JPH11506605A

JPH11506605A - 増幅反応におけるバックグラウンドを減少させるためにプローブをマスキングする方法

Info

Publication number: JPH11506605A
Application number: JP9500861A
Authority: JP
Inventors: キヤリノ，ジヨン・ジエイ; ブレイナード，トーマス・デイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 1999-06-15
Also published as: CA2223050A1; US5814492A; WO1996040992A2; WO1996040992A3; EP0832280A2

Abstract

(57)【要約】典型的にはリガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応の生成物である増幅生成物の標的非依存生成によって生じるバックグラウンドを減少させる方法であって、増幅プローブ又はプライマーを化学的に「マスキング」又はブロッキングして、前記プローブ又はプライマーが、増幅反応の開始まで遅延し得るトリッガー事象が生起するまで伸長又は連結できないようにする操作を含む。プローブのマスクは、それ自体は鋳型として機能することができない相補的ブロッキングオリゴヌクレオチドの形態を有し、プローブ／プライマーのランダムテーリングを阻止する。ブロッキングオリゴマスクは増幅時にプローブから変性され、好ましくは増幅反応でプローブに関する競合から効果的に排除される。

Description

【発明の詳細な説明】増幅反応におけるバックグラウンドを減少させるためにプローブをマスキングする方法本発明は、典型的にはリガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応の生成物である増幅生成物の標的非依存生成によって生じる望ましくないバックグラウンドシグナルを減少させる方法に関する。より特定的には本発明は、増幅プローブ又はプライマーを、増幅反応の開始まで遅延し得るトリッガー事象（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇｅｖｅｎｔ）が生起するまで、伸長又は連結できないように「マスキング」又はブロッキングする方法に関する。プローブのマスクは、増幅開始時に除去されるブロッキング機能を果たす相補的オリゴヌクレオチドの形態を有する。発明の背景生物学的試料中の標的核酸を検出するための増幅技術は、感染性微生物及び遺伝子欠陥の検出の高感度及び高特異性を提供する。特定の核酸配列のコピーは、増幅プロセスを通して幾何級数的に合成される。この種の技術の具体例としては、米国特許明細書第４６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、欧州特許出願公開明細書第３２０−３０８号（Ｂａｃｋｍａｎら）に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、並びに国際特許出願公開明細書第９０／０１０６９号（Ｓｅｇｅｖ）、欧州特許出願公開明細書第４３９−１８２号（Ｂａｃｋｍａｎら）及び国際特許出願公開明細書第９３／００４４７号（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら）に記載のギャップ充填ＬＣＲ（ＧＬＣＲ）又はその変形が挙げられる。その他の増幅技術として、Ｌｉｚａｒｄｉら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７（１９８８）に記載のようなＱβレプリカーゼ、欧州特許出願公開明細書第４９７２７２号（Ｗａｌｋｅｒ）、欧州特許出願公開明細書第５００２４４号（Ｗａｌｋｅｒら）及びＷａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９：３９２（１９９２）に記載のような鎖置換増幅（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ））、Ｆａｈｙら，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１：２５（１９９１）に記載のような自己継続配列複製（Ｓｅｌｆ−ＳｕｓｔａｉｎｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ））、並びにＫｉｅｖｉｔｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：２７３−２８６（１９９１）に記載のような核酸配列依存増幅（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｕｅｎｃｅ−ＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ））も存在する。これらの増幅方法の最大の利点の一つは、所望の核酸配列の百万倍コピーが幾何級数的反復プロセスによって形成されることにある。このような幾何級数的反応は、増幅生成物の鋳型非依存生成によって生じる望ましくないバックグラウンドの発生の可能性を増大させる。高いバックグラウンドシグナルは、いずれの増幅アッセイの検出感度も制限する。現在のところ、鋳型非依存生成物は室温での試薬のインキュベーョンに起因し得ると考えられる。増幅生成物の標的非依存生成によって発生する非特異的シグナルに対処する方法は幾つか開発されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、増幅生成物を同定するために内部ハイブリデーションプローブがしばしば使用される。また、「ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）」ＰＣＲとして知られている方法も、バックグラウンドを減少させ特異性を改善するために使用されてきた。ホットスタートＰＣＲでは、温度が少なくともアニーリング温度に到達するまで反応を阻止する。これは、試薬の一つ（例えばポリメラーゼ）の添加を遅らせるか、又は最初に試薬を隔離することによって達成し得る。ある隔離方法は、Ｃｈｏｕら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１７１７−１７２３（１９９２）で教示されているように、酵素をその他の試薬から分離するパラフィン又は他の溶融性隔膜を使用することからなる。標的を解離させるまで加熱すると、隔膜が溶融して総ての試薬が混ざり合うが、これは比較的高い温度に到達するまで生起しない。米国特許明細書第５，３３８，６７１号（Ｃｈｒｉｓｔｙら）に記載の別の方法では、熱不安定性抗体が熱安定性ポリメラーゼ酵素に結合して、低温で酵素の活性をブロックする。反応体が加熱されると、抗体は永久に失活し、ポリメラーゼが活性になる。米国特許第５，４３８，８５３号（Ｗａｎｇら，１９９４年９月２０日交付）に記載の最近開発された方法では、エネルギーシンク（ｅｎｅｒｇｙｓｉｎｋ）オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲプライマーが不注意に非標的鋳型とハイブリダイズし伸長するのを防止する。エネルギーシンクオリゴは、その伸長を防止するために修飾３’末端を有し、好ましくは５’ 末端が該オリゴがハイブリダイズするプライマーに対して引っ込んでいる。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）では、増幅生成物の鋳型非依存生成は、相補的プローブ対の平滑末端結合に大きく起因していた（Ｂａｃｋｍａｎら，欧州特許出願公開明細書第０４３９１８２号）。ギャップＬＣＲ及び他のＬＣＲ変形方法は、このような平滑末端を回避するために開発された。しかしながら本出願人は、５’末端が（相補的ＬＣＲ増幅プローブに対して）引っ込んでギャップ付きＬＣＲプローブを使用した場合でも、極端な条件下では増幅生成物の鋳型非依存生成がある程度観察されることを発見した。これは、ポリメラーゼが相補的プローブと合体した時に、非効率的ではあるが、上流ＬＣＲプローブのランダムテーリングを生起させることができ、それによって、バックグラウンドの発生に関与し得る付着末端付きＬＣＲプローブを潜在的に形成するためであると考えられる。従って本発明は、ギャップＬＣＲでも発生する少量の鋳型非依存バックグラウンドを更に減少させることを重要な目的とする。これに付随して、望ましくないバックグラウンドを減少させることによりアッセイ感度を高めることも目的とする。本発明ではこれらの目的及び別の目的を下記のように達成する。発明の概要第一に、本発明は、個々のヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドセグメントの鋳型指向付加（ｔｅｍｐｌａｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄａｄｄｉｔｉｏｎ）により、一つ以上の増幅プローブを反復して伸長させる操作を含む核酸増幅方法であって、ａ）増幅反応開始前に、少なくとも一つのマスキングした形態の増幅プローブを用意し、但しマスクは本質的に、マスキングしたプローブヘテロ二本鎖を形成すべく前記増幅プローブとハイブリダイズしたブロッキングオリゴからなり、前記ブロッキングオリゴ：増幅プローブヘテロ二本鎖は、標的鎖：増幅プローブヘテロ二本鎖のＫ₅₀であるＫ₅₀ｐｔより小さいＫ₅₀ｂｐを有し、前記ブロッキングオリゴは増幅プローブの伸長を阻止し、ｂ）ブロッキングオリゴを増幅プローブから変性させて増幅プローブを脱マスキングし、ｃ）脱マスキングした増幅プローブを用いて増幅反応を実施することを改良点とする核酸増幅方法を提供する。好ましくは、本発明は、反応混合物からブロッキングオリゴを物理的に除去することなく、ブロッキングオリゴによる増幅反応の妨害を阻止する別のステップも提供する。このステップは、Ｔｍを３〜１５℃低下させるように増幅プローブについて欠失又はミスマッチを少なくとも一つ有するブロッキングオリゴを使用することによって実施し得、又はブロッキングオリゴを相補的ブロッキングオリゴにハイブリダイズさせて、両方のブロッキングオリゴを反応から効果的に退去させる安定なブロッキングオリゴホモ二本鎖を形成することにより実施し得る。ブロッキングオリゴ：ブロッキングオリゴ二本鎖は、互いに相補的であるが標的に対して相補的ではないブロッキングオリゴ上にテール（例えば５〜３０）好ましくは５〜２０ヌクレオチドの長さ）を使用してブロッキングオリゴホモ二本鎖のＴｍを上昇させることにより安定させ得、又はブロッキングオリゴを互いに共有結合させることによって安定させ得る。本発明は更に、前記方法の実施に有用な組成物も提供する。該組成物は、少なくとも二つの増幅プローブと、少なくとも一つのマスキングしたプローブ二本鎖を形成すべく前記増幅プローブとハイブリダイズさせた少なくとも一つ、必要により二つのブロッキングオリゴとを含み、貯蔵条件下では前記増幅プローブのランダム伸長が阻止され、増幅反応条件下ではポリメラーゼ及びヌクレオチドの存在下に前記ブロッキングオリゴが増幅プローブの伸長を阻止する。好ましい組成物は、好ましい方法の実施について上述した特徴を有する。また、本発明の方法を実施するためのキットは、前記組成物と必要な試薬、例えばポリメラーゼ及び／又はリガーゼとを含み得る。図面の簡単な説明第１図は、ギャップＬＣＲで伸長可能な上流プローブ（Ａ及びＢ’）上に二つの５’ヘアピンブロッキングオリゴ（Ａ^*及びＢ’^*）を使用する本発明の実施態様の一つを簡単に示している。妨害抑制（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｃｏｎｔｒｏｌ）は、プローブ内にバブルで示した欠失によって与えられる。