CN102787133A - 利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法。其步骤包括引物设计、PCR扩增、载体构建、遗传转化、筛选、鉴定等步骤。从真核生物酿酒酵母中克隆到的磷酸甘露糖异构酶PMI基因，以其作为筛选标记，通过农杆菌介导将PMI基因导入受体水稻，将转化后的水稻愈伤组织在不同浓度梯度甘露糖的培养基上进行筛选获得转基因植株。本发明的优点是在植物转化及筛选过程中不需要添加抗生素和除草剂，并且转基因植物本身也不含有抗生素基因或抗除草剂基因，对环境和人体安全。

Description

利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法。

背景技术

植物基因工程始于20世纪70年代，1983年烟草作为首例转基因植物成功问世，目前至少有35科200多种植物转基因获得成功。转基因研究为育种家提供了一条定向改良作物的新途径，它可以将来源于植物、动物或微生物的有益基因转入植物从而实现原品种产量、品质或抗逆性的改良。

植物转基因的筛选体系常利用抗生素基因或抗除草剂基因作为选择标记，它们的表达产物可以解除抗生素类和抗除草剂类对细胞产生的毒性，如hpt基因作为选择标记可以解除潮霉素毒性，bar基因作为选择标记能够解除草甘膦毒性，这种使转化细胞产生抗性，而非转化细胞因敏感被“杀死”的筛选策略称为“负选择***”。然而传统抗生素或抗除草剂作为筛选剂对转化细胞生长会直接产生毒害，或通过非转化褐化坏死组织释放的有毒物积累间接产生不利影响，另外有研究称该***抑制转化植株不定根的再生。

近年来转基因安全性受到多方广泛争论，而选择标记基因对生态环境及食品健康的安全性问题是关注的焦点之一，人们担心转基因植物种植过程中，抗生素基因可能转移整合到微生物基因组增加抗性病原菌数量，抗除草剂基因可能水平转移给野生近缘种而使其成为有害杂草，另外具有抗生素或除草剂抗性的标记基因的应用，可能会破坏生态平衡、危及人类健康。因此，避免利用抗生素基因或抗除草剂基因作为选择标记，又能高效筛选获得转基因植株的愿望非常迫切。解决这一问题的主要途径是开发、利用安全标记基因，用于植物的遗传转化和转基因植物的筛选，培育出对环境和人体安全、无副作用的绿色优良转基因植物新品种。

应用无争议的生物安全选择标记，与常规标记基因不同，这些标记基因没有抗生素或除草剂抗性，基因本身及编码产物参与的调控对环境和生物是安全的。生物安全标记基因方面研究较多的有绿色荧光蛋白基因gfp、核糖醇操纵子rtl、6-磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose-isomerase，PMI)基因pmi、木糖异构酶基因xylA等。

甘露糖磷酸异构酶PMI基因pmi广泛存在于细菌、酵母、动物和人类。在植物中除了肉桂和其它一些豆科植物外，都没有PMI基因，因此，PMI基因可以作为选择标记应用于植物基因转化。

