CN102783579A - 约氏乳杆菌在提高蛋雏鸡生产性能中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了约氏乳杆菌CGMCC No.4926在提高蛋雏鸡生产性能中的应用。将所述的约氏乳杆菌以1.0×10⁴~10⁸cfu/g的剂量添加到饲料中，对提高饲料转化率，从而降低蛋雏鸡料肉比方面有显著的作用。

Description

约氏乳杆菌在提高蛋雏鸡生产性能中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌菌株CGMCC 4926在提高蛋雏鸡生产性能中的应用。

背景技术

约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）属于厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌纲（Bacilli）乳杆菌目（Lactobacillales）乳杆菌科（Lactobacillaceae）乳杆菌属（Lactobacillus），1980年首次被分离，然而在分类学上一直将其划分为嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）。1992年Fujisawa等通过生化实验和DNA杂交实验将其定名为约氏乳杆菌。约氏乳杆菌主要存在于动物和人的消化道中，且为优势菌群。

欧盟食品***（EFSA）会分别于2009年和2011年三次发布了针对约氏乳杆菌的健康申明，申明指出约氏乳杆菌具有减少肠道内病原菌的微生物，增强天然防御和免疫***和保持皮肤健康。并且欧盟对约氏乳杆菌进行了安全资格认定（qualified presumption ofsafety,QPS）批准其在饲料和食品中使用。综合目前关于约氏乳杆菌的文献报道，其对动物的益生功能主要体现在以下几方面：1.约氏乳杆菌对动物天然防御***及免疫机能具有调节作用，其具体调控位点，如TGFβ，TLR9，NF-κB，IgA，往往是动物机体免疫应答反应的起始受体，因此其预防动物疾病的作用机理可能是在特定时期刺激动物免疫***，早期激活下游免疫应答进而防止疾病发生；2.约氏乳杆菌表现出对动物皮炎的特异性预防作用。3.约氏乳杆菌对病原菌的排他性竞争作用。约氏乳杆菌对一些病原菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌在肠道上皮细胞上的定殖产生空间位阻，可防止病原菌对肠道上皮细胞的侵染，减少疾病发生。

2010年我国***办公厅将约氏乳杆菌收录到《可用于食品的菌种名单》中，批准其作为具有益生功能的食品添加剂使用。目前在国内尚未见有将约氏乳杆菌作为添加剂添加食品和饲料添加剂的产品面世，其在动物畜禽养殖上的应用也鲜见报道，将约氏乳杆菌开发成动物微生态饲料添加剂，为填补国内空白，筛选益生性能优良的约氏乳杆菌，对促进我国畜禽养殖水平，保证我国的粮食安全意义重大，可在畜禽养殖中发挥更大作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供约氏乳杆菌CGMCC No.4926在提高蛋雏鸡生产性能中的应用。

本发明的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，是通过体外耐酸和耐胆盐筛选得到的一株均有潜在益生功能的约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12。

其中，所述的约氏乳杆菌YS-12的筛选过程如下：

（1）收集菌种

截取健康猪结肠后半段，用生理盐水冲洗三次，用牙签多次挂取肠道上皮上的附着物，放入10mL的生理盐水中，作为样品原液，对原液进行10倍梯度稀释。

（2）菌种培养

将每个稀释度，取100微升涂布于MRS平板上，37℃倒置培养24小时。

（3）菌种鉴定

挑取平板上的单菌落进行对其16S rRNA进行菌落PCR鉴定，通过在数据库中进行序列比对，发现其16S序列（GenBank登录号：HQ641209），进一步通过理化实验证实其为约氏乳杆菌。

（4）菌种筛选

1）将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10^-2，用移液器吸取10^-2稀释液100微升分别加入900微升0.3%的胆盐溶液和PBS（对照）中，37℃保温3小时。

2）将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10^-2，用移液器吸取10^-2稀释液100微升分别加入900微升pH3.0的缓冲液和PBS（对照）中，37℃保温3小时。

3）将酸处理过的菌液继续稀释至10^-5，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度（对照组稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6）各0.1ml涂布MRS平板，37℃倒置培养48小时。挑取耐受性菌株进行反复筛选，得到耐酸和耐胆盐性能优良的约氏乳杆菌。

将约氏乳杆菌CGMCC No.4926单独或制备成制剂添加到蛋雏鸡的基础日粮中，饲喂后可显著降低蛋雏鸡料肉比。

在本发明的一个实施方案中，在蛋雏鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁴~10⁸cfu，优选每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁴cfu、1.0×10⁵cfu、1.0×10⁶cfu、1.0×10⁷cfu、1.0×10⁸cfu，与对照组相比均显著提高生产性能，提高饲料转化率，从而降低料肉比。

在一个优选的实施方案中，所述的约氏乳杆菌制剂可为本领域常规制剂，优选为约氏乳杆菌冻干剂。

其中，所述约氏乳杆菌冻干剂还可含有冻干保护剂，优选的冻干保护剂为质量比为2:2:4:1:2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油。