この欠失は、プローブ：オリゴヘテロ二本鎖をプローブ：プローブ又はプローブ：標的ホモ二本鎖より不安定にする。これらの用語の意味は本明細書に記載の通りである。第２図は、ギャップＬＣＲで伸長可能な上流プローブ（Ａ及びＢ’）上に二つの５’停止塩基（ｓｔｏｐｂａｓｅ）ブロッキングオリゴ（Ａ^*及びＢ’^*）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。妨害抑制は第１図の実施態様と同様に「バブル」欠失によって与えられる。第３図は、ギャップＬＣＲで使用する四つの各のプローブ上にある四つのブロッキングオリゴ（米印「＊」で示す）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。妨害抑制は第１図の実施態様と同様に、プローブ：オリゴヘテロ二本鎖がプローブ：プローブ又はプローブ：標的ホモ二本鎖より不安定になるように「バブル」で示す欠失によって与えられる。加えて、バブル欠失が整列させられると、相補的ブロッキングオリゴは、オリゴ：プローブヘテロ二本鎖より安定なオリゴ：オリゴホモ二本鎖を形成することができる。第４図は、ギャップＬＣＲで使用する四つの各のプローブ上にある四つのブロッキングオリゴ（米印＊で示す）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。この場合は、妨害抑制は「バブル」欠失（第１図と同様）及びブロッキングオリゴの「テール」部分によって与えられる。これらのテールは、オリゴ：オリゴホモ二本鎖をプローブ：オリゴヘテロ二本鎖より安定にする。また、プローブ：オリゴヘテロ二本鎖がプローブ：プローブ又はプローブ：標的ホモ二本鎖より不安定なことも事実である。第５図は、四つのＬＣＲプローブのセットのギャップを埋める二つのブロッキングオリゴ（ＡＢ^*及びＡ’Ｂ’^*）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。ブロッキングオリゴには、上流プローブの伸長を防止するために停止塩基が含まれている。この実施態様では、妨害抑制は、プローブ及びオリゴの長さを、プローブ：オリゴヘテロ二本鎖がプローブ：プローブ又はプローブ：標的ホモ二本鎖より不安定になるように注意深く選択することによって与えられる。例えば、ブロッキングオリゴは、オリゴとプローブがそれぞれの長さの約半分だけハイブリダイズし合うという理由で、オリゴ：プローブヘテロ二本鎖より安定なオリゴ：オリゴホモ二本鎖を形成することができる。第６図は、ギャップＬＣＲで使用する四つの各のプローブの上にある四つのブロッキングオリゴ（米印＊で示す）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。この場合には、妨害抑制は「バブル」欠失と各ブロッキングオリゴの化学基とによって与えられる。これらの化学基は活性化されると、それそれの増幅プローブから分離され互いにハイブリダイズできる状態になったブロッキングオリゴを相互に共有結合させる。この実施態様の変形例では、ヘアピンブロッキングオリゴをヒンジ部で架橋してヘアピンの「脱湾曲」（ｕｎｂｅｎｄｉｎｇ）を防止し得る。第７図は、上流ＬＣＲプローブにハイブリダイズする二つの５’停止塩基ブロッキングオリゴ（Ａ^*及びＢ’^*）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。この実施態様は第２図のものと類似しているが、欠失「バブル」は存在しても又は存在しなくてもよい。この実施態様では、妨害抑制は、増幅開始後にブロッキングオリゴを分解することによって与えられる。第８図は、一対のＰＣＲプライマーにハイブリダイズする二つの５’ヘアピンブロッキングオリゴ（Ａ^*及びＢ’^*）を使用する本発明の別の実施態様を簡単に示している。この実施態様は第１図のものに類似しているが、通常はヘアピンのみをブロックすべくＰＣＲ伸長部に停止塩基が存在し得ない。湾曲をロックし、脱折り曲げと、ブロッキングオリゴを鋳型として使用する不注意な伸長とを防止するために、ヘアピンのヒンジ部の架橋が望まれ得る。妨害抑制は、プローブ内にバブルで示す欠失によって与えられる。この欠失は、プローブ：オリゴヘテロ二本鎖をプローブ：標的ホモ二本鎖より不安定にする。第９図は、実施例１の表１−Ａに示すデータをグラフで表したものである。第１０図は、実施例８で詳述するオートラジオグラフをプリントしたものである。レーンには上部で横方向に１から１８まで番号付けし、側方にレーン１、１１及び１８の選択したサイズマーカーを記した。他の詳細は実施例に記載する。第１１図は、実施例９で詳述するオートラジオグラフをプリントしたものである。レーンには下部で横方向に１から１４まで番号付けした。他の情報はレーン番号の下に記す通りである：Ｍはサイズマーカーレーンであり、０及び５はインキュベーション時間であり、「Ｔａｑ」はＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液を使用した反応を意味し、「Ｓｔ」はポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントを含むＳｔｏｆｆｅｌ緩衝液を使用した反応を意味し、「ヘアピン」、「ヘアピン＋ミスマッチ」及び「対照」は実施例で詳述するような一連の反応におけるプローブ組成を表す。発明の詳細な説明：Ａ．用語「バックグラウンドシグナル」又は単に「バックグラウンド」は、標的の不在下で発生するシグナルを意味する。使用する検出システムにかかわりなく、増幅反応におけるバックグラウンドの主因は、検出可能な増幅生成物が標的と無関係に（標的非依存的に）形成されることにある。本出願明細書では、「標的非依存」という用語は「鋳型非依存」という用語と同義である。なぜなら増幅反応は、鋳型に従う伸長及び／又は標的もしくは同等物を鋳型として使用する連結を含むからである。ＰＣＲではバックグラウンドは、プライマーが、反応条件下でハイブリダイゼーション及び伸長を可能にするのに十分な相補性を有する非標的鋳型位置を見つけた時に発生し得る。ＬＣＲでは、バックグラウンドは、プローブが自分を鋳型として使用するか、又は鋳型の不在下で連結する時に発生し得る。本明細書では、「プローブ」、「増幅プローブ」、「標的プローブ」及び「プライマー」という用語は、所期の標的を特異的に増幅し検出するように設計されたポリヌクレオチド配列を意味するために様々に使用されている。「オリゴ」（又は「ブロッキングオリゴ」）という用語は、プローブ及びプライマーを伸長生成物を形成しないようにブロックするポリヌクレオチドを示すために使用する。標的又は標的プローブのいずれかにハイブリダイズしたブロッキングオリゴからなる二本鎖は、本明細書では「ヘテロ二本鎖」と称する。これに対し、標的：プローブ二本鎖、標的：標的二本鎖、プローブ：プローブ二本鎖及びブロッキングオリゴ：ブロッキングオリゴ二本鎖は本明細書では総て「ホモ二本鎖」と称する。「ヘテロ二本鎖」及び「ホモ二本鎖」という用語のこのような使用方法は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をホモ二本鎖と称し、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖をヘテロ二本鎖と称する一般的な使用とやや異なることが理解されよう「ヘテロ二本鎖」及び「ホモ二本鎖」という用語は、ヌクレオチドの２’位置の置換基に関係なく前述の意味を表し、本明細書では便宜上これらの用語を使用している。初期のブロッキングオリゴが除去され増幅が開始された後は必ず、ヘテロ二本鎖の形成よりホモ二本鎖の形成の方が好ましいことが認識されよう。本発明で使用するポリヌクレオチド及び「オリゴ」には、プリン及び／又はピリミジン塩基部分を所定の配列において結合するいかなるポリマー化する構造も含まれる。前記ポリマー化する構造の正確な種類は、該構造が塩基部分を一般的な塩基対形成（例えばＡ／Ｔ及びＧ／Ｃ）に関与させるのに適した間隔及び立体自由（ｓｔｅｒｉｃｆｒｅｅｄｏｍ）をもって天然ＤＮＡ又はＲＮＡと結合させるものでありさえすれば、決定的に重要なことではない。ポリマー化する主鎖構造の具体例としては、糖−リン酸結合（ＤＮＡ又はＲＮＡに生来存在）、無電荷アルキル類似体、例えばホスホン酸メチル及びホスホトリエステル、そのペプチド結合類似体（例えば国際特許出願公開明細書第９３／２５７０６号に記載のもの）、並びにそのモルホリノ類似体（例えば米国特許明細書第５，１４２，０４７号、第５，２３５，０３３号、第５，１６６，３１５号、第５，２１７，８６６号及び第５，１８５，４４４号に記載のもの）が挙げられる。「増幅反応」とは、プローブ又はプライマーの反復伸長によって核酸配列のコピーを多数形成する反応を意味する。「伸長」は、ＰＣＲの場合のように個々のヌクレオチドモノマーの重合によって生起し得、あるいはＬＣＲの場合のように予備形成したオリゴヌクレオチドセグメントの付加によって、又はギャップＬＣＲもしくは修復連鎖反応（ＲｅｐａｉｒＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＲＣＲ））の場合のように前述の操作の組合わせによって生起し得る。本発明にとって本質的なことではないが、理想的には、伸長反応は繰り返し実施し、伸長生成物をサイクルの反復に伴い増幅生成物を幾何級数的に生成するための鋳型として使用する。前述のように、バックグラウンドは、伸長が始まり増幅生成物が標的と無関係に形成された時に発生する。バックグラウンドは既存の技術によって既にある程度減少しているため、時には、増幅反応を極限状態まで「推し進めて」バックグラウンドを観察可能レベルで発生させることが必要である。これは単に、標的の検出に通常必要な回数より多くのサイクルを実施し得ることを意味する。極限状態まで「推し進める」操作は、特に高濃度の酵素及び／又はプローブの使用、あるいは増幅に必要な総ての試薬の低温予備インキュベーションを含み得る。ポリヌクレオチド二本鎖の安定性は、幾つかの因子、例えばポリヌクレオチドの長さ、Ｇ：Ｃ含量、電荷、イオン状態及び温度に作用されることが知られている。いずれの場合も、特定因子が増加方向で変化するにつれて、ハイブリダイゼーション度が（当該因子に応じて）増加又は減少し、全体的にＳ字形の曲線を描く。これらの因子総ての合計（ここでは「Ｋ」で表す）が二本鎖の安定性の尺度となる。ポリヌクレオチドが５０％ハイブリダイズし５０％ハイブリダイズしない時のポイントをここではＫ₅₀と称する。これは、よく知られ、直接類似しているＴｍ（温度因子のみが変化）について一般的にいえる。所与のプローブセット（長さ及びＧ／Ｃ含量を決定する）及びイオン状態でＫ₅₀ はＴｍに対応し、従ってＴｍは通常Ｋ５０にとってかわる。ここで挙げるＴｍはいずれも分光光度計で測定したものである。下記の表は、総ての可能なホモ及びヘテロ二本鎖、並びに可能な各対のＫ₅₀又はＴｍの一助となろう。これらの二本鎖の変形及び各々の相対的安定性を、妨害抑制に関連して以下に詳述する。Ｂ・ブロッキング方法本発明の核心はブロッキングオリゴである。上述のように、これらのオリゴは、増幅プローブに対して相補的であるが増幅プローブの伸長を阻止するポリヌクレオチドである。この種の阻止は、伸長が鋳型に従うものか又はランダムテーリング（ｒａｎｄａｏｍｔａｉｌｉｎｇ）であるかには関係ない。現在知られているポリメラーゼはプローブの３’末端から伸長又はテーリングする。そこで本発明の説明は、ＰＣＲプライマー及びＬＣＲセットの「上流」プローブの前述のような伸長又はテーリングを防止するために５’末端にマスキング手段を備えたブロッキングオリゴに基づいて行う。勿論、５’末端から伸長する重合酵素が発見されれば、本発明の概念は逆方向にも働くように反転し得る。ＣｌａｒｋはＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６（２０）：９６７７−９６８６（１９８８）で、相補的平滑末端プローブ二本鎖を２’−デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（「ｄＮＴＰ」）及びポリメラーゼと共にインキュベートすると、鋳型の不在下でもポリメラーゼが３’−ヒドロキシルプローブ末端を伸長することを明らかにした。この研究は実施例８により我々の手で確認されている。「テーリング」の効率は付加するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰが最も簡単に付加される）によってやや異なるが、低効率でも、特にランダムテーリングした末端が二つの「上流」ＬＣＲプローブの間に付着末端の重なり合いを導入する場合には、ある程度のバックグラウンドが発生し得る。本出願人は、例えば１〜約３塩基の３’突出を有する非平滑末端プローブ対を使用した場合でも、前記テーリング反応がある程度生起することを発見した。この低効率ランダム伸長の除去又は減少は、ブロッキングオリゴの目的の一つである。従ってブロッキングオリゴは、増幅プローブの伸長をブロックするように、即ち増幅プローブを「マスキング」するように設計し合成する。ブロッキングオリゴは通常、完全な相補性は必要ではないが、マスキングすべきそれぞれのプローブに対して相補的である。妨害抑制に関連して後述するように、場合によっては完全な相補性を回避すべきである。ブロッキングオリゴは、貯蔵条件下で増幅プローブ：ブロッキングオリゴヘテロ二本鎖が本質的に解離しないように、十分に相補的でありさえすればよい。貯蔵条件は典型的には、室温以下の温度を含み、通常は試薬の冷蔵も含む。前述のような相補性は、試薬プローブをマスキングするのに、即ち増幅反応の開始に先立って、プローブが真の標的配列又は極めて類似した配列を見つけるのを妨害するのに、又はＬＣＲの場合には、標的又は相補的増幅プローブを発見するのを妨害するのに、十分である。ブロッキングオリゴは相補的である以外に、対応する増幅プローブの伸長を阻止するマスキング手段を有する。マスキング手段は、状況に応じ種々のメカニズムを介して実現できる。以下にブロッキングメカニズムの具体例を数例説明する。ある実施態様では、３’伸長可能末端に対して５’突出が存在するが、突出は一つ以上の理由により伸長を誘導する鋳型として使用することはできない。例えば突出は、酵素の忠実さに起因する鋳型誘導伸長を阻止する停止塩基を含み得、ポリメラーゼが基質を認識するか基質に作用して鋳型誘導伸長を達成するのを立体的に阻止する二次構造を示し得、又は伸長を誘導するための鋳型として使用することができない一連の修飾塩基を含み得る。互いに組み合わせて使用し得る前記具体例の各々を以下に説明する。第一の具体例では（第２図、第５図及び第７図参照）、ブロッキングオリゴの５’末端の正規のヌクレオチドが増幅プローブの３’末端を越えて伸びるが、伸長を阻止するために停止塩基（後述）が使用されている。伸長は、鋳型に従う上でのポリメラーゼの忠実さと必要なｄＮＴＰの不在とに起因して、生起し得ない。この具体例の５’伸長は、一つの付加塩基、停止塩基だけでよい。しかしながら、オリゴヌクレオチドの合成では、少量のｎ−１欠損生成物の存在がほぼ不可避であり、所望の生成物からこれを精製除去することが難しい。そこで、より長い伸長、例えば３〜１５塩基の伸長を、増幅プローブの３’末端を越えて最初の一つ以上の位置が停止塩基となるように設計した。別の任意の変形例では、３〜１５塩基の伸長をヘアピン状に折り返すように設計し、従って二次構造マスクを停止塩基マスクと組み合わせて使用する。ヘアピン末端は、脱折りたたみを防止するために、必要により自己架橋し得る。停止塩基とは、潜在的プライマー分子（例えば増幅プローブ又はプライマー）がハイブリダイズし得る鋳型内の塩基又はヌクレオチドを意味する。停止塩基に対する相補的ｄＮＴＰは増幅反応混合物には含まれない。従って、停止塩基が鋳型内又はブロッキングオリゴ内に存在するものとして説明しているが、停止塩基の意味は、特定鋳型と該鋳型に基づいて伸長する必要があるｄＮＴＰ混合物とを念頭において、増幅伸長反応の状況から導き出される。例えば、ギャップＬＣＲ反応混合物が標的鋳型上のプローブ間のギャップを埋めるためにｄＡＴＰ及びｄＣＴＰを含んでいれば、ＡもしくはＣのいずれか又は両方が停止塩基として機能できる。なぜなら、これらは、反応混合物に含まれていないＴ及びＧの付加をそれぞれ指令するからである。伸長にＡ及びＴが必要であれば、Ｃ又はＧが停止塩基として機能できる。公知のポリメラーゼの場合は、停止塩基は、鋳型内では、プローブの３’末端をすぎた最初の位置に存在しなければならない。停止塩基は、ブロッキングオリゴ内では、他の位置にも存在し得る。ここで留意すべきこととして、伸長を防止するための停止塩基メカニズムは、四つのｄＮＴＰ全部より少ないｄＮＴＰが反応混合物中に存在する時に有用である。従って停止塩基法は、典型的な１〜１５塩基の短いギャップを三つ以下の種類のｄＮＴＰで容易に埋めることができるギャップＬＣＲで特に有用である。適当なギャップ構造を有する標的を選択する方法は、先行技術の文献、例えば国際特許出願公開明細書第９３／００４４７号（Ａｂｂｏｔｔ）に教示されている。この方法は、鋳型配列が既知であり、その長さに関係なく、全体が４種類のヌクレオチドのうち３種類（又はそれ以下）のヌクレオチドだけで構成されているＰＣＲで有用である。この構造は、潜在的に稀であるが、本発明には適している。なぜなら、鋳型の完成に使用されない塩基の相補的塩基を反応混合物から省略することにより、前記塩基を停止塩基として使用できるからである。ＬＣＲにおける停止塩基マスキング手段の特定のケースでは、単一のブロッキングオリゴ対か上流及び下流プローブの両方を同時にマスキングできる。この具体例は第５図に示した。ブロッキングオリゴは連結接合部を埋めている。ブロッキングオリゴ自体が鋳型として機能しないようにするためには、これらのオリゴを、上流増幅プローブの３’末端にハイブリダイズする塩基の５’側に停止塩基を含むように設計しなければならない。第二のマスキング方法は、ブロッキングオリゴ内に伸長の二次構造を使用する。これは第１図、第３図、第６図及び第８図に示した。伸長は標的に対して相補的であってはならない。やはり既知のポリメラーゼの方向性では、伸長は、二次構造が増幅プローブの３’末端のスペースを占拠して、鋳型誘導的であれ又はランダムであれ任意の酵素触媒伸長を妨害するように、ブロッキングオリゴの５’末端に形成する。このような二次構造の具体例の一つはヘアピンターンである。この最も単純な二次構造では、末端が自己相補的であり、自己相補的末端を重なり合うように折り返してアニーリングすることができるようにヒンジ部を与えるのに十分な長さを有するように伸長を設計する。ヘアピン末端は、脱折りたたみを防止するために、必要により自己架橋し得る。この構造では通常、最も効果的なマスキングを行うために、５’末端塩基がプローブの３’末端塩基に隣接するのが好ましい。しかしながら、リガーゼを含むＬＣＲ混合物では、ブロッキングオリゴの５’末端がホスホリル化されてはならず、又は該末端と増幅プローブとの間の少なくとも一つの塩基で停止しなければならない。これは、増幅プローブとブロッキングオリゴの折りたたみ部分との不注意な連結を防止するためである。プローブの末端とヘアピンターンとの間にギャップが存在する場合は、伸長可能プローブの末端でブロッキングオリゴ内に停止塩基を含ませなければならない。二次構造を形成する５’伸長の長さは、少なくとも安定なヘアピンを形成する最小長さ（最小で約７又は８ヌクレオチド）である限り、決定的に重要なものではない。ハイブリダイゼーション退去（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）をＬＣＲ妨害抑制として使用する場合は（後述）、ヘアピンが比較的長くてよく、好ましくは相補的増幅プローブのブロッキングオリゴ上の類似のヘアピンに対して相補的であり、従ってヘアピンの長さを使用して、ブロッキングオリゴ：プローブヘテロ二本鎖のＴｍに影響を与えずに、ブロッキングオリゴホモ二本鎖のＴｍを安定化する。退去式妨害抑制で使用するヘアピンは架橋しない方が好ましい。ヘアピン状二次構造を使用するＰＣＲ及びギャップＬＣＲの場合は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性が殆ど又は全くないポリメラーゼを使用するのが好ましいこともあり得るが、実施例９のデータは、ヘアピンを介して置換（disp lacement）及び伸長が発生し得ることを示唆している。あるいは、エキソヌクレアーゼ活性による分解の可能性を軽減するために、ヘアピンの５’末端は後述のような阻止部分を有し得る。実施例９で明らかにするように、ヘアピン二次構造を単独で使用した場合にはブロック能力が制限されるが、ヘアピンと３’ミスマッチとを組み合わせて使用すると優れたブロッキングが得られる。従って、二次構造はミスマッチ及び／又は停止塩基ブロッキング方法と組み合わせて使用し得る。二次構造マスクの具体例の一つは、二次構造中に形成され架橋又はその他の手段でそこに保持されるブロッキングオリゴを使用する。例えば、標準的ヘアピン末端の置換を防止するために、ヘアピンは、ヘアピンの塩基対を架橋して互いに共有結合させヘアピンを閉鎖させておく挿入剤により閉鎖状態にロックすることができる。このような挿入及び架橋剤は当業者によく知られており、例えばプソラレン及び類似の化合物が挙げられる。プローブマスキングの第三の具体例は、伸長酵素、典型的にはポリメラーゼによって基質と認識されない伸長を使用する（第２図参照）。この種の伸長は通常、糖−ホスホジエステル結合以外の手段によって結合した塩基部分のモノマーを一つ以上含む。具体例としては、修飾ヌクレオチド又は核酸類似体、例えばペプチド結合で結合したモノマー（国際特許出願公開明細書第９３／２５７０６号に記載のいわゆる「ＰＮＡ」）、並びに米国特許明細書第５，１４２，０４７号、第５，２３５，０３３号、第５，１６６，３１５号、第５，２１７，８６６号及び第５，１８５，４４４号に記載のようなモルホリノ構造で結合したものが挙げられる。これらの先行技術はいずれも本明細書に参考として包含される。いずれの場合も、この種の類似体の一つ以上を伸長防止のために停止塩基として使用することが多い。これらの類似体モノマーは単独でバックグラウンド伸長を阻止すると考えられるが、複数を使用することが必要であるか又は望ましい場合もある。また、これらの類似体から全長ブロッキングオリゴを形成し得ることも考えられる。第四の具体例（但し正確に５’突出型ではない）では、ブロックされた増幅プローブの３’末端又はその近傍にミスマッチ塩基を有するようにブロッキングオリゴを設計することによって、プローブのマスキングを行う。伸長は通常、プライマーの３’末端が鋳型と対をなす塩基であるプライムド鋳型（ｐｒｉｍｅｄｔｅｍｐｌａｔｅ）を必要とする。３’末端の第一又は第二の塩基が正確な塩基対をなしていないと、プライミングの効率は低下する。最後に挙げるマスキング方法は、ブロッキングオリゴの末端（既知のポリメラーゼの場合は５’末端）又はその近傍に結合したブロッキング分子又は部分を使用する。このようなブロッキング部分は、立体的考慮事項、即ち大きさ、嵩によって増幅プローブをマスキングし、この種の分子の配置が、二本鎖を増幅プローブの末端を伸長するための基質として使用するポリメラーゼの能力を妨害する。従って、このメカニズムは二次構造マスクに類似している。ブロッキング部分の具体例としては、ハプテン及びある種の化学的結合基が挙げられる。