CN102796113B - 一种呫吨酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种呫吨酮类化合物及其制备方法与应用。所述呫吨酮类化合物是从藤黄属灌木中分离得到，命名为oliganthoneA，其分子式为C30H34O7，具有下述结构：
所述的呫吨酮类化合物制备方法，是以藤黄属灌木为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体包括：将藤黄属灌木样品粉碎提取，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏；浸膏用有机溶剂萃取，萃取相用硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的正己烷-丙酮溶液进行梯度洗脱；1:0部分进一步用反相柱层析、凝胶柱层析、高压液相色谱分离纯化即得。本发明经试验证明，具备很好的诱导细胞凋亡和细胞毒活性，本发明化合物结构新颖，活性好；可作为抗肿瘤药物的先导性化合物。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种呫吨酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞时起着必要的作用。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一个被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病等。能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。因此诱导癌细胞的细胞凋亡被认为是有效的癌症治疗方法。Caspase家族基因在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能，caspase-3基因的激活是表示发生细胞凋亡的最关键的事件，被用于监测细胞凋亡发生的程度，因此能激活caspase-3基因的天然产物可能是很有潜力开发为抗癌药物的先导物。
研究表明，藤黄属植物富含具有诱导细胞凋亡活性和细胞毒活性的异戊烯基呫吨酮和苯甲酮。单花山竹子属于藤黄科藤黄属的灌木，高1–3m，分布于海南和广东两省海拔200–1200 m 的林中。在民间，这种植物具有抗炎、清热解毒功效，被用于牙疼、喉咙疼以及烫伤。这一植物在老挝民间也被用作药用植物。本发明从单花山竹子中分离得到一个新颖的呫吨酮化合物，该化合物具有显著的诱导细胞凋亡活性和细胞毒活性。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种呫吨酮类化合物；第二目的在于提供所述呫吨酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述呫吨酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述呫吨酮类化合物是从藤黄属灌木中分离得到，命名为oliganthone A，其分子式为C30H34O7，具有下述结构：
本发明的第二目的是这样实现的，所述的呫吨酮类化合物制备方法，是以藤黄属灌木为原料，经经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI柱脱色、硅胶柱层析、反相柱层析、凝胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体包括：
A、浸膏提取：将藤黄属灌木样品粉碎到20~40目，以有机溶剂超声提取2~4次，每次30~60min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏；
B、有机溶剂萃取：A步骤所得浸膏加入重量比为1.5~3倍的水，用水1~2倍体积的有机溶剂萃取3~5次，将每次分离的有机溶剂萃取相合并，减压浓缩成浸膏；
C、MCI柱脱色B步骤所得浸膏用重量比4~5倍的反相材料MCI进行层析，以90~99%的甲醇进行洗脱；
D、硅胶柱层析：脱色后的浸膏用重量比6~8倍量的160 - 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的正己烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
E、反相柱层析：D步骤洗脱液的1:0部分进一步用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
F、凝胶柱层析：E步骤洗脱液的85:15的甲醇水溶液洗脱部分进一步用凝胶柱Sephadex LH-20进行层析，以有机溶剂冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；
G、高压液相色谱分离：F步骤洗脱液的进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的呫吨酮类化合物。
以上述方法制备的呫吨酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明化合物为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D – 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)；紫外光谱 (溶剂为甲醇)，λ max (logε): 269 (4.08), 228 (2.68), 205 (2.34) nm；红外光谱 (溴化钾压片)ν max 3447, 3377, 3133 2286, 1656, 1597, 1439, 1266, 1122, 1064, 861, 817, 621, 569 cm-1；HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 507.2384 [M + H]+ (计算值为507.2384)，结合13C 和1H NMR谱(图-1和图-2,数据归属见表-1) 给出其分子式C30H34O7，不饱和度为14。
碳谱(Table 1)和 DEPT 谱中显示有7个甲基、3个亚甲基、6个次甲基（其中5个为不饱和）以及14个季碳（9个不饱和、1个氧化，3个羰基）。红外吸收表明有羟基(3447 cm-1) 和一个呫吨酮羰基 (1656 cm-1)。氢谱信号 δ H 4.89–4.91 and 4.85–4.89 (2H, m, H-17, H-22), 2.60–2.66 (m) and 2.70–2.75 (m) (each 2H, m, H-16 and H-21), 1.56, 1.64, 1.53 and 1.58 (each 3H, s, H-19, H-20, H-24, and H-25)说明该化合物中存在一个gem bis(3-methylbut-2-enyl) 基团连接在一个sp3 碳原子上δ C 58.5 (C-1)。碳谱中除了呫吨酮羰基信号δ C 180.1 (C-9)外，还有一个羰基信号δ C 212.2 (C-2)说明该化合物应为氧杂蒽二酮的骨架。从1H and 13C NMR 谱判断该化合物含有三个异戊烯基团。二维谱中，C-6与8-OH、H-11 和H-12的HMBC相关, H-12 与被氧化的季碳C-13和两个甲基碳C-14和C-15的HMBC相关说明，除了gem bis(3-methylbut-2-enyl) 基团中的两个异戊烯基外，还有一个异戊烯基形成了二甲基吡喃连接在C-6(δ C 162.0)位。H-16和C-1以及H-21和C-2的HMBC相关可证实两个异戊烯基在C-1位。氢谱中还有一个芳香质子与C-6, C-7, C-8a, 和C-10a有HMBC相关，说明其为 H-5 (Fig. 3)。
