CN104262154A - 鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物中有效成分提取技术领域，具体来说是一种鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法，步骤包括(1)鼠曲草过柱产物；(2)上样洗脱；(3)结构测定；本发明利用HSCCC与制备HPLC联用技术从鼠曲草中制备分离得到6个化合物，该方法简便、高效无毒，适宜化合物的大量制备，并鉴定了其中5个化合物；同时，对化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用进行了研究，为鼠曲草进一步药理研究及质量控制奠定基础；本发明方法可快速才鼠曲草中提取多酚类化合物单体，方法操作简单，制备的多酚类单体化合物纯度高。

Description

鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法

技术领域

本发明涉及植物中有效成分提取技术领域，具体来说是一种鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法。

背景技术

鼠曲草(Gnaphalium affine D.Don)为菊科鼠曲草属植物鼠曲草的全草，1977年版《中华人民共和国药典》一部中就有收载。传统医学认为它具有止咳化痰，祛风除湿，解毒之功效，主治咳嗽痰多，风湿痹痛，水肿，赤白带下，痈肿疔疮等症。在墨西哥，鼠曲草属植物常被用作抗炎药物。现代药理研究进一步表明鼠曲草不仅具有显著的抗炎、抗氧化、抑菌、镇咳祛痰、保肝等作用，还有杀虫作用，因此具有广泛的开发利用前景。

目前，文献报道的鼠曲草的化学成分主要是黄酮及黄酮苷类成分，而对其他化合物研究较少，深入研究鼠曲草中化合物种类、分离其单体成分并进行化学结构鉴定及结构—活性关系是极其必要的。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法，步骤为：

(1)新鲜的鼠曲草置于60℃的烘箱中烘干后粉碎至10～20目，然后粉碎的原料加入鼠曲草粉末量20～30倍、质量浓度为50～70％的乙醇，在70～80℃条件下回流提取0.5～1h，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至1～1.5ml/g，同时用盐酸调节pH＝3，过滤除去沉淀，将滤液以4BV/h流速通过装有D101树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.5h，用水洗至无色，然后用4～6BV质量浓度为60％乙醇以2～4BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；

(2)将正己烷、乙酸乙酯、无水甲醇、体积浓度为0.5％的冰乙酸水溶液按体积比为0.7:3.5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气，将制得的鼠曲草过柱纯化产物100～120mg用10～20mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂以20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在850～900rpm/min的转速下将下相以1.5mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，设温箱温度20～30℃，待下相流出时即***已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为95.3％、98.7％、99.6％、99.7％的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6，及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A泵为质量浓度为0.5％冰醋酸，B泵为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相以32％的体积，水相以68％的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温30℃，进样量1ml,检测输出波长328nm，根据峰形收集化合物4、5；

(3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为绿原酸，化合物3为3,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物4为4,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物5为3,4-双咖啡酰基奎宁酸，化合物6为2′,4,4′-三羟基-6′-甲氧基查尔酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明中，参照文献方法(GaoH,Kawabata J.Α-glucosidase inhibitionof6-hydroxyflavones.Part3:Synthesis and evaluation of2,3,4-trihydroxybenzoyl-containing flavonoid analogs and6-aminoflavones as α-glucosidase inhibitors.Bioorganic&MedicinalChemistry.2005；13:1661-1671；YE X-P,SONG C-Q,YUAN P,et al.α-glucosidase and α-amylase inhibitory activity of common constituentsfrom traditional chinese medicine used for diabetes mellitus.ChineseJournal of Natural Medicines.2010；8:349-352)以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物测定化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。6个化合物对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，其抑制活性均与浓度呈正相关，化合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用由强到弱为：化合物2>化合物6≈化合物1>化合物3>化合物5>化合物4，抑制作用远远大于同等浓度的拜糖平。

本发明的有益技术效果是：本发明利用HSCCC与制备HPLC联用技术从鼠曲草中制备分离得到6个化合物，该方法简便、高效无毒，适宜化合物的大量制备，并鉴定了其中5个化合物；同时，对化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用进行了研究，为鼠曲草进一步药理研究及质量控制奠定基础；

