CN102787100B - 一种高繁殖能力猪圆环病毒2型毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高繁殖能力猪圆环病毒2型毒株及其应用，猪圆环病毒2型毒株，命名为PCV2-ZJ/H株，保藏号为CGMCC No.6391，基因序列如SEQ ID NO：1所示，该毒株基因组核苷酸序列中的1376位点的核苷酸缺失。本发明病毒具有高繁殖能力，在PK-15细胞中的病毒效价(TCID₅₀)达到10^7.6/mL，比亲本病毒(10^6.3/mL)的毒价高出10倍以上，利用它制得的疫苗具有良好的免疫保护力。

Description

一种高繁殖能力猪圆环病毒2型毒株及其应用

技术领域

本发明属于病毒学领域，具体涉及一种利用病毒分子遗传学技术改造获得的高繁殖能力的猪圆环病毒2型新毒株及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

根据猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)的致病性、抗原性及核苷酸序列，可将其分为两个基因型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。

PCV2是近十年新出现的一种可引起猪圆环病毒病(Porcine circovirusvirus-associated disease，PCVAD)的病毒。PCV2对猪的致病性以免疫***的损伤为特征，使感染猪处于严重免疫抑制状态，临床上主要表现为消瘦、***肿大等病变，与多种病原混合感染还可导致多***衰竭、呼吸困难、繁殖障碍等。

猪圆环病毒属圆环病毒科圆环病毒属。在电镜下，PCV2是一种无囊膜的呈二十面体对称的圆形小颗粒病毒，直径17nm，具有单股环状的DNA基因组。对氯仿、碘酒、酒精等有机溶剂不敏感，可在70℃稳定存活15分钟。但对苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化剂等试剂较敏感。

目前已发现1768、1767个核苷酸组成的不同基因组大小的PCV2毒株，二者的核苷酸同源性在90％以上。PCV2基因组研究可将PCV2分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因亚型，三型之间基因组核苷酸和氨基酸同源性均在95％左右。

PCV2基因组含有11个阅读框，即ORF1～ORF11，各阅读框大小相差悬殊。其中ORF1、ORF5、ORF7、ORF10的5’-3’方向相同，ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11的5’-3’方向相同，这些阅读框表现为基因部分重叠，可充分利用圆环病毒有限的遗传物质。

近来年，PCV成为国内外学者的研究热点，很多学者采用不同方式构建了PCV1及PCV2的感染性克隆，并将其拯救出的重组病毒应用于相关研究中。授权公告号为CN101423836B的中国发明专利公开了一种猪圆环病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和应用，该发明将猪圆环病毒1型的2个基因组顺式连接***到pUC19载体中构建获得感染性分子克隆，并在该感染性克隆中***Sal I酶切位点作为分子靶标，所拯救出的重组病毒带有分子靶标，可用PCR结合RFLP将其与亲本病毒相鉴别，并将该拯救病毒用于制备检测猪圆环病毒1型抗体的试剂或药物中。

目前，PCV2感染引起的猪圆环病毒病给全球养猪业造成巨大损失，病毒感染产生的免疫抑制能够导致现有疫苗免疫失败，造成多种病原混感，并使疫病流行更加严重。采用疫苗免疫已成为控制PCV2相关疾病的关键，是减少经济损失的有效方法。PCV2体外培养时病毒滴度低，是疫苗价格高昂的根本原因，也是当今疫苗研制的最大障碍。

发明内容

本发明提供了一种具有高繁殖能力(高滴度)的猪圆环病毒2型新毒株，解决了现有PCV2毒株繁殖能力差，应用于开发疫苗成本高的问题。

一种猪圆环病毒2型毒株，命名为猪圆环病毒2型ZJ/H株，简写为PCV2-ZJ/H株，该毒株于2012年7月17日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6391。

所述猪圆环病毒2型毒株通过方法制得：

(1)以PCV2-HZ0201病毒的基因组DNA为模板，以FSAC和RSAC为引物扩增PCV2全基因序列，然后凝胶纯化回收试剂盒纯化PCR产物，连接到质粒pMD18-T，转化Top10感受态细胞，获得重组质粒pMD-HZ0201。