植物细胞不能在以甘露糖为碳源的培养基上正常生长分化。当植物细胞在含有甘露糖的培养基中生长时，植物细胞从培养基中吸收甘露糖，并在己糖激酶的作用下将甘露糖磷酸化为6-磷酸甘露糖，不含PMI基因的细胞不能进一步利用6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖的积累一方面会消耗细胞内的无机磷酸，另一方面会抑制葡萄糖磷酸异构酶而阻碍糖酵解过程，这就使未转化的细胞在含有甘露糖的培养基上发生碳饥饿不能正常生长。而转化的细胞含PMI基因，在甘露糖磷酸异构酶的作用下将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，6-磷酸果糖能够参与糖酵解而被进一步利用，这样就使转化细胞能够以甘露糖为碳源，在含有甘露糖的培养基上正常生长，而获得代谢优势。利用这种原理，以磷酸甘露糖异构酶基因作为标记基因、以甘露糖作为筛选剂，利用糖类代谢进行筛选的PMI/甘露糖体系发展迅猛，已在许多植物的转基因研究中获得成功(Boscariol R L，Almeida WA B，Derbyshire M T V C，et al.The use of the PMI/mannose selectionsystem to recover transgenic sweet orange plants(Citrus sinensis L.Osbeck).Plant Cell Rep，2003，22：122-128；Dale P J.Spread of engineered genes to wild relatives.Plant Physiol，1992，100：13-15.；Degenhardt J，Poppe A，Montag J，Szankowski I.The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selection system to recover transgenic apple plants.Plant Cell Rep，2005，25：1149-1156；He Z，Duan Z，Liang W，Chen FJ，Yao W，Liang H，Yue C，Sun Z，Chen F，Dai F.Mannose selectionsystem used for cucumber transformation.Plant Cell Rep，2006，25：953-958；Joersbo M，DonaldsonI，Kreiberg J，et al.Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet.MolBreed，1998，4(2)：111-117；Joersbo M，Mikkelsen J D，Brunstedt J.Relationship between promoterstrength and transformation frequencies using mannose selection for the production of transgenicsugar beet.Mol Breed，2000，6(2)：207-213；Joersbo M，Petersen S G，Okkels F T.Parametersinteracting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet.PhysiolPlant，1999，105：109-115；Lee B T，Matheson N K.Phosphomannoisomerase and phosphoglucoisomerasein seeds of Cassia coluteoides and some other legumes that synthesize galactomannan.Phytochem，1984，23：983-987；Lindsey K and Gallois P.Transformation of sugar beet(Beta vulgaris)byAgrobacterium tumefaciens.J Exp Bot，1990，41：529-536；Lucca P，Ye X D，Potrykus I.Effectiveselection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent.Mol Breed，2001，7(1)：43-49；Min BW，Cho YN，Song MJ，Noh TK，Kim BK，Chae WK，Park YS，Choi YD，Harn CH.Successful genetic transformation of Chinese cabbage using phosphomannose isomerase as aselection marker.Plant Cell Rep，2007，26(3)：337-344；Negrotto D，Jolley M，Beer S，et al.The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic plants(Zeamays L.)via Agrobacterium transformation.Plant Cell Rep，2000，19(8)：798-803；Reed J，PrivallelM，Powell L，et al.Phosphomannose isomerase：an efficient selectable marker for planttransformation.In Vitro Cell Dev Boil Plant，2001，37：127-132；Sigareva M，Spivey R，WillitsMG，Kramer CM，Chang YF.An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverseeffect on the ploidy level of transgenic plants.Plant Cell Rep，2004，23：236-245；Todd R，TagueB W.Phosphomannose isomerase：A versatile selectable marker for Arabidopsis thaliana germ-linetransformation.Plant Mol Biol Rep，2001，19：307-319；Van Sehaftingen E，Jaeken J.Phosphomarmomutase deficiency is cause of earbohydrated-deficient giycoprotein syndrome typeI.FFBS letters，1995，377：318-320；Wang AS，Evans RA，Altendorf PR，Hanten JA，Doyle MC，Rosichan JL.A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants fromprotoplasts.Plant Cell Reports，2000，19：654-660；Wright M，Dawson J，Dunder E，et al.Efficientbiolistic transformation of maize(Zea mays L.)and wheat(Triticum aestivum L.)using thethe phosphomannose isomerase gene，pmi，as the seleetable marker.Plant Cell Rep，2001，20：429-436；Zhu YJ，Agbayani R，McCafferty H，Albert HH，Moore PH.Effective selection of transgenic papayaplants with the PMI/Man selection system.Plant Cell Rep，2005，24：426-432)。