本发明方法可快速才鼠曲草中提取多酚类化合物单体，方法操作简单，制备的多酚类单体化合物纯度高。

说明书附图

图1鼠曲草提取物HPLC检测图谱；

图2鼠曲草提取物HSCCC分离色谱图；

图3鼠曲草中分离组分的HPLC图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法，步骤为：

(1)新鲜的鼠曲草置于60℃的烘箱中烘干后粉碎至10目，然后粉碎的原料加入鼠曲草粉末量20倍、质量浓度为50％的乙醇，在70℃条件下回流提取0.5h，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至无乙醇味，同时用盐酸调节pH＝3，过滤除去沉淀，将滤液以4BV/h流速通过装有D101树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.5h，用水洗至无色，然后用4BV质量浓度为60％乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；

(2)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、体积浓度为0.5％的冰乙酸水溶液按体积比为0.7:3.5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气；将制得的鼠曲草过柱纯化产物100mg用10mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂以20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在850rpm/min的转速下将下相以1.5mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，设温箱温度20℃，待下相流出时即***已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为95.3％、98.7％、99.6％、99.7％的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6，及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A泵为质量浓度为0.5％冰醋酸，B泵为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相以32％的体积，水相以68％的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温30℃，进样量1ml，检测输出波长328nm，根据峰形收集化合物4、5；

(3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为绿原酸，化合物3为3,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物4为4,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物5为3,4-双咖啡酰基奎宁酸，化合物6为2′,4,4′-三羟基-6′-甲氧基查尔酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例2

(1)新鲜的鼠曲草置于60℃的烘箱中烘干后粉碎至10目，然后粉碎的原料加入鼠曲草粉末量25倍、质量浓度为60％的乙醇，在75℃条件下回流提取1h，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至无乙醇味，同时用盐酸调节pH＝3，过滤除去沉淀，将滤液以4BV/h流速通过装有D101树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.5h，用水洗至无色，然后用5BV质量浓度为60％乙醇以3BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；

(2)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、体积浓度为0.5％的冰乙酸水溶液按体积比为0.7:3.5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气；将制得的鼠曲草过柱纯化产物110mg用15mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂以20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在875rpm/min的转速下将下相以1.5mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，设温箱温度25℃，待下相流出时即***已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为95.3％、98.7％、99.6％、99.7％的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6，及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A泵为质量浓度为0.5％冰醋酸，B泵为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相以32％的体积，水相以68％的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温30℃，进样量1ml，检测输出波长328nm，根据峰形收集化合物4、5；

(3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为绿原酸，化合物3为3,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物4为4,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物5为3,4-双咖啡酰基奎宁酸，化合物6为2′,4,4′-三羟基-6′-甲氧基查尔酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例3

(1)新鲜的鼠曲草置于60℃的烘箱中烘干后粉碎至20目，然后粉碎的原料加入鼠曲草粉末量30倍、质量浓度为70％的乙醇，在80℃条件下回流提取1h，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至无乙醇味，同时用盐酸调节pH＝3，过滤除去沉淀，将滤液以4BV/h流速通过装有D101树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.5h，用水洗至无色，然后用6BV质量浓度为60％乙醇以4BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；

(2)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、体积浓度为0.5％的冰乙酸水溶液按体积比为0.7:3.5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气；将制得的鼠曲草过柱纯化产物120mg用20mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂以20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在900rpm/min的转速下将下相以1.5mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，设温箱温度30℃，待下相流出时即***已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为95.3％、98.7％、99.6％、99.7％的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6，及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A泵为质量浓度为0.5％冰醋酸，B泵为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相以32％的体积，水相以68％的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温30℃，进样量1ml，检测输出波长328nm，根据峰形收集化合物4、5；

(3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为绿原酸，化合物3为3,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物4为4,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物5为3,4-双咖啡酰基奎宁酸，化合物6为2′,4,4′-三羟基-6′-甲氧基查尔酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例4