当業界では多くのハプテンが知られており、非限定的具体例としては多くの薬物（例えばジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、サリチレート等）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ダンシル、２，４− ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、並びに修飾ヌクレオチド、例えばブロモウラシル、及びＮ−アセタル−７−ヨード−２−フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基の導入によって修飾した塩基、その他多くが挙げられる。本明細書に記載のある種のハプテンは、同時係属共有名義米国特許出願明細書第０８／０４９，８８８号（アダマンタン酢酸）、第０８／０８４，４９５号（カルバゾール及びジベンゾフラン）に開示されている。これらの出願明細書はどちらも１９９１年１２月１７日の優先権である。プローブにハプテンを付加する方法は文献でよく知られている。また、欧州特許出願公開明細書第０３２４６１６号（Ａｍｃｏ）、国際特許出願公開明細書第９／０１０６９号（Ｓｅｇｅｖ）及び国際特許出願公開明細書第９４／２９４８５号（Ｓｅｇｅｖ）に記載のような化学結合基もマスキング基としても使用できる（第６図参照）。これらの化合物は立体ブロッキング基として機能する。この種の化学基を使用する別の理由は、妨害抑制に関連して後述する。以上の説明は、普通に伸長するプローブの３’末端のブロッキングに焦点を合わせたものである。これは、ＰＣＲ及びギャップＬＣＲの両方に適している。しかしながらＬＣＲでは、残りの二つのプローブの５’末端をブロックすることも可能である。ギャップＬＣＲでギャップを埋めるために伸長するプローブは、当業界で「上流」プローブと称されてきた。これに対し、残りのプローブ（伸長した上流プローブが連結するプローブ）は「下流」プローブと称されてきた。上流プローブは前述の方法でブロックし得る。下流プローブのブロッキングには、前述の方法のうち任意のものを使用し得るが、簡単な３’ホスフェートで、増幅プローブの連結伸長及びブロッキングオリゴ自体の重合伸長を十分にブロックすることができる。通常は、ブロッキングオリゴの３’末端も必ずブロックすることが好ましい。これらの末端も伸長用プライマーとして機能し得るからである。場合によっては、下流プローブをマスキングするブロッキングオリゴの３’末端に化学結合部分を使用するのが好ましいこともあり得る。これは後で説明する。ＰＣＲでは、バックグラウンドの総てが一方のプライマーのみに起因するとわかっているのでなければ、通常は両方のプライマーをブロックすべきである。ＬＣＲでは、四つのプローブを総てブロックすることが好ましい。ギャップＬＣＲでも、重合伸長及び連結伸長の両方をマスキングするという利点を得るために、やはり四つのプローブ総てをブロックするのが好ましい。二つのプローブのみをブロックする場合は、３’末端がギャップを埋めるために伸長する二つの「上流」プローブをブロックするのが好ましい。実施例で明らかにするように、これら二つのプローブのマスキングは、「下流」プローブのみをマスキングした場合より効果的にバックグラウンドを減少させる。直ぐには分からないかもしれないが、ギャップＬＣＲ増幅反応では、下流プローブのみをブロックすることによってある程度のブロッキング値が得られる（実施例５参照）。これは、ランダムテーリングの生起に二本鎖が必要であることに起因すると考えられる。下流プローブをマスキングすると、相補的上流プローブが一本鎖状態を維持し、テーリングされる可能性が低くなる。上述のように、前述のプローブマスキング方法を組み合わせて、同じブロッキングオリゴ内で使用するか、又は同じセットの異なるブロッキングオリゴ上で使用することができる。実施例で明らかにするように、ヘアピン伸長及び停止塩基を同じブロッキングオリゴ内で使用してもよい。また、ハプテン又は他のブロッキング部分を同じ増幅プローブセットの異なる増幅プローブ上で使用してもよい。ヘアピンマスクをミスマッチマスクと組み合わせても有用である。勿論、別の変形も当業者の技量範囲内で容易に実現し得る。Ｃ．妨害抑制方法ブロッキングオリゴを増幅前にプローブをマスキングする目的で使用したら、これらのオリゴが増幅反応を妨害しないように、反応混合物から効果的に除去することが望ましい。前述の妨害は、例えば、ブロッキングオリゴが増幅プローブに関して真の標的と競合する時、又はブロッキングオリゴが真の標的に関して増幅プローブと競合する時に生起し得る。増幅反応からオリゴを効果的に排除する操作は、幾つかの方法のうち、一つ以上の任意の方法で実施し得る。これらの方法は通常、次の２種類に分類される：（１）Ｋ₅₀（又はＴｍ）差異を利用するもの、従ってブロッキングオリゴヘテロ二本鎖（ｂｔ及びｂｐの両方）が対応するホモ二本鎖、特にプローブ：標的ホモ二本鎖より不安定であることを必要とするもの、並びに（２）増幅開始時にマスキング又はブロッキングオリゴを分解させるもの。二本鎖の安定性に関する考慮は、第一の種類の妨害抑制を実施する上で重要である。最も一般的には、ヘテロ二本鎖は種類に関係なくホモ二本鎖より不安定でなければならない。より特定的には、ブロッキングオリゴ：標的（ｂｔ）及びブロッキングオリゴ：プローブ（ｂｐ）ヘテロ二本鎖はどちらも、標的：標的（ｔｔ）、標的：プローブ（ｔｐ）及びプローブ：プローブ（ｐｐ）ホモ二本鎖のＫ₅₀ 又はＴｍの最小値より小さいＫ₅₀又はＴｍを有していなければならない。また、ブロッキングオリゴ：ブロッキングオリゴ（ｂｂ）二本鎖を形成できる場合には必ず、これらの二本鎖のＴｍがいずれかのヘテロ二本鎖のＴｍより大きいか又は小さいかのいずれかでなければならない（同等ではない）。これは後でより詳細に説明するが、下記のように要約することができる。Ｋ₅₀も同様に要約される。（１）最も重要なのは、Ｔｍ_pb及びＴｍ_btの両方がＴｍ_ptより小さいことである。（３）Ｔｍ_bbが存在する場合には、通常は該Ｔｍ_bbがＴｍ_bpより大きいことが好ましい。第１図〜第５図及び第６図〜第８図に示す第一の方法では、ｐｔホモ二本鎖のＴｍ（Ｔｍ_pt）を最大にするために、増幅プローブの配列が標的に対して完全に相補的になっている。ｂｐヘテロ二本鎖（従ってｂｔヘテロ二本鎖）のＴｍは、ブロッキングオリゴ配列を、通常はオリゴの中央近傍で、一つ以上の塩基の欠失、付加又はミスマッチを除いて、相補的であるように設計することにより、Ｔｍ_pt より小さい値に維持される。その結果、ブロッキングオリゴ：プローブヘテロ二本鎖に「バブル」が発生し、そのためＴｍ_bp（及びＴｍ_bt）がＴｍ_ptより小さくなる。本出願人は、ＬＣＲ条件下では単一塩基欠失が好ましく、またＴｍに５〜８℃の差を与えるのに十分であることを発見した。一般的には、Ｔｍ差は２〜２０℃で十分であり、好ましくは３〜１５℃、最適には５〜１０℃である。従って、ブロッキングオリゴ：プローブヘテロ二本鎖は、マスキングが望まれる低い貯蔵温度（室温以下）では安定であるが、妨害を回避することが好ましいＰＣＲ及びＬＣＲで使用する高いアニーリング温度（典型的には５０〜７０℃）では不安定である。この方法は実施例１〜２、４〜９及び１１〜１２に記述されている。本出願人は欠失が好ましいことを発見したが、付加及び／又はミスマッチもＴｍに同様の影響を与え、やはり使用可能である。従って、アニーリング及び伸長反応を、ｐｐ及びｐｔホモ二本鎖は形成されるがｂｐ及びｂｔヘテロ二本鎖は実質的な量で形成されないような中間条件（例えば温度）Ｔｍ_bt及びＴｍ_ptで実施し得る。この妨害抑制方法の二つの適用は、ＬＣＲで四つのプローブ全部をブロックする時に特に有用である。上述のように、この場合は、Ｔｍ_bbが＞Ｔｍ_bpでなければならない。第４図に示す第一の変形例では、テール又は伸長がブロッキングオリゴに付加される。このようなブロッキングオリゴのテールは比較的長く、標的に対してではなく互いに相補的でなければならない。この方法では、ブロッキングオリゴホモ二本鎖のＴｍ（「Ｔｍ_bb」）が増加し、ｂｂホモ二本鎖をｂｔ又はｂｐヘテロ二本鎖より優先的に安定にし、それによってブロッキングオリゴを退去させる（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）。このようなテールは、片側では（Ｉ）ｎ及び（Ｉ’）ｎ、反対側では（Ｊ）ｍ及び（Ｊ’）ｍとして特徴付け得、標的ＤＮＡに対して相補的であってはならない。（Ｉ）ｎ及び（Ｊ）ｍは例えば、２から約１００ヌクレオチド、典型的には２から５０、より典型的には５から１０ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列である。（Ｉ）ｎ及び（Ｊ）ｍは、Ｉ及びＪの各発生が独立して決定されるホモポリマー又はヘテロポリマーであり得る。Ｉ伸長の長さ（ｎ）及びＪ伸長の長さ（ｍ）は同じであっても、又は異なっていてもよい。また、Ｉ及びＩ’は同じ長さを有し得る（Ｊ及びＪ’も同様）。（Ｉ’）ｎ及び（Ｊ’）ｍはそれぞれ（Ｉ）ｎ及び（Ｊ）ｍに対して相補的なポリヌクレオチド配列を表す。（Ｉ）ｎの長さを（Ｉ’）ｎに対して変化させても利点はないが（なぜなら対になった塩基のみがＴｍに関与する）、このような変化は本発明の範囲内に含まれる。第６図に示す退去方法の別の変形例は、ブロッキングオリゴホモ二本鎖内の二つのブロッキングオリゴを結合するための共有結合手段を使用する。これは、ブロッキングプローブによる妨害をより永続的に防止する。なぜなら、対になった鎖の水素結合の安定性だけに依存するものではないからである。従って、ブロッキングオリゴホモ二本鎖の並置及び初期アニーリングの促進にはテールが好ましいとされ得るが、テールは少なくともより短くてよく、例えば５から５０ヌクレオチドでよい。この方法のメカニズムは、ブロッキングオリゴを互いに架橋するか又は共有結合させて、永久に妨害しないようにすることにある。例えば、第６図に示すように、５’末端に反応性結合部分を備えたヘアピン形成５’ヌクレオチド伸長を有するブロッキングオリゴで上流プローブをブロックする。相補的下流プローブは、３’結合部分を有するオリゴでブロックする。上流プローブ、下流プローブ及び下流プローブをブロックするオリゴは総て、本質的に外端部で隣接している。上流プローブのブロッキングオリゴのヘアピン末端は、該オリゴでマスキングされるプローブとの間にギャップを殆ど又は全く設けずに停止する。この構造は、ブロッキングオリゴが、対応するプローブから分離された時に、反応性結合基が互いに隣接して活性化及び共有結合を容易にするようにアニーリングすることを可能にする。オリゴヌクレオチドの共有結合方法は当業界で幾つか知られている。例えば、欧州特許出願公開明細書第０３２４６１６号（Ａｍｃｏ）及び国際特許出願公開明細書第９０／０１０６９号（Ｓｅｇｅｖ）はどちらも、オリゴヌクレオチドに結合することができ、光エルネギーに暴露すると共有結合を形成することが知られている多数の化合物を記述している。これらの明細書の開示は本明細書に参考として包含される。この種の化合物の非限定的具体例としては、クマリン、プソラレン、アントラセン、ピレン、カロチン、トロポン、クロモン、キノン、マレイン酸無水物、アルキルマレイドミド、オレフィン、ケトン及びアジドが挙げられる。前述の化合物の製造方法及びオリゴヌクレオチドへの結合方法は先行技術で教示されている。この方法の変形例では、一緒に結合できる化学基を光活性化可能基に代えて使用し得る。この種の基はオリゴヌクレオチドを結合するためのものとして国際特許出願公開明細書第９４／２９４８５号（Ｓｅｇｅｖ）に開示されている。この先行特許明細書も本明細書に参考として包含される。このような化学的及び光化学的結合は、相補的プローブ又は隣接プローブ上の反応性基の間に配置できる。従って、プローブセットの相補的プローブ（即ち上流プローブ及び下流プローブの両方）は、一方のオリゴの５’末端上及び他方のオリゴの３’末端上に反応性化学基を有する相補的ブロッキングオリゴを用いてマスキングし得る。