CN102793737B - 一种雷公藤有效部位粉末的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于治疗慢性肾炎的雷公藤有效部位粉末的制备方法，属于中药有效成分提取分离技术。本方法包括以下过程：将雷公藤根茎粉末以乙醇提取，回收溶剂，浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取后浓缩至一定体积；乙酸乙酯萃取液用2wt％-5wt％碳酸盐水溶液萃取2-3次后，回收有机层，干燥得到粉末。制得有效部位粉末萜类成分含量超过50％，有毒成分红素含量小于0.2％。本方法操作简单，生产成本低，有效成分含量高、毒性低，主要用于治疗慢性肾炎疾病。
Description
技术领域
本发明属于中药有效成分提取分离方法，具体涉及一种雷公藤有效部位粉末的制备方法。
技术背景
有关调查结果显示，我国的慢性肾病患病率在8％左右。各种慢性肾脏疾病如常见的慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、自身免疫性疾病肾损害等，给患者家庭和社会带来沉重负担。慢性肾炎是一组多病因的慢性肾小球病变为主的肾小球疾病，目前认为它可能是由于各种细菌、病毒或原虫等感染，通过免疫机制炎症介质因子及非免疫机制等引起，临床上主要采用激素、免疫抑制剂治疗。雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook.f)系卫矛科雷公藤属植物，始载于《神农本草经》，主产于我国的湖北、湖南、福建等省，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育等多种药理活性，至今已从雷公藤中分离得到了数百种化学成分，其中主要的活性成分为萜类成分，包括倍半萜生物碱、二萜以及三萜类化合物。自1977年黎磊石院士等首次报导中药雷公藤治疗肾小球肾炎以来，雷公藤已广泛用于各种原发性和继发性肾炎的治疗，并显示了独特的疗效。
雷公藤化学成分众多，药理作用复杂，其中既含有药效成分，也含有毒性成分，这使雷公藤提取物具有良好而独特的临床治疗效果，同时又导致其具有明显的毒副作用，限制了雷公藤在临床上的应用。尽量富集雷公藤提取物中的药效成分而去除无效和有毒成分，可以大大降低雷公藤提取物的毒性，同时保持其有效性，使临床用药安全得到提高。文献报道，雷公藤红素是一种毒性成分(朱晓明等，中华器官移植杂志，1996，1：21)，由此我们有针对性的除去雷公藤红素，降低其毒副作用。
现有的雷公藤制剂，其原料来源多用雷公藤的去皮根提取物。雷公藤提取物在制备工艺上有：醇提乙酸乙酯萃取法，水提氯仿萃取后柱层析方法，醇提氯仿萃取后柱层析方法等方法(专利CN 200710043857.1；CN 200910196969.X；US 5580562；夏志林等，中国医药工业杂志，1994，3，135)，这些制备方法存在如下缺点：
1.乙酸乙酯直接萃取方法，其提取有效成分复杂，有效成分含量低，不利于下一步制剂生产。
2.用柱层析方法，虽然有效成分含量高，但有机溶剂用量大，大多数情况下用到氯仿，毒性大。
3.柱层析方法中，用混合溶剂，操作复杂以及进一步回收利用困难。
4.针对性不强。雷公藤所含化学成分复杂，现有的工艺制备的原料没有根据不同疾病对化学成分成分进行有针对性的取舍，导致副作用高。
发明内容
本发明的目的是提供一种雷公藤有效部位粉末的制备方法，解决现有提取方法针对性不强，生产成本高、处理过程复杂等问题。
本发明的一种雷公藤有效部位粉末的制备方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：选用雷公藤根茎，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；
(2)醇提：将雷公藤粉末用浓度为90wt％～100wt％的乙醇回流提取2～3次，将各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏；
(3)第一次萃取：将粗提浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取1～3次，乙酸乙酯溶剂与粗提浸膏用量比为5～8mL∶1g，合并各次萃取液，浓缩萃取液至原体积的20％～40％，得到浓缩萃取液；
(4)第二次萃取：以碳酸盐水溶液对步骤(3)所得浓缩萃取液萃取2～3次，弃去碳酸盐水溶液，得到二次萃取液，用等体积的水洗二次萃取液2～3次后，回收二次萃取液溶剂，干燥得到有效部位粉末；所述碳酸盐水溶液中碳酸盐的含量为2wt％～5wt％，碳酸盐水溶液和浓缩萃取液的体积比为0.5～1.5∶1。