1方法

(1)高效液相色谱(HPLC)分析条件

流动相为A泵：水(0.5％冰醋酸)，B泵：甲醇，采用高压二元梯度洗脱，洗脱方法如下：0min(:A70％，B:30％)→15min(A:55％，B:45％)→25min(A:55％，B:45％)→40min(A:30％，B:70％)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测输出波长328nm。

(2)鼠曲草提取液的制备

新鲜的鼠曲草于室内自然阴干，置60℃烘箱中干燥，粉碎，取200g鼠曲草粉碎原料，用70％乙醇，料液比为1:30，在80℃回流提取1h，提取2次，合并提取液并用盐酸调节pH3，抽滤去除沉淀，滤液经旋转减压浓缩仪浓缩至无醇味(200ml)，得到鼠曲草提取液。

(3)鼠曲草提取液的纯化

将上述所得提取液通过装有D101树脂(3cm×60cm，450ml)的层析柱，流速4BV/h，吸附后静置0.5h，用1BV水洗去水溶性杂质，再用4BV的60％乙醇以3BV/h的流速洗脱，收集60％乙醇洗脱部位，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草纯化产物6.44g，4℃冰箱中保存，作为高速逆流进样原料。

(4)HSCCC两相溶剂体系的选择

实验通过HPLC测定目标化合物的分配系数(K值)来选择高速逆流的溶剂体系，一般来说各分离组分K值在0.2-5之间时可以接受。选择方法操作步骤：按照不同比例配置溶剂体系，充分混匀，30s静置分层，待溶剂体系两相分层彻底后，取适量鼠曲草纯化提取物粉末用2mL下相溶解，过0.45um膜，取20μL过膜溶液经HPLC分离，记录各峰面积为A1；取已过膜下相溶液1mL加入等体积已过膜的上相充分混合摇匀萃取，静置分层彻底后，再取下相20μL经HPLC分离，记录各峰面积为A2，按下列公式计算K值。

对于逆流色谱，选择K值合适的溶剂体系作为HSCCC的固定相与流动相。

(5)高速逆流色谱(HSCCC)制备分离鼠曲草中化合物

按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积浓度为0.5％的冰乙酸)＝0.7:3.5:1:4(V/V)配制溶剂体系。将所有溶剂按体积比加入到2000mL的分液漏斗中充分震荡得溶剂混合物，静置一晚，等到两相平衡后，将上相与下相分离，分别装入试剂瓶里，超声脱气40min。然后将上相溶剂以20mL/min的流速泵入高速逆流色谱主机管路中，待上相溶剂充满管路后，开启仪器以900rpm/min转速正向旋转，同时将下相以1.5mL/min的流速泵入主机管路，计算固定相的保留率Sf。称取鼠曲草HSCCC进样原料100mg，用10mL下相溶解，从进样口注入。设置色谱采集波长340nm，分离温度20℃，进样1h后进行图谱采集。根据流出峰形手动收集每个峰的尖部流出液，经HPLC鉴定其纯度。

(6)制备HPLC分离化合物4、5

将HSCCC分离物中含有组分4、5的流出液部分浓缩至干，用少量甲醇溶解后用制备型HPLC分离。分离条件为：流动相为A泵：水(0.5％冰醋酸)，B泵：甲醇，洗脱方法如下：0min(A:68％，B:32％)→60min(A:68％，B:32％)，流速15mL/min，柱温30℃，进样体积1mL，检测输出波长328nm。

(7)结构鉴定

质谱采用电喷雾电离源(ESI)，负离子模式，核磁共振谱用INOVA-300核磁共振仪完成，用CD3OD为溶剂，由湖南大学分析测试中心完成。

(8)化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以PNPG为底物测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。在试管中加入PBS(PH＝6.8、0.2mol/L)0.7mL、样品溶液0.1mL(化合物浓度0.05-0.7mg/mL，纯化产物、拜糖平2.0-10.mg/mL)、PNPG(20mmol/L)0.1mL、α-葡萄糖苷酶(0.57U/ml)0.1mL在37℃水浴加热15min，加入5ml0.1mol/L Na₂CO₃终止反应,在400nm波长下测定吸收值，同时作样品对照。按下式计算抑制率：