これらの末端は方向に応じて内部末端であり得る。その場合は、化学基もそれぞれのプローブのマスキングに使用し得る（前述）。あるいは、前記末端は外部末端（即ち連結点に対して遠位の末端）であってもよく、又は両方であってもよい。いずれにしても、ブロッキングオリゴホモ二本鎖内のブロッキングオリゴの末端は、これらの反応性基が、光エルネギー活性化であれ化学的活性化であれ、トリッガー事象時に共有結合する位置に配置されるように、十分に接近し得る。ブロッキングオリゴはこのようにして共有結合し、増幅反応を永久に妨害しなくなる。Ｔｍ妨害抑制の更に別の変形例は、第５図に示すように単一ブロッキングオリゴが二つのプローブの間のギャップを埋める実施態様で有用である。この構造では、ブロッキングオリゴを、長さの約半分にわたって標的プローブとハイブリダイズするが、分離されると、ブロッキングオリゴ同士がほぼ全長にわたってイブリダイズできるように設計する。これは、ｂｂホモ二本鎖のＴｍを最大にする一方で、ｂｐヘテロ二本鎖のＴｍを減少させ、その結果Ｔｍ_bp より大きいＴｍ_ptが得られる。しかしながらこの場合は、Ｔｍ_bbがＴｍ_btにほぼ等しい。いずれの場合も、マスキングしたプローブ二本鎖は早期の脱マスキングを防止する条件下で貯蔵しなければならない。大半の実施態様では、これは単に低温での貯蔵を意味する。共有結合基方法の欠点は、貯蔵条件として、光又は他のトリッガー刺激からの遮蔽も必要なことにある。第二の種類の妨害抑制は、増幅開始後にブロッキングオリゴを分解させる操作からなる。分解は、実質的にブロッキングオリゴのみに作用し且つ増幅開始後にのみ機能する限り、化学的もしくは酵素的又はその両方であってよい。例えば、第７図に示すように、ブロッキングオリゴはｄＴに代えてｄＵを含み得る。その場合は、デオキシウラシルＮグリコシラーゼ（ｄＵＮＧ）がウラシル塩基を除去し得、次いで、結果として得られた非塩基部位で熱サイクル条件下に開裂が生起する。前述のプローブマスキング方法及び／又は妨害回避方法を組合わせて使用することも可能である。所望であれば、ヘアピン伸長／停止塩基ブロッキングオリゴを一つの増幅プローブに使用し、ハプテン又は他のブロッキング部分を別の増幅プローブに使用し得る。また、欠失又は付加を誘起するバブルの導入により片側のブロッキングオリゴ：標的プローブ二本鎖を脱安定化する一方で、退去方法を使用して反対側のブロッキングオリゴの妨害を排除してもよい。Ｄ．試薬及び材料本発明に有用なポリメラーゼ及びリガーゼは市販されている。これらの酵素は、熱サイクルにかけられるＰＣＲ及びＬＣＲ反応の場合は通常熱安定性でなければならない。熱安定性ポリメラーゼはＨｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｍ等から入手できる。Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）は適当な熱安定性ポリメラーゼである。熱安定性リガーゼもＥｐｉｅｎｃｔｒｅ（Ｃｉｔｙ，ＳＴ），ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（ｃｉｔｙ，ＭＡ）、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏlｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。増幅プローブであれ又はブロッキングオリゴであれ、ポリヌクレオチドの合成は現在では自動化されルーチン化されている。増幅プローブを適当なハプテンで標識する操作は前述の通りである。結合ブロッキング部分の結合は前出の参考文献を含む先行技術で開示されている。Ｅ．検出増幅生成物の検出は任意の適当な手段で実施する。好ましい検出方法は、増幅生成物を検出するための微粒子捕捉酵素イムノアッセイ（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｃａｐｔｕｒｅｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（ＭＥＩＡ））の使用からなる。ＭＥＩＡはＦｉｏｒｅら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４（９）：１７２６−１７３２（１９８８）及び欧州特許出願公開明細書第２８８７９３号に記載されており、この方法を使用する市販の臨床分析器としては、ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）から市販されているＩＭｘ（登録商標）器具がある。増幅生成物のＭＥＩＡ検出では、捕捉ハプテン（ハプテン１）及び検出ハプテン（ハプテン２）の両方が各増幅生成物に結合（例えば共有結合）しなければならない。これは、マスキング反応でのブロッキング部分としてのハプテンの使用とは異なる。ＬＣＲ又はＰＣＲ反応生成物中へのハプテンの導入は、例えば欧州特許出願公開明細書第０３５７０１１号及び第０４３９１８２号で当業者に公知である。要約すれば、この方法は、反応性対構成員が結合しているプライマーを（ＰＣＲ反応で）使用する。反応性対構成員は固相に結合し得、及び／又は標識結合体によって検出し得る。反応性対は、ハプテン及び抗体、ビオチン及びアビジン、酵素及び酵素受容体、炭水化物及びレクチン、並びに相補的ＤＮＡ鎖の対の中から選択した。Ｆ．組成物及びキット組成物は、増幅反応（ＰＣＲ又はＧＬＣＲ）並びにブロッキングオリゴの数及び種類（上述）に応じて多数の構成を有する。典型的ＰＣＲキットは、各々がいずれかの種類のブロッキングオリゴでマスキングされた二つの増幅プライマーを含む。典型的ＬＣＲキットは四つの増幅プローブを含む。好ましくは四つ全部をマスキングするが、二つだけでもよい。好ましくは、効果的なマスキングを行うために、プローブを別個の反応でブロッキングオリゴと反応させる。次いで、マスキングしたプローブを混合し得る。但し試薬混合物は、ブロッキングオリゴの分離及び増幅プローブの再構成を抑制する条件下で貯蔵する。これらの組成物及びキットのマスキング手段及び妨害抑制は任意に変更し得る。キットは通常、マスキングしたプローブ試薬組成物の他に、必要な酵素、典型的には熱安定性ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ、補因子、例えばマグネシウム及びＮＡＤ、適当な緩衝液もしくは緩衝溶液、並びに結果を解明するための検出手段を含む。検出手段としては、例えば抗体結合体、酵素及び基質又は指示薬、固相等が挙げられる。実施例以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明を明らかにするものであって、これを制限するものではない。実施例を通して、下記の略号は記載の意味を有する。・アダマンタンという用語は、リポーターハプテンのコンテクストで使用する場合は、本明細書に参考として包含される同時係属出願第０８／０４９，８８８号の実施例に記載の免疫原性３−フェニル−１−アダマンタン酢酸化合物を意味する。・カルバゾールという用語は、リポーターハプテンのコンテクストで使用する場合には、本明細書に参考として包含される同時係属出願第０８／０８４，４９５号の実施例に記載の免疫原性カルバゾール化合物を意味する。・ＩＦＵは、理論的には１個の生物に等しい１混在物形成単位を意味する。Ｃｈｌａｍｙｄｉａは絶対細胞内寄生虫であるため、対照希釈物（ｃｏｎｔｒｏｌｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）を正確に定量することが難しい。対照溶液（ｃｏｎｔｒｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎ）ＩＦＵは、ＩＦＵを評価するために培養した原液に対して較正した標準曲線を使用してＩＭｘ（登録商標）速度で評価する。・ＬＣＲ緩衝液は５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、２０ｍＭＫＣｌ及び３０ｍＭＭｇＣｌ₂からなる。・オリゴは通常オリゴデオキシリボヌクレオチドを意味するが、状況によってはオリゴリボヌクレオチドを意味し得る。・酵素の単位：１単位のポリメラーゼは製造業者、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩに従って定義される。１単位のリガーゼは次のように定義される：１ｍｇの９５％精製ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼは約１×１０⁸単位の比活性を有する。これは正確には標準化されておらず、２０％も変化し得るが、最適化はルーチンのオペレーターの手腕の範囲内にある。実施例１〜４：ブロッキングオリゴを使用するＣｈｌａｍｙｄｉａＬＣＲ下記の二本鎖標的ＤＮＡ配列（配列番号５）は簡明化のために一本鎖として示す。標的はＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＭＯＭＰ遺伝子の地図位置４３５−４８２に対応する。Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｘ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．及びＣａｌｄｗｅｌｌ，Ｈ．Ｄ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：１０６１（１９９０）による。下記の標的特異的プローブ（ここでは「増幅プローブ」とも称する）及びブロッキングオリゴは、ＬＣＲにより低レベルのバックグラウンドで前記標的配列を検出するように設計した。標的の増幅に特異的なプローブは下記の通りである。該増幅プローブセットは、カルバゾール（「Ｄ」で示す）でハプテン化した二つのプローブ（配列番号１及び２）とアダマンタン（「Ｅ」で示す）でハプテン化した二つのプローブ（配列番号３及び４）を特徴とする。プローブ１及び３は標的鎖（配列番号５）に適合するように設計されているため標的の相補体とハイブリダイズし、プローブ２及び４は図示の標的鎖に対して相補的であって、これとハイブリダイズする。下記のようにプローブ１及び２は互いにハイブリダイズし、プローブ３及び４も同様である。実施例１．四つのブロッキングオリゴ；ヘアピン修飾５’末端ブロッキングオリゴを、前述の標的ＬＣＲプローブに対して相補的であるように設計した。ブロッキングオリゴ及びそのハイブリダイゼーション方向は下記の通りである。このセットの各ブロッキングオリゴは、伸長を阻止するために末端３’リン酸ブロッキング基を有する。ここでは、且つ実施例を通して、ブロッキングオリゴ中のダッシュ（「−」）は、妨害抑制に関して記載したように、Ｔｍを操作するために欠失したヌクレオチドを表す。本出願明細書を通して、米印（＊）は増幅プローブに対応するブロッキングオリゴを示すために使用されている。例えば、ブロッキングオリゴ１^*（配列番号６）は増幅プローブ１（配列番号１）に対して相補的であり、ブロッキングオリゴ２^*（配列番号７）は増幅プローブ２（配列番号２）に対して相補的であり、ブロッキングオリゴ３^*（配列番号８）は増幅プローブ３（配列番号３）に対して相補的であり、ブロッキングオリゴ４^*（配列番号９）は増幅プローブ４（配列番号４）に対して相補的である。プローブ１^*（配列番号６）及び４^*（配列番号９）中の下線を引いた配列（５’伸長）は、相補的標的特異的プローブにハイブリダイズしても、ヘアピンループ構造を形成する能力を有する。この下線は、約束事として、実施例全体を通してこのように使用する。標的特異的プローブが相補的ブロッキングオリゴにハイブリダイズすると、ＤＮＡポリメラーゼによる標的特異的プローブの５’から３’への伸長が、潜在的二次構造により、及び／又はオリゴ１^*（配列番号６）及び４^*（配列番号９）の５’伸長部内の停止塩基（Ｃ）の存在によって阻止される。