。在另一个方面中,靶核酸的组包含、由或者基本上由LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91,或其任何亚组组成。在另一个方面中,靶核酸的组包含、由或者基本上由HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82,或其任何亚组;和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91,或其任何亚组组成。在另一个方面中,靶核酸与和如下任一者相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性:HPV、HPV的遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA或HR-HPV类型的HPVRNA。在另一个方面中,靶核酸与和如下相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性:HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82的任一种,或者LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一种。
在另一个方面中,HPV的亚组可首先鉴定为感染的候选物,然后可通过本文公开的方法对其进行特定的基因分型。大量的测试是商业上可得到的,用于确定样品中高危核酸的存在,如可从Qiagen Gaithersburg,Inc得到的HPV测试。这些测试通常鉴定一组HPV核酸,所述核酸通过它们与病理状况(如***)的临床关联而相关。然而,它们一般不用于对感染的类型进行特定的基因分型。
在一个方面中,选择了三个核酸的组。作为实例而非限制,HPV 16,HPV 18和HPV 45是与HPV相关***的发生最常相关的三种HPV变体。因此,本方法可包括首先通过细胞学分析鉴定异常的宫颈细胞,确认样品中存在HPV 16,HPV 18和HPV 45之一,然后根据本文所述的方法进行基因分型。
C.样品制备
在如上所述将样品收集于收集介质中之后,可将样品用变性试剂处理以使靶核酸可以进行杂交。在一个方面中,样品用碱性溶液变性。不受限制地,合适的碱包括NaOH和KOH。
蛋白质的碱处理有效地使样本均质化以确保给定样品的分析结果的可再现性。还可以减少样品的粘性而增加动力学,使样品均质化,并通过破坏样品中的任何内源单链RNA核酸、DNA-RNA杂合体或RNA-RNA杂合体而降低背景。还有助于使可存在于样品中的酶如RNA酶和DNA酶失活。本领域的技术人员会意识到,如果RNA是所述靶核酸(与DNA相对),不同的试剂可为优选的,包括但不限于,酚提取和TCA/丙酮沉淀,和硫氰酸胍-酚-氯仿提取。
可采用其它的变性方法,如使用加热步骤,例如将样品加热到约95°C以分离核酸链。也可以使用酶,如解旋酶。
D.检测混合物
在制备出用于杂交的含核酸样品之后,将其分成2个等分试样,使每个等分试样与包含至少一种对于所测试的靶核酸的每个基因型特异的多核苷酸探针的探针组在足以使探针与样品中的至少一种靶核酸杂交的条件下接触。该至少一种多核苷酸探针可为全长的、截短的或合成的DNA,或者全长、截短或合成的RNA。
在一个方面中,对于每个基因型使用多个多核苷酸探针。在一个方面中,提供了对于每个基因型特异的2、3、4、5、6、7、8、9或10种多核苷酸探针。在另一个方面中,选择每种多核苷酸探针,使得仅对于一个基因型是特异的,并且在严格条件下不与任何其它的靶核酸交叉反应。在另外一个方面中,对于每个基因型提供了至少两种多核苷酸探针,其中每种多核苷酸探针与靶核酸的不同区杂交。作为实例,当靶核酸包含HPV核酸时,可对于HPV核酸E6/E7和L1区的每一个选择至少一种多核苷酸。
在一个方面中,在检测之前使用多核苷酸探针纯化靶核酸。在这种情况下,每种多核苷酸探针可仅对于单一的基因型为特异的,或者可设计为在严格条件下与检测混合物中靶定的每种基因型杂交。作为实例而非限制,可针对编码特异基因产物的核酸的高度保守区设计多核苷酸探针,使得所述多核苷酸探针可预期在严格条件下与基本上全部的编码该基因产物的核酸杂交。