和常规的呫吨酮相比，本发明化合物碳谱和氢谱中C-3, C-26, C-27, 和C-28 的化学位移有较大变化。通过仔细分析其二维谱发现，δ H 5.15 (br) (OH-3) 与 δ C 212.2 (C-2), 164.0 (C-4a),和42.8 (C-26)有HMBC相关，据此可推断 C-4a 和 C-3相连。在本发明化合物的碳谱中没有找到C-4信号，说明这是一类新骨架的呫吨酮。δ H 2.77–2.82 (m) (H-26) 与 δ C 212.2 (C-2), 75.9 (C-3), 208.4 (C-27), 31.9 (C-28), 以及δ H 2.26 (s) (H-28)与δ C 42.8 (C-26), 208.4 (C-27)的 HMBC相关说明C-3还有一个丙酮基取代。至此该化合物的结构得到确定，并命名为oliganthone A。
表-1. 化合物的 1H NMR和 13C NMR数据(溶剂为CDCl3)
| 原子 | δ H | δ C | 原子 | δ H | δ C |
| 1 | 58.5 s | 15 | 1.81 (s) | 28.2 q | |
| 2 | 212.2 s | 16 | 2.60–2.66 (m) | 33.6 t | |
| 3 | 75.9 s | 17 | 4.89–4.91 (m) | 119.7 d | |
| 5 | 6.30 (s) | 100.7 d | 18 | 135.9 s | |
| 6 | 162.0 s | 19 | 1.56 (s) | 17.7 q | |
| 7 | 101.7 s | 20 | 1.64 (s) | 25.9 q | |
| 8 | 159.7 s | 21 | 2.70–2.75 (m) | 34.6 t | |
| 9 | 180.1 s | 22 | 4.85–4.89 (m) | 118.9 d | |
| 4a | 164.0 s | 23 | 135.6 s | ||
| 8a | 106.0 s | 24 | 1.53 (s) | 17.7 q | |
| 9a | 119.8 s | 25 | 1.58 (s) | 25.8 q | |
| 10a | 152.2 s | 26 | 2.77–2.82 (m) | 42.8 t | |
| 11 | 6.63 (d, 10.0) | 114.4 d | 27 | 208.4 s | |
| 12 | 5.61 (d, 10.0) | 127.8 d | 28 | 2.26 (s) | 31.9 q |
| 13 | 78.3 s | 3-OH | 5.15 (br) | ||
| 14 | 1.49 (s) | 28.4 q | 8-OH | 12.66 (s) |
本发明的第三目的是这样实现的，即将所述呫吨酮类化合物应用于抗肿瘤药物的制备。
本发明呫吨酮类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为呫吨酮类化合物，并表征了其具体结构。经对HeLa-C3 细胞的诱导凋亡实验，在低浓度25 μM 时能在72小时内有效降低HeLa-C3 细胞的YFP/CFP比值到3以下，具有较好的诱导细胞凋亡作用。经对HeLa 细胞的抗细胞毒活性检测试验，试验结果清楚地表明，IC50 值为7.27 ± 0.23 μM。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗肿瘤药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构新颖活性好，可作为抗肿瘤药物的先导性化合物。
附图说明
图1为化合物的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为化合物的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3为化合物的主要HMBC相关。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述呫吨酮类化合物是从藤黄属灌木中分离得到，命名为oliganthone A，分子式为C30H34O7，其制备方法是以藤黄属灌木为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI柱脱色、硅胶柱层析、反相柱层析、凝胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体包括：
所述浸膏提取是将藤黄属灌木样品粉碎到20~40目，以有机溶剂超声提取2~4次，每次30~60min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏；
所述有机溶剂萃取是将浸膏提取步骤所得浸膏加入重量比为1.5~3倍的水，用水1~2倍体积的有机溶剂萃取3~5次，将每次分离的有机溶剂萃取相合并，减压浓缩成浸膏；
所述MCI柱脱色是将有机溶剂萃取步骤所得浸膏用重量比4~5倍的反相材料MCI进行层析，以90~99%的甲醇进行洗脱；
所述硅胶柱层析是将脱色后的浸膏用重量比6~8倍量的160 - 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的正己烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
所述反相柱层析是将硅胶柱层析步骤洗脱液的1:0部分进一步用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
所述凝胶柱层析是将反相柱层析步骤洗脱液的85:15的甲醇-水溶液洗脱部分进一步用凝胶柱Sephadex LH-20进行层析，以有机溶剂冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；
所述高压液相色谱分离是将凝胶柱层析步骤洗脱液的进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的呫吨酮类化合物。
所述浸膏提取步骤中溶剂可采用70％－100％的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种。
所述有机溶剂萃取步骤中萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、***、石油醚、苯中的任意一种。
