CN102796757A - 在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体及其构建方法和应用。该载体的构建方法：以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，用PCR方法扩增hpaA基因；将得到的hpaA基因与表达载体pNZ8110-lysM经酶切后进行连接，连接产物用于转化大肠杆菌；筛选并鉴定阳性转化菌，从阳性转化菌中提取重组质粒pNZ8110-hpaA-lysM；用电穿孔法将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ3900菌株，经筛选和鉴定得到重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM；培养该重组菌株，用诱导剂Nisin诱导hpaA基因的表达。Western blots分析显示重组菌株细胞壁蛋白中含有表达的HpaA蛋白，且该蛋白具有免疫活性。本发明提供的表达载体及包含该载体的重组菌株可应用于抗幽门螺杆菌疫苗和诊断试剂的制备或食品加工。

Description

在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可在乳酸乳球菌中表达幽门螺杆菌蛋白、且使表达蛋白展示于菌体表面的表达载体，同时还涉及一种该载体的制备方法与应用。 

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性致病菌，感染者占世界人口50%以上。幽门螺杆菌感染与人体慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生、发展密切相关[Kitajima Y,Ohtaka K,Mitsuno M,et al.Helicobacter pylori infection is an independent risk factor for Runx3 methylation in gastric cancer.Oncol Rep,2008,19(1):197-202]，防治幽门螺杆菌感染可以降低这些疾病的发病率。由于采用抗生素治疗幽门螺杆菌感染容易产生抗药性，且不能预防重复感染，因此控制幽门螺杆菌感染流行主要寄希望于幽门螺杆菌疫苗的研制成功。幽门螺杆菌定植于人体胃粘膜表面，经口免疫是最合理的免疫途径。目前，虽有个别幽门螺杆菌疫苗进入临床试验的报道，但尚无免疫效果理想的口服疫苗菌株[Zhang S,Moise L,Moss SF.H.pylori vaccines:why we still don't have any.Hum Vaccin,2011,7(11):1153-7.]。现有研究表明，缺乏安全有效的疫苗载体是影响口服疫苗研究发展的一个关键性因素[Agarwal K,Agarwal S.Helicobacter pvlori vaccine:from past to future.Mayo Clin Proc,2008,83(2):169-175.]。 

现有研究多采用减毒伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）作为幽门螺杆菌口服疫苗载体[Xu C,Li ZS,Du YQ,et al.Construction of recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine expressing H pylori ureB and IL-2.World J Gastroenterol,2007,13(6):939-944]。由于沙门氏菌是致病菌，减毒株不仅仍具有一定的毒性，而且还存在遗传稳定性问题，应用于人体时其安全性很难保证[Lee MH,Roussel Y,Wilks M,et al.Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene in Lactococcus lactis MG1363 and its use as a vaccine delivery system against H. pylori infection in mice.Vaccine,2001,19(28-29):3927-3935]；而且动物实验显示以该菌为载体构建的抗幽门螺杆菌疫苗菌株用于免疫小鼠时常引发较严重的免疫后胃炎，造成组织损伤。因此，有必要探讨更安全有效的口服疫苗载体。 

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级的益生菌，其安全性十分可靠[Morello E,Bermúdez-Humarán LG. Llull D,et al.Lactococcus lactis,an effcient cell factory for recombinant protein production and secretion.J Mol Microbiol Biotechnol,2008,14(1-3):48-58]；而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有作为口服疫苗载体的很大潜力[Stentz R,Bongaerts RJ,Gunning AP，Gasson M,Shearman C.Controlled release of protein from viable Lactococcus lactis cells.Appl Environ Microbiol,2010,76(9):3026-3031.]。目前，NICE***是应用最为广泛的乳酸菌表达***[Mierau I,Kleerebezem M.10years of the nisin-controlled gene expression system(NICE)in Lactococcus lactis.Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(6):705-17.]。采用NICE***的表达载体pNZ8110和pNZ8149表达幽门螺杆菌抗原已有报道，但这两种表达载体只能将外源蛋白表达于细胞质中或分泌至细胞外[Zhang XJ,Duan G, Zhang R,Fan Q.Optimized expression of Helicobacter pylori ureB gene in the Lactococcus lactis nisin-controlled gene expression (NICE) system and experimental study of its immunoreactivity.Curr Microbiol.2009,58(4):308-14.//Chen S,Zhang R,Duan G, Shi J.Food-grade expression of Helicobacter pylori ureB subunit in Lactococcus lactis and its immunoreactivity.Curr Microbiol.2011,62(6):1726-31.]，而无在细胞壁或细胞膜上展示表达外源蛋白的功能。作为口服疫苗抗原表达载体，pNZ8110和pNZ8149存在明显缺陷。因为现有研究显示，作为口服疫苗载体，将疫苗抗原展示表达于宿主菌细胞壁或细胞膜上，可显著提高疫苗菌株的免疫效果[翟伟强.减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用.研究华中农业大学，硕士学位论文，2011.6见中国学术文献网络出版总库]。因此，应用基因工程技术，通过对pNZ8110表达载体的改造，构建能够在L.lactis表面展示表达幽门螺杆菌疫苗抗原的表达载体，建立更为安全有有效的抗幽门螺杆菌疫苗菌株，这对幽门螺杆菌感染及相关疾病的防治具有重要意义和实用价值，可望产生可观的社会和经济效益。 

发明内容

本发明目的在于提供一种可表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的乳酸乳球菌表达载体。 

同时，本发明的目的还在于提供一种可表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的乳酸乳球菌表达载体的制备方法与应用。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种可表面展示表达幽门螺杆菌黏附素(HpaA)的L.lactis表达载体，HpaA是免疫效果最好的幽门螺杆菌疫苗候选抗原之一。所述L.lactis表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.6所示 的核苷酸序列存在至少95%或至少90%同源性。 

本发明所述表达载体pNZ8110-hpaA-lysM包含以下元件：来自幽门螺杆菌的hpaA基因序列(见序列表中SEQ ID NO.3)、来自L.lactis基因组的lysM基因序列(见序列表中SEQID NO.2)、来自L.lactis表达载体pNZ8110的启动子Pnis、复制子repC和repA、Usp45蛋白信号肽序列ssusp45、氯霉素抗性基因cm及Nae Ⅰ、Sph Ⅰ、Xba Ⅰ等限制性内切酶的酶切位点。 

lysM是L.lactis自溶素（AcmA）的锚定区基因序列，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。在诱导剂Nisin作用下，表达载体pNZ8110-hpaA-lysM中的ssusp45、hpaA与lysM基因融合表达，ssusp45编码的信号肽引导融合蛋白分泌至胞外，lysM基因编码的锚定肽与细胞壁结合，从而使融合表达的HpaA蛋白展示于菌体表面。 

本发明的技术方案还采用了一种表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），于2012年5月16日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6115，分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis。 

表达幽门螺杆菌HpaA蛋白的重组乳酸乳球菌菌株，它是用乳酸乳球菌表达载体pNZ8110-hpaA-lysM转化L.lactis NZ3900得到的重组菌株，被命名为Lactococcus lactisNZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，具有表面展示表达幽门螺杆菌黏附素(HpaA)的功能。 

本发明还提供了核苷酸序列为SEQ ID NO.6的L.lactis表达载体pNZ8110-hpaA-lysM的构建方法。 

本发明还提供了L.lactis表达载体pNZ8110-hpaA-lysM的应用。尤其是应用pNZ8110-hpaA-lysM  与L. lactis NZ3900构建重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM。 