在一个方面中,多核苷酸探针能够与如下核酸杂交或结合,所述核酸与和HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA或HR-HPV类型的HPVRNA、或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,和82之一的任一个、或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个相关的核酸具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%同一性。在另一个方面中,探针与HPV、HPV遗传变体、HR-HPV类型的HPV DNA或HR-HPV类型的HPV RNA、或HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68,和82之一的任一个、或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91的任一个互补。
在另一个方面中,提供了多个多核苷酸探针,所述多个探针被选择与检测混合物中靶定的每种基因型杂交并将其纯化。在一个方面中,所述多个多核苷酸探针能够与由如下组成的靶核酸的组的每个核酸杂交:HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82核酸或其任何亚组。在一个方面中,所述多个多核苷酸探针能够与由如下组成的靶核酸的组的每个核酸杂交:LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组。在一个方面中,所述多个多核苷酸探针能够与由如下组成的靶核酸的组的每个核酸杂交:HR-HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82或其任何亚组;和LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91或其任何亚组。
如果使用碱处理使所述靶核酸变性,则一个或多个多核苷酸探针可稀释在探针稀释液中,所述稀释液也可以充当中和杂交缓冲液(以中和碱性变性试剂)。
用于DNA或RNA探针的探针稀释液是不同的,因为DNA和RNA稳定性所需的要求是不同的。例如,如果探针是RNA,优选首先中和样品然后添加探针,或者可选地,同时向样品添加RNA探针和中和剂(探针稀释液),因为过多的碱性会破坏RNA。探针稀释液可用于溶解和稀释探针,并也有助于将样品保持在约中性pH,例如约pH6至约pH9,而提供更有利的杂交环境。可使用足够体积的探针稀释液,优选样品体积的一半,来中和碱处理的样品。
对于全长探针,可向样品添加热碱性溶液,然后可在室温向样品添加探针稀释液,随后可再加热样品。这样的方法能够抑制二级结构的形成。抗体倾向于不可逆地结合于具有二级结构的结构。当使用非全长探针如截短的或合成的探针时,加热溶液或样品可为不需要的,因为不存在二级结构问题。在一个方面中,当使用截短的或合成的探针时,不加热样品。
在用变性试剂处理之后,可以在合适的条件下向样品添加中和缓冲液的等分试样,在一个方面中为前述的探针稀释液,其中溶解了一种或多种探针,以使探针与至少一种靶核酸发生杂交或结合。中和缓冲液可含有单一的缓冲盐。在一个方面中,中和缓冲液不含有多于单一的缓冲盐。杂交条件足以使一种或多种多核苷酸探针与样品中可能存在的相应互补核酸序列退火以形成双链核酸杂合体。