FSAC：GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT

RSAC：GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA

(2)以构建好的pMD-HZ0201质粒为模板，利用核苷酸缺失特异性引物进行Dpn I定点诱变扩增，然后凝胶纯化回收试剂盒纯化PCR产物，连接到质粒pMD18-T，转化Top10感受态细胞，获得重组质粒pMD-ZJ/H。

(3)经过序列测定正确的pMD-ZJ/H重组质粒，用限制性内切酶Sac II酶切，用T4DNA连接酶环化，再将环化质粒用lipofectamine^TM 2000转染PK-15细胞，收获病毒粒子的细胞培养物。

(4)然后通过间接免疫荧光试验(IFA)方法验证拯救的病毒PCV2ZJ/H。对拯救的病毒进行传代，用间接免疫荧光方法测定不同代次的病毒半数感染量(TCID₅₀)，比较拯救病毒与亲本病毒在PK-15细胞上的繁殖能力。经过细胞传代培养和IFA测定，拯救出的PCV2-ZJ/H病毒粒子在PK-15细胞中的病毒效价(TCID₅₀)达到10^7.6/mL，比亲本病毒(10^6.3/mL)的毒价高出10倍以上。

本发明还提供了一种所述猪圆环病毒2型PCV2-ZJ/H毒株的基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，相对于野生型毒株，该毒株基因组核苷酸序列中的1376位点的核苷酸缺失。

本发明又提供了一种包含所述基因的重组载体，所述载体的原始载体可以是pMD18-T。

本发明还提供了所述猪圆环病毒2型ZJ/H株在制备灭活疫苗中的应用，所述灭活疫苗主要用于预防动物感染猪圆环2型病毒，所述动物可以是猪。

本发明提供了一种利用所述猪圆环病毒2型ZJ/H株制备灭活疫苗的方法，包括：

以猪圆环病毒2型ZJ/H株为毒种制备病毒液，病毒液经灭活、稀释后与佐剂混合，即制得灭活疫苗。

所述病毒液的效价为大于10^7.0TCID₅₀/mL。

所述灭活采用试剂为β-丙内酯，其在病毒液中终浓度一般为0.05～1.0％。

所述免疫佐剂一般选用矿物油类佐剂、天然药物类佐剂或铝胶佐剂，所述矿物油累佐剂可以选用ISA206VG，佐剂与稀释后的病毒液体积比一般为5∶5～9∶1。

本发明提供利用所述猪圆环病毒2型ZJ/H株制的备灭活疫苗。

本发明通过核苷酸缺失、基因移码技术和感染性克隆技术人工制造了一株具有高繁殖能力的猪圆环病毒2型新毒株，为推动PCV2的疫苗开发提供了新的毒种资源。

本发明病毒具有高繁殖能力，在PK-15细胞中的病毒效价(TCID₅₀)达到10^7.6/mL，比亲本病毒(10^6.3/mL)的毒价高出10倍以上，利用它制得的疫苗具有良好的免疫保护力。

附图说明

图1为突变体以及HZ0201正常基因的SacII酶切鉴定图(M泳道：DNAMarker；泳道A-D：突变体克隆酶切；

图2为1376位点缺失体拯救后的PCV2/Cap蛋白单克隆抗体检测；

图3为PCV2-ZJ/H株繁殖能力测定图。

具体实施方式

实施例1 核苷酸位点1376缺失突变株感染性克隆构建与鉴定

1.1病毒、细胞和质粒

PCV2-HZ0201株(Genbank NO.AY188355)，大肠杆菌菌株TG1、载体pMD18-T、PCV阴性PK-15细胞系、PCV2/Cap蛋白单克隆抗体、FITC羊抗鼠IgG，均为试验材料，无特异性要求。

其中，PCV2/Cap蛋白单克隆抗体、FITC羊抗鼠IgG的制备可以参考文献(Shang SB et al.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins ofporcine circovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2.Molecular Immunology.2009.46：327-334)，其余为市售产品。

