CN102755665A

CN102755665A - 一种异种骨移植材料的制备方法

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Publication number: CN102755665A
Application number: CN2012102673238A
Authority: CN
Inventors: 陈学英; 李宝兴; 李宝明; 杨婷; 张育敏; 李靖
Original assignee: China Institute for Radiation Protection
Current assignee: China Institute for Radiation Protection
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2012-10-31

Abstract

本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种异种骨移植材料的制备方法。本发明主要解决目前异种骨移植材料存在的制备过程繁琐、清洗效果难以保证、化学物质引入过多易发生残留、没有进行病毒灭活等不足。本发明一种异种骨移植材料的制备方法包括取材、深低温冷冻、成型、清洗、除病毒、脱脂、酶处理、清洗、冷冻干燥和灭菌十个步骤，本发明的制备方法具有方法简单、清洗效果好、既降低了异种骨材料的免疫原性，又能保留骨诱导活性与力学强度的优点。

Description

一种异种骨移植材料的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种异种骨移植材料的制备方法。

背景技术

异种骨是采用动物源性如猪或牛等的骨组织，经过处理降低其免疫原性，用作骨移植材料，在临床上植入患者骨缺损处，起到填充、支撑的作用，并最终改建成宿主的自身骨组织，从而达到治疗的目的。

公告号为CN1456363，名称为异种骨胶原基质制备的新方法的专利，公开了一种异种骨胶原基质制备的新方法，但该专利对异种骨胶原的制备方法未做详述，所提到的部分脱钙会引起骨材料的力学强度明显下降；公告号为CN1188015，名称为新型块形脱脂去抗原异种骨移植材料及其制备方法的专利，采用脱脂、去抗原及部分脱钙的方法处理异种骨，骨矿成分与胶原蛋白的含量比例约为１:１，导致所制备材料力学强度明显下降；公告号为CN1296804，名称为强力抗感染型重组合异种骨的制备方法的专利，采用抗菌剂与重组合异种骨复合，使材料既有骨诱导活性又有抗感染性，但重组合异种骨要复合骨形态发生蛋白，剂量难于控制，加之受体个体差异的不确定性，如果剂量过大容易诱发骨肿瘤。由此可见现有的异种骨制备方法制备过程大多比较繁琐，或引入的化学试剂过多容易引起残留，或清洗效果难以保证，关键性的，未有针对性地对异种骨材料进行病毒灭活处理，以确保移植的安全性，都难以提供一种既保留生物活性与力学强度、又安全有效的异种骨移植材料。

发明内容

本发明主要针对目前异种骨移植材料存在的制备过程繁琐、清洗效果难以保证、化学物质引入过多易发生残留、没有进行病毒灭活等不足，而提供一种方法比较简单、清洗效果好、既降低了异种骨材料的免疫原性，又能保留骨诱导活性与力学强度的异种骨移植材料的制备方法。

本发明为实现上述目的而采取的技术方案为：

一种异种骨移植材料的制备方法，包括以下步骤：

1）取材：健康合格的动物，生长6个月以上，取其髂骨与四肢长骨，即异种骨；

2）深低温冷冻：将所取异种骨储存于深低温冰箱中保存；

3）成型：将深低温冷冻后的异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成型；

4）清洗：将成型的异种骨浸于水中，超声条件下清洗2～5次，以骨组织不显血色为准；

5）除病毒：将步骤（4）所得异种骨，采用次氯酸钠溶液浸泡，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用水在超声条件下清洗2～5次；