采用适于本文所述的特殊探针和稀释液的杂交条件。例如,可将探针和样品核酸温育一定的杂交时间,优选至少约5-约30分钟,约5-约20分钟,或者约7-约15分钟,或者约10分钟,以及在所述范围内足以使一种或多种多核苷酸探针与相应的互补核酸序列退火的任何数字。杂交条件可包括如下的杂交温度:至少约65°C,约68.5°C,和约67°C-约70°C,以及所述范围内的任何数字。对于给定的至少一种靶核酸和给定探针,本领域的普通技术人员能够通过常规实验容易地确定理想的杂交条件。本领域的普通技术人员会进一步意识到,杂交时间和温度必须相对彼此进行优化。因此,更高的杂交温度可进行更短的时间,反之亦然。并非限制,可通过提高温度、将离子条件增加至0.5M以上(例如NaCl)或降低PAA的浓度而控制严格杂交条件。作为实例而非限制,严格杂交条件可包括在高温进行杂交反应,如至少约65°C,至少约68.5°C,约67°C-约70°C,和约69°C-约70°C。严格杂交条件还可包括高温,如至少约65°C,至少约68.5°C和约67°C-约70°C。核酸杂交的广泛指导可见于:Tijssen,LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic AcidProbes,第I部分第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays”,Elsevier,New York(1993);和Current Protocols inMolecular Biology,第2章,Ausubel等编,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York (1995),通过提述以其整体并入。
就本目的而言,“严格条件”涵盖如下条件,即只有杂交分子和靶序列之间有25%或更少的错配时才会发生杂交。未来更精确的定义,“严格条件”可分解为严格性的特定水平。因此,如本文所使用的,“温和严格性”条件是具有超过25%序列错配的分子不杂交的条件;“中等严格性”条件是具有超过15%错配的分子不杂交的条件;而“高严格性”条件是具有超过10%错配的序列不杂交的条件。“非常高严格性”条件是具有超过6%错配的序列不杂交的条件。关于获得特定严格性程度所需的杂交条件的计算也由Sambrook等(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,第9和11章讨论,通过提述以其整体并入本文。
在一个方面中,杂交步骤在50°C在约15-25分钟内;在50°C在约20-25分钟内;或者在50°C在约22.5分钟内完成。
在一个方面中,通过将样品悬浮在收集介质中,用变性剂使靶核酸变性,并将靶核酸与悬浮在中和缓冲液中的核酸探针杂交而形成每种检测混合物。在另一个方面中,中和缓冲液是包含2.2M BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸),2.6%聚丙烯酸,0.7N NaOH和0.05%叠氮化钠的探针稀释液。
E.检测
在使探针与至少一种靶核酸杂交并形成双链核酸杂合体之后,对杂合体进行检测。
在一个方面中,杂合体在检测之前首先固定于固相。将杂合体固定于固相之后,通过洗掉未捕获的核酸可将捕获的杂合体与样品的其余部分分离。然后对核酸杂合体进行检测。
在一个方面中,探针或者固定于固相(如通过共价键)或者适于固定于固相(如藉由抗生蛋白链菌素-生物素相互作用)。在这种情况下,核酸探针与靶核酸的杂交会导致靶核酸固定于固相。
在另一个方面中,核酸不固定或者不适于固定于固相。在这种情况下,杂合体可通过使其与抗杂合体抗体接触而固定于固相。在另一个方面中,抗杂合体抗体在捕获该双链核酸杂合体之前固定在支持物上。将抗体固定于固体支持物的方法是本领域公知的。作为实例而非限制,抗体可共价连接于固体支持物。作为另一个实例,抗体可吸附在固相上,例如藉由蛋白-蛋白相互作用、蛋白-G珠、生物素-抗生蛋白链菌素相互作用、EDAC与羧基或甲苯磺酰基等连接,或者使用例如亲和柱中的序列特异性核酸直接杂交到固体支持物上。在另一个方面中,抗杂合体抗体可在固定到固体支持物上之前与双链核酸杂合体复合。作为实例而非限制,抗杂合体抗体可与生物素标签缀合,而支持物可与抗生蛋白链菌素基团缀合。然后在没有固体支持物的情况下可得到抗杂合体抗体/双链核酸杂合体复合物。在向反应混合物添加固体支持物时,抗杂合体抗体/双链核酸杂合体复合物通过生物素缀合物和抗生蛋白链菌素基团之间的相互作用固定于固体支持物。
一旦固定,即可进行检测。