以上述方法制备的雷公藤有效部位粉末，萜类成分总含量超过50％，有毒成分雷公藤红素含量少于0.2％，主要用于慢性肾炎的治疗。
所述的制备方法，优选地，所述粉碎步骤中，所述雷公藤根茎为带皮的雷公藤根茎；所述步骤(4)中，所述碳酸盐为碳酸钠或碳酸钾。
本发明中所用乙醇、乙酸乙酯溶剂，可以回收以后继续使用。
本发明操作简单，有毒有机溶剂使用少，溶剂均可以方便的回收使用，生产成本低，易于工业化生产，在第二次萃取步骤中去除了毒性的酸性成分(红素)，本方法制备的粉末主要针对慢性肾炎疾病，有效成分的含量高于50％，毒副作用少。
具体实施方式
以下本发明所制备的有效部位粉末中的萜类成分中总二萜内酯，总三萜含量，倍半萜生物碱，雷公藤红素的测定如下。
总二萜内酯含量测定：
(1)对照品溶液的制备：精密称取雷公藤甲素对照品，用浓度70％的乙醇超声溶解，制备浓度为0.15mg/mL的对照品贮备液；
(2)供试品溶液的制备：取雷公藤有效部位粉末30mg，用5mL氯仿溶解后，上柱(SPE小柱，长6.0cm、直径0.8cm，填料用量1.5g，为100-200目氧化铝)，以20mL氯仿-甲醇混合溶剂(体积比95∶5)洗脱，收集流出液和洗脱液，减压蒸干，用浓度70％的乙醇超声溶解，定容至25mL；
(3)线性关系考察：分别准确移取对照品贮备液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL于具有塞子的刻度试管中，加入浓度70％的乙醇至4.0mL，再加入浓度2％的3，5-二硝基苯甲酸溶液0.5mL，浓度2％的KOH溶液0.5mL，摇匀，使之反应。测定在549nm下显色30min时的吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y＝0.0172x+0.0234，R2＝0.9991；
(4)含量测定：吸取1.0mL供试品溶液，加入浓度70％的乙醇至4.0mL，再加入浓度2％的3，5-二硝基苯甲酸溶液0.5mL，浓度2％的KOH溶液0.5mL，摇匀，使之反应。测定在549nm下显色30min时的吸光度，按下列公式计算总二萜内酯含量：
总二萜内酯含量＝(供试品吸光度/对照品吸光度)×对照品浓度×125。
总三萜含量测定：
(1)对照品溶液的制备：精密称取雷公藤内酯甲对照品，乙醇超声溶解，制备浓度为0.175mg/mL的对照品贮备液
(2)供试品溶液的制备：取雷公藤有效部位粉末5mg，5mL氯仿溶解上住(SPE小柱，长6.0cm，直径0.8cm，填料100-200目氧化铝，用量1.5g)，以20mL氯仿-甲醇混合溶液(95∶5)洗脱，收集流出液和洗脱液，减压蒸干，乙醇超声溶解，定容至25mL。
(3)线性关系考察：准确移取对照品贮备液20μL、40μL、60μL，80μL、100μL、120μL于具塞刻度试管中，吹干。加入5％香草醛-冰醋酸0.2mL、高氯酸0.8mL，60℃水浴中加热显色15min，冷却后加入冰醋酸4mL。测定在540nm下吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y＝9.9688x+0.5251，R2＝0.9926；
(4)含量测定：吸取0.1mL供试品溶液，吹干。加入5％香草醛-冰醋酸0.2mL、高氯酸0.8mL，60℃水浴中加热显色15min，冷却后加入冰醋酸4mL。测定在540nm下的吸光度，按下列公式计算总三萜含量：
总三萜含量＝(供试品吸光度/对照品吸光度)×对照品浓度×1250。
总倍半萜生物碱含量测定：
(1)对照品溶液的制备：精密称取雷公藤次碱对照品，乙醇超声溶解，制备浓度为0.4mg/mL的对照品贮备液。
(2)供试品溶液的制备：取雷公藤有效部位粉末10mg，5mL氯仿溶解上住(SPE小柱，长6.0cm，直径0.8cm，填料100-200目氧化铝，用量1.5g)，以20mL氯仿-甲醇混合溶剂(95∶5)洗脱，收集流出液和洗脱液，减压蒸干，乙醇超声溶解，定容至25mL。
(3)线性关系考察：精密吸取上述对照品贮备液0.3mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL置于5mL容量瓶中，乙醇定容，摇匀。在267nm处测定吸光度值，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：y＝0.0051x+0.0007，R2＝0.9998。