本发明通过实验证明，L.lactis表达载体pNZ8110-hpaA-lysM可通过以下方法构建并鉴定： 

1)根据Genbank数据库中幽门螺杆菌hpaA基因序列(Genbank：DQ353891)，利用生物软件Primer5.0设计PCR引物，上游引物P1的核苷酸序列为5’-CGTGCCG  GCATGAAAGCAAATAATC-3’，含有NaeI酶切位点，下游引物P2的核苷酸序列为5’-ACAT  GCATGCTTATCGGTTT CT-3’，含有SphI酶切位点。 

2)以幽门螺杆菌H.pylori MEL-HP27基因组DNA为模板，用PCR方法扩增幽门螺杆菌hpaA基因。采用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)从大肠杆菌(Escherichia coli）MC1061/pNZ8110-lysM菌株中提取表达载体pNZ8110-lysM。 

3)将hpaA基因用NaeⅠ+SphⅠ双酶切，并用同样酶双酶切L.lactis表达载体pNZ8110-lysM，酶切片段经琼脂糖电泳后进行纯化回收，将得到的hpaA基因和载体pNZ8110-lysM酶切片段用T4DNA连接酶连接。 

4)将上述hpaA基因与载体pNZ8110-lysM的连接产物用于转化大肠杆菌Escherichia coli MC1061菌株，利用载体含有的氯霉素抗性基因筛选阳性转化菌。培养筛选的阳性转化菌，采用常规碱裂解法从阳性转化菌中提取质粒，并进行酶切及测序鉴定，鉴定结果符合预期的重组质粒即为所构建的乳酸乳球菌表达载体，将其命名为pNZ8110-hpaA-lysM。 

5)制备L.lactis NZ3900菌株感受态细胞，应用电穿孔法将pNZ8110-hpaA-lysM转入L.lactis细胞，通过氯霉素抗性筛选阳性转化菌，用质粒提取试剂盒从阳性转化菌中提取质粒，对质粒进行PCR、酶切及测序鉴定，得到含有pNZ8110-hpaA-lysM的L.lactis NZ3900重组菌，将其命名为：L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM。 

6)为鉴定表达载体pNZ8110-hpaA-lysM具有在L.lactis菌体表面展示表达幽门螺杆菌HpaA蛋白的功能，培养菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，并用乳酸链球菌素(Nisin)诱导。提取细胞壁蛋白，用SDS-PAGE和Western blots法检测蛋白表达及其免疫活性。结果，应用Westernblots方法在细胞壁蛋中检测到表达的HpaA蛋白，而且重组表达的HpaA蛋白能够与幽门螺杆菌菌体裂解抗原(lysate antigens)免疫小鼠血清发生免疫反应。 

本发明通过实验证明，L.lactis表达载体pNZ8110-hpaA-lysM与重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM可应用于制备幽门螺杆菌口服疫苗、幽门螺杆菌感染免疫诊断试剂和食品加工。 

本发明具有以下有益效果： 

1)本发明构建的表达载体pNZ8110-hpaA-lysM能够在L.lactis中表达幽门螺杆菌蛋白HpaA，并使表达的重组蛋白与细胞壁结合，实现了在L.lactis菌体表面展示疫苗抗原HpaA的目的，目前尚无相同研究报道，这是幽门螺杆菌口服疫苗研究的一次技术进步。 

2)L.lactis重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM能有效表达幽门螺杆菌HpaA抗原，且表达的重组抗原HpaA可与小鼠抗幽门螺杆菌菌体抗原免疫血清反应，证实表达的HpaA蛋白有抗原活性，表明该L.lactis菌株在幽门螺杆菌疫苗研制中具有应用价值，有望应用于幽门螺杆菌疫苗的制备。 

3)L.lactis重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM表达的HpaA蛋白可与幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清发生免疫反应而与正常小鼠血清无免疫反应，表明该L.lactis菌株在幽门螺杆菌感染诊断试剂的制备中具有应用价值。 

4)L.lactis重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM能表达具有免疫活性的幽门螺杆菌疫苗抗原HpaA，表明此L.lactis菌株可用于生产具有预防和治疗幽门螺杆菌感染及相关胃肠疾病的保健食品，例如，将该菌作为发酵菌株，应用于乳制品发酵，生产具有预防幽门螺杆菌感染的酸奶等，有望产生非常可观的社会和经济效益。 

附图说明

图1为L.lactis表达载体pNZ8110-hpaA-lysM构建示意图； 

图2为幽门螺杆菌hpaA基因PCR扩增产物电泳图；图中1~4为hpaA基因扩增产物，5为DNAMarker； 

图3为重组菌Escherichia coli MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM菌液PCR鉴定电泳图；图中1为阴性对照，2,3,4为以MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM菌液为模板的PCR扩增产物，5为DNA Marker； 

图4为重组菌Escherichia coli MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM的质粒酶切鉴定电泳图；图中1为SphI酶切的pNZ8110-hpaA-lysM，2为SphI+NaeI酶切的pNZ8110-hpaA-lysM，3为SphI酶切的pNZ8110，4为hpaA基因PCR产物，5为DNA Marker； 

图5为诱导后L.lactis NZ3900/pNZ8110-HpaA-LvsM细胞壁蛋白及菌体全蛋白的SDS-PAGE电泳图；图中1,2,3,4分别是L.lactis NZ3900、L.lactis NZ3900/pNZ8110、L.lactis NZ3900/pNZ8110和L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株的细胞壁蛋白，图中5,6,7,8分别是L.lactis NZ3900、L.lactis NZ3900/pNZ8110、L.lactis NZ3900/pNZ8110和L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株的菌体总蛋白，9为Protein Marker； 

图6为L.lactis NZ3900/pNZ8110-HpaA-LysM表达HpaA蛋白与小鼠免疫血清的Westernblots分析；图中1,2,3是L.lactisNZ3900/pNZ8110-HpaA-LvsM细胞壁蛋白与小鼠免疫血清反应结果，4,5分别是L.lactis NZ3900和L.lactis NZ3900/pNZ8110菌株细胞壁蛋白与小鼠免疫血清反应结果，6是Protein Marker。 

具体实施方式

(一)本发明实验中使用的细菌菌株和质粒 

L.lactis NZ3900菌株(lacF^-,pepN::nisRnisK)购自荷兰NIZO Food Research(Kernhemseweg，Netherlands)。也可从德国Mobitec公司 

购得。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌种。 

大肠杆菌(Escherichia coli）MC1061/pNZ8110-lysM菌株是保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏日 期为2012年5月16日，保藏号为CGMCC NO.6116，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。采用含200ml/L甘油和10μg/ml氯霉素的LB液体培养基于-80℃保存该菌种。 

L.lactis表达载体pNZ8110购自荷兰NIZO Food Research(Kernhemseweg，Netherlands)。其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，含启动子Pnis、分泌信号肽序列ssusp45、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm等元件。 

幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori MEL-HP27为在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的菌株，保藏日期为2005年3月29号，保藏号为CGMCC NO.1338，分类命名为幽门螺杆菌Helicobacter pylori。幽门螺杆菌菌种保存方法属于公知技术。发明人采用100g/L的蔗糖溶液与等体积胎牛血清的混合液为菌株保存液，将菌株保存于-80℃冰箱。 

E.coli MC1061菌株(F^-araD139Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16Δ(lac)X74 rpsL(Str^r)hsdR2(r_K ^-m_K ⁺)mcrA mcrB1)是常用基因工程菌株，属于公知技术，可于美国Boca Scientifc Inc.公司或Sigma-Aldrich公司购得。 

(二)本发明实验中使用和涉及的培养基的配制 

⑴LB培养基 

LB液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠,溶于100ml蒸馏水中，用10mol/LNaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。 

LB固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠,1.5g琼脂粉，溶于100ml蒸馏水中，用10mol/LNaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板备用。 