所述MCI柱脱色步骤中浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解后用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶硅胶拌样。
所述硅胶柱层析步骤中正己烷-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。
所述反相柱层析步骤中甲醇-水溶液体积配比为80:20、85:15、90:10、95:5、100:0。
所述凝胶柱层析步骤中有机溶剂可采用氯仿、甲醇、丙酮中的任意一种。
所述高压液相色谱分离步骤中高压液相色谱分离纯化是采用75~90％的甲醇为流动相，流速2.5~4mL/min，9.4 × 250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~55 μL，收集9.1~39.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
所述高压液相色谱分离纯化是采用80~85％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样47~49 μL，收集16.5~27.3min的色谱峰，多次累加后蒸干。
本发明所述呫吨酮类化合物的应用是其在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明单花山竹子所用原料不受地区和品种限制，也不仅限于藤黄属灌木，均可以实现本发明，下面以来源于海南的单花山竹子对本发明做进一步说明：
实施例1
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品5.5 kg粉碎到40目，以70%的乙醇超声提取2次，每次60min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/4，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏436 g。浸膏用重量比1.5倍量的水溶解后用与水1.5倍体积的二氯甲烷萃取3次，二氯甲烷萃取相浓缩得浸膏242g。二氯甲烷萃取相再用MCI反相柱脱色，以90%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得130g粗样。脱色后的样品加入3倍丙酮溶解用156g的100目硅胶拌样，1.04Kg的 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分5.05g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用80％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样48 μL，收集27.3min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例2
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品3 kg粉碎到20目，以99%的乙醇用超声提取4次，每次30min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/2，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏240 g。浸膏用重量比2倍量的水溶解后用与水2倍体积的二氯甲烷萃取4次，二氯甲烷萃取相浓缩得浸膏135g。二氯甲烷萃取相再用MCI反相柱脱色，以95%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得70g粗样。脱色后的样品加入1.5倍丙酮溶解用56g的100目硅胶拌样，0.42Kg的 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分3.12g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用85％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样49μL，收集16.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例3
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品4 kg粉碎到30目，以80%的乙醇用超声提取3次，每次40min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/3，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏336 g。浸膏用重量比3倍量的水溶解后用与水1倍体积的乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯萃取相浓缩得浸膏187g。乙酸乙酯萃取相再用MCI反相柱脱色，以99%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得95g粗样。脱色后的样品加入2倍丙酮溶解用95g的90目硅胶拌样，0.67Kg的 180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分4.2g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用83％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样49μL，收集22.1min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例4
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品3 kg粉碎到20目，以70%的甲醇用超声提取3次，每次60min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/4，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏245g。浸膏用重量比1.5倍量的水溶解后用水2倍体积的氯仿萃取5次，氯仿萃取相浓缩得浸膏119g。氯仿萃取相再用MCI反相柱脱色，以97%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得61g粗样。脱色后的样品加入3倍丙酮溶解用156g的90目硅胶拌样，1.04Kg的 180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分2.96g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用75％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45 μL，收集38.1min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例5