ブロッキングオリゴによる増幅の妨害は、ｐｔホモ二本鎖のＴｍをｂｐ及びｂｔヘテロ二本鎖のＴｍより大きくすることによって最小になる。この実施例では、標的特異的プローブホモ二本鎖のＴｍ（Ｔｍ_pt）は７０℃〜７２℃であり、ブロッキングオリゴヘテロ二本鎖のＴｍ（Ｔｍ_bp）は６３〜６９℃である。ブロッキングオリゴのヘテロ二本鎖Ｔｍは、この実施例では、ブロッキングオリゴの１ヌクレオチドの欠失によって減少させる。オリゴ１^*（配列番号６）及び４^*（配列番号９）の５’伸長部は標的に対して非相補的であるため、オリゴ：標的二本鎖のＴｍに影響はない。ギャップＬＣＲを、ブロッキングオリゴを使用して、及び使用せずに実施した。ブロッキングオリゴを評価するために、各々１×１０¹²分子の標的特異的プローブ１（配列番号１）及び４（配列番号４）と、各々２×１０¹²分子のブロッキングオリゴ１^*（配列番号６）及び４^*（配列番号９）とを、最終容量２０μｌのＬＣＲ緩衝液中で混合した（ＬＣＲ緩衝液は５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８と２０ｍＭＫＣｌと３０ｍＭＭｇＣｌ₂とを含む）。別の反応管で、各々１×１０¹²分子の標的特異的プローブ２（配列番号２）及び３（配列番号３）と各々２×１０¹²分子のブロッキングオリゴ２^*（配列番号７）及び３^*（配列番号８）とを、最終容量２０μｌのＬＣＲ緩衝液、即ち５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８と２０ｍＭＫＣｌと３０ｍＭＭｇＣｌ₂とからなる緩衝液中で混合した。これら２種類の混合物を１００℃に加熱し、次いでゆっくりと室温に冷却した。その結果得られたブロックされたプローブの混合物を一緒にして、ＬＣＲ緩衝液と１００μＭＮＡＤと１μＭ２’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（ｄＡＴＰ）と１μＭ２’−デオキシシトシン５’−トリホスフェート（ｄＣＴＰ）とを含む反応混合物に加えた。次いで、０又は２．５ＩＦＵのＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノムＤＮＡ（ＭＯＭＰ遺伝子標的を含む）と、３３０ナノグラムのヒト胎盤ＤＮＡと、酵素混合物、即ち５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、８．２０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、１００００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼ及び１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む混合物とを加えた。反応管を室温で１時間インキュベートした。次いでギャップＬＣＲを４３サイクル実施した。各サイクルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーモサイクラーを使用して、９７℃で１秒のインキュベーション、６１℃で１秒のインキュベーション及び６８℃で５０秒のインキュベーションを行うことからなる。いずれの場合も最終反応容量は１００μｌであり、サイクルにかける前に反応混合物の表面を約２０μｌの鉱油で覆った。標的特異的プローブでバックグラウンドの量を決定するためにブロッキングオリゴを使用しないギャップＬＣＲも実施もした。このプロトコルは前述のブロッキングオリゴプロトコルと少し異なる。各々１×１０¹²分子の標的特異的プローブ１（配列番号１）、２（配列番号２）、３（配列番号３）及び４（配列番号４）を、ＬＣＲ緩衝液（前述）と１００μＭＮＡＤと１μＭ（ｄＡＴＰ）と１μ Ｍ（ｄＣＴＰ）とを含む反応混合物に加えた。次いで、０又は２．５ＩＦＵの標的ＤＮＡ（ＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノムＤＮＡ）、３３０ナノグラムのヒト胎盤ＤＮＡ、及び酵素混合物、即ち５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８と２０ｍＭＫＣｌと３０ｍＭＭｇＣｌ₂と１０μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡと１００００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼと１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼとを含む酵素混合物を加えた。最終反応容量は１００μｌであった。反応管を室温で１時間インキュベートし、ギャップＬＣＲを前述のように４３サイクル実施した。増幅後、カルバゾール−アダマンタンＬＣＲ増幅生成物を、ＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）ＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＥＩＡ）システムでサンドイッチイムノアッセイを実施することによって検出した。ブロッキングオリゴの使用によるバックグラウンドの減少を、標的ＤＮＡを含まない試料について、表１Ａ及び第９図に示す。表１Ｂは、標的ＤＮＡを含む試料を、ブロッキングオリゴを使用して及び使用せずに標的特異的プローブで増幅した場合の結果である。これらのデータは、ブロッキングオリゴが増幅効果率に対して無視し得る程度の影響しか与えないことを示している。反応しない場合は典型的には≦１００ｃ／ｓ／ｓの速度を与えるであろう。実施例２．四つのブロッキングオリゴ；ＰＮＡ修飾５’末端下記のブロッキングオリゴセット（５^*、２^*、３^*及び６^*、配列番号１０、７、８及び１１）を実施例１の標的特異的プローブセット（配列番号１、２、３及び４）と共に使用して実施例１のギャップＬＣＲ増幅及びＩＭｘ（登録商標）検出を繰り返し、標的ＤＮＡを増幅する。ブロッキングオリゴのヌクレオチド配列は、ブロッキングオリゴ５^*（配列番号１０）及び６^*（配列番号１１）（オリゴ１^*（配列番号６）及び４^*（配列番号９）の代わりに使用）の５’末端が、５’ヘアピン伸長部及び停止塩基の代わりに、ペプチド結合で結合したヌクレオチドの３塩基伸長部（「ＣＣＣ」）であるＦ（二重下線）を含む点を除いて、実施例１と同じである。伸長部の配列は重要ではなく、停止塩基を考慮する必要はない。なぜなら、このようなＰＮＡは標的特異的ＬＣＲプローブの５’から３’への伸長の鋳型として機能しないからである。保護した塩基オリゴヌクレオチド配列を出発材料として、国際特許出願公開明細書第９３／２５７９６号に記載のようにＰＮＡ合成反応を実施することにより、キメラＤＮＡ／ＰＮＡ分子を合成する。実施例１と同様に、ブロッキングオリゴは伸長を防止するために末端３’リン酸を含む。ブロッキングオリゴ：増幅プローブハイブリッドのＴｍは、ダッシュで示すヌクレオチドの欠失によって減少する。標的特異的プローブが相補的ブロッキングオリゴにハイブリダイズすると、標的特異的プローブのＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’への伸長が阻止される。実施例３．四つのブロッキングオリゴ；テールドＴｍ制御下記のブロッキングオリゴセットを実施例１の標的特異的プローブセットと一緒に使用して、標的ＤＮＡを増幅する。ブロッキングオリゴ７^*、８^*、９^*及び１０^*のヌクレオチド配列は、Ｆ及び下記のヌクレオチド伸長部を除いて、それぞれ実施例２のブロッキングオリゴ５^* 、２^*、３^*及び６^*と同じである。プローブ７^*（配列番号１２）は１０塩基の３ ’ヌクレオチド伸長（Ｉ）ｎを含む。これは、プローブ８^*（配列番号１３）の５’ヌクレオチド伸長（Ｉ’）ｎに対して相補的である。また、プローブ９^*（配列番号１４）は、プローブ１０^*（配列番号１５）の３’伸長（Ｊ’）ｍに対して相補的な約１０塩基の５’ヌクレオチド伸長（Ｊ）ｍを含む。Ｆは、この実施例では、実施例１と同様に停止塩基を有する５’ヘアピン構造を表す。この実施例では、二つの相補的ブロッキングオリゴからなるホモ二本鎖ハイブリッドのＴｍをプローブ：ブロッキングオリゴヘテロ二本鎖のＴｍより大きくし、好ましくはプローブ：標的ホモ二本鎖のＴｍより大きくして（即ちＴｍ_bb＞Ｔｍ_pb）、ブロッキングオリゴが互いに結合して安定なハイブリッドを形成し、ＬＣＲ反応で標的特異的プローブと競合する可能性をより少なくようにすることにより、ブロッキングオリゴによる妨害を更に低下させる。実施例１と同様に、但し前述のブロッキングオリゴセットを使用して、ギャップＬＣＲ増幅及びＩＭｘ（登録商標）検出を行う。実施例４．二つのブロッキングオリゴ（５’ミスマッチを有する１及び４）下記のブロッキングオリゴを実施例１の標的特異的プローブセットと一緒に使用して標的ＤＮＡを増幅する。この実施例では、標的特異的増幅プローブ１（配列番号１）及び４（配列番号４）をブロッキングオリゴ１^*（配列番号１６）及び４^*（配列番号１７）でブロックし、プローブ２（配列番号２）及び３（配列番号３）はブロックしないでおく。この実施例では、ブロッキングオリゴは、増幅プローブの不注意な伸長を防止するために、５’末端ミスマッチ（二重下線）を使用する。各ブロッキングオリゴの３’末端は伸長を防止するためにリン酸を有し、ダッシュは実施例１と同様にＴｍ妨害抑制のために欠失した塩基を示す。但し、ミスマッチだけでもＴｍ_bp はある程度減少する。ギャップＬＣＲ増幅及びＩＭｘ（登録商標）検出を、実施例１と同様に、但し前記ブロッキングオリゴセットを用いて実施する。実施例５〜７：ブロッキングオリゴを使用するＨＢＶＬＣＲ下記の二本鎖標的ＤＮＡ配列（配列番号２２）は簡明化のために一本鎖として示す。この配列は、ＨＢＶ表面抗原遺伝子（ａｄｒサブタイプ）の地図位置２３１−２７９に対応するＨＢＶＤＮＡを表す。Ｏｎｏ，Ｙ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１１：１７４７−１７５７（１９８３）による。この増幅プローブセットは、カルバゾール（Ｄで示す）でハプテン化した二つの標的特異的プローブ（１１及び１２、配列番号１８及び１９）と、アダマンタン（Ｅで示す）でハプテン化した二つの標的特異的プローブ（１３及び１４、配列番号２０及び２１）を特徴とする。プローブ１１及び１３（配列番号１８及び２０）は標的鎖（配列番号２２）に適合するように設計されているため標的の補体とハイブリダイズし、プローブ１２及び１４（配列番号１９及び２１）は図示の標的鎖に対して相補的であり、これとハイブリダイズする。図示のようにプローブ１１及び１２は互いにハイブリダイズし、プローブ１３及び１４も同様である。標的特異的プローブ１１（配列番号１８）と標的ＤＮＡとの間には、イタリック体で示すように、単一塩基ミスマッチが存在する。実施例５．二つのブロッキングオリゴ（３’リン酸を有する２及び３）前記標的配列を低レベルのバックグラウンドのＬＣＲで検出するために、標的特異的増幅プローブ及びブロッキングオリゴ（下記）を設計した。ブロッキングオリゴは、増幅プローブに対して相補的であるように設計した。該セットの各ブロッキングオリゴは、伸長を防止するために末端３’リン酸を有する。ダッシュは、前述のように、Ｔｍを操作するためにブロッキングオリゴ中で欠失したヌクレオチドを表す。ブロッキングオリゴ１２^*（配列番号２３）及び１３^*（配列番号２４）はこれらの伸長を防止する３’ホスホリル化末端を有する。実施例１と同様に、ブロッキングオリゴによる増幅妨害は、プローブ：ブロッキングオリゴヘテロ二本鎖のＴｍをプローブ：標的二本鎖より不安定にすることによって最小にする。