1.2引物设计与合成

根据GenBank中提供的PCV2-HZ0201株序列，针对1376～1379bp设计连续的单核苷酸缺失。应用Prime5.0生物软件，设计合成1对扩增PCV2基因组全长的引物FSAC和RSAC，表中划线部分为SacII酶切位点；1对扩增ORF2的引物FORF2和RORF2；4对构成单核苷酸缺失的引物，F1376/R1376造成1376位点缺失，扩增产物命名为A；F1377/R1377造成1377位点缺失，扩增产物命名为B；F1378/R1378造成1378位点缺失，扩增产物命名为C；F1379/R1379造成1379位点缺失，扩增产物命名为D。

具体引物序列如表1所示，引物均由上海生工生物工程公司合成，用前溶解于灭菌超纯水中至终浓度10μmol/L，-20℃保存备用。

表1  PCR扩增所用引物

引物名称	引物序列(5′→3′)
		F1376	GAATAACAGCACTGAGCCCACTCCCCT
R1376	AGTGGGCTCAGTGCTGTTATTCT
		F1377	CTAGAATAACAGCACTGGGCCCACTCC
R1377	AGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTA
		F1378	CTAGAATAACAGCACTGGACCCACTC
R1378	GAGTGGGTCCAGTGCTGTTATTCTA
		F1379	CTAGAATAACAGCACTGGAGCCACT
R1379	GAGTGGCTCCAGTGCTGTTATTCTA
		FSAC	GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT
RSAC	GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA
		FORF2	GAGGATCCATGACGTATCCAAGGAGG
RORF2	GCCCTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGG

1.3PCV2全基因组扩增及纯化

将PCV2-HZ0201株(10^5.75TCID₅₀/mL)以1∶10悬浮接种到PK15细胞中，感染后72h收毒，将细胞放置-70℃冰箱反复冻融三次，收集细胞培养液，12,000r/min离心5min，取上清病毒液抽提病毒DNA。以上述抽提的PCV2-HZ0201株病毒DNA为模板，利用特异性引物FSAC和RSAC扩增PCV2基因组全长。

PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer，FSAC和RSAC引物各0.5μL，0.5μLdNTP，0.12μl Probest DNA polymerase，质粒模板≤200ng，去离子水补足至25μL。充分混匀后，进行PCR。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，35个循环[94℃变性15s，55℃退火45s，72℃延伸2min]，72℃总延伸10min。

得到的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后凝胶纯化回收试剂盒(AXYGEN AP-GX-250)纯化PCR产物，与载体pMD18-T连接构建pMD-HZ0201质粒模板。

1.4单核苷酸缺失突变体构建

以构建好的pMD-HZ0201质粒为模板，利用表1中的4对构成单核苷酸缺失的引物分别进行Dpn I定点诱变得到不同位点单核苷酸缺失基因序列。

PCR反应体系：2.5μL 10×PCR buffer，上下游引物各0.5μL，0.5μLdNTP，0.12μl Probest DNA polymerase高保真酶，质粒模板≤200ng，ddH₂O补足至25μL。

PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸5min，15个循环；72℃总延伸10min。

得到的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定；将PCR产物(不同位点单核苷酸缺失基因序列)分别连接pMD18-T质粒进行测序鉴定，得到不同单核苷酸缺失重组质粒。

1.5单核苷酸缺失病毒拯救

对抽提的单核苷酸缺失重组质粒进行SacII酶切，酶切鉴定结果如图1所示，回收点缺失后的基因，回收的目的基因即为带有SacII酶切位点末端的DNA，在灭菌的EP管内加入T4连接酶连接环化病毒。

连接体系为：T4DNA连接酶1μL，酶切回收的目的基因≥1μg，连接Buffer 1μL，混匀后，于16℃连接过夜。

连接产物用脂质体2000(invitrogen)转染PK-15细胞；转染后的细胞吸取培养液；用PBS清洗3次。每孔加入适量甲醇/丙酮(1∶1)覆盖细胞表面，-20℃固定20min，弃去固定液，在通风处晾干。加入5％的脱脂奶2mL，封闭40～60min。弃去脱脂奶，分别将抗PCV2/Cap蛋白单克隆抗体在脱脂奶内稀释到适当比例，加入孔内，孵育60min。弃去混合液，用PBS清洗3次，每次3min。