(4)含量测定：取供试品溶液1mL，定容至5mL，在267nm处测定吸光度值。按下面公式计算总生物碱的含量。
总倍半萜生物碱含量＝(供试品吸光度/对照品吸光度)×对照品浓度×125。
雷公藤红素含量测定：
(1)对照品溶液的制备：精密称取雷公藤红素对照品，甲醇超声溶解，制备浓度为0.2mg/mL的对照品贮备液。
(2)供试品溶液的制备：取雷公藤有效部位粉末15mg，用10mL乙醇溶解后，定容到25mL。溶液过0.45μm微孔滤膜后，取续滤液作为供试品溶液。
(3)线性关系考察：精密吸取上述对照品贮备液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL置于10mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀。进HPLC检测，得到红素色谱峰，并计算色谱峰峰面积大小。色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm×5um)；流动相：甲醇∶1％醋酸＝(90∶10)；流速：1.0mL/min-1；检测波长：425nm，进样量：10μL；柱温：25℃。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：Y＝13771X-7.9093(r＝0.9999)
(4)含量测定：取供试品溶液，进HPLC检测，进样量：10μL。记录峰面积，按下面公式计算雷公藤红素含量。
红素含量＝(供试品峰面积/对照品峰面积)×对照品浓度×25。
下面通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
本实施例所述雷公藤有效部位粉末的制备方法，包括以下步骤：
(1)粉碎步骤：选用雷公藤带皮根茎1.0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；
(2)醇取步骤：将雷公藤粉末用浓度为100％的乙醇回流提取2次，将2次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏70g；
(3)第一次萃取步骤：将粗提浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取1次，乙酸乙酯溶剂与粗提浸膏用量比为8mL∶1g，浓缩萃取液至原体积的40％，得到浓缩萃取液；
(4)第二次萃取步骤：以浓度为2wt％的碳酸钠水溶液对浓缩萃取液萃取3次，碳酸钠水溶液和浓缩萃取液的体积比为0.5∶1；弃去碳酸钠水溶液，得到二次萃取液，用等体积的水洗二次萃取液2次后，回收二次萃取液溶剂，干燥得到有效部位粉末15g。萜类成分为59.3％，其中总二萜内酯含量1.3％，总三萜含量14％，倍半萜生物碱为44％，雷公藤红素含量0.09％。
实施例2
本实施例所述雷公藤有效部位粉末的制备方法，包括以下步骤：
(1)粉碎步骤：选用雷公藤带皮根茎1.0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；
(2)醇取步骤：将雷公藤粉末用浓度为90wt％的乙醇回流提取3次，将各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏76g；
(3)第一次萃取步骤：将粗提浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取2次，乙酸乙酯溶剂与粗提浸膏用量比为5mL∶1g，合并各次萃取液，浓缩萃取液至原体积的20％，得到浓缩萃取液；
(4)第二次萃取步骤：以5wt％的碳酸钠水溶液对浓缩萃取液萃取2次，碳酸钠水溶液和浓缩萃取液的体积比为1∶1；弃去碳酸钠水溶液，得到二次萃取液，用等体积的水洗二次萃取液2次后，回收二次萃取液溶剂，干燥得到有效部位粉末19g；萜类成分为56％，其中总二萜内酯含量1.2％，总三萜含量15％，总倍半萜生物碱为40％，雷公藤红素含量0.11％。
实施例3
本实施例所述雷公藤有效部位粉末的制备方法，包括以下步骤：
(1)粉碎步骤：选用雷公藤带皮根茎1.0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；
(2)醇取步骤：将雷公藤粉末用浓度为90wt％的乙醇回流提取3次，将各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏76g；