其中，所述约氏乳杆菌冻干剂的制备方法如下：

1）将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1%接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养8~10小时后作为种子液；

2）以5%～10%的接种量将步骤1）所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3）发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～14小时，发酵过程不通气或通入N₂，维持溶氧小于1%；

4）当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值（即OD600）不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹¹cfu/ml以上的发酵液；

5）4000-8000转/分钟离心5-10分钟，得到约氏乳杆菌菌泥；

6）得到的产物按照菌泥(g):保护剂(mL)质量体积比1:5加入冻干保护剂，进行真空冷冻干燥，得到约氏乳杆菌冻干剂。

本发明的约氏乳杆菌CGMCC No.4926以适当的剂量适当的剂量添加饲料中对提高蛋雏鸡生产性能，降低料蛋比方面有显著的作用。其中，尤以在基础日粮中添加1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸cfu/g的约氏乳杆菌CGMCC No.4926效果最为显著。

本发明中的约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101）保藏，保藏日期为2011年6月8日，保藏号为CGMCC No.4926。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1约氏乳杆菌CGMCC No.4926冻干剂的制备

1）将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1%接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；

2）以5%的接种量将步骤1）所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3）发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入氮气，维持溶氧小于1%；

4）当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值（即OD600）不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹¹cfu/ml以上的发酵液；

5）8000转/分钟离心10分钟，得到约氏乳杆菌菌泥；

6）得到的产物按照菌泥(g):保护剂(mL)质量体积比1:5加入质量比为2:2:4:1:2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油，进行真空冷冻干燥，得到约氏乳杆菌冻干剂，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达3.7×10¹¹cfu/g。

实施例2

（1）实验动物及实验设计

将540只1日龄雌性健康健康京红蛋雏鸡，从北京华都峪口禽业有限责任公司孵化场购买，随机分成6个处理组，每个处理组6个重复，每个重复15只鸡。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2-6组为约氏乳杆菌菌粉试验组，分别在基础日粮中添加1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸cfu/g的约氏乳杆菌菌粉。试验周期为120天。基础日粮配方见表1。参照NRC（1994）配制。分0-6周龄和7-17周龄两个阶段。

表1基础日粮配方和营养成分

（2）动物实验方法

采用叠层笼养，15只/笼。进雏后供给温水饮用，4-5个小时后供给雏鸡料。随后自由采食与饮水。鸡舍温湿度、光照程序分别见表2，表3。

表2鸡舍温湿度表

表3光照程序

（3）生产性能指标观测

分别在每周龄早8点以重复空腹称重，统计各周龄末平均体重；每周清扫料槽一次，统计每周采食量。

（4）统计方法

试验数据采用SAS统计软件进行单因素方差分析，用Duncan氏进行多重比较，以P<0.05为显著水平，试验数值以“平均数±标准差”表示。

（5）结果分析

1)约氏乳杆菌对蛋雏鸡采食量的影响

表4约氏乳杆菌菌粉对蛋雏鸡采食量的影响(克/只.天）

注：同行数据肩标含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不含有相同字母表示差异显著(P<0.05)，下表同。

结果显示（表4），饲料中添加约氏乳杆菌对蛋雏鸡的采食量具有显著影响，不同添加量之间，影响效果不同。添加1.0×10⁶cfu/g、1.0×10⁷cfu/g、1.0×10⁸cfu/g对采食量具有显著降低作用（P<0.05）添加1.0×10⁴cfu/g、1.0×10⁵cfu/g对采食量没有显著影响；从全程看，约氏乳杆菌对蛋雏鸡采食量的显著影响只表现在试验前期（1-10周），后期（11-17周）影响不显著。

2)约氏乳杆菌对蛋雏鸡体重的影响

表5约氏乳杆菌菌粉对蛋雏鸡体重的影响(克/只）

结果显示（表5），4周龄前各组之间体重差异不显著（P>0.05）。第5周至第13周时，约氏乳杆菌对初级体重产生了不同程度的影响，其中，添加1.0×10⁶cfu/g、1.0×10⁷cfu/g的实验组体重显著低于对照组（P<0.05），而且持续时间较长。第14周之后，试验各组体重之间差异不显著（P>0.05）。

3)约氏乳杆菌对蛋雏鸡料肉比的影响

表6约氏乳杆菌菌粉对蛋雏鸡料重比的影响(克/只）

结果显示（表6），约氏乳杆菌对蛋雏鸡料重比的影响在试验期的不同阶段表现的效果不同，总体来讲没有明显的规律变化；从全期平均结果分析，约氏乳杆菌对蛋雏鸡的料重比具有显著影响，添加约氏乳杆菌的各组料重比均显著低于对照组（P<0.05）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.约氏乳杆菌CGMCC No.4926在提高蛋雏鸡生产性能中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在蛋雏鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克基础日粮中的含量达到1.0×10⁴~10⁸cfu。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的约氏乳杆菌制剂为约氏乳杆菌冻干剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述约氏乳杆菌冻干剂的冻干保护剂为质量比为2:2:4:1:2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油。