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品6 kg粉碎到40目，以99%的甲醇用超声提取2次，每次60min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/3，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏497 g。浸膏用重量比3倍量的水溶解后用水1.5倍体积的***萃取4次，***萃取相浓缩得浸膏265g。***萃取相再用MCI反相柱脱色，以98%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得147g粗样。脱色后的样品加入2倍丙酮溶解用117.6g的90目硅胶拌样，0.882Kg的 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分6.1g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用80％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样47 μL，收集27.3min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例6
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品3.5 kg粉碎到40目，以85%的甲醇用超声提取4次，每次45min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/4，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏293 g。浸膏用重量比2倍量的水溶解后用水2倍体积的石油醚萃取3次，石油醚萃取相浓缩得浸膏162g。石油醚萃取相再用MCI反相柱脱色，以92%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得89g粗样。脱色后的样品加入1.5倍丙酮溶解用106.8g的100目硅胶拌样，0.712Kg的 170目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分3.23g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用85％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样49 μL，收集16.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例7
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品4.3kg粉碎到30目，以99%的丙酮用超声提取4次，每次30min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/2，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏368 g。浸膏用重量比2.5倍量的水溶解后用水2倍体积的苯萃取3次，苯萃取相浓缩得浸膏179g。苯萃取相再用MCI反相柱脱色，以95%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得102g粗样。脱色后的样品加入3倍丙酮溶解用101g的100目硅胶拌样，0.835Kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分4.5g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分得14个组分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用90％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样55 μL，收集9.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例8
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品5.6 kg粉碎到20目，以80%的丙酮用超声提取2次，每次50min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/2，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏453 g。浸膏用重量比2倍量的水溶解后用水1倍体积的苯萃取5次，苯萃取相浓缩得浸膏261g。苯萃取相再用MCI反相柱脱色，以99%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得142g粗样。脱色后的样品加入2倍丙酮溶解用150g的80目硅胶拌样，1.14Kg的 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分5.05g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用85％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45 μL，收集16.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例9
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品3.8kg粉碎到30目，以70%的丙酮用超声提取3次，每次35min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/4，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏367g。浸膏用重量比3倍量的水溶解后用水1.5倍体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯萃取相浓缩得浸膏186g。乙酸乙酯萃取相再用MCI反相柱脱色，以98%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得130g粗样。脱色后的样品加入2倍丙酮溶解用141g的100目硅胶拌样，0.92Kg的 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分4.05g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用90％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样47 μL，收集9.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例10