6）脱脂：将步骤（5）所得异种骨，用碳酸钠溶液进行脱脂清洗，每小时换液一次；

7）酶处理：将脱脂后的异种骨，采用胰酶溶液处理；

8）清洗：经胰酶溶液处理的异种骨，在超声条件下用水清洗干净；

9）冷冻干燥：清洗干净的异种骨，冷冻干燥至含水的质量分数为2-10%；

10）灭菌：冻干的异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60 γ射线辐照灭菌。

其中所述的深低温保存条件为-70度以下保存不少于1个月。

所述的次氯酸钠溶液的质量分数为0.05%～5%，处理时间为0.5～16小时。

所述的碳酸钠溶液的质量分数为0.05%～5%，水温35～70度，处理时间为0.5～20小时。

所述的胰酶溶液的浓度为0.1～10g/L，水温30～60度，处理时间为0.5～20小时。

所述的冷冻干燥至含水量为5%。

所述的钴-60 γ射线辐照灭菌剂量为15～30kGy。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

（1）本发明采用深低温冷冻的方法保存异种骨，降低了其免疫原性；

（2）本发明采用超声条件下清洗的办法，提高了清洗的效率与效果；

（3）本发明采用次氯酸钠溶液对异种骨组织进行病毒灭活，杜绝病毒传播的可能性；

（4）本发明采用碳酸钠溶液进行脱脂，脱脂效果好，并且不引入其它可能对人健康有影响的化学试剂；

（5）本发明进一步采用酶处理异种骨，对其胶原结构进行切割，进一步降低其免疫原性。

附图说明

图1是实施例1制备的猪源性异种骨数码照片；

图2是实施例1制备的猪源性异种骨放大25倍的扫描电镜图；

图3是实施例1制备的猪源性异种骨放大2000倍的扫描电镜图；

图4是新鲜猪源性异种骨放大了200倍的光学显微镜图；

图5是实施例1制备的猪源性异种骨放大200倍的光学显微镜图，

图6是实施例1制备的猪源性异种骨体外细胞毒性试验的细胞生长曲线图。

具体实施方式

实施例1

一种异种骨移植材料的制备方法，包括以下步骤：

1）取材：健康合格的猪，生长7个月，取其髂骨与四肢长骨，即猪源性异种骨；

2）深低温冷冻：将所取猪源性异种骨储存于深低温冰箱中在-70度保存1个月；

3）成型：将深低温冷冻后的猪源性异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成5mm×5mm×20mm的骨条；

4）清洗：将成型的猪源性异种骨浸于纯化水中，超声条件下清洗2次使骨组织不显血色；

5）除病毒：将步骤（4）所得猪源性异种骨，采用质量分数为0.05%的次氯酸钠溶液浸泡16小时，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用纯化水在超声条件下清洗3次；

6）脱脂：将步骤（5）所得猪源性异种骨，用温度为35度，质量分数为0.05%的碳酸钠溶液进行脱脂清洗20小时，每小时换液一次；

7）酶处理：将脱脂后的猪源性异种骨，采用温度为30度，浓度为0.1g/L的胰酶溶液处理20小时；

8）清洗：经胰酶溶液处理的猪源性异种骨，在超声条件下用纯化水清洗干净；

9）冷冻干燥：清洗干净的猪源性异种骨，用冷冻干燥机冷冻干燥至含水的质量分数为2%；

10）灭菌：冻干的猪源性异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60 γ射线辐照灭菌，辐照灭菌剂量为15kGy。

进了进一步表明本实施例制备的猪源性异种骨的各种性能，本实施例还做了如下实验：

1、观察其形态结构以及清洗的效果。

附图1是利用数码相机对本实施例制备的猪源性异种骨拍照进行大体观察，同时采用离子溅射仪对猪源性异种骨表面喷金后，用JSM6360LV低真空扫描电子显微镜观察，扫描拍片，Smile View软件分析测量其腔隙直径，附图2是异种骨放大25倍的扫描电镜图，附图3是放大了2000倍的扫描电镜图。

图1、图2和图3的观察结果显示，与人松质骨结构相似，本实施例制备的猪源性异种骨呈蜂窝状三维多孔网状立体结构，孔隙分布均匀，材料的腔隙直径大小在150μm-600μm之间，在其松质骨小梁上有大量直径在10μm -100μm的小孔，这样的三维孔隙结构，植入体内时，有利于宿主组织与细胞的长入、营养成分的进入，便于宿主成骨相关细胞的迁徙、贴附与长入，进而发生爬行取代。制备的猪松质骨清洗彻底，无软组织与细胞组分的残留。

2、组织学观察

将新鲜的异种骨和本实施例制备的猪源性异种骨，用***溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察其显微结构，从而观察处理与清洗的效果，以及处理方法对异种骨组织的显微结构的影响。附图4是新鲜异种骨光学显微镜图，附图5是本实施例制备的猪源性异种骨光学显微镜图，从两个附图可以看出，制备出来的异种骨材料清洗效果好，显微结构保持良好。

3、异种骨力学强度检测，目的是比较制备过程对异种骨材料的力学强度是否影响。

表1是将本实施例制备的猪源性异种骨加工成10mm×10mm×20mm的骨块，于处理的不同阶段取材，分新鲜猪骨组、次氯酸钠处理组、胰酶处理后组、冻干辐照组，用RGT-20A微机控制电子万能材料试验机检测样品的抗压性能，试验条件为室温，湿度为30％，加载速度为5mm/min。

表1异种骨力学强度检测数据

结果表明，力学强度变化无统计学差别。

4、碳酸钠脱脂过程中材料的脂肪含量。

主要目的是比较不同制备阶段异种骨材料中脂肪的含量，检测脱脂的效果。

在制备的不同阶段，取部分骨材料，冷冻干燥后，采用索氏提取装置提取粗脂肪。样品称重，置于提取管内，加无水***150ml，经烘烤恒衡重的烧瓶接于底部， 40±2 ℃恒温水浴，接收回流提取液并继续加热蒸发，以每小时回流7～8次为宜。提取12h，将提取液蒸发回收，烧瓶经烘烤恒重。测量提取前后烧瓶重量的差别，从而计算脂肪含量。表2是按所述方法制备三批异种骨，于不同处理阶段的脂肪含量检测数据。

表2是三组不同阶段的脂肪含量检测数据

数据结果表明本发明采用的碳酸钠溶液脱脂方法，脱脂效果良好，并且胰酶也有能起到一定的脱脂效果。

5、体外细胞毒性试验

采用MTT法，检测不同培养时期兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖状况，评价异种骨对BMSCs生长与增殖的影响，从而判定其体外细胞毒性。