在一个方面中,杂合体可通过将可检测标记的第二核酸探针与靶核酸杂交加以检测。在另一个方面中,通过使杂合体与特异结合双链核酸杂合体的分子接触而检测杂合体。对于双链核酸杂合体特异的分子包括,但不限于,单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质如但不限于RNAse H、核酸包括但不限于适体或序列特异性核酸。适体是随机序列的短的伸展,其通过与靶物杂交、扩增该杂交的适体和重复该选择过程而从连续地选自序列的文库。与双链核酸杂合体特异性结合的分子可被可检测地标记。
在一个方面中,在杂交时,探针与靶核酸形成DNA:RNA杂合体。在这种情况下,可通过使用对于双链DNA:RNA杂合体特异的抗体对固定的杂合体进行检测。抗体可直接或间接地被可检测标记,并可为单克隆或多克隆抗体。在一个方面中,第二抗体是单克隆的。在另一个方面中,抗体用可检测标志直接标记且是单克隆的。在一个方面中,抗体具有标签,其必须与底物反应以提供可检测的信号。所述抗体可溶解在合适的缓冲液中。在一个方面中,所述缓冲液包含100mM TrisHCl,pH 7.4,0.5M NaCl,0.1mM ZnCl2,1.0mM MgCl2,0.25%Tween 20,0.2mg/ml RNase A,4%羟丙基-b-环糊精(环糊精),如先前讨论的30%珠稀释缓冲液,0.05%羊IgG,0.05%叠氮化钠。
在一个方面中,在杂交时,探针与靶核酸形成DNA:RNA杂合体,使用对于双链DNA:RNA杂合体特异的抗体将杂合体固定于固相,并用对于双链DNA:RNA杂合体特异的第二抗体对其进行检测。
固体支持物包括但不限于珠;磁珠,包括顺磁的、反磁的、强磁的/铁磁的、强磁的/铁磁的和反磁的珠、柱子、板、滤纸、聚二甲基硅氧烷(PDMS);浸渍片(dipstick);涂覆的管、板和盘;和树脂柱。可以使用任何支持物,只要它允许液相的提取并提供分离出结合的与未结合的抗体的能力。顺磁珠是特别有用的,因为在施加磁场固定珠时,它们能够被留在溶液中并且液相可以被提取或倾析。小而且具有高表面积的珠是优选的,如直径约1μm的珠。也可以使用其它利用电荷转换或二氧化硅捕获(与磁场相对)的珠。
在一个方面中,将杂合体与附接于支持物的抗杂合体抗体温育足够长的时间,以允许固定的抗杂合体抗体捕获双链核酸杂合体。在一个方面中,支持物是珠。抗杂合体抗体可为单克隆的或多克隆的。在一个方面中,抗体是单克隆的。在一个方面中,抗体通过1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)接头与支持物偶联。在一个方面中,支持物是聚苯乙烯珠。在一个方面中,与抗体偶联的支持物或珠稀释在珠稀释缓冲液中。该珠稀释缓冲液有助于使珠上蛋白质的变性最小化。珠稀释缓冲液的一个实例包含6%酪蛋白,100mM Tris-HCl,300mM NaCl,和0.05%叠氮化钠。
在一个方面中,将用抗杂合体抗体涂覆的珠与样品在约67°C-约70°C温育约30分钟。在另一个方面中,珠和样品在约68°C-约69°C温育约30分钟。在另外一个方面中,珠和样品在约68.5°C温育30分钟。温育时间的范围可为约5分钟-约60分钟,约15分钟-约45分钟,约20分钟-约40分钟,或者所述范围内的任何数字,并且一般地与温度成反比。本领域的技术人员应当会理解,可以改变温育时间、温度和/或振荡条件以实现期望的可选择的捕获动力学。
本领域的技术人员会理解,可使用任何可检测标签,如但不限于,酶、放射性分子、荧光分子、或金属颗粒如金颗粒。在某些方面中,可检测标签可为碱性磷酸酶。将标签与抗体缀合的方法是已知的。例如,可用二硫苏糖醇(DTT)将抗体还原以产生单价抗体片段。然后可将还原的抗体通过Ishikawa等J.Immunoassay 4:209-237(1983)和Means等,Chem.1:2-12(1990)的方法直接缀合于马来酸化的碱性磷酸酶,所述文献每篇的内容通过提述以其整体并入本文,并可通过HPLC纯化最终的缀合物。所述缀合物可使用任何类型的大小排阻层析纯化。纯化的一个益处是一个蛋白与一个抗体的缀合物可与具有其他蛋白-抗体比例的缀合物分离。