但是，以上研究中所用的磷酸甘露糖异构酶基因都是来自于大肠杆菌，目前还没有利用酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为水稻等植物遗传转化的筛选标记的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种来源于酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI基因)作为水稻遗传转化的筛选标记，快速准确获得转基因植物的新方法。本发明不需要添加任何抗生素或除草剂，使用甘露糖作为转基因植物转化的筛选剂，具有对人畜和环境安全的优点，因此，本发明可以消除人们对转基因植物安全性的对筛选标记基因的担忧。更重要的是酿酒酵母是一种真核生物，它与水稻等植物的亲缘关系比大肠杆菌更近，其基因将会比来源于原核生物的大肠杆菌基因更适合于在真核生物植物中表达，发挥更高的筛选效率，提高植物遗传转化的成功率。并且，以前所用的PMI基因都来源于大肠杆菌。大肠杆菌一般是在动物肠道、粪便等环境中生存，来源于大肠杆菌的基因作为选择标记未免会引起人们的担忧，而酵母菌常用于制作面包、馒头等食品及应用于酿酒工业。从心理角度考虑，利用酵母菌种的PMI基因取代大肠杆菌中的PMI基因作为安全选择标记更容易被人们接受。

本发明通过以下技术方案实现的：

申请人建立了一种利用酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因PMI获得转基因水稻的方法，以酿酒酵母甘露糖异构酶基因PMI作安全转基因筛选标记，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的PMI基因导入受体水稻中，利用甘露糖代替抗生素或除草剂作筛选剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR和RT-PCR检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下：

1)使用XhoI限制性内切酶对质粒pCAMBIA1303进行酶切，将其中的潮霉素基因hpt切掉，得到不含潮霉素基因hpt的载体片段；

2)设计一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：

正向引物P1：5’-GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG-3’，

反向引物P2：5’-GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG-3’；

利用上述引物扩增酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶PMI基因，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；

3)将步骤2)所述的DNA片段连接到到步骤1)得到的质粒pCAMBIA1303中，构建得到表达质粒pPMI；

4)将步骤3)的表达质粒pPMI转化根癌农杆菌，得到含有pPMI质粒的根癌农杆菌，将所

述的根癌农杆菌培养于YEP培养基中，得到转化菌株；

5)将水稻种子接种在愈伤组织诱导培养基上获得愈伤组织，备用；或将获得的愈伤组织在继代培养基上继代两次，备用；

6)将步骤5)得到的愈伤组织转移至预培养的预培养基中，于暗处培养四天；

7)将步骤6)得到的愈伤组织置于含有步骤4)根癌农杆菌的侵染培养基中，侵染愈伤组织30min，农杆菌的菌液浓度OD600＝1.0，共培养3天；

8)利用甘露糖筛选培养基中的甘露糖浓度由低到高逐步筛选阳性愈伤组织；

9)将步骤8)的愈伤组织在分化培养基上诱导分化；在生根培养基上诱导生根，得到转基因水稻植株；

10)利用PCR和RT-PCR方法鉴定转基因植株；

其中

步骤5)所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D 2.5mg/L，水解酪蛋白600mg/L，30g蔗糖；3g/L Phytage；pH5.8；

将步骤6)的预培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白600mg/L，30g/L蔗糖，8g/L琼脂糖；pH5.6；

步骤7)所述的侵染培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，乙酰丁香酮100μM，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖；pH5.4

步骤7)所述的共培养培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，8g/L琼脂糖；pH5.6

步骤8)所述的甘露糖筛选培养基按以下配方和步骤制备：

第一次筛选用培养基：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖5g/L，蔗糖15g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

第二次筛选用培养基：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖11g/L，蔗糖9g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

第三次筛选用培养基：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖15g/L，蔗糖5g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

步骤9)所述的分化培养基的配方如下：

MS培养基的无机盐的大量成分，N6培养基的无机盐的微量成分，6-BA2mg/L，KT2mg/L，NAA0.2mg/L，IAA0.2mg/L，水解酪蛋白600mg/L，脯氨酸300mg/L，潮霉素50mg/L，30g/L蔗糖，03g/L Phytage；pH5.8；

步骤9)所述的生根培养基的配方如下：

1/2MS培养基，20g/L蔗糖，3g/LPhytage；pH5.8。

上述酿酒酵母PMI基因序列来自Genebank登录号：M85238所述的序列。提取酿酒酵母基因组DNA的菌株是酿酒酵母HB52(见孔林，郝勃，喻子牛，富锌酵母的选育及其培养工艺，食品与生物技术学报，2006年，第25卷第6期)。