⑵乳酸菌培养基 

GM₁₇培养基：称取4.25gM₁₇培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。 

GM₁₇培养基平板：称取4.25g GM₁₇培养基，1.5g琼脂粉，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/LNaOH调pH值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却至约60℃时加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L，混匀后将培养基倒入培养皿中，制成培养基平板。 

GSGM₁₇培养基：称取85.50g蔗糖，12.50g甘氨酸，18.63g M₁₇培养基，溶于400ml蒸馏水中，用10mol/LNaOH调pH值至7.2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。 

GM₁₇MC恢复培养基：称取3.73g M₁₇培养基，0.19g MgCl₂,0.02g CaCl₂，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/LNaOH调pH至7.2，定容至100ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。 

(3)幽门螺杆菌培养基 

布氏血平板培养基：称取大豆蛋白胨1.00g，胰蛋白胨1.00g，酵母浸出粉0.10g，氯化钠0.50g，亚硫酸钠0.01g，琼脂粉1.50g，加入蒸馏水100ml，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃左右时，加入羊血8ml，胎牛血清5ml，并加入下列4种抗生素：10mg/L万古霉素0.5ml，2mg/L两性霉素0.5ml，2500U/L多粘菌素0.1ml，5mg/L磺胺增效剂（TMP）0.2ml。混匀后倾倒入经高压灭菌的玻璃培养皿中。 

(三)本发明实验中使用的试剂 

M₁₇培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)、氯霉素(美国Amresco公司)、T₄DNA连接酶和限制性内切酶NaeI和SphI等(美国Fermentas公司)、凝胶回收试剂盒(杭州爱思进(AxyGen)生物科技有限公司)、质粒提取试剂盒和DNA markerⅢ(北京康为世纪科技有限公司)、RNA酶(RNaseA)和PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。 

未作特别说明的实验材料与方法属于公知技术，在生物技术领域常用工具书，例如，分子克隆实验指南(J萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)，中可查到。 

实施例1乳酸乳球菌表达载体pNZ8110-hpaA-lysM的构建 

乳酸乳球菌表达载体pNZ8110-hpaA-lysM的构建参见图1。 

1幽门螺杆菌基因组DNA的制备 

1.1采用布氏血平板培养基，于37℃，5%CO₂，微需氧条件下，培养幽门螺杆菌MEL-HP27菌株3～4d，用接种环刮取1~2环菌体，加入0.5ml灭菌去离子水和100μl100g/L SDS溶液，100℃煮沸5min。 

1.2加RNaseA（至终浓度50μg/ml）于37℃水浴作用1h，然后加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，于42℃水浴1h。 

1.3分别用等体积的苯酚、酚氯仿(苯酚与氯仿等体积混合物)、氯仿各抽提一次。 

1.4加入2倍体积冰预冷的无水乙醇和1/10体积2.5mol/L醋酸钠，于-20℃使DNA沉淀1h，15000r/min离心15min。 

1.5用75%无水乙醇洗涤沉淀两次，自然晾干，将DNA沉淀溶于100μl去离子水中，于-20℃保存备用。 

2.幽门螺杆菌hapA基因的PCR扩增 

2.1引物设计与合成 

根据Genbank数据库中幽门螺杆菌hpaA基因序列(Genbank:DQ353891)，利用生物软 件Primer5.0设计PCR引物，上游引物P1序列为5’-CGTGCCGGC ATGAAAGCAAATAATC-3’(SEQ ID NO.4)，含有Nae Ⅰ酶切位点，下游引物P2序列为5’-ACATGCATGCTTATCGGTTTCT-3’(SEQ ID NO.5)，含有SphⅠ酶切位点。 

2.2幽门螺杆菌hpaA基因的PCR扩增 

⑴PCR反应体系：参照PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明配制50μl反应体系：20μM的上游引物1μl，20μM的下游引物1μl，2×Taq PCR Master Mix 25μl，幽门螺杆菌基因组DNA模板2μl，加去离子水至50μl。 

⑵PCR循环条件：95℃预变性5min，94℃变性60s，50℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃延伸10min。 

⑶PCR产物分析：取3μl PCR反应产物，于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，电压为5V/cm，电泳20min，用凝胶图像分析仪分析电泳结果。 

3．大肠杆菌MC1061菌株感受态细胞的制备 

应用常规CaCl₂法制备大肠杆菌MC1061菌株感受态细胞[J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]。 

4．大肠杆菌中质粒pNZ8110-lysM的提取 

(1)从-80℃冰箱中取保种的大肠杆菌(Escherichia coli）MC1061/pNZ8110-lysM菌株，接种于含氯霉素10μg/ml的LB固体培养基，于30℃、5%CO₂培养箱中静置培养过夜(本发明说明书中过夜培养的时长为12h～14h)。 

(2)从培养板上挑取单菌落接种于5ml含10μg/ml氯霉素的LB液体培养基，于37℃培养箱中摇震培养12h，转速180r/min。 

(3)取3ml菌液，按常规大肠杆菌质粒提取方法(碱裂解法)[J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]提取质粒pNZ8110-lysM。将提取的质粒置于-20℃贮存。 

5.hpaA基因与表达载体pNZ8110-lysM的双酶切 

取PCR扩增得到hpaA基因及提取的质粒pNZ8110-lysM用限制性内切酶SphI和NaeI进行双酶切。酶切体系：质粒pNZ8110或hpaA基因25μl，10×Buffer 5μl，SphI1μl，NaeI 1μl，去离子水18μl。37℃酶切12h，65℃水浴20min灭活内切酶。取hpaA基因双酶切产物5μl于20g/L琼脂糖凝胶电泳，取质粒pNZ8110-lysM双酶切产物5μl用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。 

6.hpaA基因片段与质粒pNZ8110-lysM酶切产物的回收 

用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)回收酶切片段，步骤如下： 

⑴取50μl双酶切产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳20min，依据DNA Marker条带的相应位置，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用滤纸将凝胶表面液体吸干，然后装入1.5ml的洁净的EP管中，称其重量，根据凝胶重量估算凝胶体积（100mg的凝胶按100μl体积估算）； 

⑵加入3个凝胶体积的溶液DE-A，混合均匀后于75℃水浴，间断混合，直到凝胶完全熔化。 

⑶加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 

⑷将步骤三的混合液转移到DNA制备管中，12000r/min离心1min，弃滤液。 

⑸将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1,12000r/min离心30s，弃滤液。 

⑹将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2,12000r/min离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000r/min离心1min。 

⑺将制备管置回2ml离心管中，12000r/min离心1min。 

⑻将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl去离子水，室温静置1min。12000r/min离心2min洗脱DNA，DNA置于-20℃贮存。 

7.hpaA基因与表达载体pNZ8110-lysM的连接 

将凝胶回收得到的hpaA基因与乳酸乳球菌表达载体pNZ8110-lysM的双酶切产物进行连接。连接反应体系：10×Buffer 2μl，T₄DNA连接酶1μl，hpaA基因8μl，pNZ8110-lysM载体2μl，去离子水7μl。于16℃进行连接反应16h。 

8.大肠杆菌MC106感受态细胞的制备 

从LB培养基平板上挑选大肠杆菌MC106单菌落，接种到5ml LB液体培养基中，180r/min摇振过夜。取1ml菌液加入100ml LB液体培养基中，37℃，250r/min培养约80min，至对数生长期时，将菌液转移至两个50ml的聚丙烯管中，于冰中放置20min。于4℃，4000g离心10min，倒出上清。用10ml冰预冷的0.1M的CaCl₂重悬细菌，置于冰中30min。于4℃，4000g离心10min，倒出上清。每管中加4ml 0.1M的CaCl₂溶液，重悬细菌，按每管200μl菌液进行分装。4℃贮存，3天内使用。 

9.大肠杆菌Escherichia coli MC1061感受态细胞的转化 

（1）取10μl连接产物加入200μl大肠杆菌MC1061感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰水中放30min。 