酶活性抑制率＝

A_空白：不加待测样品反应后的吸收值；A_样品：加入待测样品反应后的吸收值；A_背景：只加待测样品的吸收值。

2结果

(1)HPLC分析条件的优化

实验分别考察了不同溶剂组成以及不同浓度梯度的乙腈-水(0.5％冰醋酸)、甲醇-水、甲醇-水(0.5％冰醋酸)作为流动相体系对鼠曲草多酚类化合物HPLC分离效果。结果表明(图1)，以甲醇-水(0.5％冰醋酸)作为流动相时，鼠曲草提取液中化合物的检测基线比较平稳，分离效果好，色谱峰分布均匀，能实现多个色谱峰之间的分离，因此选择甲醇-水(0.5％冰醋酸)作为流动相。

(2)HSCCC的两相溶剂体系选择

在高速逆流色谱分离中，最关键的是要选出合适的溶剂体系，实验对多个不同极性的溶剂体系进行考察，结果发现，由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(0.5％乙酸)组成的体系中各组分的K值较好，再进一步调整溶剂的不同比例，K值结果见表1。

表1不同溶剂体系的K值

由表1可见，溶剂***1-3中多个组分的K值大于3，K值越大，所需分离时间越长。在溶剂***4中各峰组分的K值已经接近理想范围0.5-2，因此最终选择该溶剂***进行上机分离。

(3)HSCCC操作条件的优化

影响HSCCC分离效果的主要操作因素有转速、温度、流速等，本研究考察了转速、不同温度、不同流速对HSCCC分离效果的影响。本实验通过比对，转速在800-900rmp/min分离效果没有显著影响。温度在20-30℃分离效果也无显著影响。本实验通过比对，结果表明流动相流速对分离效果有较大影响，当流速2.0mL/min时，流速过快，流分出峰时间短，不利于接收，调整流速为1.5mL/min后，出峰时间延长，有利于收集并获得高纯度化合物。

通过对操作条件的优化，最终采用转速850-900rmp/min、主机箱温度20-30℃、流速1.5mL/min、上样量100-120mg为HSCCC操作条件。在该条件下固定相保留率为72％，HSCCC图谱见图2。

各组分接收区间：组分1(95-103min)，组分6(255-268min)，组分4、5(430-480min)，组分3(511-536min)，组分2(659-668min)。

样品经HSCCC条件下分离后经HPLC检测，由图3可见，分离得到了4种纯度高的单体化合物：组分1(纯度95.3％)、组分2(纯度98.7％)、组分3(纯度99.6％)、组分6(纯度99.7％)。另外得到了组分4与组分5的混合流分。

(4)制备HPLC分离化合物4、5

在1.2.6条件下，通过制备型HPLC分离得到化合物4、5，纯度分别为98.6％、98.4％。

结构鉴定

化合物1：m/z.353.0865[M-H]^-。保留时间与绿原酸标准品相同，加入绿原酸标准品，为对称的单一峰，确定组分1为绿原酸。

化合物3：灰白色，MS(APCI,Neg.)：m/z515.0[M-H]^-。¹H-NMR(CD3OD，δ)：1.97～2.01(1H,m,HH-6),2.02～2.27(2H,m,H-2),2.30～2.99(1H,m,HH-6),3.96(1H,br d,J＝8.4Hz,H-4),5.46(1H,br s,H-3),5.50～5.60(1H,m,H-5),6.32(2H,dd,J＝16.2,22.5Hz,H-8’,H-8”),6.83(2H,dd,J＝3,8.1Hz,H-5’,H-5”),6.99(2H,t,J＝7.5Hz,H-6’,H-6”),7.11(2H,d,J＝9.3Hz,H-2’,H-2”),7.66(1H,d,J＝9.9,H-7’)，7.60(1H,d,J＝9.9,H-7’)。氢谱数据与文献^{[7， 8]}基本一致，确定化合物7为3,5-di-O-Caffeoylquinic Acid。