2、转基因植株的分子生物学检测

1)PCR鉴定：

取经过甘露糖培养基筛选出来的转基因水稻的叶片，利用CTAB法抽提转pmi水稻DNA(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版，科学出版社)介绍的方法，用于扩增PMI基因的特异引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物P1：5’GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG3’，

反向引物P2：5’GCCTCGAGATAGAAAGAAAGCTAATTTGG3’；

PCR反应检测水稻基因组中有无PMI基因存在。

2)RT-PCR检测

利用Trizol方法(试剂购自上海英骏生物技术有限公司，按照产品说明书操作)抽提水稻总RNA，进行RT-PCR，检测PMI基因的转录情况。

3)GUS染色

取筛选出来的转基因水稻的根部染色，检查与PMI基因同时转入的GUS基因表达情况。GUS染色液配方(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版，科学出版社)。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因PMI基因(Genbank登录号M85238)序列，序列全长为1455bp。

图1，本发明技术路线图。

图2，本发明的植物转化载体pPMI物理图谱。

图3，本发明实施例中转基因水稻植株PCR分子鉴定结果，图中泳道序号如下：M：Marker；1、2为两个独立单株；C1为阳性对照；C2为阴性对照。

图4，本发明中实施例转基因水稻RT-PCR鉴定结果，图中泳道序号如下：M：Marker；1、2为两个独立单株；1-L、1-R、2-L分别为1号叶片、1号根和2号叶片；C1：阳性对照，以含全长酵母PMI基因的质粒为模板；C2：阴性对照，以非转pmi水稻叶片的cDNA为模板。

图5，本发明中实施例转基因水稻根部GUS染色结果。

具体实施方式

实施例1  酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶PMI基因的克隆

从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HB52(由华中农业大学生命科学技术学院郝勃教授惠赠，参见：孔林，郝勃，喻子牛，富锌酵母的选育及其培养工艺，食品与生物技术学报，2006年，第25卷第6期)提取基因组DNA，克隆得到磷酸甘露糖异构酶PMI基因。具体步骤如下：接种一环新鲜的酿酒酵母于20mL YPD液体培养基中，YPD培养液含：2％胰化蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖，30℃，180r/min振荡培养18～22h。离心收集菌体，用生理盐水重悬，离心弃上清。将收集好的菌体置于5mL离心管中，按照每0.5g菌体加入1mL裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，180mmol/L EDTA pH 8.0，1％SDS，现配)，少量菌体可采用1.5mL离心管，加适量裂解缓冲液，保证能振荡开为宜。同时加入3/10总体积的石英砂，盖紧离心管盖，在漩涡振荡器上振荡5～8min，每隔1min用力上下晃动离心管30s，使内容物混合均匀。65℃放置10min，加入600μL 7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴8min。以最大转速离心5min，转移上清至另一无菌的5mL离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L的NaAc以及0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴8min。室温下以最大转速离心收集沉淀，弃上清，用200μL TE溶解沉淀，加入适量RNase，65℃温浴10min。取出，加入200μL氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，将上清转入另一无菌的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L的NaAc以及2.5倍体积的无水乙醇，以15000rpm离心8min收集染色体DNA，70％乙醇洗涤一次，待乙醇挥发完全，用适量TE溶液或水溶解沉淀。

根据(Genebank登记号：M85238)所述的PMI基因的序列，用Primer Premier软件设计了扩增该基因的引物对的核苷酸序列，如下所示：

上游引物P1：5’GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG3’(引物的下划线部分为XhoⅠ酶切位点)；

下游引物P2：5’GCCTCGAGATAGAAAGAAAGCTAATTTGG3’(引物的下划线部分为XhoⅠ酶切位点)。

PCR反应体系：50μLPCR反应液中含：1×buffer、1.5mM/L MgCl₂、200μM/L dNTP、0.4μM/L引物、2U LA DNA聚合酶(TaKaRa)、0.1μg酵母DNA，反应条件为：94℃ 2min预变性；94℃ 30S变性，56℃45S退火，72℃ 1min 30s延伸，20个循环；72℃5min保温。将PCR产物连接到pGEM-T载体(普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上，测序。