（2）将1.5ml Ep管置于42℃水浴中，90s。 

（3）将管快速转移到冰浴中，冷却3min。 

（4）每管加800μl LB液体培养基，37℃水浴10min后，将管放入摇床，120r/min振荡培养45min使细菌复苏。 

（5）4000r/min离心5min，去除800μl液体培养基，剩余液体混匀后涂含10μg/ml氯霉素的LB固体培养板。室温放30min，使菌液吸收。 

（6）倒置平板培养，于37℃恒温培养箱中培养约16h。 

10.阳性转化菌的鉴定 

(1)菌液PCR鉴定 

从大肠杆菌转化菌筛选培养基平板上挑取单菌落，接种到5ml含10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h。以菌液为PCR模板，采用的前述PCR引物P1和P2扩增hpaA基因。PCR循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性60s，50℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃延伸10min。取3μl PCR反应产物，于10g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压为5V/cm，用DNAMarker做分子量标记，电泳20min，用凝胶图像分析仪分析电泳结果。 

(2)重组质粒的酶切鉴定 

采用常规大肠杆菌质粒提取法(碱裂解法)[J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，从培养的转化菌中提取重组质粒。分别采用SphⅠ单酶切和SphⅠ+NaeⅠ双酶切鉴定质粒。双酶切体系：质粒15μl，10×Buffer 5μl，SphI1μl，NaeI1μl，去离子水28μl。单酶切体系：质粒15μl，10×Buffer 5μl，Sph Ⅰ2μl，去离子水28μl。37℃酶切12h，65℃水浴20min灭活内切酶。取酶切产物5μl用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。 

(3)重组质粒的测序鉴定 

由上海捷瑞生物工程有限公司对重组质粒中hpaA基因进行测序，将测序结果与GenBank上公布的hpaA序列(Genbank:DQ353891)进行BLAST比对。 

结果如下： 

幽门螺杆菌hpaA的PCR扩增结果：以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增hpaA基因，取3μl PCR产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳，结果显示，PCR扩增片段长度与预期的hapA基因扩增产物长度(783bp)符合(图2)。 

以阳性转化菌菌液为模版，用引物P1和P2对hpaA基因进行PCR扩增，并用10g/L琼脂糖电泳分析PCR产物，结果显示扩增片段长度与预期长度一致（图3）。 

从阳性转化菌中提取重组质粒，分别进行SphⅠ单酶切和NaeⅠ+SphⅠ双酶切，酶切产物用10g/L琼脂糖电泳分析，结果显示，重组质粒单酶切和双酶切片段长度均与预期一致（图4），进一步证实hapA基因正确***表达载体pNZ8110-lysM中。 

对从阳性转化菌中提取的重组质粒进行测序鉴定，结果显示，重组质粒中包含hpaA基因序列(SEQ ID NO.3)，测序得到的hpaA基因序列(SEQ ID NO.3)与Genbank上公布的hpaA基因序列(Genbank:DQ353891)一致，证实该重组质粒即为构建成功的乳酸乳球菌表达载体，将此表达载体命名为：pNZ8110-hpaA-lysM，包含此表达载体的重组大肠杆菌命名为：E.coli MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM。采用含200ml/L甘油和10μg/ml氯霉素的LB培养基于-80℃保存该菌株。 

实施例2构建L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 

1.乳酸乳球菌L.lactis NZ3900菌株感受态细胞的制备 

(1)从-80℃保存的L.lactis NZ3900菌种管中取200μl菌液接种于5ml GSGM₁₇培养基中，放入CO₂培养箱，30℃、5%CO₂静置过夜培养； 

(2)将过夜培养的5ml菌液加入50ml GSGM₁₇培养基中,30℃、5%CO₂静置培养12h~14h； 

(3)将培养的50ml菌液加入400ml GSGM₁₇培养基中，30℃、5%CO₂静置培养至OD₆₀₀约为0.3； 

(4)将菌液于4℃、4000r/min离心20min，收集菌体； 

(5)用冰冷的400ml的洗液I（0.5mol/L蔗糖，100ml/L甘油）洗涤一次，4000r/min、4℃离心20min，收集菌液； 

(6)用冰冷的200ml洗液II（0.5mol/L蔗糖，100ml/L甘油，50mM EDTA）重悬菌体，冰上静置15min；4000r/min、4℃离心20min，收集菌体； 

(7)再用冰冷的洗液I（0.5mol/L蔗糖，100ml/L甘油）100ml重悬菌体，4000r/min、4℃离心20min，收集菌体； 

(8)用4ml冰冷的洗液I（0.5mol/L蔗糖，100ml/L甘油）悬浮菌体，分装入事先冰浴的0.5ml EP管中，每管40μl，储存于-80℃。 

2.L.lactis NZ3900菌株的转化 

将1μl重组质粒pNZ8110-hpaA-lysM(10ng~20ng)与40μl NZ3900感受态细胞混合，转入用冰预冷的0.2cm电转化杯中，设置电击参数为2.0KV、25μF、200Ω，用纸巾擦干 电转化杯金属电极片上水分，然后将转化杯置于电击槽中电击。电击后立即加入800μlGM₁₇MC恢复培养基，冰浴5min后转入1.5ml EP管中，恢复培养2h，将菌液涂布于含氯霉素的GM₁₇培养板上，待菌液被吸收后，于30℃、5%CO₂培养箱中静置培养40h，筛选鉴定阳性转化菌。 

3.乳酸乳球菌转化菌的鉴定 

从筛选阳性转化菌的含10μg/ml氯霉素的GM₁₇培养板上挑取单菌落接种于5ml液体GM₁₇培养基，于30℃、5%CO₂培养箱中静置培养12h。取3ml菌液，用于质粒提取。 

乳酸乳球菌转化菌中质粒的提取既可参照L.lactis NZ3900菌株供应商提供的技术资料，也可使用高纯度质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，按如下方法完成： 

(1)将上述所取的3ml菌液，加入离心管中，13000r/min离心1min，弃上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1和100μl 100mg/ml的溶菌酶，使用涡旋振荡器悬浮细菌沉淀。 

(2)向离心管中加入250μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4~6次，使菌体充***解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过5min，以免质粒受损伤。 

(3)向离心管中加入350μl BufferN3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，此时出现白色絮状沉淀。13000r/min离心10min，吸取上清，加入到已装入Collection Tube的Spin ColumnCM中。 

(4)13000r/min离心30-60s，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM放回Collection Tube中。向Spin Column CM加入500μl Buffer PB，13000r/min离心30~60s，倒掉Collection Tube中的废液，将SpinColumn CM重新放回Collection Tube中。 

(5)向Spin Column CM中加入700μl Buffer PW，13000r/min离心30~60s，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM重新放回收Collection Tube中。向Spin Column CM中加入500μl Buffer PW，13000r/min离心1min，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM重新放回收Collection Tube中。 

(6)13000r/min离心1min，倒掉废液。将Spin Column CM置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的Buffer PW。将Spin Column CM置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl Buffer EB，室温放置1~2分钟，13000r/min离心1min，将质粒收集到离心管中，用于以下酶切和测序鉴定。 

采用实施例1中鉴定重组质粒(pNZ8110-hpaA-lysM)的方法对从乳酸转化菌转化菌中提取的质粒进行酶切和测序鉴定，酶切体系和反应条件相同。 

结果如下： 

对从乳酸乳球菌阳性转化菌中提取的质粒进行酶切和测序鉴定的结果与实施例1中对重组质粒pNZ8110-hpaA-lysM的鉴定结果相同，表明得到的阳性转菌中为含有重组质粒pNZ8110-hpaA-lysM重组乳酸乳球菌菌株，将该菌株命名为：L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM(保藏编号为CGMCC NO.6115)。采用含150ml/L甘油和10μg/ml氯霉素的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌株。 