在另一个方面中,双链核酸杂合体可用非直接标记的第二抗杂合体抗体检测。例如,第二抗体可为小鼠免疫球蛋白,其可通过标记的羊抗小鼠抗体加以检测。
存在于被标记固体支持物上的标签可用于鉴定靶核酸的特定基因型。探针或检测抗体上的标签可传达有关纯化的每种靶核酸的量的信息,而且除此之外,可传达关于靶核酸的基因型的额外信息。
用于检测各种标签的方法是本领域已知的。例如,Coutlee等,J.Clin.Microbiol.27:1002-1007(1989)描述了比色法、放射性、表面等离子体共振或化学发光法,该文件内容通过提述以其整体并入本文。例如,使用试剂如LUMI-PHOS 530试剂(Lumigen,Detroit,MI)或DR2(Applied Biosystems,Foster City,CA),使用检测器如E/LUMINA发光计(Source Scientific Systems,Inc.,Garden Grove,CA),OPTOCOMPI发光计(MGM Instruments,Hamden,CT)等,如Turner Biosystems的Veritas微孔板发光计通过化学发光检测结合的碱性磷酸酶缀合物。也可以顺序或平行使用多种检测技术。例如,可通过化学发光和荧光检测缀合物。在另一个方面中,可通过化学发光检测偶联物。
使用不同的缀合物检测技术的检测器可为例如以模块的方式可逆或不可逆附接于能够执行用于确定样品中是否存在至少一种靶核酸的方法的仪器。
本文所用的所有探针可为短的合成RNA探针,其仅特异性结合至少一种靶核酸。实例在美国专利申请公开No.US 2009-0298187A1中描述,该文件内容通过提述以其整体并入本文。
本公开还提供了测定组合物、探针和条件,其中与标准的FDA批准的HPV测定和探针组相比,HR-HPV探针组与LR-HPV类型之间的交叉反应性被显著减少。在一个方面中,HPV高危探针组选自下组:HPV高危类型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82,或LR-HPV类型2,3,6,7,10,11,13,27,28,30,32,40,42,43,53,54,55,61,62,67,69,70,71,72,74,81,83,84,85,86,87,89,90和91。使用本测定及这些HR-HPV探针,LR-HPV类型与HR-HPV探针之间的交叉反应性减少。参见,例如,美国专利申请公开No.US 2009-0298187A1。
本公开还提供了用于检测癌症例如***的方法和测定,其是通过检测样品中至少一种靶核酸,如HPV,的存在来进行的。
本领域的技术人员会理解,本发明可以在大量平台上进行,包括但不限于,管、浸渍片、微阵列、微孔板、384孔板、其它微滴定板和微流体***。本领域的技术人员会理解,与发展中国家相关地,本发明对于涉及移动液体的步骤可利用低技术方法,如滴瓶、橡皮球、Pasteur吸管或喷射瓶(squirtbottle)。这些设备可在测定所需的大致范围内传递相对精确的体积。在一个方面中,本公开的方法不包括自动移液器或其它电池供电或能量供电的移液设备。
实施例
I.SP样品
反射基因分型PS测试(reflex genotyping PS test)是用于对已经定量确定为HR-HPV阳性的样品进行基因分型的非靶物扩增平台。用于PS测试的样品输入体积与用于STM、PC和SurePath介质的HC2筛选测试所需的样品输入体积相同。LBC介质的样品制备也和进行HC2测试所需的制备相同。为了证明SurePath介质与基因分型PS测试的相容性,使用了SurePath宫颈样本。此外,为了证明STM和SurePath溶液样本之间的等同性,对每种介质中HPV靶物的回收进行了检查和比较。
用SurePath临床样品证明,PS测试不仅与STM和PC相容,而且与SurePath介质相容。PS测试在SurePath临床样本中在每个测定5000或更高拷贝下可检测到HPV16、18和/或45感染,结果得到了qPCR的确认。此外,结果证明,HPV DNA的回收对于STM和SurePath介质是等同的。每种样本类型均根据其各自的加工/变性程序进行了处理,并用PS测试进行了测试。