(3)第一次萃取步骤：将粗提浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取3次，乙酸乙酯溶剂与粗提浸膏用量比为5mL∶1g，合并各次萃取液，浓缩萃取液至原体积的20％，得到浓缩萃取液；
(4)第二次萃取步骤：以5wt％的碳酸钠水溶液对浓缩萃取液萃取3次，碳酸盐水溶液和浓缩萃取液的体积比为1∶1，弃去碳酸盐水溶液，得到二次萃取液，用等体积的水洗二次萃取液3次后，回收二次萃取液溶剂，干燥得到有效部位粉末18g；萜类成分为57.5％，其中总二萜内酯含量1.5％，总三萜含量14％，总倍半萜生物碱为42％，雷公藤红素含量0.08％。
实施例4
本实施例所述雷公藤有效部位粉末的制备方法，包括以下步骤：
(1)粉碎步骤：选用雷公藤去皮根茎1.0kg，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；
(2)醇取步骤：将雷公藤粉末用浓度为100％的乙醇回流提取3次，将各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏45g；
(3)第一次萃取步骤：将粗提浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取2次，乙酸乙酯溶剂与粗提浸膏用量比为8mL∶1g，合并各次萃取液，浓缩萃取液至原体积的20％，得到浓缩萃取液；
(4)第二次萃取步骤：以浓度为2wt％的碳酸钾水溶液对浓缩萃取液萃取3次，碳酸钾水溶液和浓缩萃取液的体积比为1.5∶1；弃去碳酸钾水溶液，得到二次萃取液，用等体积的水洗二次萃取液3次后，回收二次萃取液溶剂，干燥得到有效部位粉末11g；萜类成分为52.5％，其中总二萜内酯含量1.5％，总三萜含量14％，总倍半萜生物碱为37％，雷公藤红素含量0.02％。
通过上述测定可以看出，本发明制备的雷公藤有效部位粉末中，活性成分萜类成分含量高，有毒成分红素含量限制在较低范围。
实施例5：
毒性实验
在临床应用中，雷公藤提取物肝毒性是常见的副反应。我们选用人正常肝细胞系HL-7702，将雷公藤粗提浸膏、雷公藤有效部位粉末溶液与肝细胞共同培养24小时，以空白溶剂作为对照(100％存活)，采用IC50(半数致死量)值来反映测试物的毒性大小，实验结果见表1。
药效评价
慢性肾炎中，系膜细胞的炎性增殖既是慢性肾炎的初期反映，也是后续病情恶化的发起者。抑制系膜细胞的增殖可以有效缓解慢性肾炎发展。取雷公藤粗提浸膏、雷公藤有效部位粉末进行抑制肾小球系膜细胞增殖实验来评价各个部位针对慢性肾炎的活性大小，采用EC50(半数有效量)来反映各个部位活性大小，实验结果见表1。
表1 实施例1各个部位毒性和活性大小
IC50越大表明毒性越小，耐受性越高；EC50越小表明活性越强，效果好，IC50/EC50值综合反映了药物的安全性，值越大表明安全范围越广，药物越安全。通过表1可以看出，本发明制备的雷公藤有效部位粉末显示良好的抑制肾小球系膜细胞增殖作用，EC50为2.42μg/mL，并且毒效比(IC50/EC50)比雷公藤粗提浸膏要大，这表明针对慢性肾炎疾病，雷公藤有效部位粉末安全性更高。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (3)
1.一种雷公藤有效部位粉末的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)粉碎：选用雷公藤根茎，干燥粉碎后制得雷公藤粉末；
(2)醇提：将雷公藤粉末用浓度为90wt％～100wt％的乙醇回流提取2～3次，将各次提取液合并后，回收乙醇，得粗提浸膏；
(3)第一次萃取：将粗提浸膏用乙酸乙酯溶剂萃取1～3次，乙酸乙酯溶剂与粗提浸膏的用量比为5～8mL∶1g，合并各次萃取液，浓缩萃取液至原体积的20％～40％，得到浓缩萃取液；
(4)第二次萃取：以碳酸盐水溶液对步骤(3)所得浓缩萃取液萃取2～3次，弃去碳酸盐水溶液，得到二次萃取液，用等体积的水洗二次萃取液2～3次后，回收二次萃取液溶剂，干燥得到有效部位粉末；所述碳酸盐水溶液中碳酸盐的含量为2wt％～5wt％，碳酸盐水溶液和浓缩萃取液的体积比为0.5～1.5∶1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述步骤(1)中，所述雷公藤根茎为带皮的雷公藤根茎。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述步骤(4)中，所述碳酸盐为碳酸钠或碳酸钾。
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