化合物4：灰白色MS(ESI,Neg.):515.1191[M-1],353.0881,191.0562,179.0349,173.0445,135.446；¹H-NMR(300Hz,D₂O,δ):1.82～1.84(1H,m,H-6a),1.97～2.09(2H,m,H-2),2.16～2.34(1H,m,H-6b),4.31～4.38(1H,m,H-3),4.92(1H,dd,J＝3.6,9.9Hz,H-4),5.60(1H,brs,H-5),6.12(1H,d,J＝15.6Hz,H-8'),6.30(1H,d,J＝15.9,Hz,H-8″),6.61(1H,d,J＝8.4Hz,H-5'),6.69(1H,d,J＝8.4Hz,H-5″),6.74(1H,d,J＝8.1Hz,H-6'),6.81(1H,d,J＝8.4Hz,H-6″),6.85(1H,d,J＝1.8Hz,H-2'),6.90(1H,d,J＝1.8Hz,H-2″),7.35(1H,d,15.6Hz,H-7'),7.38(1H,d,16.2Hz,H-7″)；13C-NMR(300Hz,D₂O,δ):171.44(C-7),168.17(C-9',C9″),146.29(C-4',C-4″),145.32(C-3',C-3″),143.57(C-7',C-7″),127.21(C-1',C-1″),122.85(C-6',C-6″),115.41(C-5',C-5″),113.97(C-8',C-8″),114.13(C-2',C-2″),76.15(C-1),75.35(C-5),69.01(C-4),67.31(C-3),38.68(C-6),37.97(C-2)。氢谱数据与文献^[7，8]基本一致，确定为4,5-di-O-Caffeoylquinic Acid:

化合物5：灰白色3,4-di-O-Caffeoylquinic Acid(6):MS(ESI,Neg.):515.1190[M-1],353.0876,191.0561,179.0349；¹H-NMR(300Hz,D₂O,δ):1.92～1.97(1H,m,H-6a),2.01～2.09(2H,m,H-2),2.15～2.32(1H,m,H-6b),4.37(1H,brs,H-5),5.14(1H,dd,J＝3.0,8.7H-4),5.67～5.74(1H,m,H-3),6.19(1H,d,J＝15.6Hz,H-8'),6.29(1H,d,J＝15.6,Hz,H-8″),6.87(2H,d,J＝8.4Hz,H-5',H-5″),7.04(2H,d,J＝8.4Hz,H-6',H-6″),7.12(1H,s,H-2',H-2″),7.41(1H,d,15.9Hz,H-7',H-7″)；¹³C-NMR(300Hz,D₂O,δ):171.43(C-7),167.67(C-9'),167.27(C9″),145.60(C-4',C-4″),143.37(C-3',C-3″),143.04(C-7',C-7″),127.45(C-1',C-1″),121.31(C-6',C-6″),115.40(C-5',C-5″),114.02(C-8',C-8″),114.00(C-2',C-2″),76.28(C-1),75.81(C-3),70.55(C-5),69.95(C-4),39.68(C-2),38.77(C-6)。氢谱数据与文献^[7，8]基本一致，确定为3,4-di-O-Caffeoylquinic Acid。