将FITC羊抗鼠IgG在脱脂奶内稀释到适当比例，加入孔内，再次孵育60～90min。弃去混合液，用PBS清洗3次，每次3min。清洗完，每孔加入100μL的防猝灭剂，放置荧光显微镜下观察。结果如图2所示，1376～1379点缺失病毒转染后的P0代传代到P1代后，1376位点缺失病毒能继续传代，且各代次均能检测到荧光，说明病毒拯救成功。

将基因组中1376位点缺失的病毒毒株命名为猪圆环病毒(Porcine circovirus)2型ZJ/H株，该毒株于2012年7月17日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6391。

实施例2单位点核苷酸缺失毒株的体外复制能力

2.1试验方法

通过对原代和传代病毒的间接免疫荧光(IFA)的检测，得到拯救成功的突变病毒。将突变病毒P0代感染PK-15细胞，37℃培养72h后，放置-70℃，反复冻融三次，用滤器过滤除菌后收集病毒液。以1∶10悬浮接种PK-15细胞，进行病毒的传代培养。连续在PK-15细胞内培养8代至毒价稳定。

2.2繁殖能力测定将拯救成功的PCV2-ZJ/H病毒以1∶10感染PK-15细胞进行传代培养，此过程中，病毒的毒力逐渐增强，连续传代培养8代至毒价稳定，对各病毒进行复制能力测定。每一代均测所培养病毒的TCID₅₀。

分别取PCV2-ZJ/H的病毒液用MEM稀释，从10^-1至10^-10，共10个梯度，将稀释好的病毒液加入到96孔板中(每孔100μl)，每个样品设4个重复孔；于5％CO₂和37℃条件下培养72h；用PBS洗三遍，固定液于-20℃固定20min；5％的脱脂奶37℃封闭2h；加入PCV2/Cap蛋白单克隆抗体；用PBST冲洗3次，加入FITC标记的羊抗猪IgG，37℃作用1h；用PBST洗3次，荧光显微镜观察是否产生绿色荧光；按Reed-Muench方法计算每代培养病毒的TCID₅₀。

结果如图3所示。PCV2-ZJ/H株(1376位点缺失病毒)在传代到第8代后病毒的TCID₅₀已达到10^7.6/mL，野生毒株PCV2-HZ0201的TCID₅₀为10^6.3/mL，拯救的PCV2-ZJ/H病毒比野生型毒株高10倍以上。

实施例3本发明毒株制备的灭活疫苗对小鼠的保护力试验

应用清洁级Balb/C小鼠对PCV2-ZJ/H株的免疫原性进行测定。

3.1用本发明毒株制备灭活疫苗

将效价大于10^7.0TCID₅₀/ml的PCV2-ZJ/H株病毒液用终浓度为0.05％β-丙内酯在4℃灭活48小时，37℃水浴2小时，将灭活的毒液以MEM培养液进行适当稀释，按3∶1(v/v)比例，将毒液与ISA206VG佐剂(法国赛比克)混合、乳化，制备成水包油型PCV2-ZJ/H株灭活疫苗。

3.2试验动物及试验方案

PCV2抗原及抗体检测阴性的8周龄清洁级BALB/C小鼠随机分组，每组10只。攻毒后观察小鼠的食欲、健康状况。于攻毒前断尾采血和攻毒后剖杀采血，分离血清。免疫后第21天用PCV2-ZJ/H株攻击，每只腹腔注射0.2ml，攻毒21天时剖杀取脾组织，组织用于病毒分离。

3.3疫苗的小鼠免疫效力评价

将小鼠组织称重，按1∶20比例加入MEM无血清培养基、用组织研磨器25次/s震荡研磨3min，研磨完毕冻融3次后，离心取上清，过滤除菌收集。PK15细胞单层用PBS冲洗，0.05％的胰酶置37℃消化5～8分钟，用MEM培养基配制成浓度为1×106/ml的细胞悬液，细胞悬液按10∶1的比例与小鼠组织研磨虑液混合后接种12孔细胞板，置37℃培养箱培养72小时后，收获细胞冻融3次。连续盲传三代。