实施例3重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110的制备 

重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110的制备可以参照L.lactis NZ3900菌株销售方荷兰NIZO Food Research或德国Mobitec公司提供的技术方法，也可采用以下方法： 

1.制备L.lactis NZ3900感受态细胞 

方法同实施例2。 

2.电转化L.lactis NZ3900菌株感受态细胞 

取1μl表达载体pNZ8110(10ng~20ng)与40μlL.lactis NZ3900感受态细胞混合，电转化L.lactis和阳性转化菌的筛选方法参见实施例2。 

3.L.lactis阳性转化菌的鉴定 

3.1从筛选阳性转化菌的含10μg/ml氯霉素的GM₁₇培养板上挑取单菌落接种于5ml液体GM₁₇培养基，于30℃、5%CO₂培养箱中静置培养12h。取3ml菌液，参照实施例2的方法从乳酸乳球菌转化菌中提取质粒。 

3.2分别用NaeI和Sph Ⅰ单酶切提取的质粒。NaeI酶切体系为：NaeI1μl、10×Buffer 2μl、质粒10μl、去离子水9μl。37℃酶切4h。Sph Ⅰ酶切体系为：SphI Ⅰ1μl、10×Buffer 2μl、质粒10μl、去离子水9μl。37℃酶切4h。酶切产物用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳分析。 

结果显示：从筛选的阳性转化菌中提取的质粒经酶切得到片段长度与预期片段长度3459bp符合，证明该阳性转化菌为构建正确的重组L.lactis菌株，将其命名为：L.lactisNZ3900/pNZ8110。采用含150ml/L甘油和10μg/ml氯霉素的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌株。 

实施例4幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清的制备 

1.幽门螺杆菌菌体裂解抗原(lysate antigens)的制备 

采用布氏血平板培养基，于37℃，5%CO₂，微需氧条件下，培养幽门螺杆菌H.pylori  MEL-HP27菌株3～4天。将培养的幽门螺杆菌刮入生理盐水中，混匀后离心去上清。用6mlPBS（10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4）重悬细菌，进行超声破碎，条件为：300w，超声10s，间歇10s，共30次。超声破碎物于4℃，8000g离心30min，取上清测定总蛋白浓度，调整蛋白浓度为0.5μg/μl。为制备初次免疫抗原，取2ml浓度为0.5μg/μl幽门螺杆菌菌体裂解抗原与2ml弗氏完全佐剂混匀后，进行超声乳化，条件为：200w，10s，间歇1min，共4次。为制备加强免疫抗原，取2ml浓度为0.5μg/μl的幽门螺杆菌菌体裂解抗原与2ml弗氏不完全佐剂混匀后，进行超声乳化，条件为：200w，10s，间歇1min，共4次。 

2.免疫小鼠 

选择8周龄的Balb/c小鼠10只，第1周，每只小鼠两只后腿和腹腔注射初次免疫抗原200μl（约含总蛋白50μg），分别在第2周、第3周、第4周以同样的方式注射加强免疫抗原（200μl/次/只，约含总蛋白50μg）各1次。 

3.采集血清与抗体检测 

最后1次免疫后1周，摘眼球取血，分离血清，-20℃保存备用。 

通过Westernblots，检测到制备的小鼠免疫血清与幽门螺杆菌菌体裂解抗原呈阳性反应，证明免疫血清制备成功。也可采用常规ELISA方法测定免疫血清抗体滴度[J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]。 

实施例5L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM的诱导表达与免疫鉴定 

1.诱导剂乳酸链球菌素Nisin的配制（10mg/ml） 

称取纯度为2.5%(W/W)的Nisin干粉0.20g，溶于0.5ml 0.5ml/L的乙酸溶液中，振荡数分钟促进溶解，12000r/min离心10min，取上清即为10mg/ml Nisin储存液。临用前用去离子水稀释至10μg/ml备用。 

2.菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM的活化 

取-80℃冻存的菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM划线接种于含氯霉素10μg/ml的GM₁₇固体培养板上，于30℃、5%CO₂培养箱中静置培养40h。挑取单菌落接种于4ml含10μg/ml氯霉素的GM₁₇液体培养基中，于30℃、5%CO₂培养箱中静置培养12h，即成为活化种子菌液。 

3．菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM的诱导表达 

取活化的种子菌液400μl转种于10ml含10μg/ml氯霉素的GM₁₇液体培养基，37℃ 静止培养至OD₆₀₀为0.3～0.4时，加入Nisin工作液至终浓度为40ng/ml，诱导5h。同时以菌株L.lactis NZ3900和L.lactis NZ3900/pNZ8110为阴性对照。 

4.L.lactis细胞壁蛋白的提取 

取诱导后的菌液10ml，于4℃、4300g离心5min，弃上清，留取菌体细胞沉淀；菌体沉淀用TES缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)洗涤两次；菌体用200μlTES-LMR缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，20%蔗糖，30mg/ml溶菌酶，0.1mg/mlRNase A，pH7.4)悬浮；于37℃温浴3h，期间混匀数次，使TES-LMR充分消化细胞壁；于4℃、25000g离心10min，取上清，菌体沉淀保存备用；上清液中加入用冰预冷的80%三氯醋酸水溶液(V/V)50μl，使其终浓度为16%，以沉淀细胞壁释放的蛋白质。冰浴20min，4℃、11500g离心10min，弃上清液；沉淀用100μl 50mM NaOH悬浮，4℃作用12h后离心取上清。 

5.L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM表达蛋白的SDS-PAGE分析 

参照文献[J.萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，操作步骤如下： 

5.1取2μl蛋白提取物用Bradford法测定OD₅₉₅，从标准曲线上查找相应蛋白质量，即可计算出蛋白浓度。取相同的蛋白量分别加入2×上样缓冲液，100℃煮5min，冷却后进行SDS-PAGE电泳。 

5.2制备分离胶和浓缩胶：配制12%分离胶，混匀后加入凝胶板中，室温聚合约1h；配制5%浓缩胶，混合均匀后灌胶，放置样品梳，室温聚合约30min。 

5.3上样及电泳：取相同蛋白量的各个样品行SDS-PAGE电泳，电泳缓冲液为1×甘氨酸缓冲液，浓缩胶中电泳电压为80V，待溴酚蓝电泳至浓缩胶与分离胶交界时，更换电压为120V，待溴酚蓝电泳至凝胶下缘时停止电泳。 

6.重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM表达蛋白的免疫学鉴定 

采用Western blots方法，参照文献[J.萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，具体步骤如下： 

6.1转膜：实施例4的SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶取出，用去离子水漂洗10min，然后放在转移液中平衡10min；剪与胶大小相同的硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)一张和两张稍小的超厚滤纸，放入转移缓冲液，浸泡15min，浸泡好后，取出凝胶、硝酸纤维素膜和滤纸，从下往上依次为超厚滤纸、NC膜、凝胶、超厚滤纸，放入Bio-Rad半干式电转仪中，转膜条件为18V、10min。 

6.2封闭：转印后，硝酸纤维素膜用PBS（10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4）漂洗一次，然后将硝酸纤维素膜置于封闭液(含20g/L脱脂奶粉的PBS)中，室温缓慢摇动封闭2h，封闭后，用PBS洗涤3次，每次漂洗10min。 

6.3一抗反应：免疫血清用封闭液1:100稀释，硝酸纤维素膜置于稀释后的免疫血清中，37℃孵育1h。用PBS洗3次，每次漂洗10min。再用TBS（0.15mM NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 7.5）漂洗3次，每次持续10min； 

6.4二抗反应：在硝酸纤维素膜上加入用含20g/L脱脂奶粉的TBS稀释过的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃1h，用TBS溶液漂洗3次，每次10min； 