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品3.6kg粉碎到20目，以79%的乙醇用超声提取2次，每次55min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/3，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏348 g。浸膏用重量比1.5倍量的水溶解后用水2倍体积的石油醚萃取4次，石油醚萃取相浓缩得浸膏159g。石油醚萃取相再用MCI反相柱脱色，以92%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得100g粗样。脱色后的样品加入3倍丙酮溶解用90g的80目硅胶拌样，0.78Kg的 160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分3.6g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用85％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样55 μL，收集16.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例11
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品6.5 kg粉碎到40目，以83%的甲醇用超声提取3次，每次45min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/3，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏588g。浸膏用重量比3倍量的水溶解后用水1倍体积的***萃取5次，***萃取相浓缩得浸膏298g。***萃取相再用MCI反相柱脱色，以95%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得223g粗样。脱色后的样品加入2倍丙酮溶解用178.4g的100目硅胶拌样，1.338Kg的 160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分5.98g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用82％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50 μL，收集26.3min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例12
取干燥的单花山竹子枝条和叶样品5 kg粉碎到20目，以75%的丙酮用超声提取4次，每次50min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至1/4，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏，得浸膏396g。浸膏用重量比2倍量的水溶解后用水1倍体积的氯仿萃取4次，氯仿萃取相浓缩得浸膏198g。氯仿萃取相再用MCI反相柱脱色，以99%甲醇洗脱，洗脱液浓缩得130g粗样。脱色后的样品加入3倍丙酮溶解用0.83g的80目硅胶拌样，1.04Kg的 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分；洗脱液的1:0部分5.05g用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；反相层析洗脱液的85%的甲醇水溶液洗脱部分进一步用Sephadex LH-20凝胶柱进行层析，以纯甲醇冲柱，收集含目标化合物的洗脱液并浓缩；用凝胶柱层析的洗脱液进一步用80％的甲醇为流动相，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样48 μL，收集28.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，可得该新化合物。
实施例13
取实施例1制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)；
测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
1）紫外光谱 (溶剂为甲醇)，λ max (logε): 269 (4.08), 228 (2.68), 205 (2.34) nm；
2）红外光谱 (溴化钾压片) ν max 3447, 3377, 3133 2286, 1656, 1597, 1439, 1266, 1122, 1064, 861, 817, 621, 569 cm-1；
3) HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 507.2384 [M + H]+ (计算值为507.2384)，结合13C和1H NMR谱(图-1和图-2,数据归属见表-1) 给出其分子式C30H34O7，不饱和度为14。
碳谱(Table 1)和 DEPT 谱中显示有 7个甲基、3个亚甲基、6个次甲基（其中5个为不饱和）以及14个季碳（9个不饱和、1个氧化，3个羰基）。红外吸收表明有羟基(3447 cm-1) 和一个呫吨酮羰基 (1656 cm-1)。氢谱信号 δ H 4.89–4.91 and 4.85–4.89 (2H, m, H-17, H-22), 2.60–2.66 (m) and 2.70–2.75 (m) (each 2H, m, H-16 and H-21), 1.56, 1.64, 1.53 and 1.58 (each 3H, s, H-19, H-20, H-24, and H-25)说明该化合物中存在一个gem bis(3-methylbut-2-enyl) 基团连接在一个sp3 碳原子上δ C 58.5 (C-1)。碳谱中除了呫吨酮羰基信号δ C 180.1 (C-9)外，还有一个羰基信号δ C 212.2 (C-2)说明该化合物应为氧杂蒽二酮的骨架。从1H and 13C NMR 谱判断该化合物含有三个异戊烯基团。二维谱中，C-6与8-OH、H-11 和H-12的HMBC相关, H-12 与被氧化的季碳C-13和两个甲基碳C-14和C-15的HMBC相关说明，除了gem bis(3-methylbut-2-enyl) 基团中的两个异戊烯基外，还有一个异戊烯基形成了二甲基吡喃连接在C-6(δ C 162.0)位。H-16和C-1以及H-21和C-2的HMBC相关可证实两个异戊烯基在C-1位。氢谱中还有一个芳香质子与C-6, C-7, C-8a, 和C-10a有HMBC相关，说明其为 H-5 (Fig. 3).