以定量PCR(qPCR)用作参考或确认方法,对HPV基因分型探针组测试(PS)与SurePath样本的相容性进行了评价。
使用HC2测试产生了宫颈样本中样品是否含有高危人***瘤病毒(HR-HPV)的定量信号。HC2测试在700μL的SurePath样本上进行。在本研究中鉴定和使用了50个HC2阳性和10个HC2阴性样本。
从每个样品,将粗SurePath的250μL等分试样转移到微离心管中用于DNA分离。将细胞通过离心沉淀,并重悬于200μL的100mM Tris pH 8.0中。向每个样品添加含有80:20比例的缓冲液ATL和蛋白酶K的缓冲溶液。样品以600rpm振荡在60°C温育2小时。用蛋白酶K消化后,使用 Virus Spin试剂盒根据制造商的规程对样品进行处理。在三个分离的PCR反应中,进行qPCR分析作为参考,以确定HPV 16,18和/或45的存在和病毒载量(viral load)。
在HC2测试和用于qPCR的样品制备之后,剩余的SurePath体积(~1850μL)通过离心加以沉淀。弃去上清,将细胞重悬于150μL的STM和75μL的变性试剂中。随后,向三个分离的孔转移75μL以单独地鉴定基因型。将样品变性并将DNA:RNA杂合体捕获到HC2捕获板上,并藉由与碱性磷酸酶缀合的专用杂合体特异性抗体进行检测。最后,添加化学发光底物,用发光计阅读这些孔以测量相对光单位(RLU)。如果RLU值/截止值(RLU/CO)大于或等于1.3,则将样品分类为对基因型阳性。结果示于表1中:
RLU/CO | PS测试结果 | qPCR测试结果 | 不一致 |
0.8-0.9 | 5 | 0 | 0 |
1.0-1.2 | 2 | 0 | 0 |
1.3-1.9 | 4 | 0 | (4) |
2.0-4.9 | 3 | 2 | (1) |
>5.0 | 13 | 12 | (1) |
表1
总共有16个测试样本以PS测试测试为阳性样本,总共有20个阳性结果,包括4个多重感染。在所有测试的样品中,根据PS测试,60个样本中有56个(93.3%)的结果与qPCR一致(4个不一致),而有174/180(96.7%)的基因型结果与qPCR一致(6个不一致)。所有的不一致结果均为PS阳性和qPCR阴性。
II.PreservCyt样品
PS测试的意欲用途是分别检测多重HPV基因型,这需要每个患者样本的多个等分试样。在HC2测试之后,一些PC样本可缺乏足够的体积用于期望的测试数目。采用探针鸡尾酒(cocktailing)可限制所需测试的数目,并提供显著减少样本输入体积的可选择的解决方案。
在本研究中使用了28个HC2阳性的PC样本。根据对于介质的标准HC2转换规程,对12ml PC样本进行了处理。对来自每种变性样本的6个等分试样同时进行了PS测试。使用三种单独探针的混合物,其中每种探针混合物仅含有一种类型特异性探针,三次测试分别检测了HPV 16、18和45。对每个样本进行了三次额外的测试以一起检测两种或更多种基因型。为了在单次测试中检测超过一种靶物,将两种或三种单独的探针组合入单一的混合物。使用多探针鸡尾酒在一次测试中一起检测HPV 16和18,一起检测HPV18和45,以及全部三种类型。通过使用探针鸡尾酒检测浓度为2pg/ml的HPV质粒对分析性能进行评价。结果表示为相对光单位比截止值(RLU/CO)。实验根据表2中所列的方案进行。
*方法可应用于对于HPV16和18一起,HPV45单独的测试
表2
使用PS测试对28个HC2阳性PC样本测试HPV16、18和45。测试每个样本,其中使用单独的探针进行类型特异性检测并使用探针鸡尾酒一起检测两种或更多种HPV基因型。结果对所有样本均一致。在28个HC2阳性样品中,有18个对HPV16、18和45为阴性。表2中提供的数据详细显示了HPV16、18和45阳性样本结果。阳性结果具有大于或等于1.3的RLU/CO值。图3中提供的数据证明,各个HPV类型的多探针检测与单一探针检测相比等同的灵敏度。
表3
Claims (14)
1.提供了一种用于对样品中的靶核酸进行基因分型的方法,其包括:
(a)通过如下方法产生第一检测混合物,所述方法包括将所述样品的一部分与第一探针组接触,其中所述第一探针组包含对于靶核酸的第一基因型特异的核酸探针和对于靶核酸的第二基因型特异的核酸探针,但是不包含对于靶核酸的第三基因型特异的核酸探针;
(b)通过如下方法产生第二检测混合物,所述方法包括将所述样品的一部分与第二探针组接触,其中所述第二探针组包含对于靶核酸的第二基因型特异的核酸探针和对于靶核酸的第三基因型特异的核酸探针,但是不包含对于靶核酸的第一基因型特异的核酸探针;和
(c)在如下条件下处理第一和第二检测混合物,其中所述核酸探针与靶核酸的第一、第二和/或第三基因型特异性地杂交;和
(d)检测所述核酸探针与靶核酸的杂交,其中:
(i)在第一检测混合物中杂交但在第二检测混合物中不杂交,指示所述样品包含靶核酸的第一基因型;
(ii)在第二检测混合物中杂交但在第一检测混合物中不杂交,指示所述样品包含靶核酸的第三基因型;和
(iii)在第一检测混合物和第二检测混合物中均杂交,指示所述样品包含靶核酸的第二基因型。
2.权利要求1的方法,其中所述靶核酸是HPV核酸,并且所述靶核酸的第一、第二和第三基因型选自下组:HPV2,HPV3,HPV6,HPV10,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV27,HPV28,HPV29,HPV30,HPV31,HPV32,HPV33,HPV34,HPV35,HPV39,HPV42,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV54,HPV56,HPV57,HPV58,HPV59,HPV64,HPV66,HPV67,HPV68,HPV69,HPV70,HPV73,HPV82,HPV84,HPV85,HPV86,HPV87和HPV94。
3.权利要求2的方法,其中所述靶核酸的第一、第二和第三基因型是HPV16,HPV18和HPV45。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中样品是保存在液基细胞学介质中的临床样品。
5.权利要求4的方法,其中所述液基细胞学介质选自下组:Preservcyt和SurePath。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述核酸探针的杂交形成DNA:RNA杂合体。
7.权利要求6的方法,其中DNA:RNA杂合体通过如下方法进行检测,所述方法包括将所述DNA:RNA杂合体与DNA:RNA特异性抗体接触。
8.权利要求1-7中任一项的方法,其中通过如下方法将所述靶核酸首先鉴定为是所述靶核酸的第一、第二或第三基因型,所述方法包括用能够扩增所述靶核酸的第一、第二和第三基因型中每一种的至少一部分的共有引物扩增所述靶核酸。
9.权利要求8的方法,其中所述靶核酸通过包括定量PCR的方法进行扩增。
10.权利要求1-9中任一项的方法,其中通过如下方法将所述靶核酸首先鉴定为是所述靶核酸的第一、第二或第三基因型,所述方法包括将共有探针与所述靶核酸杂交,其中该共有探针对于所述靶核酸的第一、第二和第三基因型的每一种是特异的。
11.权利要求10的方法,其中所述共有探针与第一、第二和/或第三HPV核酸的杂交产生DNA:RNA杂合体。
12.权利要求11的方法,其中DNA:RNA杂合体通过如下方法进行检测,所述方法包括将所述DNA:RNA杂合体与DNA:RNA特异性抗体接触。
13.权利要求6的方法,其中DNA:RNA杂合体通过如下方法进行检测,所述方法包括将所述DNA:RNA杂合体与DNA:RNA特异性抗体接触。
14.权利要求1的方法,包括:(1)对样品进行定量PCR反应以获得存在HR-HPV基因型的初始指示;(2)进行杂合体捕获测定法以确认对存在HR-HPV的确定;和(3)进行PS测试以对确定存在于所述样品中的HR-HPV进行基因分型。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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