6.5显色：将硝酸纤维素膜放入平皿中，用DBA显色试剂盒(北京康为世纪科技有限公司)进行显色，参照产品说明书，步骤为：取1ml试剂B入到1.5ml离心管中，再向离心管中加入50μl试剂A，混匀后，将混合液滴加在硝酸纤维素膜上，显色1~5min，显色后把膜放入到去离子水中浸泡，终止反应。 

结果如下： 

SDS-PAGE结果显示，重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM与对照菌株L.lactis NZ3900、L.lactis NZ3900/pNZ8110在菌体总蛋白和细胞壁蛋白电泳图谱上均无显著差异(图5)，可能与菌体蛋白组分复杂、与目的蛋白分子量相近的背景蛋白呈高表达及SDS-PAGE分析的敏感性较低等因素有关。 

Western blots结果显示：在乳酸乳球菌重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM细胞壁蛋白图谱中，在预期位置（29KD）出现明显的杂交带，而阴性对照菌株L.lactis NZ3900和L.lactis NZ3900/pNZ8110在相应位置均无杂交条带(图6)。结果表明，乳酸乳球菌重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM能够于菌体胞壁展示表达HpaA蛋白，而且该表达蛋白具有幽门螺杆菌HpaA抗原的免疫活性。 

实施例6L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株在制备口服疫苗中的应用 

L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株在制备口服疫苗中的应用包括： 

将该重组菌株用于制备防治幽门螺杆菌感染及相关疾病的口服疫苗。此类应用的一种可行的技术方案是：培养重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ811O–hpaA-lysM，通过Nisin诱导使菌体表面展示表达幽门螺杆菌疫苗抗原，将菌液制成适合人类口服的剂型，制剂被人类口服后可产生预防幽门螺杆菌感染的免疫作用。 

实施例7L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株在制备免疫诊断试剂的应用 

方案1：培养L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株；用诱导剂Nisin诱导hpaA基因表达；菌液经离心，分离得到菌体，用10ml/L甲醛溶液固定后，于4℃贮存备用；取适量菌体，加入待检测血清，37℃温育2h，用PBS液（10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4）洗涤菌体3次；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37℃温育2h，用TBS液（0.15mM NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 7.5）洗菌体3次；加酶的底物(如DAB)显色；菌液经离心后取上清，用分光度计测定菌液上清的OD值，以乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8110菌体为阴性对照，设立阳性反应判定标准，确定检测结果。普通ELISA检测血清抗体时需要先用抗原包被ELISA反应孔，因此耗时较长，操作较繁琐。该方案无需用抗原包被ELISA反应孔，免疫反应可以在普通0.5ml Ep管中完成，不依赖ELISA反应板，在技术上有实质性的特点和显著进步。 

方案2：体外培养乳酸乳球菌重组菌株NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，用诱导剂诱导hpaA基因表达；菌液经离心处理分离出菌体，含1%甲醛的PBS液固定菌体，于4℃贮存备用；取适量菌体，加入待检测血清，37温育2h，用PBS液洗菌体3次；加入荧光标记羊抗人IgG抗体37℃温育2h，用PBS缓冲液洗菌体3次；通过流式细胞术检测荧光染色的菌体；由于检测到特异性荧光染色菌体，能反映待检血清中抗HpaA抗体的存在，因此该方案可为诊断幽门螺杆菌感染提供免疫学依据。该方案用表面携带抗原(HpaA)的乳酸乳球菌菌体代替流式细胞分析(免疫磁珠法或液相芯片法)中的免疫磁珠，用于检测血清中的抗体，可以避免制备免疫标记磁珠的繁琐步骤，可显著减少检测成本，具有独特的优势，符合该领域技术发展的趋势。 

实施例8L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株在食品加工中的应用 

取适量乳酸乳球菌重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，作为发酵菌株，用于乳制品或其它食品加工工艺中，使产品具有预防幽门螺杆菌感染及其相关疾病的有益作用。该菌株的此类应用可望为我国食品工业尤其是乳制品工业发展产生促进作用，产生巨大社会和经济效益。 

序列表 

SEQUENCE LISTING 

<110>  郑州大学 

<120>  在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体及其制备方法和应用 

<160>  6 

<170>  PatentIn version 3.5 

<210>  1 

<211>  3709 

<212>  DNA 

<213>  人工序列 

<221>  pNZ8110-lysM 

<222>  (1)..(3709) 

<400>  1 

agatctagtc ttataactat actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa    60 

ttctatcttg agaaagtatt ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg    120 

gctctgatta aattctgaag tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa    180 

taaattataa ggaggcactc accatggcta aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt    240 

ctacagtgat actttctgct gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgccggc tgcagccggc    300 