本实验中克隆的酿酒酵母PMI基因与NCBI数据库中的PMI40(Genebank登记号：M85238)进行核苷酸序列和氨基酸序列比对，酵母PMI基因测序结果与PMI40序列存在99.4％的相似性，有9个核苷酸存在差异，1个位于内含子中，8个散布于外显子中。氨基酸序列比对结果显示开放阅读框(Open Read Frame，ORF)内有4个氨基酸的差异，第15位的Ser(Tyr)，Ser为不带电荷极性脂肪族氨基酸，Tyr为不带电荷极性芳香族氨基酸；第25位Ala(Arg)，Ala为非极性脂肪族氨基酸，Arg为带正电荷碱性氨基酸；第151位Gln(Lys)，Gln为不带电荷极性含酰胺基氨基酸；Lys为正电荷碱性氨基酸；第214位Glu(Lys)，Glu为带负电荷酸性氨基酸，Lys为带正电荷碱性氨基酸。比较发现差异氨基酸性质有明显不同，这种差异可能源于酵母菌株基因组本身，但氨基酸的差异性对PMI酶活性的影响需要进行酶活性分析。其它的DNA碱基序列的变化不会导致氨基酸种类的改变。

实施例2  PMI基因的pPMI载体的构建

申请人构建的含有PMI基因的转化载体，该载体被命名为pPMI，是由质粒pCAMBIA1303改造而成(构建流程图见图2)。pCAMBIA1303含有卡那霉素抗性基因，左右T-DNA边界之间具有与35S启动子和CaMV终止子相连的潮霉素抗性基因和与35S启动子和NOS终止子相连的GUS-GFP融合蛋白基因。含有pCAMBIA1303质粒的大肠杆菌接种在LB培养液(10％胰化蛋白胨，5％酵母提取物，10％NaCl)中，37℃ 150rpm过夜培养，提取质粒，用氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)纯化质粒。37℃过夜酶切纯化质粒，以切除潮霉素抗性基因。PCR产物纯化后同样用Xho I酶切过夜。按pCAMBIA1303质粒酶切产物1μL、PCR酶切产物3μL、T4 DNA连接酶(Promega)0.5μL，10×buffer 0.5μL，16℃连接过夜。1μL连接产物与50μL大肠杆菌DH10B电转化感受态混合，设置电转化仪电压为1800V，电击。加入800μL SOC溶液(20％胰化蛋白胨，5％酵母提取物，0.5％NaCl，250mM/L KCl，20mM/L葡萄糖)，混合后放于37℃保温5min，再37℃ 130rpm恢复培养45min-1h。取100μL培养物涂在含50mg/L卡那霉素的LB培养基(10％胰化蛋白胨，5％酵母提取物，10％NaCl，15g/L琼脂粉)上，待水分吸干后放于37℃烘箱倒置培养16h。挑取菌斑接种于500μL含50mg/L的LB培养液中，37℃150rpm过夜培养。以1mL菌液为模板，用引物P1、P2检测酵母PMI基因是否***，用引物P3：5’CCCTTATCTGGGAACTACTC3’，P4：5’TTCGACAGGTCCTCTGGT3’检测***的方向是否与质粒载体上的启动子方向一致。培养并保存***方向正确的克隆。构建好的载体见图2。将构建好的载体通过电转化导入农杆菌EHA105(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻组林拥军教授惠赠)。

实施例3  水稻遗传转化与筛选

本发明的受体植物是水稻(Oryza Sativa L)品种牡丹江8号，该品种的种子由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻组林拥军教授提供。本实施例的遗传转化的方法是：先去除谷壳，用70％乙醇浸泡1min，再用0.15％的升汞消毒20min，然后经无菌水洗3-4次接种至水稻愈伤组织诱导培养基，26℃暗培养诱导愈伤。经35-40天，取生活力强、淡黄色颗粒状愈伤转入继代培养基，26℃暗处继代培养，继代1-2次的胚性愈伤便可进行农杆菌介导的遗传转化实验。取继代培养2次、生活力强质地致密的淡黄色愈伤颗粒接入预培养培养基，暗处预培养4天。预培养结束前2天，农杆菌EHA105(pPMI)在LB平板上划线，28℃暗处静置培养2天。预培养结束，将LB平板上的农杆菌刮入活化培养基，28℃振荡培养3-4h，调整菌液OD值为1.0左右。活化后的农杆菌菌液浸泡预培养水稻愈伤0.5h，后倒去菌液，将侵染后的愈伤放在灭菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养培养基，20℃暗处培养3天。共培养3天后，愈伤组织经无菌水冲洗3-5遍，凉干后接入含甘露糖(选择压)筛选培养基上筛选培养，每2周继代筛选1次。将筛选获得的甘露糖及潮霉素抗性愈伤接入预分化培养基，26℃暗培养1周后转入分化培养基，26℃，光照强度为2000Lux，约3-4周分化出幼芽。将分化得到的幼苗转入生根培养基，待根系健壮发达后炼苗移栽到土钵中。