化合物6：黄色粉末；MS(APCI,Neg.)：m/z446.8[M-H]-；UVλmax nm(logε)：328nm。1H-NMR(CD3OD，δ)：7.77(1H，d，J＝11.1Hz，H-7)，7.73(1H，d，J＝10.2Hz，H-8)，7.56(2H，d，J＝14.1，H-2’，H-6’)，6.88(2H，J＝8.7，H-3，H-5)，6.36(1H，d，J＝2.4Hz，H-3’)，6.29(1H，d，J＝2.4Hz，H-5’)，5.04(1H，d，J＝8.1Hz，H-1”’)，4.00(3H，br s，OCH3)，3.94(1H，d，J＝2.1Hz，H-2”’)，3.73(1H，dd，J＝6.0，12.3Hz，H-5”)；3.57～3.59(1H，m，H-6”’a)，3.55(1H，t，J＝3.6Hz，H-6”’b)，3.50(1H，d，J＝3.0Hz，H-3”’)，3.43(1H，m，H-4”’)。¹³C-NMR(CD3OD，δ)：194.61(C-9)，167.57(C-4’)，165.01(C-6’)，163.92(C-2’)，161.41(C-4’)，144.67(C-7)，131.52(C-2，C-6)，128.13(C-1)，125.22(C-8)，116.91(C-3，C-5)，108.46(C-1’)，101.44(C-1”)，98.01(C-5’)，93.16(C-3’)，78.46(C-5”’)，77.89(C-3”’)，74.72(C-2”’)，71.31(C-4”’)，62.45(C-6”’)，56.57(OCH3)。碳氢谱数据与文献^[7，8]基本一致，确定化合物6为2′,4,4′-trihydroxy-6′-methoxychalcone-4′-O-β-D-glucopyranoside。

(5)鼠曲草化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

在试验浓度范围内，6个化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性均与浓度呈正相关，其中化合物2在低浓度(〈20μg/mL)时活性最强，随着浓度的增大，化合物1、2、3、6的抑制活性相近，化合物4、5的抑制活性相近且相对较低。6个化合物、过柱纯化产物及阳性对照拜糖平的样品浓度与抑制率的线性回归方程为：y1＝29.086Ln(x)-30.037(R²＝0.9599)，y2＝14.622Ln(x)+31.634(R²＝0.8396)，y3＝29.931Ln(x)-35.386(R²＝0.9426)，y4＝14.077Ln(x)-0.6034(R²＝0.8949)y5＝26.286Ln(x)-39.595(R²＝0.9647)，y6＝35.176Ln(x)-46.647(R²＝0.955)，y纯＝8.2876Ln(x)-16.776(R²＝0.9347)，y拜＝21.736Ln(x)-100.37(R²＝0.9753)，根据线性方程计算其IC₅₀分别为：15.67μg/mL、3.52μg/mL、17.34μg/mL、36.41μg/mL、30.22μg/mL、15.60μg/mL、3156.86μg/mL、1010.31μg/mL，由此可见，化合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用由强到弱为：化合物2>化合物6≈化合物1>化合物3>化合物5>化合物4，抑制作用远远大于同等浓度的拜糖平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法，其特征在于，步骤为：

(1)新鲜的鼠曲草置于60℃的烘箱中烘干后粉碎至10～20目，然后粉碎的原料加入鼠曲草粉末量20～30倍、质量浓度为50～70％的乙醇，在70～80℃条件下回流提取0.5～1h，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至1～1.5ml/g，同时用盐酸调节pH＝3，过滤除去沉淀，将滤液以4BV/h流速通过装有D101树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.5h，用水洗至无色，然后用4～6BV质量浓度为60％乙醇以2～4BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；

(2)将正己烷、乙酸乙酯、无水甲醇、体积浓度为0.5％的冰乙酸水溶液按体积比为0.7:3.5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气，将制得的鼠曲草过柱纯化产物100～120mg用10～20mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂以20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在850～900rpm/min的转速下将下相以1.5mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，设温箱温度20～30℃，待下相流出时即***已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为95.3％、98.7％、99.6％、99.7％的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6，及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A泵为质量浓度为0.5％冰醋酸，B泵为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相以32％的体积，水相以68％的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温30℃，进样量1ml,检测输出波长328nm，根据峰形收集化合物4、5；

(3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为绿原酸，化合物3为3,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物4为4,5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物5为3,4-双咖啡酰基奎宁酸，化合物6为2′,4,4′-三羟基-6′-甲氧基查尔酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。