gtaaacacct gacaacgggg ctgcaggcat gcgacggacg gagcttcttc agctggaaat    360 

actaattctg gtggctcgac aaccacaatt acgaataata attctggaac caatagcagt    420 

tcaactactt ataccgtcaa atctggtgat actctttggg gaatctcaca aagatatgga    480 

attagtgtcg ctcaaattca aagtgcgaat aatcttaaaa gtaccattat ctacattggt    540 

caaaaacttg tactgacagg ttcagcttct tctacaaatt caggtggttc ataatctaga    600 

gagctcaagc tttctttgaa ccaaaattag aaaaccaagg cttgaaacgt tcaattgaaa    660 

tggcaattaa acaaattaca gcacgtgttg ctttgattga tagccaaaaa gcagcagttg    720 

ataaagcaat tactgatatt gctgaaaaat tgtaatttat aaataaaaat caccttttag    780 

aggtggtttt tttatttata aattattcgt ttgatttcgc tttcgataga acaatcaaag    840 

cgagaataag gaagataaat cccataaggg cgggagcaga atgtccgaga ctaatgtaaa    900 

tttgtccacc aattaaagga ccgataacgc gagcttctcg agtgcatatt ttcggcaatc    960 

ttctcaatga gatgctcttc agcatgttca atgatgtcga ttttttatta aaacgtctca    1020 

aaatcgtttc tgagacgttt tagcgtttat ttcgtttagt tatcggcata atcgttaaaa    1080 

caggcgttat cgtagcgtaa aagcccttga gcgtagcgtg ctttgcagcg aagatgttgt    1140 

ctgttagatt atgaaagccg atgactgaat gaaataataa gcgcagcgtc cttctatttc    1200 

ggttggagga ggctcaaggg agtttgaggg aatgaaattc cctcatgggt ttgattttaa    1260 

aaattgcttg caattttgcc gagcggtagc gctggaaaat ttttgaaaaa aatttggaat    1320 

ttggaaaaaa atggggggaa aggaagcgaa ttttgcttcc gtactacgac cccccattaa    1380 

gtgccgagtg ccaatttttg tgccaaaaac gctctatccc aactggctca agggtttgag    1440 

gggtttttca atcgccaacg aatcgccaac gttttcgcca acgtttttta taaatctata    1500 

tttaagtagc tttattgttg tttttatgat tacaaagtga tacactaatt ttataaaatt    1560 

atttgattgg agttttttaa atggtgattt cagaatcgaa aaaaagagtt atgatttctc    1620 

tgacaaaaga gcaagataaa aaattaacag atatggcgaa acaaaaaggt ttttcaaaat    1680 

ctgcggttgc ggcgttagct atagaagaat atgcaagaaa ggaatcagaa caaaaaaaat    1740 

aagcgaaagc tcgcgttttt agaaggatac gagttttcgc tacttgtttt tgataaggta    1800 

atatatcatg gctattaaaa atactaaagc tagaaatttt ggatttttat tatatcctga    1860 

ctcaattcct aatgattgga aagaaaaatt agagagtttg ggcgtatcta tggctgtcag    1920 

tcctttacac gatatggacg aaaaaaaaga taaagataca tggaatagta gtgatgttat    1980 

acgaaatgga aagcactata aaaaaccaca ctatcacgtt atatatattg cacgaaatcc    2040 

tgtaacaata gaaagcgtta ggaacaagat taagcgaaaa ttggggaata gttcagttgc    2100 

tcatgttgag atacttgatt atatcaaagg ttcatatgaa tatttgactc atgaatcaaa    2160 

ggacgctatt gctaagaata aacatatata cgacaaaaaa gatattttga acattaatga    2220 

ttttgatatt gaccgctata taacacttga tgaaagccaa aaaagagaat tgaagaattt    2280 

acttttagat atagtggatg actataattt ggtaaataca aaagatttaa tggcttttat    2340 

tcgccttagg ggagcggagt ttggaatttt aaatacgaat gatgtaaaag atattgtttc    2400 

aacaaactct agcgccttta gattatggtt tgagggcaat tatcagtgtg gatatagagc    2460 

aagttatgca aaggttcttg atgctgaaac gggggaaata aaatgacaaa caaagaaaaa    2520 

gagttatttg ctgaaaatga ggaattaaaa aaagaaatta aggacttaaa agagcgtatt    2580 

gaaagataca gagaaatgga agttgaatta agtacaacaa tagatttatt gagaggaggg    2640 

attattgaat aaataaaagc ccccctgacg aaagtcgacg gcaatagtta cccttattat    2700 

caagataaga aagaaaagga tttttcgcta cgctcaaatc ctttaaaaaa acacaaaaga    2760 

ccacattttt taatgtggtc tttattcttc aactaaagca cccattagtt caacaaacga    2820 

aaattggata aagtgggata tttttaaaat atatatttat gttacagtaa tattgacttt    2880 

taaaaaagga ttgattctaa tgaagaaagc agacaagtaa gcctcctaaa ttcactttag    2940 

ataaaaattt aggaggcata tcaaatgaac tttaataaaa ttgatttaga caattggaag    3000 

agaaaagaga tatttaatca ttatttgaac caacaaacga cttttagtat aaccacagaa    3060 

attgatatta gtgttttata ccgaaacata aaacaagaag gatataaatt ttaccctgca    3120 

tttattttct tagtgacaag ggtgataaac tcaaatacag cttttagaac tggttacaat    3180 

agcgacggag agttaggtta ttgggataag ttagagccac tttatacaat ttttgatggt    3240 

gtatctaaaa cattctctgg tatttggact cctgtaaaga atgacttcaa agagttttat    3300 

gatttatacc tttctgatgt agagaaatat aatggttcgg ggaaattgtt tcccaaaaca    3360 

cctatacctg aaaatgcttt ttctctttct attattcctt ggacttcatt tactgggttt    3420 

aacttaaata tcaataataa tagtaattac cttctaccca ttattacagc aggaaaattc    3480 

attaataaag gtaattcaat atatttaccg ctatctttac aggtacatca ttctgtttgt    3540 

gatggttatc atgcaggatt gtttatgaac tctattcagg aattgtcaga taggcctaat    3600 

gactggcttt tataatatga gataatgccg actgtacttt ttacagtcgg ttttctaatg    3660 

tcactaacct gccccgttag ttgaagaagg tttttatatt acagctcca                3709 

<210>  2 

<211>  266 

<212>  DNA 

<213>  人工序列 

<221>  lysM 

<222>  (1)..(266) 

<400>  2 

atgcgacgga cggagcttct tcagctggaa atactaattc tggtggctcg acaaccacaa    60 

ttacgaataa taattctgga accaatagca gttcaactac ttataccgtc aaatctggtg    120 

atactctttg gggaatctca caaagatatg gaattagtgt cgctcaaatt caaagtgcga    180 

ataatcttaa aagtaccatt atctacattg gtcaaaaact tgtactgaca ggttcagctt    240 

cttctacaaa ttcaggtggt tcataa                                         266 

<210>  3 

<211>  783 

<212>  DNA 

<213>  Helicobacter pylori 

<221>  hpaA 

<222>  (1)..(783) 

atgaaagcaa ataatcattt taaagatttt gcatggaaaa aatgcctttt aggcgcgagc    60 

gtggtggctt tgttagtggg atgcagtccg catattattg aaaccaatga agtcgctttg    120 

aaattgaatt accatccagc tagcgagaaa gttcaagcgt tagatgaaaa gattttactt    180 

ttaaagccag cttttcaata cagcgataat attgctaaag agtatgaaaa caaattcaag    240 

aatcaaacca cgctcaaggt tgaacagatt ttgcaaaatc agggctataa ggttattaat    300 

gtagatagca gcgataaaga cgatctttct tttgcgcaaa aaaaagaagg gtatttggcc    360 

gttgctatga gtggcgaaat tgttttacgc cccgatccta aaagaaccac acagaaaaaa    420 

tcagaacccg ggttattatt ctccactggt ttggataaaa tggaaggggt tttaatcccg    480 

gccgggttta tcaaggttac catattagag cctatgagtg gggaatcttt agattctttt    540 

acgatggatt tgagcgagtt ggacattcaa gaaaaattct taaaaaccac ccattcaagc    600 

catagcgggg ggttagttag cactatggtt aagggaacgg ataattctaa tgatgcgatc    660 

aagagcgctt tgaataagat ttttgcaaat atcatgcaag aaatagacaa aaagctcact    720 

caaaagaatt tagaatctta tcaaaaagac gctaaggaat tgaaaaacaa gagaaaccga    780 

taa                                                                  783 

<210>  4 

<211>  25 

<212>  DNA 

<213>  人工序列 

<221>  引物P1 

<222>  (1)..(25) 

<400>  4 

cgtgccggca tgaaagcaaa taatc                                          25 

<210>  5 

<211>  22 

<212>  DNA 

<213>  人工序列 

<221>  引物P2 

<222>  (1)..(22) 

acatgcatgc ttatcggttt ct                                             22 

<210>  6 

<211>  4456 

<212>  DNA 

<213>  人工序列 

<221>  pNZ8110-hpaA-lysM 

<222>  (1)..(4456) 

agatctagtc ttataactat actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa    60 

ttctatcttg agaaagtatt ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg    120 

gctctgatta aattctgaag tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa    180 

taaattataa ggaggcactc accatggcta aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt    240 

ctacagtgat actttctgct gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgccggc atgaaagcaa    300 