このＨＢＶ実施例では、プローブホモ二本鎖のＴｍ（Ｔｍ_pp及びＴｍ_pt）は７０℃〜７１℃である。プローブ：ブロッキングオリゴヘテロ二本鎖のＴｍ（Ｔｍ_pb）は６４℃〜６８℃ である。第一の実験では、前述の二つのブロッキングオリゴ１２^*及び１３^*（配列番号２３及び２４）を標的特異的プローブセット（プローブ１１、１２、１３及び１４、即ち配列番号１８、１９、２０及び２１）と共に使用して、低バックグラウンドでＨＢＶ標的ＤＮＡを増幅した。実施例１と同様に、ブロッキングオリゴを使用するギャップＬＣＲ及び使用しないギャップＬＣＲを実施した。ブロッキングオリゴを評価するために、各々５ ×１０¹¹分子の標的特異的プローブ１２（配列番号１９）及び１３（配列番号２０）と、各々１×１０¹²分子のブロッキングオリゴ１２^*（配列番号２３）及び１３^*（配列番号２４）とを、最終容量２０μｌのＬＣＲ緩衝液、即ち５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８と２０ｍＭＫＣｌと３０ｍＭＭｇＣｌ₂とを含む緩衝液中で混合した。該混合物を１００℃に加熱し、次いでゆっくりと室温に冷却した。次いでこの溶液を、ＬＣＲ緩衝液（実施例１に記載）と１００μＭＮＡＤと１μＭ［ｄＴＴＰ］と１μＭ［ｄＣＴＰ］と各々５×１０¹¹分子のＬＣＲ標的特異的プローブ１１（配列番号１８）及び１４（配列番号２１）とを含む反応混合物に加えた。次いで、０又は１００分子の標的ＤＮＡ（肝炎Ｂ型ウイルスＡＤＲサブタイプゲノムＤＮＡ）、３３０ナノグラムのヒト胎盤ＤＮＡ、及び酵素混合物、即ち５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８と８．２０ｍＭＫＣｌと３０ｍＭＭｇＣｌ₂ と１０μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡと１００００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼと１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼとを含む混合物を加えた。反応管を室温で２時間インキュベートした。次いでギャップＬＣＲを３８サイクル実施した。各サイクルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーモサイクラーを使用して、９７℃で１秒のインキュベーション、６０℃で１秒のインキュベーション及び６７℃で５０秒のインキュベーションを行うことからなる。いずれの場合も、最終反応容量は１００μｌであり、サイクルにかける前に反応混合物の表面を約２０μｌの鉱油で覆った。標的特異的プローブでバックグラウンドの量を決定するために、ブロッキングオリゴを使用しないギャップＬＣＲも実施した。このプロトコルは前述のブロッキングオリゴプロトコルと少し異なる。各々５×１０¹¹分子の標的特異的プローブ１１（配列番号１８）、１２（配列番号１９）、１３（配列番号２０）及び１４（配列番号２１）を、ＬＣＲ緩衝液（実施例１に記載）と１００μＭＮＡＤと１μＭ［ｄＡＴＰ］と１μＭ［ｄＧＴＰ］とを含む反応混合物に加えた。次いで、０又は１００分子の標的ＤＮＡ（肝炎Ｂ型ウイルスＡＤＲサブタイプゲノムＤＮＡ）、３３０ナノグラムのヒト胎盤ＤＮＡ、及び５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８と２０ｍＭＫＣｌと３０ｍＭＭｇＣｌ₂と１０μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡと１００００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼと１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼとを含む酵素混合物を加えた。最終反応容量は１００μｌであった。反応管を室温で２時間インキュベートするか、又は直ぐに前述のようなサイクルに３８回かけて増幅した。増幅後、カルバゾール−アダマンタンＬＣＲ増幅生成物を、ＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）システムで実施したサンドイッチイムノアッセイによって検出した。対照実験として、試料＋／−標的ＤＮＡ及び＋／−予備インキュベーションを評価した（表５−Ａ及び５−Ｂ）。これらのデータは、予備インキュベーションがバックグラウンドを増加させることを示している。表５−Ｃは、標的ＤＮＡを含まない試料について観察された、バックグラウンド量に対するブロッキングオリゴ１２^*（配列番号２３）及び１３^*（配列番号２４）の作用を示している。増幅効率に対するブロッキングオリゴの作用は表５−Ｄに示す。これらのデータは、ブロッキングオリゴ１２^*（配列番号２３）及び１３^*（配列番号２４）がバックグラウンドを低下させるが、増幅効率は余り損なわないことを示している。我々は、この実験で、オリゴがギャップＬＣＲで伸長する上流プローブではなく下流プローブをブロックした場合でも、バックグラウンドがブロッキングオリゴによって減少することを観察した。これは、バックグラウンド発生メカニズムが、ランダムテーリングを生起させるために二本鎖プローブを必要とすることを示唆するものである。これはまた、本発明のこの実施態様が、下流プローブのみを阻止した場合でも、上流伸長可能プローブの伸長を阻止する効果を有することを意味する。実施例６．二つのブロッキングオリゴ（５’ヘアピン伸長を有する１及び４）別の実験で、二つのブロッキングオリゴ１１^*（配列番号２５）及び１４^*（配列番号２６）からなる別のセットを実施例５の標的特異的プローブセット（プローブ１１、１２、１３及び１４、即ち配列番号１８、１９、２０及び２１）と共に使用して、低バックグラウンドで標的ＤＮＡを増幅した。この実施例では、標的特異的増幅プローブ１１（配列番号１８）及び１４（配列番号２１）をブロッキングオリゴ１１^*（配列番号２５）及び１４^*（配列番号２６）でブロックし、プローブ１２（配列番号１９）及び１３（配列番号２０）をブロックしないでおいた。いずれの場合も、ブロッキングオリゴは、これとハイブリダイズする上流プローブの伸長を防止するために、ヘアピン形成伸長（下線部）及び５’停止塩基（Ｃ又はＴ）を使用する。各ブロッキングオリゴの３’ 末端は伸長を防止するためのリン酸を有する。ギャップＬＣＲ増幅及びＩＭｘ（登録商標）検出を実施例５と同様に、但し前述のブロッキングオリゴセットを使用して実施する。表６−Ａは、標的ＤＮＡを含まない試料について観察された、バックグラウンド量に対するブロッキングオリゴ１１^*（配列番号２５）及び１４^*（配列番号２６）の作用を示している。ブロッキングオリゴが増幅効率に与える影響は表６−Ｂに示す。これらのデータは、ブロッキングオリゴ１１^*（配列番号２５）及び１４^*（配列番号２６）がバックグラウンドを減少させるが、増幅効率には余り悪影響を与えないことを示している。実施例７．二つのブロッキングオリゴ；キャップ：連結内実施例５と同様に、但し下流プローブブロッキングオリゴセットの代わりに下記のブロッキングオリゴ１１／１３^*及び１２／１４^*を使用して操作を行う。ブロッキングオリゴ１１／１３^*（配列番号２７）はプローブ１１（配列番号１８）の３’末端及びプローブ１３（配列番号２０）の５’に対して相補的である。ブロッキングオリゴ１２／１４^*（配列番号２８）はプローブ１２（配列番号１９）の５’末端及びプローブ１４（配列番号２１）の３’末端に対して相補的である。標的特異的プローブが相補的ブロッキングオリゴにハイブリダイズすると、標的特異的プローブのＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’への伸長が、ブロッキングオリゴ中の停止塩基の存在によって阻止される。例えば、プローブ間のギャップ内のＣ及びＴは停止塩基として効果的に機能する。なぜなら、反応混合物はｄＡＴＰもｄＧＴＰも含まないからである。ブロッキングオリゴは、ブロッキングオリゴのＤＮＡポリメラーゼ伸長を防止するために末端３’リン酸基も含む。この実施例では、ブロッキングオリゴ１１／１３^*（配列番号２７）及び／又はブロッキングオリゴ１２／１４^*（配列番号２８）を標的特異的プローブ１１〜１４（配列番号１８、１９、２０及び２１）と一緒にインキュベートする。しかしながら、両方のブロッキングオリゴを使用する場合には、これらを対応する標的特異的プローブと共に別個にインキュベートし、次いで一緒にまとめて、実施例５及び６に記載のように増幅を行う。増幅反応の妨害は、本明細書に記載のようにブロッキングオリゴ：標的特異的プローブハイブリッドのＴｍを操作することによって最小にする。例えば、いずれかのプローブ上のブロッキングオリゴのＴｍ_bpを標的上の二つのプローブのＴｍ_pt どちらもＴｍ_ptより小さい。増幅後、ＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡシステムでサンドイッチイムノアッセイを実施して、カルバゾール−アダマンタンＬＣＲ増幅生成物を検出し得る。実施例８．ＤＮＡポリメラーゼのテーリング活性ＣｌａｒｋはＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６（２０）：９６７７−９６８６（１９８８）で、四つのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートのうちのいずれかを使用して、Ｔａｑポリメラーゼが平滑末端ＤＮＡ二本鎖の３’末端を伸長することができるという、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｑ）に関連した標的非依存テーリング活性を開示している。我々は下記のオリゴヌクレオチドを使用して、平滑末端二本鎖及び１塩基３’突出二本鎖の両方を伸長するＴａｑの能力を調べた。 γ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチド１５（配列番号２９）の５’末端を標識した（＊）。伸長反応混合物は、平滑末端二本鎖（オリゴヌクレオチド１５及び１６、即ち配列番号２９及び３０）又は１塩基３’突出を有する二本鎖（オリゴヌクレオチド１５及び１７、即ち配列番号２９及び３１）のいずれかを、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、４００ｍＭｄＮＴＰ及び２．５単位Ｔａｑポリメラーゼを添加した１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ））中に３３２ｎＭ含んでいた。反応混合物の容量は５μｌであった。各反応混合物を５５℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応混合物を同量のホルムアミド充填緩衝液と混合し、５μｌを１５％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分析した。結果は第１０図に示す。レーン１、１１及び１８はサイズマーカーである。レーン２〜５は、各ｄＮＴＰを使用して、Ｔａｑが平滑末端二本鎖（２５〜２６ｎｔ伸長したオリゴヌクレオチド１５（配列番号２９））の３’末端を伸長することができることを示している。ｄＡＴＰを使用したとき、＋２付加生成物を表す不鮮明なバンドを観察することができる。レーン６〜９は、ｄＡＴＰを使用した時に、微量の＋１生成物を除いて伸長しない１塩基３’突出を含む二本鎖（オリゴヌクレオチド１５（配列番号２９））にヌクレオチドを付加するＴａｑの能力が減少することを示している。レーン１２〜１７は対照であり、レーン１０は未使用である。