5.1 浸提液的制备

制备5mm×5mm×5mm的异种骨小块，按照中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价》，按1g异种骨:10ml浸提液的比例，无菌条件下将异种骨小块浸于含10％FBS的L-DMEM培养基中，装于无菌的密闭容器内，37℃浸取72h，取上清液作为实验组培养基。对照组的培养为含10％FBS的L-DMEM培养液。

5.2细胞生长曲线的测定

从幼兔骨髓提取、培养兔骨髓间充质干细胞，取生长状态良好的第2，3代细胞，待细胞刚好贴壁融合铺满瓶底后，以0.25％胰酶消化，离心，用10％FBS的L-DMEM培养基稀释，血细胞计数板进行细胞计数，制成细胞浓度约1×10⁵/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，接种前吹打混匀，每孔加细胞悬液200μl，置5％CO₂培养箱37℃培养。培养24h，待细胞贴壁后，弃培养液，按组别分别加入异种骨浸提液与对照培养液，每3d换相应培养液1次，每隔24h取出培养板，每次取5孔，弃孔内培养液，加用PBS配成的5mg/ml MTT溶液20μl，培养4h，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150μl，震荡10min，用酶标仪检测OD值，测试波长为490nm，绘制细胞生长曲线，见附图6。

附图6结果显示，采用异种骨（猪）材料浸提液对细胞生长与增殖无明显的影响，异种骨具有良好的组织相容性。

实施例2

一种异种骨移植材料的制备方法，包括以下步骤：

1）取材：健康合格的牛，生长10个月，取其髂骨与四肢长骨，即牛源性异种骨；

2）深低温冷冻：将所取牛源性异种骨储存于深低温冰箱中在-90度保存2个月；

3）成型：将深低温冷冻后的牛源性异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成5mm×5mm×40mm的骨条；

4）清洗：将成型的牛源性异种骨浸于纯化水中，超声条件下清洗4次使骨组织不显血色；

5）除病毒：将步骤（4）所得牛源性异种骨，采用质量分数为2%的次氯酸钠溶液浸泡10小时，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用纯化水在超声条件下清洗2次；

6）脱脂：将步骤（5）所得牛源性异种骨，用温度为55度，质量分数为2%的碳酸钠溶液进行脱脂清洗10小时，每小时换液一次；

7）酶处理：将脱脂后的牛源性异种骨，采用温度为45度，浓度为6g/L的胰酶溶液处理10小时；

8）清洗：经胰酶溶液处理的牛源性异种骨，在超声条件下用纯化水清洗干净；

9）冷冻干燥：清洗干净的牛源性异种骨，用冷冻干燥机冷冻干燥至含水的质量分数为5%；

10）灭菌：冻干的牛源性异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60 γ射线辐照灭菌，辐照灭菌剂量为20kGy。

实施例3

一种异种骨移植材料的制备方法，包括以下步骤：

1）取材：健康合格的猪，生长12个月，取其髂骨与四肢长骨，即猪源性异种骨；

2）深低温冷冻：将所取猪源性异种骨储存于深低温冰箱中在-100度保存3个月；

3）成型：将深低温冷冻后的猪源性异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成5mm×5mm×5mm的骨块；

4）清洗：将成型的猪源性异种骨浸于纯化水中，超声条件下清洗5次使骨组织不显血色；

5）除病毒：将步骤（4）所得猪源性异种骨，采用质量分数为5%的次氯酸钠溶液浸泡0.5小时，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用纯化水在超声条件下清洗5次；

6）脱脂：将步骤（5）所得猪源性异种骨，用温度为70度，质量分数为5%的碳酸钠溶液进行脱脂清洗0.5小时；

7）酶处理：将脱脂后的猪源性异种骨，采用温度为60度，浓度为10g/L的胰酶溶液处理0.5小时；

9）冷冻干燥：清洗干净的猪源性异种骨，用冷冻干燥机冷冻干燥至含水的质量分数为10%；

10）灭菌：冻干的猪源性异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60 γ射线辐照灭菌，辐照灭菌剂量为30kGy。

Claims

1.一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是包括以下步骤：

2）深低温冷冻：将所取异种骨储存于深低温冰箱中保存；

7）酶处理：将脱脂后的异种骨，采用胰酶溶液处理；

2.根据权利要求1所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的深低温保存条件为-70度以下保存不少于1个月。

3.根据权利要求1所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的次氯酸钠溶液的质量分数为0.05%～5%，处理时间为0.5～16小时。

4.根据权利要求1所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的碳酸钠溶液的质量分数为0.05%～5%，水温35～70度，处理时间为0.5～20小时。

5.根据权利要求1所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的胰酶溶液的浓度为0.1～10g/L，水温30～60度，处理时间为0.5～20小时。

6.根据权利要求1所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的冷冻干燥至含水量为5%。

7. 根据权利要求1所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的钴-60 γ射线辐照灭菌剂量为15～30kGy。