和常规的呫吨酮相比，本发明化合物碳谱和氢谱中C-3, C-26, C-27, 和C-28 的化学位移有较大变化。通过仔细分析其二维谱发现，δ H 5.15 (br) (OH-3) 与 δ C 212.2 (C-2), 164.0 (C-4a),和42.8 (C-26)有HMBC相关，据此可推断 C-4a 和 C-3相连。在本发明化合物的碳谱中没有找到C-4信号，说明这是一类新骨架的呫吨酮。δ H 2.77–2.82 (m) (H-26) 与 δ C 212.2 (C-2), 75.9 (C-3), 208.4 (C-27), 31.9 (C-28), 以及δ H 2.26 (s) (H-28)与δ C 42.8 (C-26), 208.4 (C-27)的 HMBC相关说明C-3还有一个丙酮基取代。至此该化合物的结构得到确定，并命名为oliganthone A。
实施例14
取实施例2制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例2制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例15
取实施例3制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例3制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例16
取实施例4制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例4制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例17
取实施例5制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例5制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例18
取实施例6制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例6制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例19
取实施例7制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例7制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例20
取实施例8制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例8制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例21
取实施例9制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例9制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例22
取实施例10制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例10制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例23
取实施例11制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例11制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例24
取实施例12制备的化合物，为黄色无定形粉末；旋光值[α]25.3 D– 3.6 (溶剂为甲醇c 0.030)。测定方法与实施例13相同，确认实施例12制备的化合物为所述的呫吨酮类化合物——oliganthone A。
实施例25
取实施例1~12制备的呫吨酮类化合物进行细胞毒活性试验，试验情况如下：
1）诱导HeLa-C3细胞凋亡活性
所有被检测的样品都溶于DMSO 作为stock solutions。每一个stock的浓度至少是工作浓度的1000 倍。用于监测caspase是否被激活的HeLa-C3 细胞用minimum essential medium (MEM) 培养基（含有 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin）, 在37℃的含有5% CO2 的humidified incubator里培养。每个用于检测细胞凋亡活性的样品孔加入悬浮有7,500 HeLa-C3细胞的 100 μL培养基。经过12–16 h 培养，将老的培养基倒掉，并加入100 μL新鲜的含有工作浓度的被测样品的培养基，在背景中只加入新鲜的培养基。含有0.1% DMSO的培养基被用作阴性对照，而加入500 nM紫杉醇的培养基则用作阳性对照。然后用Perkin-Elmer Victor reader with excitation wavelength at 440 ± 10 nm and emission wavelength at 486 ± 8 nm for cyan fluorescent protein (CFP) and 535 ± 8 nm for yellow fluorescent protein (YFP) 在各实验时间点读取数据。数据获取的时间超过72 小时。并对YFP/CFP 的比值进行计算。如果YFP/CFP比值降低到3以下，而且观察到细胞萎缩，就可认为在工作浓度下该样品能有效诱导细胞凋亡。所有样品的实验都进行三次重复。
2）样品对HeLa细胞的细胞毒活性检测
用MTT assay决定细胞活力。MTT 粉末溶解于PBS，浓度为 5 mg/mL。细胞加入样品72小时后，在96孔板的每个孔中都加入10 μL 的 MTT 溶液。在37℃放置2小时后， 加入100 μL 含10% SDS 的 0.01 M HCl溶液，使得紫色晶体溶解。培养24小时后，测定其595 nm 的OD 值 (optical density) 。用化合物处理过的细胞的活力等于所测得OD 值除以阴性对照的OD值。(这一值用百分数的形式表示。)