盲传1～3代的细胞培养单层，弃细胞上清，细胞单层用1∶1冷丙酮-甲醇液于-20℃固定30分钟。在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBST稀释的PCV2/Cap蛋白单克隆抗体，37℃下孵育；PBST清洗；加FITC标记的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；直接在倒置荧光显微镜下观察。结果显示，不免疫攻毒小鼠脾脏的病毒分离率为80％；0.2ml剂量组在免疫后21天攻毒的病毒分离阳性率为20％。

实施例4本发明毒株制备的灭活疫苗对仔猪的保护力试验

应用PCV2抗体和抗原阴性的健康仔猪，对PCV2-ZJ/H株的免疫原性进行了测定。

4.1本发明毒株的灭活与乳化

将效价为大于10^7.0TCID₅₀/ml的PCV2-ZJ/H株病毒液用终浓度为0.05％β-丙内酯在4℃灭活48小时，37℃水浴2小时。将灭活的毒液进行适当稀释，按3∶1(v/v)比例，将毒液与ISA206VG佐剂(法国赛比克)混合、乳化，制备成水包油型PCV2-ZJ/H株灭活疫苗。

4.2试验动物及试验方案

选择PCV2抗体和抗原阴性的14～18日龄健康仔猪12头，随机分为2组，每组5头。第1肌肉注射PCV2-ZJ/H株灭活疫苗，2ml/头；第2组不注射疫苗的空白对照组。免疫后第21天用PCV2-ZJ/H株攻击，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml。免疫后第7、14天采血。攻毒后第14天剖杀各组动物，采集肺脏、脾脏、肺门***、下颌***、肩前***、腹股沟***、肠系膜***、髂***，进行PCV2病毒分离。

4.3疫苗的仔猪免疫效力评价

将组织匀浆(1∶3)用0.22μm滤膜过滤除菌，按1∶10比例接种新鲜消化的PK-15细胞，于37℃、5％CO2条件下培养72h后收获细胞培养物，反复冻融三次后，接种下一代。

连续盲传1-3代的细胞单层，弃细胞上清。细胞单层用1∶1冷丙酮-甲醇液于-20℃固定30分钟。细胞单层用1∶1冷丙酮-甲醇液于-20℃固定30分钟。在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBST稀释的PCV2/Cap蛋白单克隆抗体，37℃下孵育；PBST清洗；加FITC标记的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；直接在倒置荧光显微镜下观察。

实验结果如表2所示，疫苗免疫组病料在PK-15细胞传代3次后，除了1头猪肺脏分离到PCV2病毒，其他组织均未分离到病毒，保护率为80％。未用疫苗免疫的空白对照组病料在PK-15细胞传代2次，均能分离到病毒，病毒分离阳性率为100％(5/5)。不同组织的病毒分离结果显示(表2)，攻毒后不同组织病毒分离阳性率有很大差异，以腹股沟***和肺脏病毒分离阳性率为最高，而髂***、肠系膜***、肩前***病毒分离阳性率最低。

表2  仔猪不同组织PCV2再分离结果

注：*分子为病毒分离阳性动物数量，分母为免疫动物数量。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒2型毒株，其特征在于，命名为猪圆环病毒（Porcine circovirus）2型ZJ/H株，保藏号为CGMCC No.6391。

2.如权利要求1猪圆环病毒2型毒株的基因，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种包含权利要求2所述基因的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，原始载体为质粒pMD18-T。

5.如权利要求1所述猪圆环病毒2型毒株在制备灭活疫苗中的应用。

6.一种利用如权利要求1所述猪圆环病毒2型毒株制备灭活疫苗的方法，包括：

以猪圆环病毒2型ZJ/H株为毒种制备病毒液，病毒液经灭活、稀释后与佐剂混合，即制得灭活疫苗。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭活所采用试剂为β-丙内酯。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒液的效价大于10^7.0TCID₅₀/mL。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述佐剂为ISA206VG。

10.如权利要求6～9任一所述方法制备的灭活疫苗。

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