愈伤组织诱导培养基按以下配方：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D 2.5mg/L，水解酪蛋白600mg/L，30g蔗糖；3g/L Phytage；pH5.8；

预培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白600mg/L，30g/L蔗糖，8g/L琼脂糖；pH5.6；

侵染培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，乙酰丁香酮100μM，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖；pH5.4。

共培养培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，8g/L琼脂糖；pH5.6。

甘露糖筛选培养基按以下配方和步骤制备：

第一次筛选用培养基：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖5g/L，蔗糖15g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

第二次筛选用培养基：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖11g/L，蔗糖9g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

第三次筛选用培养基：

KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖15g/L，蔗糖5g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

分化培养基按以下配方和步骤制备：

MS培养基的无机盐的大量成分，N6培养基的无机盐的微量成分，6-BA2mg/L，KT2mg/L，NAA0.2mg/L，IAA0.2mg/L，水解酪蛋白600mg/L，脯氨酸300mg/L，潮霉素50mg/L，30g/L蔗糖，03g/L Phytage；pH5.8；

生根培养基按以下配方和步骤制备：

1/2MS培养基，20g/L蔗糖，3g/LPhytage；pH5.8。

上述愈伤组织的继代培养基的成分如愈伤组织诱导基成分相同。

实施例4  转基因水稻的鉴定

1)PCR鉴定：

取经过甘露糖培养基筛选分化的转基因水稻的叶片，利用CTAB法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版，科学出版社)抽提叶片总DNA，设计了扩增PMI基因的特异引物，其核苷酸序列如下所示：

P1：5’GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG3’，

P2：5’GCCTCGAGATAGAAAGAAAGCTAATTTGG3’；

PCR检测水稻基因组中有无PMI基因存在。结果见图3。表明经过筛选的转基因水稻植株，其DNA整合了PMI基因，扩增出一条1.5kb左右的条带，而未转化的对照植株则没有这条DNA谱带。

2)RT-PCR检测

利用Trizol方法(试剂购自上海英骏生物技术有限公司，按照产品说明书操作)抽提水稻总RNA并进行RT-PCR，检测PMI基因的转录情况。结果见图4。电泳图谱表明，与基因组DNA的扩增产物相比，RNA的RT-PCR的结果要小约100bp，进一步检查是酿酒酵母PMI基因长93bp的内含子序列被成功剪切。真核生物内含子都有一些共同的特征，在内含子和外显子交界处分别有两个高度保守的碱基，5’端为GT(mRNA中对应为GU)，3’端为AG，只有少数基因例外，酵母PMI基因在水稻细胞中被切除的内含子符合真核生物内含子的特征，说明酵母pmi在水稻愈伤中发生转录，内含子被正确剪切，水稻的mRNA剪接***可识别酵母基因的内含子并准确加工。

3)GUS染色

GUS染色结果图5显示：水稻根被染成蓝色，而对照没有颜色变化，说明含有酵母PMI基因和GUS基因的T-DNA一起稳定整合到水稻基因组中，GUS基因在转化水稻的根部表达。

Claims (1)

1.一种利用酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因PMI获得转基因水稻的方法，其特征在于，以酿酒酵母甘露糖异构酶基因PMI作安全转基因筛选标记，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的PMI基因导入受体水稻中，利用甘露糖代替抗生素或除草剂作筛选剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR和RT-PCR检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下：