还用MTT方法测定了该新化合物的IC50 值（该化合物抑制一半细胞生长的浓度）。首先，在96孔板的每个孔中将2,500 HeLa细胞悬浮于100 μL MEM 培养基中。经过24 h的培养后，将含有不同浓度化合物的新鲜培养基加入每个孔以取代旧的培养基。化合物的浓度为100 μM至1.5625 μM，这些浓度经过六次两倍稀释得到。 在0 h和72 h的对照组 OD595值以及72 h 的加有化合物组的OD595值用plate reader测定。
6）试验结果
经对HeLa-C3 细胞的诱导凋亡实验，在低浓度25 μM 时能在72小时内有效降低HeLa-C3 细胞的YFP/CFP比值到3以下，具有较好的诱导细胞凋亡作用。经对HeLa 细胞的抗细胞毒活性检测试验，试验结果清楚地表明，IC50 值为7.27 ± 0.23 μM。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗肿瘤药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构新颖活性好，可作为抗肿瘤药物的先导性化合物。
Claims (10)
1.一种呫吨酮类化合物，其特征在于所述呫吨酮类化合物是从藤黄属灌木中分离得到，命名为oliganthone A，其分子式为C30H34O7，具有下述结构：
。
2.一种权利要求1所述的呫吨酮类化合物制备方法，其特征在于以藤黄属灌木为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI柱脱色、硅胶柱层析、反相柱层析、凝胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体包括：
A、浸膏提取：将藤黄属灌木样品粉碎到20~40目，以有机溶剂超声提取2~4次，每次30~60min，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏；所述的藤黄属灌木样品为来源于海南的单花山竹子枝条和叶；
B、有机溶剂萃取：A步骤所得浸膏加入重量比为1.5~3倍的水，用水1~2倍体积的有机溶剂萃取3~5次，将每次分离的有机溶剂萃取相合并，减压浓缩成浸膏；
C、MCI柱脱色：B步骤所得浸膏用重量比4~5倍的反相材料MCI进行层析，以90~99%的甲醇进行洗脱；
D、硅胶柱层析：脱色后的浸膏用重量比6~8倍量的160 - 200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的正己烷-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
E、反相柱层析：D步骤洗脱液的1:0部分进一步用反相材料C-18装柱进行层析，以体积配比为4:1~1:0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩；
F、凝胶柱层析：E步骤洗脱液的85:15的甲醇-水溶液洗脱部分进一步用凝胶柱Sephadex LH-20进行层析，以有机溶剂冲柱，收集洗脱液并浓缩；
G、高压液相色谱分离：F步骤洗脱液进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的呫吨酮类化合物。
3.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤中溶剂可采用70％－99％的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、***、石油醚、苯中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解后用浸膏重量比0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
6.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤中正己烷-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。
7.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述E步骤中甲醇-水溶液体积配比为80:20、85:15、90:10、95:5、100:0。
8.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述F步骤中有机溶剂可采用氯仿、甲醇、丙酮中的任意一种。
9.根据权利要求2所述的呫吨酮类化合物的制备方法，其特征在于所述G步骤中高压液相色谱分离纯化是采用75~90％的甲醇为流动相，流速2.5~4mL/min，9.4×250 mm, 5 μm 的Alltima C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~55 μL，收集9.1~39.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
10.一种权利要求1所述呫吨酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| Prenylated Xanthone Derivatives with Antiplasmodial Activity from Allanblackia monticola STANER L.C.;Anatole Guy Blaise AZEBAZE, et al.;《Chem. Pharm. Bull.》;20060131;第54卷(第1期);111-113 * |
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