ataatcattt taaagatttt gcatggaaaa aatgcctttt aggcgcgagc gtggtggctt    360 

tgttagtggg atgcagtccg catattattg aaaccaatga agtcgctttg aaattgaatt    420 

accatccagc tagcgagaaa gttcaagcgt tagatgaaaa gattttactt ttaaagccag    480 

cttttcaata cagcgataat attgctaaag agtatgaaaa caaattcaag aatcaaacca    540 

cgctcaaggt tgaacagatt ttgcaaaatc agggctataa ggttattaat gtagatagca    600 

gcgataaaga cgatctttct tttgcgcaaa aaaaagaagg gtatttggcc gttgctatga    660 

gtggcgaaat tgttttacgc cccgatccta aaagaaccac acagaaaaaa tcagaacccg    720 

ggttattatt ctccactggt ttggataaaa tggaaggggt tttaatcccg gccgggttta    780 

tcaaggttac catattagag cctatgagtg gggaatcttt agattctttt acgatggatt    840 

tgagcgagtt ggacattcaa gaaaaattct taaaaaccac ccattcaagc catagcgggg    900 

ggttagttag cactatggtt aagggaacgg ataattctaa tgatgcgatc aagagcgctt    960 

tgaataagat ttttgcaaat atcatgcaag aaatagacaa aaagctcact caaaagaatt    1020 

tagaatctta tcaaaaagac gctaaggaat tgaaaaacaa gagaaaccga taagcatgcg    1080 

acggacggag cttcttcagc tggaaatact aattctggtg gctcgacaac cacaattacg    1140 

aataataatt ctggaaccaa tagcagttca actacttata ccgtcaaatc tggtgatact    1200 

ctttggggaa tctcacaaag atatggaatt agtgtcgctc aaattcaaag tgcgaataat    1260 

cttaaaagta ccattatcta cattggtcaa aaacttgtac tgacaggttc agcttcttct    1320 

acaaattcag gtggttcata atctagagag ctcaagcttt ctttgaacca aaattagaaa    1380 

accaaggctt gaaacgttca attgaaatgg caattaaaca aattacagca cgtgttgctt    1440 

tgattgatag ccaaaaagca gcagttgata aagcaattac tgatattgct gaaaaattgt    1500 

aatttataaa taaaaatcac cttttagagg tggttttttt atttataaat tattcgtttg    1560 

atttcgcttt cgatagaaca atcaaagcga gaataaggaa gataaatccc ataagggcgg    1620 

gagcagaatg tccgagacta atgtaaattt gtccaccaat taaaggaccg ataacgcgag    1680 

cttctcgagt gcatattttc ggcaatcttc tcaatgagat gctcttcagc atgttcaatg    1740 

atgtcgattt tttattaaaa cgtctcaaaa tcgtttctga gacgttttag cgtttatttc    1800 

gtttagttat cggcataatc gttaaaacag gcgttatcgt agcgtaaaag cccttgagcg    1860 

tagcgtgctt tgcagcgaag atgttgtctg ttagattatg aaagccgatg actgaatgaa    1920 

ataataagcg cagcgtcctt ctatttcggt tggaggaggc tcaagggagt ttgagggaat    1980 

gaaattccct catgggtttg attttaaaaa ttgcttgcaa ttttgccgag cggtagcgct    2040 

ggaaaatttt tgaaaaaaat ttggaatttg gaaaaaaatg gggggaaagg aagcgaattt    2100 

tgcttccgta ctacgacccc ccattaagtg ccgagtgcca atttttgtgc caaaaacgct    2160 

ctatcccaac tggctcaagg gtttgagggg tttttcaatc gccaacgaat cgccaacgtt    2220 

ttcgccaacg ttttttataa atctatattt aagtagcttt attgttgttt ttatgattac    2280 

aaagtgatac actaatttta taaaattatt tgattggagt tttttaaatg gtgatttcag    2340 

aatcgaaaaa aagagttatg atttctctga caaaagagca agataaaaaa ttaacagata    2400 

tggcgaaaca aaaaggtttt tcaaaatctg cggttgcggc gttagctata gaagaatatg    2460 

caagaaagga atcagaacaa aaaaaataag cgaaagctcg cgtttttaga aggatacgag    2520 

ttttcgctac ttgtttttga taaggtaata tatcatggct attaaaaata ctaaagctag    2580 

aaattttgga tttttattat atcctgactc aattcctaat gattggaaag aaaaattaga    2640 

gagtttgggc gtatctatgg ctgtcagtcc tttacacgat atggacgaaa aaaaagataa    2700 

agatacatgg aatagtagtg atgttatacg aaatggaaag cactataaaa aaccacacta    2760 

tcacgttata tatattgcac gaaatcctgt aacaatagaa agcgttagga acaagattaa    2820 

gcgaaaattg gggaatagtt cagttgctca tgttgagata cttgattata tcaaaggttc    2880 

atatgaatat ttgactcatg aatcaaagga cgctattgct aagaataaac atatatacga    2940 

caaaaaagat attttgaaca ttaatgattt tgatattgac cgctatataa cacttgatga    3000 

aagccaaaaa agagaattga agaatttact tttagatata gtggatgact ataatttggt    3060 

aaatacaaaa gatttaatgg cttttattcg ccttagggga gcggagtttg gaattttaaa    3120 

tacgaatgat gtaaaagata ttgtttcaac aaactctagc gcctttagat tatggtttga    3180 

gggcaattat cagtgtggat atagagcaag ttatgcaaag gttcttgatg ctgaaacggg    3240 

ggaaataaaa tgacaaacaa agaaaaagag ttatttgctg aaaatgagga attaaaaaaa    3300 

gaaattaagg acttaaaaga gcgtattgaa agatacagag aaatggaagt tgaattaagt    3360 

acaacaatag atttattgag aggagggatt attgaataaa taaaagcccc cctgacgaaa    3420 

gtcgacggca atagttaccc ttattatcaa gataagaaag aaaaggattt ttcgctacgc    3480 

tcaaatcctt taaaaaaaca caaaagacca cattttttaa tgtggtcttt attcttcaac    3540 

taaagcaccc attagttcaa caaacgaaaa ttggataaag tgggatattt ttaaaatata    3600 

tatttatgtt acagtaatat tgacttttaa aaaaggattg attctaatga agaaagcaga    3660 

caagtaagcc tcctaaattc actttagata aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt    3720 

aataaaattg atttagacaa ttggaagaga aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa    3780 

caaacgactt ttagtataac cacagaaatt gatattagtg ttttataccg aaacataaaa    3840 

caagaaggat ataaatttta ccctgcattt attttcttag tgacaagggt gataaactca    3900 

aatacagctt ttagaactgg ttacaatagc gacggagagt taggttattg ggataagtta    3960 

gagccacttt atacaatttt tgatggtgta tctaaaacat tctctggtat ttggactcct    4020 

gtaaagaatg acttcaaaga gttttatgat ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat    4080 

ggttcgggga aattgtttcc caaaacacct atacctgaaa atgctttttc tctttctatt    4140 

attccttgga cttcatttac tgggtttaac ttaaatatca ataataatag taattacctt    4200 

ctacccatta ttacagcagg aaaattcatt aataaaggta attcaatata tttaccgcta    4260 

tctttacagg tacatcattc tgtttgtgat ggttatcatg caggattgtt tatgaactct    4320 

attcaggaat tgtcagatag gcctaatgac tggcttttat aatatgagat aatgccgact    4380 

gtacttttta cagtcggttt tctaatgtca ctaacctgcc ccgttagttg aagaaggttt    4440 

ttatattaca gctcca                                                    4456 

Claims (7)

1.一种在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体，其特征在于：包含有SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。

2.一种表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，其特征在于：保藏编号为CGMCC NO.6115。

3.一种如权利要求1所述的在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，用PCR方法得到幽门螺杆菌黏附素(HpaA)基因hpaA(SEQ ID NO.3)；

2)将得到的hpaA基因与表达载体pNZ8110-lysM(SEQ ID NO.1)经酶切后进行连接，连接产物用于转化大肠杆菌Escherichia coli MC1061感受态细胞；

3)筛选阳性转化菌，从阳性转化菌中提取质粒，酶切和测序鉴定结果与预期符合的质粒即为在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体，将其命名为pNZ8110-hpaA-lysM；

4)用电穿孔法将pNZ8110-hpaA-lysM导入乳酸乳球菌NZ3900菌株，经筛选和鉴定得到重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM；

5)培养L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株，用乳酸链球菌素Nisin诱导hpaA基因的表达，提取细胞壁蛋白，用SDS-PAGE和Western blots法检测蛋白表达。

4.一种如权利要求2所述的表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌菌株在制备抗幽门螺杆菌疫苗方面的应用。

5.一种如权利要求2所述的表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌菌株在制备幽门螺杆菌感染诊断试剂方面的应用。

6.一种如权利要求2所述的表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌菌株作为发酵菌株在食品加工中的应用。

7.一种如权利要求2所述的表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌菌株在乳制品加工方面的应用。

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