1)使用XhoI限制性内切酶对质粒pCAMBIA1303进行酶切，将其中的潮霉素基因hpt切掉，得到不含潮霉素基因hpt的载体片段；

2)设计一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：

正向引物P1：5′-GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG-3′，

反向引物P2：5′-GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG-3′；

利用上述引物扩增酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶PMI基因，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；

3)将步骤2)所述的DNA片段连接到到步骤1)得到的质粒pCAMBIA1303中，构建得到表达质粒pPMI；

4)将步骤3)的表达质粒pPMI转化根癌农杆菌，得到含有pPMI质粒的根癌农杆菌，将所述的根癌农杆菌培养于YEP培养基中，得到转化菌株；

5)将水稻种子接种在愈伤组织诱导培养基上获得愈伤组织，备用；或将获得的愈伤组织在继代培养基上继代两次，备用；

6)将步骤5)得到的愈伤组织转移至预培养的预培养基中，于暗处培养四天；

7)将步骤6)得到的愈伤组织置于含有步骤4)根癌农杆菌的侵染培养基中，侵染愈伤组织30min，农杆菌的菌液浓度OD600＝1.0，共培养3天；

8)利用甘露糖筛选培养基中的甘露糖浓度由低到高逐步筛选阳性愈伤组织；

9)将步骤8)的愈伤组织在分化培养基上诱导分化；在生根培养基上诱导生根，得到转基因水稻植株；

10)利用PCR和RT-PCR方法鉴定转基因植株；

其中

步骤5)所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方：

KNO₃ 2830mg/L，NH₄SO₄ 463mg/L，CaCl₂·2H₂O 166mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄400mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，H₂BO₃0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D 2.5mg/L，水解酪蛋白600mg/L，30g蔗糖；3g/L Phytage；pH5.8；

将步骤6)的预培养基按以下配方制备：

KNO₃ 1415mg/L，NH₄SO₄ 231.5mg/L，CaCl₂·2H₂O 83mg/L，MgSO₄·7H₂O 92.5mg/L，KH₂PO₄ 200mg/L，FeSO₄·7H₂O 13.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 2.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI 0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白600mg/L，30g/L蔗糖，8g/L琼脂糖；pH5.6；

步骤7)所述的侵染培养基按以下配方制备：

KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4 200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI 0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，乙酰丁香酮100μM，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖；pH5.4

步骤7)所述的共培养培养基按以下配方制备：

KNO₃ 1415mg/L，NH₄SO₄ 231.5mg/L，CaCl₂·2H₂O 83mg/L，MgSO₄·7H₂O 92.5mg/L，KH₂PO₄ 200mg/L，FeSO₄·7H₂O 13.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 2.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8mg/L，H₂BO₃ 0.4 KI 0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，8g/L琼脂糖；pH5.6

步骤8)所述的甘露糖筛选培养基按以下配方和步骤制备：

第一次筛选用培养基：

KNO₃ 2830mg/L，NH₄SO₄ 463mg/L，CaCl₂·2H₂O 166mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 400mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，H₂BO₃ 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖5g/L，蔗糖15g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

第二次筛选用培养基：

KNO₃ 2830mg/L，NH₄SO₄ 463mg/L，CaCl₂·2H₂O 166mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 400mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，H₂BO₃ 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖11g/L，蔗糖9g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

第三次筛选用培养基：

KNO₃ 2830mg/L，NH₄SO₄ 463mg/L，CaCl₂·2H₂O 166mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 400mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，MnSO₄·4H₂O 4.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，H₂BO₃ 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4-D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖15g/L，蔗糖5g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；

步骤9)所述的分化培养基的配方如下：

MS培养基的无机盐的大量成分，N6培养基的无机盐的微量成分，6-BA2mg/L，KT2mg/L，NAA0.2mg/L，IAA0.2mg/L，水解酪蛋白600mg/L，脯氨酸300mg/L，潮霉素50mg/L，30g/L蔗糖，03g/L Phytage；pH5.8；

步骤9)所述的生根培养基的配方如下：

1/2MS培养基，20g/L蔗糖，3g/LPhytage；pH5.8。

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