実施例９．ブロッキングオリゴを使用するプライマーマスキングＤＮＡポリメラーゼの、ブロッキングオリゴ−プライマー二本鎖で退去させられたプライマーを伸長させる能力を調べた。γ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて、プライマー配列１８（配列番号３２）の５’末端を標識した。プライマー配列１８（配列番号３２）とヘアピンマスキングプローブ１８ａ^*（配列番号３３）又は１８ｂ^*（配列番号３４、下記）のいずれかとを含むマスキングした二本鎖を、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ及び１．２５単位／反応混合物のＴａｑポリメラーゼ（図面の「Ｔａｑ」）を添加した１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ））、又は２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ及び２．５単位／反応混合物のＳｔｏｆｆｅｌポリメラーゼ（第１１図の「ｓｔ」）を含むＳｔｏｆｆｅｌ緩衝液５０ μｌ中でインキュベートした。反応混合物を５０℃で５分間インキュベートした。１５μｌの試料を時間０及び５分間のインキュベーション後に除き、同量のホルムアミド充填緩衝液と混合した。試料を２０％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルで電気泳動にかけて分析した。結果は第１１図に示す。レーン２〜９は、いずれかのポリメラーゼがブロッキングオリゴを鋳型として用いてプライマー１８（配列番号３２）を伸長させる能力を示している。ヘアピン構造だけ（ブロッキングオリゴ１８ａ^*（配列番号３３）でもポリメラーゼ伸長のブロッキングが制限される（レーン２〜５）。しかしながら、プライマー１８の３’末端に対して二つのミスマッチを有する（ＧＴの二重下線参照）ブロッキングオリゴ１８ｂ^*（配列番号３４）をヘアピン構造と共に使用すると、プライマーの伸長が十分にブロックされる（レーン６〜９）。レーン１０〜１３は、８塩基５’突出を有する類似の鋳型に基づくプライマーの伸長を示す対照である。ヘアピン１８ａ^*（配列番号３３）は、本明細書に記載のプソラレン又は類似の架橋剤を用いて共有結合的に閉鎖すると、より大きいブロック能力を示すと考えられる。実施例１０〜１１．ブロッキングオリゴを使用するＨＩＶＰＣＲＨＩＶ−１ｔａｔ領域に対応する標的配列を増幅し検出するために標的特異的プライマーを設計した。下に示すのは、ＨＩＶ−１の増幅用としてＣｈｏｕら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１７１７−１７２３（１９９２）に開示されているプライマー１９（配列番号３５）及び２０（配列番号３６）をである。米印で示したブロッキングオリゴを、以下の対応する実施例で説明する。実施例１０．二つのブロッキングオリゴ；ヘアピン／ミスマッチ５’末端ブロッキングオリゴ１９ａ^*及び２０ａ^*（配列番号３７及び３８）は、図示のようにＰＣＲプライマーに対して相補的であるように設計した。各ブロッキングオリゴは伸長を防止するために末端３’リン酸を有する。ダッシュは、本明細書に記載のようにＴｍを操作するためにブロッキングオリゴ中で欠失したヌクレオチドを表す。ブロッキングオリゴ１９ａ^*（配列番号３７）及び２０ａ^*（配列番号３８）中の下線で示す配列（５’伸長）は、プライマーとハイブリダイズしてもヘアピンループ構造を形成することができる。二重下線で示す塩基は、実施例９で明らかにされたように、ブロッキング能力を高めるプライマー３’末端に対するミスマッチを表す。ＰＣＲは当業者に公知の標準的条件を使用して実施する。増幅後は、アガロースケル電気泳動及び臭化エチジウム染色、特異的内部プローブとのハイブリダイゼーション、又は当業者に公知の他の任意の方法で反応生成物を検出し得る。実施例１１．二つのブロッキングオリゴ；固定ヘアピン／ミスマッチ５’末端実施例１０と同様に操作を行うが、この場合はＰＣＲを実施する前に、ブロッキングオリゴ１９ａ^*及び２０ａ^*（配列番号３７及び３８）を別個にハイブリダイズ条件下でプソラレン架橋剤と反応させて、ヘアピン末端を「閉鎖」構造に共有的に架橋させる。この二次構造は脱折りたたみ耐性を示し、ミスマッチ塩基と協働してブロッキング能力を高める。実施例１２．二つのブロッキングオリゴ；ブロッキング部分修飾５’末端ブロッキングオリゴ１９ｂ^*及び２０ｂ^*（配列番号３９及び４０）は、図示のようにＰＣＲプライマーに対して相補的であるように設計した。各ブロッキングオリゴは伸長を防止するために末端３’リン酸を有する。ダッシュは、本明細書に記載のようにＴｍを操作するためにブロッキングオリゴ中で欠失したヌクレオチドを表す。ブロッキングオリゴ１９ｂ^*（配列番号３９）及び２０ｂ^*（配列番号４０）中の下線で示す配列（５’伸長）は、プライマーとハイブリダイズしてもヘアピンループ構造を形成する能力を有する。二重下線で示す塩基は、前述のように、プライマーの３’末端に対するミスマッチを表す。これらのブロッキングオリゴではｄＴがｄＵに置換されている。ＰＣＲを実施する直前に、オリゴ：プローブヘテロ二本鎖をウラシルＮ−グリコシラーゼで処理する（米国特許第５，０３５，９９６号、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。その結果、熱不安定性の非塩基部位が形成される。ＰＣＲは前述のように標準的条件を使用して実施する。熱サイクル条件下で、ブロッキングオリゴが非塩基部位で開裂される。その結果、ブロッキングオリゴ二本鎖のＴｍが減少し、該二本鎖が不安定になるため、増幅反応の妨害が低下する。以上、実施例を挙げて本発明を説明してきたが、本発明はこれらの実施例の特定具体例に限定されない。本発明の範囲はむしろ「請求の範囲」によって決定される。

Claims

【特許請求の範囲】１．個々のヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドセグメントを鋳型に従って付加することにより一つ以上の増幅プローブを反復して伸長させる操作を含む核酸増幅方法において、ａ）増幅反応開始前に、少なくとも一つのマスキングした形態の増幅プローブを供給し、但しマスクは本質的に、マスキングしたプローブヘテロ二本鎖を形成すべく前記増幅プローブとハイブリダイズしたブロッキングオリゴからなり、前記ブロッキングオリゴ：増幅プローブヘテロ二本鎖は、標的鎖：増幅プローブヘテロ二本鎖のＫ₅₀であるＫ₅₀ｐｔより小さいＫ₅₀ｂｐを有し、前記ブロッキングオリゴは増幅プローブの伸長を阻止し、ｂ）ブロッキングオリゴを増幅プローブから変性させて増幅プローブを脱マスキングし、ｃ）脱マスキングした増幅プローブを用いて増幅反応を実施することを改良点とする前記核酸増幅方法。２．前記ブロッキングオリゴ：標的鎖ヘテロ二本鎖がやはりＫ₅₀ｐｔより小さいＫ₅₀ｂｔを有する請求項１に記載の方法。３．ブロッキングオリゴを反応混合物から物理的に除去することなく、ブロッキングオリゴによる増幅反応の妨害を阻止するステップも含む請求項１に記載の方法。４．前記阻止ステップを、増幅プローブについて欠失又はミスマッチを少なくとも一つ有するブロッキングオリゴを使用することによって実施する請求項１に記載の方法。５．前記ブロッキングオリゴ：増幅プローブヘテロ二本鎖のＴｍを３〜１５℃ 低下させる請求項４に記載の方法。６．前記阻止ステップを、ブロッキングオリゴを相補的ブロッキングオリゴとハイブリダイズさせて両方のブロッキングオリゴを反応から効果的に退去させるブロッキングオリゴホモ二本鎖を形成させることにより実施する請求項３に記載の方法。７．ブロッキングオリゴホモ二本鎖のＴｍを増加させるブロッキングオリゴ上の相補的テールを使用することにより、マスキングしたプローブのヘテロ二本鎖よりブロッキングオリゴホモ二本鎖の方を優先的にする請求項６に記載の方法。８．前記テールが５から約３０ヌクレオチドの長さを有する請求項７に記載の方法。９．前記ブロッキングオリゴホモ二本鎖を共有結合させて、増幅反応を永久に妨害しないようにする請求項６に記載の方法。１０．前記共有結合を、ブロッキングオリゴ上に存在する光活性化可能な基又は化学的結合基を結合することによって実施する請求項９に記載の方法。１１．ブロッキングオリゴが、マスキングしたプローブ二本鎖内の増幅プローブの３’末端より突出する５’伸長を含む請求項１に記載の方法。１２．前記５’突出伸長が二次構造を形成することができる請求項１１に記載の方法。１３．前記５’伸長がそれ自体でヘアピンターンを形成する請求項１２に記載の方法。１４．増幅プローブの３’末端を越えて最初の伸長部内ヌクレオチドが停止塩基である請求項１１に記載の方法。１５．ブロッキングオリゴが、マスキングしたプローブ二本鎖内の増幅プローブの伸長及びテーリングを防止する５’ブロッキング部分を含む請求項１に記載の方法。１６．ブロッキングオリゴが、増幅開始時にブロッキングオリゴの開裂又は分解を実施するための手段を含む請求項１に記載の方法。１７．前記開裂又は分解を実施するための手段が、デオキシウラシルＮ−グリコシラーゼで処理し次いで熱サイクルにかける操作からなる請求項１６に記載の方法。１８．前記増幅反応が少なくとも二つの増幅プローブ／プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応であり、前記増幅プローブ／プライマーを両方ともマスキングしたプローブの形態で最初に供給する請求項１に記載の方法。１９．前記増幅反応が少なくとも四つの増幅プローブを使用するリガーゼ連鎖反応であり、前記プローブのうち少なくとも二つをマスキングしたプローブの形態で最初に供給する請求項１に記載の方法。２０．前記リガーゼ連鎖反応が、ギャップを埋めるために伸長しなければならない二つのプローブを有するギャップリガーゼ連鎖反応であり、最初にマスキングされた二つの増幅プローブが伸長する二つのプローブである請求項１９に記載の方法。２１．共通ブロッキングオリゴが二つの増幅プローブを同時にマスキングする請求項１９に記載の方法。２２．四つの増幅プローブ全部をマスキングしたプローブの形態で最初に供給する請求項１９に記載の方法。２３．少なくとも二つの増幅プローブと、少なくとも一つのマスキングしたプローブ二本鎖を形成すべく前記増幅プローブとハイブリダイズさせた少なくとも一つ、必要により二つのブロッキングオリゴとを含む材料組成物であって、貯蔵条件下では前記増幅プローブのランダム伸長が阻止され、増幅反応条件下ではポリメラーゼ及びヌクレオチドの存在下に前記ブロッキングオリゴが増幅プローブの伸長を阻止する組成物。２４．前記ブロッキングオリゴが増幅プローブの３’末端より突出する５’伸長を含む請求項２３に記載の組成物。２５．前記５’伸長がそれ自体でヘアピンターンを形成する請求項２４に記載の組成物。２６．増幅プローブの３’末端を越えて最初の伸長部内ヌクレオチドが停止塩基である請求項２４に記載の組成物。２７．ブロッキングオリゴが、増幅プローブについて欠失又はミスマッチを少なくとも一つ含む請求項２３に記載の組成物。２８．更に、リガーゼ連鎖反応増幅に適した二つのセンス増幅プローブ及び二つのアンチセンス増幅プローブも含み、前記増幅プローブが、各センスの一つの増幅プローブの伸長によって埋められなければならないようなギャップが同じセンスのプローブの間に設けられるように構築されており、最初にマスキングされた二つの増幅プローブが伸長する二つのプローブである請求項２３に記載の組成物。２９．四つの増幅プローブの全部がマスキングしたプローブの形態で存在する請求項２８に記載の組成物。３０．請求項１に記載の組成物とポリメラーゼ試薬とを一つ以上の容器に入れたものからなるキット。３１．更にリガーゼ試薬も含む請求項３０に記載のキット。